（蔬菜学专业论文）甘蓝类蔬菜遗传多样性及亲缘关系RAPD、SSR分析.pdf

摘要 甘蓝类蔬菜是十字花科( c r u c i f e r a e ) 芸薹属( b r a s s i c a ) 植物。起源于地中海沿岸，并 在长时期的进化过程中形成了许多栽培类型。甘蓝类蔬菜于1 6 世纪开始陆续传入我国，在 我国已有几百年的栽培历史。现存于我国种质库中除了结球甘蓝( 2 2 1 份) 外，其余的栽培 类型均处于匮乏阶段。而且在育种工作中大量使用一些相同的亲本、种质鉴定工作不完善等 问题，导致一些优良的遗传资源流失使其遗传背景日盏狭窄、遗传变异率降低，育成的品 种单一化，这对品种在产量和品质方面的进一步改良起着极大的限制作用。本研究采用 r a p d 、s s r 两种分子标记技术，对甘蓝类蔬菜的部分品种和品系进行亲缘关系鉴定和遗传 多样性分析，一方面在育种工作中为亲本的选配提供理论依据。另一方面在d n a 水平上对 甘蓝类蔬菜进化、分类提供理论依据。实验结果如下： l 、r a p d 标记：在所用的9 6 个引物中，有1 0 条引物具有多态性，共产生9 1 条带，其 中多态性条带为7 3 条，占8 0 2 ，平均每条引物扩增的多态性位点数是7 3 个，相似性系 数分布在0 5 1 4 - 0 9 4 9 范围内。r a p d 分子标记可以清楚的将甘蓝类蔬菜分为七个类群，它 们分别是结球甘蓝、抱子甘蓝、羽衣甘蓝、青花菜，花椰菜、皱叶甘蓝类群，苤蓝和芥蓝为 一个类群。在本研究中单独对结球甘蓝群体进行r a p e ) 分析，从分子生物学角度对结球甘 蓝群体进行分类研究。研究结果是r a p d 可以清楚地将结球甘蓝群体分为中晚熟系列、早 熟系列、晚熟特大型系列、中熟品系列，它们的平均遗传相似性系数分别为：0 8 0 8 、0 8 4 2 、 0 7 8 6 、0 8 2 0 ，在结球甘蓝材料之间也表现出较高的遗传相似性系数，最高的可达0 9 4 9 ， 其平均值也达到了0 7 6 6 。这说明了本研究中所选用的结球甘蓝材料之间的遗传距离较近、 遗传背景比较窄。 2 、s s r 标记：在s s r 分析中，5 对多态性引物共检测到等位基因2 1 个，平均每对引物 检测到的等位基因为4 2 个。引物平均p i c 为0 5 4 3 ，遗传相似性系数分布范围在0 0 8 7 一l 之间。s s r 分子标记同样可以将供试甘蓝类蔬菜分为七个类群，它们分别是夏甘蓝，春甘蓝、 大型晚熟甘蓝、秋甘蓝和来自日本的绿菜花、野崎早生、早生子持三个品种。 3 、r a p d 与s s r 标记比较：r a p d 与s s r 这两种分子标记原理不同，揭示的是基因组 不同范围，同时产生的聚类分析图也存在着一定的差异。从实验的结果看r a p d 的聚类结 果与植物学分类变种间的差异比较吻合。更加确定芥蓝作为甘蓝种内一个变种成员的证据。 s s r 的聚类分析结果与品种的生长习性和品种的地理起源有着明显的相关性，有益于变种内 不同品种类群遗传多样性的鉴定。 对3 0 个甘蓝类蔬菜品种和品系的r a p d 、s s r 分析结果表明，本实验所选取的材料之 间具有极高的遗传相似性，其遗传背景比较狭窄。所以在继续搜集、引种、鉴定种质资源的 基础上，运用基因工程、组织培养、诱变育种等方法创造优异的种质资源，以拓宽甘蓝类蔬 菜的遗传基础事在必行。 关键词甘蓝类蔬菜；r a p d ；s s r ；遗传多样性；亲缘关系；聚类分析 v 东北农业大学农学硕士学位论文 g e n t i cd i v e r s i t ya n d r e l a t i o n s h i pa n a l y s i so f b r a s s i c a o l e r a c e alb yr a p d 、s s r a b s t r a c t b r a s s i c ao l e r a c e al h a db e e ns e r e r a lc e n t u r i e sg r o w t hh i s t o r ys i n c e1 6a d o u rc o u n t r y g e r mp l a s ms t o r e r o o mi sd e f i c i e n ti nt h er e s tc u r i v a t et y p e se x c e p tc a b b a g e t h e r ea r es om a n y p r o b l e m sw h i c hu s i n gs o m eu n i f o r ms e e d p a r e n t si nb r e e d i n g ，f a u l t yg e r mp l a s ma p p r a i s a l ，t h a tl o t s o f c u l t i v a t eg e n eh a dg o n e ，r e s u l t i n gi nt h es t r i c t u r eo f i n h e r i tb a s i sa n dl o w n e s si ng e n e t i cv