（发育生物学专业论文）真核生物高度保守基因wdr1的表达和功能初步研究.pdf

摘要 摘要 w d 4 0 重复序列这种基序存在于许多蛋白质中。蛋白质中的w d 重复区被认为是为蛋白与蛋白之间的相互作用提供位点作用。这种 特点具有3 个功能：提供蛋白质的结合位点；构成蛋白复合物的 整合组分：作为大蛋白的相互作用区模块。含有重复的w d 4 0 基序 的基因组成了一个基因大家族，其具有各种各样的细胞功能，如r n a 处理的过程、基因的调控过程、核小体的重建过程、信号传导和细 胞凋亡。 w d 4 0r e p e a tp r o t e i n2 ( w d r l 夕是利用人类心脏的e d n a 文库克 隆出来的一个高度保守的可能影响骨骼肌及心肌发育的一个候选基 因，其c d n a 全长3 1 6 0 个碱基，o r f 全长1 8 2 0 个碱基，编码一个 长6 0 6 个氨基酸残基的蛋白质。该蛋白包含l o 个w d 4 0 重复结构域， 在包括酵母，鸡，小鼠等在内的多个物种中均发现了它的同源蛋白， 并且它们之间具有极高的保守度，说明此蛋白可能具有相当重要的功 能。小鼠胚胎原位杂交及成人膜n o r t h e n 表达分析表明该基因在胚胎 和成体中有不同的表达模式，但均在肌肉组织中有较高水平的表达。 在c o s 7 细胞中过表达w d r l 蛋白可以使r h o 信号途径的两个 下游转录因子s r f 和p 2 1 的转录启动活性显著下降，但同时在c 2 c 1 2 细胞中，w d r l 蛋白可使肌肉分化途径中的s r f 和p 2 1 的转录启动 活性微弱上升。并同时与m y o d 共同作用促使骨骼肌标记基因m c k 活性的增强。另外在c o s 一7 细胞中，w d r l 对m a p k 其它信号通路 摘要 如：e l k i ，c j u n 和a p i 都有激活的作用。综合目前的研究结果来看， p d r l 很可能通过m a p k 信号途径参与了对骨骼肌