a r i a n c e r a t i o ，w h i c hg r e a t l yr e s t r i c t sf u r t h e ri m p r o v e m e n to fi t sq u a n t i t ya n dq u a l i t y e m p l o y i n gt h e t e c h n i q u eo f r a p d s a n ds s r s 棚l i a t i o na m o n g3 0b r a s s i e ao l e r a c e a 厶c u l t i v a r sw e r es t o d i e di n t h i sp a p e r d e t e c t i o na n da n a l y s i so nr e l a t i o n s h i p sa n dg e n e t i cd i v e r s i t yo f f e r e dt h e o r ye v i d e n c e s o ns e l e c t i n gp a r e n t si nb r e e d i n g ，e v o l u t i o na n dc l a s s i f yo fb r a s s i e ao l e r a e e a 厶o u rr e s u l t sa r e e x p e c t e dt oo f f e rv a l u a b l er e f e r e n c ew h i c ha r ea sf o l l o w s ： 1 r a p d s ：i nt h e9 6p r i m e r sw ec h o s e n ，1 0r a n d o mp r i m e r sh a dp o l y m o r p h i s ma n dt o t a l l y9 1 b a n d sw e r eg e n e r a t e d a b o u t8 0 2 o ft h eb a n d sw e r ep o l y m o r p h i c e a c hp r i m e rc o u l da m p l i f i e d 6 一llb a n d sw i t h7 3i nt h ea v e r a g e r e s u i t so ft o t a lg e n o m eh o r i a o n t a lc l u s t e ro n3 0v a r i t i e do f b r a s s i c ao l e r a e e ali n d i c a t e dt h a tt h es i m i l a r i t yi n d e xr a n g ei sn a r r o w , w h i c hl o c a t a db e t w e e n o 5 1 4 - 0 9 4 9 c u l t i v a r sw e r ed i v i d e di n t os e mg r o u p sb yr a p d s ：b r a s s i c a o l e r a c e av a t e a p i t a t a , 。 b r a s s i e a o l e r a c e av a r g e m m l y e r a ，b r a s s i c n o l e r a c e av a r a c e p i t a t a , b r a s s i e a o l e r a c e av a t i t a l i e a , b r a s s i c a o l e r a c e av a t b o t r y t 括，b r a s s i c a o l e r a c e av a r b u l l a t a , b r a s s i c a o l e r a c e av a r a l b o g l a b r a a n db r a s s i e a o l e r a c e av a e c a u l o r a p a t h er e l a t i o n g s h i p sw i t h i nc a b b a g ew e r ea l s oa s s e s su s i n g r a p d s f o u rs u b g r o u p sp r e s e n t i n gm i d d l el a t et y p e s ，e a r l yt y p e s ，l a t el a r g et y p e s ，m i d d l et y p e s t h e a v e r a g eg e n e t i cs i m i l a r i t yw i t h i nf o u rt y p e sw e r eo 8 0 8 ，0 8 4 2 ，0 7 8 6 ，0 8 2 0 2 s s r s ：t h er e s u l ts h o w e dt h a tat o t a lo f 2 1g e n ea l l e l e sw e md e t e c t e df r o m5s s rp r i m e r s t h en u m b e ro fa l l e l e sp e rr a n g e df r o mt w ot o f i v ew i t ha na v e r a g eo f4 2 p i er a n g ew a s o 2 5 7 - 0 9 2 1 ，w i t ha na v e r a g eo f o 5 4 3 1 1 1 es i m i l a r i t yi n d e xr a n g ei sw i d e ，w h i c hl o c a t e db e t w e e n 0 0 8 7 1 c u l t i v a r sw h i c hc o m ef r o mo u rc o u n t r yw e r ed i v i d 酣i n t of o u rg r o u p s ：s u m m e r t y p e ，s p r i n gt y p e ，l a t el a r g et y p e ，a u t u m nt y p e 3 c o m p a r i s o n b e t w e e ns s r sa n dr a p d s ：r a p d sa n ds s r sw h i c hh a v ed i f f e r e n t p r i n c i p l e s ，d e t e c t s d i f f e r e n tr a n g eo fg e n o m e ，r e s u l t i n gi n d i f f e r e n t c l u s t e r i n ga n a l y s i s t h e c l u s t e r i n go fr a p d sw a si na c c o r dw i t hb o t a n yc l a s s i 母a m o n gb r a s s i c ao l e r a c e al r e s u l to f s s r si n d i c a t e dt h a ti ti sp o s s i b l ef o rs s rm a r k e r st os t u d yr e l a t i o n s h i p sb e t w e e nd i f f e r e n tg r o u p s u n d e rb r a s s i c ao l e r a c e a 上v a r c a p i t a t aa n dc u l t i v a rd i s c r i m i n a t i o n o u rr e s u l t so f 3 0 b r a s s i e a o l e r a c e a l c u t i v a r s f r o m r a p d sa n ds s r ss t u d yd e m o n s t r a t e t h a t m o s t v a r i t i e sw h i c hw ec o l l e c t e dh a v ee x t r e m e l yh i g hi n h e r i t a n c es i m i l a r i t ya n dn a r r o wi n h e r i t a n c e b a c k g r o u n d s oo nt h eb a s i co f c o n t i n u ec o l l e c t i o n ，a p p r a i s a lg e r mp l a s m ，c r e a t i n gn e wg e r mp l a s m b yu s i n gg e n ee n g i n e e r i n g ，t i s s u ec u l t u r ea n ds oo nw i l lb e c o m ea i le m p h a s e ss t u d y k e yw o r db r a s s i e ao l e r a e e a ，s s r s , r a p d s ，g e n e t i cd ! v e r s i t y ，r e l a t i o n s h i p ，c l u s t e r i n ga n a l y s i s v i v i i p o s t g r a d u a t e ：t i a ny u a n m a j o r ：p r o f w a n gc h a o s u p e r v i s o r - v e g e t a b l eb r e e d i n g 独创声明 本人声明所里交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名：旧穆， 日期：西7 年月o 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 、刁碾 ， 导师签名：毛起 日期：1 西7 年f 月t 日 日期：印f 。 前言 1 前言 1 1 甘蓝类蔬菜的起源、进化与分类 1 1 1 甘蓝类蔬菜的起源、进化与传播 甘蓝类蔬菜原产西北欧的海滨和地中海沿岸，并且在进化过程中产生很多栽培种，其中 包括( 表1 - 1 ) ： 表1 - 1 甘蓝类蔬菜的种类 t a b 1 - 1 t y p e so fb r a s s i c ao l e r a c e a 变种名称拉丁名 结球甘蓝 羽衣甘蓝 球茎甘蓝 皱叶甘蓝 抱子甘蓝 芥蓝 青花菜 花椰菜 b r a s s i c a o l e r a c e av a n c a p i t a t al b r a s s i c a o l e r a c e av a n a c e p f a t a d c b r a s s i c a o l e r a c e av a r c a u l o r a p ad c b r a s s i c a 。o l e r a c e av a r b u l l a t ad c b r a s s i c a o l e r a c e av a r g e m m i f e r a 盈止 b r a s s i c a o l e r a c e av a r a l b o g l a b r ab a i l e y b r a s s i c a o l e r a c e av a r i t a l i c ap b r a s s i c a o l e r a c e av a ，：b o t r y t i sd c 经英国剑桥植物育种研究所研究，甘蓝不同的栽培类型的早期进化发生在地中海或小亚细亚 地区。现在一些学者认为，甘蓝类蔬菜起源于现在尚存的一种一年生野生杂草( b r a s s i c a o l e r a c e av a n o l e r a c e a ) 。但也有一些学者认为甘蓝类蔬菜起源于b r a s s i c ao l e r a c e a ，b r a s s i c a c r e t i c a ，b r a s s i c ai n s u l a r i s 和b r a s s i c ar u p e s t r i s4 个野生近缘种的复合体 甘蓝是分化变异类型比较多的一种。首先甘蓝的野生种( b r a s s i c a o l e r a c e a v a r o l e r a c e a ) 大约在公元前6 0 0 年，由希腊人栽培驯化成羽衣甘蓝，主要作为饲料用，为不分枝类型。后 来这种羽衣甘蓝又分化出3 个类型：分枝细茎的、髓状茎的和高茎的类型( 刘英，2 0 0 6 ) 。 结球甘蓝起源于地中海至北岸，是由不分枝类型羽衣甘蓝分化出来的h e l m ( 1 9 6 3 年) 认 为真正的卷心b o l e r a c e av a n c a p i t a t a 是在德国形成的。这个变种于1 4 世纪在英国形成了红 色结球甘蓝和白色结球甘蓝，1 6 世纪传入北美加拿大，1 7 世纪传入美国，1 9 世纪传入日本。 皱叶甘蓝可能起源于意大利，并于1 6 世纪和1 7 世纪传播到法国和德国。羽衣甘蓝的栽培历 史长达几千年，早在公元前6 0 0 年希腊人就种植羽衣甘蓝。抱子甘蓝( b r a s s i c a o l e r a c e a v a r g e m m i f e r az n k ) ，作为一种“变态植物”，以它现在的形态大约于1 7 5 0 年出现在比利时 的布鲁塞尔，到1 8 0 0 年，已经传到法国和英国，从1 8 2 0 年起被称作“c h o u d eb r u x e l l e s ”， 它可能起源于结球甘蓝同一个祖先类型的羽衣甘蓝( 不分枝类型) 。球茎甘蓝变种 ( b r a s s i c a o l e r a c e av a n c a u l o r a p ad c ) 起源于髓状茎的羽衣甘蓝类型，起源地大约在现在的 德国或北欧，分化时间和结球甘蓝差不多。高茎类型的羽衣甘蓝，现在在英国作为饲料大面 积栽培( 刘英，2 0 0 6 ) 。青花菜( b r a s s i c a o l e r a c e av a r i t a l i c ap ) 和花椰菜( b r a s s i c a o l e r a c e a v a r b o t r y t i s d c ) 都起源于地中海东部沿岸地区，它们都是由“立木花椰菜”( b r a s s i c a o l e r a c e a v a r b o t r y t i s ) 分化而来，最初由罗马人将其传入意大利。立木花椰菜大约在1 5 7 6 年由分枝细 茎的羽农甘蓝类型进化而来的。一般认为：青花菜的出现可能早于花椰菜，与花椰菜比较， 东北农业大学农学顺j j 论文 青花菜更接近于甘蓝的其他类型。1 6 一1 8 世纪，花椰菜被传向欧洲北部，在沿海地区形成 t - - 年生类型，在内陆地区形成一年生类型。对与芥蓝的起源，目前的主要观点是起源于我 国南方的福建、广东一带。图卜1 是它们的进化路线： 图卜1 甘蓝类蔬菜的进化路线 f i g 1 1e v o l v e m e n to fb r a s s i c ao l e r a c e a 1 1 2 甘蓝类蔬菜的分类 甘蓝类蔬菜的种内下分6 个变种，分别是结球甘蓝变种( b r a s s i c a o l e r a c e av a r c a p i t a t a ) ， 立木花椰菜变种( b r a s s i c ao l e r a c e av a r b o t r y t i s ) ，抱子甘蓝变种( b r a s s i c a o l e r a c e a v a ，= g e m m i f e r a ) ，羽衣甘蓝变种( b r a s s i c a o l e r a c e av a r a c e p i t a t a ) ，球茎甘蓝变种 ( b r a s s i c a o l e r a c e av a r c a u l o r a p a ) 和野生甘蓝变种( b r a s s i c ao l e r a c e av a r o l e r a c e a ) 。 第二种分类方法是甘蓝类蔬菜的种内分7 个变种，即结球甘蓝变种( b r a s s i c a o l e r a c e a v a r c a p i t a t a ) ，花椰菜变种( b r a s s i c a o l e r a c e av a r b o t r y t i s ) ，青花菜变种( b r a s s i c a o l e r a c e a v a r i t a l i c a ) ，抱子甘蓝变种( b r a s s i c a o l e r a c e av a r g e m m i f e r a ) ，羽衣甘蓝变种( b r a s s i c a o l e r a c e a v a r a c e p i t a t a ) ，球茎甘蓝变种( b r a s s i c a o l e r a c e av a r c a u l o r a p a ) 和野生甘蓝变种( b r a s s i c a o l e r a c e av a r o l e r a c e a ) 。其他的分类方法有把“皱叶甘蓝”( b r a s s i c a o l e r a c e av a ，：b u l l a t a ) 作 为一个变种。还有把“白花芥蓝”( b r a s s i c a o l e r a c e av a r a l b o g l a b r a ) 作为甘蓝种的一个变种。 ( 刘英j2 0 0 6 ) 2 前言 1 2 研究目的与意义 1 2 1 研究目的 本试验在搜集了比较齐全的甘蓝类各个变种的品种和品系的前提下，利用显性标记 r a p d 和共显性标记s s r 两种方法，对供试的甘蓝类蔬菜品种及品系的亲缘关系进行鉴定 和遗传多样性分析，并且从分子水平上对甘蓝类蔬菜间的亲缘关系做初步的探讨。通过试验 可以达到以下目标： 第一方面，为保护甘蓝类蔬菜种质资源遗传多样性提供理论基础，了解甘蓝类作物群体 的遗传背景，为育种工作的开展提供理论前提。 第二方面，可以进一步为完善甘蓝种以下的分类提供依据，并从分子生物学角度去研究 甘蓝种下的分类。 第三方面，比较r a p d 和s s r 两种分子标记在揭示甘蓝类蔬菜的遗传多样性和亲缘关 系方面的差异性。 1 2 2 研究意义 遗传多样性被认为是生物多样性的核心问题。蕴藏于物种间或种间的分子、细胞和个体 水平的遗传变异。遗传多样性可以揭示物种的进化潜力，通常物种或居群的遗传多样性大小 是长期进化的产物，是其生存和发展的前提，与生物多样性的形成、消失和发展休戚相关。 一个居群( 或物种) 遗传多样性越高或遗传变异越丰富，对环境变化的适应能力越强，越容 易扩散其分布的范围和开拓新环境。理论推导和大量的实验证据表明，生物居群中遗传变异 的大小与其进化速度成正比，因此对遗传多样性的研究可以揭示物种和居群起源进化历史， 尤其是加深人们对微观进化的认识，为动植物的分类、进化研究提供了有利的资料，进而为 动植物育种和遗传改良奠定基础，也能为进一步分析其进化潜力和未来的命运提供重要的资 料。同时还可以对优良的遗传资源进行保护。农业是人类赖以生存的基础，特别是在全球气 候变暖的今天，气候的变化同样会影响农业产生预料不到的变化。因此保护遗传多样性，也 是农业可持续发展的需要。 甘蓝类蔬菜在我国的栽培历史已有几百年，这种植物的全部器官均可以被人们利用。例 如结球甘蓝，有很多相互重叠的叶片包住顶芽形成的叶球：抱子甘蓝的增大的腋芽；球茎甘 蓝的球状茎：细长羽衣甘蓝的肉质但不像球状的茎；花椰菜的肉质花序形成的可食的花球等。 这些多态的种为人类提供了大量的蔬菜，也为家畜提供了大量的饲料。 从“六五”“九五”期间，我国甘蓝育种主要目标是抗病和丰产，随着近些年来随着 人们生活水平不断提高，人们对甘蓝类蔬菜的需求也越来越高。为了满足不同地区消费者的 需求，育种工作者们从1 9 8 0 - - 2 0 0 1 年对生产上使用的甘蓝类蔬菜品种更新了3 _ - 4 代，良种 普及率达9 0 以上。由于我国目前搜集到的甘蓝种质资源有限。所以甘蓝种质资源的研究和 利用水平已成为我国甘蓝育种提高的一个主要因素。据统计我国入库的甘蓝类种质资源为 5 4 4 份，其中结球甘蓝为2 2 1 份，球茎甘蓝为1 0 4 份，花椰菜1 2 8 份，青花菜4 份，芥蓝8 7 份( 方志远，2 0 0 4 年) 。据报导，目前世界上收集到的结球甘蓝种质资源为2 9 5 5 份，仅美 国就保存甘蓝类种质资源1 9 6 9 份。所以从数量上看，还不能满足育种且标多样性的需要。 况且对这些保存下来的材料有尚未做过鉴定和评价，制约了育种工作者对育种材料准确和有 效利用。 3 东北农业大学农学硕士论文 甘蓝是欧美各国的主要蔬菜，栽培历史悠久，育种技术先进，有许多优异的种质资源值 得我们引进。我们过去的育种实践证明，许多表现突出的甘蓝杂交种，其双亲往往一方来自我 国地方品种，另一方来源于国外引进品种。如羽衣甘蓝，现行少量从国外引入的羽衣甘蓝杂 种一代品种，耐冻性差、抽薹早、类型也不够丰富，适宜种植的区域仅限于长江以南较温暖 的气候地区，而我国的长江两岸主要城镇地区则基本无适宜品种可供种植，冬季寒冷冰冻造 成室外长达3 个半月的盆花淡季。我们积极利用引进的国外的羽衣甘蓝杂种一代品种，通过 杂交、回交、连续自交基因重组方法系统选育创造了一批形态特征相当稳定的较为丰富的羽 农甘蓝新种质，加之新品种选育杂种优势利用形态变异更是多种多样，均填补了国内空白 我国结球甘蓝一代杂种的配制骨干亲本大多数来自北京早熟、金旱生、黑叶小平头、黑 叶大平头、黄苗、鸡心、楠木叶等资源材料，遗传背景比较狭窄，并且不排除其中也有一些 近亲交配的一年生变种。使得在杂交种中出现不合格的自交系或姊妹株，这对抗逆及品质育 种的发展都有影响的。本实验通过分析育种群体的遗传多样性，可以使育种工作者清楚它们 之间的亲缘关系，有利于育种工作的展开。 在种质资源的收集的同时对野生资源的考察与收集也是非常重要的。众所周知，作物的 野生近缘种与当代的品种相比在许多方面表现较差。但不可否认的是在作物野生近缘种中存 在着能够提高当代品种产量和质量的许多重要基因，这样可以开发野生种的遗传潜力从而提 高当代品种的产量和质量。近些年来，国外已经逐步开始重视对甘蓝野生资源的研究考察工 作，国内还尚未起步。 1 3 亲缘关系及遗传多样性的研究方法 1 3 1 遗传多样性的概念 1 3 1 1 生物多样性的概念 遗传多样性是生物多样性的核心，那么什么是生物的多样性，就象许多其它学科的概念 一样，至今还没有一个严格、统一的定义。 美国国会技术评价办公室在1 9 8 7 年将生物多样性定义为：“生物之间的多样化和变异性 及物种生境的生态复杂性。” 1 9 8 2 年，联合国环境发展会议清楚的生物多样性公约将生物多样性定义为：“生物 多样性是指所有来源形形色色的生物体，这些来源包括陆地、海洋和其它水生生态系统及其 所构成的生态综合体，还包括物种内部、物种之间的生态多样性。” 1 9 9 5 年联合国环境规划署发表的全球生物多样性的巨著全球生物多样性平评估给 出一个较简单的定义：生物多样性是所有生物种类、种内遗传变异和它们与生存环境构成的 生态系统的总称。 这样一个复杂的、多学科综合的、内涵极其丰富的概念群，为了更好的理解他的内涵， 有将其分为四个层次。即遗传多样性、物种多样性、生态系统的多样性和景观多样性。其中 遗传多样性起源和变化对物种多样性、生态系统多样性的起源和变化起着决定性作用，或者 说遗传多样性对生物多样性的大小起着巨大的贡献。 1 3 1 2 遗传多样性概念 广义的遗传多样性是指地球上所有生物所携带信息的总和。狭义遗传多样性主要指种 内不同群体之间或一个群体内不同个体的遗传变异总和( 陈灵芝等，2 0 0 1 ) 。这是一个种、 变种、种或品种的基因变异来衡量一个种内变异性的概念。基因是一种携带遗传信息由特 定蛋白质编码的染色体单位，在研究遗传多样性时要考虑形态多态性、染色体多态性、蛋白 4 质多态性及d n a 多态性。它能一代一代地传下去但一般所指的遗传多样性是指种内的多 样性。种内多样性是物种以上水平多样性的最重要来源。而且种内的多样性是一个物种对人 为干扰能否进行成功反应的决定因素种内变异程度也决定其进化潜能。 所有的遗传多样性都发生在分子水平上。高等生物的染色体由蛋白质和脱氧核糖核酸 ( d n a ) 组成，基因的生物基础是d n a 。d n a 能自我复制，基因也同时自我复制。细胞分裂 时，复制了的染色体和其上面的基因传于后代，使后代保持上一代的遗传特征。同一物种不 同个体的染色体结构和数目的变化，使基因也随之变化，从而导致遗传信息的改变。染色体 结构的变化包括缺失、重复、倒位和易位四种类型，而其数目可有整数倍和非整数倍的变化。 这些变化为进化新颖性提供了遗传基础，因此是遗传多样性产生的源泉。基因存在于染色体 的d n a 分子上，通过转录和翻译，基因传递信息，决定生物性状。( 曾宗承，2 0 0 2 ) 1 3 2 研究方法 自1 9 世纪达尔文在物种起源中揭示生物中普遍存在变异现象即多样性开始，国内 外学者就已经对遗传多样性进行了广泛、深入的研究( t 旭琴，2 0 0 2 ) 。遗传多样性检测方 法的多种多样，不同技术从不同角度、不同层次揭示物种的遗传背景信息( 宿兵，1 9 9 8 ) 。 2 0 世纪初，由于显微镜的发明，促进了染色体的研究和细胞遗传学的发展，使遗传多样性 的研究从物种多样性的研究水平深入到种下和种内细胞。1 9 6 6 年h a r r i s 采用蛋白电泳技术 首次报道了同工酶和蛋白质的多态性以来，各种新的技术不断涌现，实验手段的不断改进， 检测遗传多样性的方法逐步发展起来，现已突飞猛进上升到d n a 水平。目前，同工酶电泳、 蛋白质序列分析、核酸序列分析、d n a 杂交、d n a 限制性内切酶图谱、d n a 指纹和随即 扩增多态d n a 等技术已经在分类和系统演化的研究中得到了广泛的应用。 1 3 2 1 形态学水平 利用形态标记来检测遗传变异是最古老的也是最简便易行的方法。形态学标记是指生物 特定的肉眼可见的外部特征，如植物的株高、叶形、果实的颜色等。从广义上讲形态学标记 也可包括色素、生殖生理特征、抗病虫性等有关的标记但植物的表现型性状遗传表达不 太稳定，易受环境条件及基因显隐性的影响。如果是符合孟德尔遗传规律的单基因控制的质 量性状，择可用其作为遗传标记来研究遗传多样性，这主要还是针对一些有重要经济价值的 作物。如果是多基因控制的数量性状，则用更为科学和严密的方法，即数量遗传学方法来研 究它的遗传变异，因为用数量遗传学方法可以通过特定试验设计来分析亲子代问的遗传规 律，将遗传因素和环境因素区分开，同时还可分析遗传和环境互作，甚至可以估算控制数量 性状多基因的位点数目。 1 3 2 2 染色体水平 随着显微技术的改进，使人类又进一步认识到微观世界的多样性，并建立了以细胞水平 为基础反应植物遗传多样性的标记。 染色体多样性的检测主要针对细胞分裂时期染色体核型分析和带型分析。核型分析是 对染色体数目变异( 整倍性、非整倍性) 和染色体结构变异( 缺失、易位、倒位、重位) 的 分析，除了数目和结构变异外，染色体水平上的多样性还可体现在染色体的形态( 着丝点位 置) 、缢痕和随体等核型特征上，这些特征的变异使种内出现细胞壁的多样性。带型分析即 将某物种染色体制片用不同物化手段处理，再用不同染料染色，在荧光激发下染色体臂会显 示出不同的带数。如g 带、c 带、n 带等等。它应用于种下水平居群间，其组型和染色体 特征差别不明显，则必须对染色体进行分带处理。显然染色体分带技术是一种直观、快速而 经济的检测外源遗传物质的方法。由于分带技术性较强，易受条件的影响，且大多数染色体 具有这种细胞学标记数目有限，导致细胞学标记对某些不具有特异性带的染色体或切片进行 东北农业大学农学硕士论文 鉴定时结果的可靠性略差。 1 3 2 3 等位酶水平 上个世纪6 0 年代初出现了同工酶标记是鉴定外源d n a 和研究物种起源进化有效工具， 可以从蛋白质水平反应生物遗传变异。同工酶是指具有同一底物专一性的不同分子形式的 酶，具有组织、发育及物种的特性。基本原理是根据电荷性质差异，通过蛋白质电泳或色谱 技术和专门的染色反应显示出同工酶的不同形式，从而鉴别不同的基因型。p r a k a s h e t a l 提出 了把同一基因位点的不同等位基因所编码的一种酶的不同形式叫做“等位酶”，是借助于特 定的遗传分析方法确定的一种特殊的同工酶，把它从广义的“同工酶”概念中分离出来。由 于其通常以共显性方式遗传，在生物界中广泛存在，且材料丰富、实验技术简单、结果易于 比较，使其成为一种十分有效的遗传标记。等位酶分析同样有其局限性，表现在：实验结果 随动植物不同发育时期、器官及环境而变化；可以利用的遗传位点数量比较小，常规电泳方 法只能检测出d n a 序列中1 4 左右的d n a 碱基替换；对电泳分析的样品要求较高。因此。 其代表性和敏感性仍不如对直接分析。 1 3 2 4d n a 水平 自1 9 8 0 年以来，分子生物学的飞速发展，使对遗传多样性的研究上升到了d n a 水平， d n a 是遗传物质的载体，遗传信息就是d n a 的碱基排列顺序，d n a 多态性是生物多样性 的本质内容，为了更深入掌握生物多样性的遗传学基础，最理想的办法就是直接观察测定 d n a 序列变异。与其他几种遗传标记形态标记、同工酶标记、细胞标记相比，分子标 记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的农艺性状的选择十分便利：基因组 变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的：在生物发育的不同阶段，不同组织的d n a 都可用于标记分析；分子标记揭示来自d n a 的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达， 与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。 目前，d n a 分析技术主要是针对部分d n a 进行的，从原理上可大致分为两类：一类 是直接测序，主要是分析一些特定基因或d n a 片段的核苷酸序列，度量这些片段d n a 的 变异性；另一类是检测基因组的一批识别位点，从而估测基因组的变异。那么d n a 序列的 变异尺度也就成为揭示遗传多样性最为理想的方法。遗传多样性的等级尺度是根据d n a 片 段的大小分为五级：( 1 ) 单碱基变异相当于突变子与重组子；( 2 ) 2 - 6 核苷重复序列拷贝数的 变化，即微卫星d n a 多态性；( 3 ) 几百碱基重复序列的变异，所谓小卫星：( 4 ) 整个蛋白编码 序列的变异，即顺反子；( 5 ) 基因组水平上的变异，包括细菌质粒、胞质d n a 和染色体及其 片段的缺失、插入、重组和水平转移。 目前针对d n a 标记的主要方法是对不特定基因组或d n a 片段识别位点的研究十分普 遍，是通过r f l p 、p c r 、r a p d 、d a f 、a p p c r 、s t s 、a f l p 等技术分析一些特定基因 或d n a 片段的核苷酸序列度量变异性，检测基因组的一批识别位点，从而估计基因组的变 异性。 分子标记的方法很多，依据所用的分子生物学技术，大致可以分为以s o u t h e r n 杂交为基 础和以p c r 为基础的两大类。 i 以p c r 为基础的分子标记有 简单序列重复( s s 艮s i m p l es e q u e n c er e p e a t ) 单引物扩增反应( s p a r , s i n g l ep r i m e r a m p l i f i c a t i o nr e a c t i o n ) 单链形态多态性( s s c p , s i n g l es t r a n dc o n f o r m a t i o n a lp o l y m o r p h i s m l 简单序列重复间扩增( i s s r , i n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a t sp o l y m o r p h i s m ) 任意引物p c r ( a p p c r 。a r b i t r a r i l y - p d m e dp c r ) 随机扩增多态性d n a ( r a p d r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ) r a p d 变性梯度凝胶电泳( r a p d d g g e d e n a t u r i n gg r a d i e n tg ee l e c t r o p h o r e s e s ) 6 d n a 扩增指纹 ( d a f ，d n aa m p l i f i e df i n g e r p r i n t i n g ) 扩增片段长度多态性( a f l p , a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 序列特异性扩增区( s c a rs e q u e n c ec h a r a c t e r i z e da m p l i f i e dr e g i o n ) 序标位 ( s t s ，s e q u e n c et a g g e ds i t e ) 割裂扩增多态性序列( c a p , c l e a v e da m p l i f i e dp o l y m o r p h i cs e q u e n c e ) 特异扩增多态性( s a p , s p e c i f i ca m p l i c o np o l y m o r p h i s m ) 以s o u t h e m 杂交为基础的分子标记 限制性片段长度多态性( r f l p , r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) d n a 指纹f d n af i n g e r p r i n t i n g ) 除了这些种常用的分子标记以外，近几年来分子标记技术已经发展到几十种，如a d a m s 等于1 9 9 1 年提出“表达序列标签”概念，近几年e s t 技术取得很大进展，目前主要被广泛 应用到分子遗传和基因组的研究，包括作为遗传学图谱分析中的分子标记，作为守一找具有 生物学或组织特异性表达基因的线索，作为基因组生物信息学分析的序列标签，作为d n a 芯片的基因资源等但用于植物的亲缘关系及遗传多样性分析方面还很少，目前只在小麦上 有应用。 1 9 9 8 年。在人类基因组计划实施方案过程中，第三代分子标记一单核苷多态性( s n p ) 标记诞生。基于s n p 的图谱用于群体分析具有许多优势。人类s h i p 己用于群体结构分析， 因为有些多态性是普遍存在的，而有些多态性则是当地某一群体所特有的，不同地理种群存 在巨大的差异。和其它分子标记一样，从s n p 分析中得到的等位基因频率也可用于比较群 体的分化，因为它也能产生用于估计基因流及群体分化的数据。通过分析s n p ，可以了解 中一个基因在复杂多基因控制性状中的贡献，但只有从取样群体的角度去分析、了解s n p 才是有价值的，反之，也可以从s n p 来估计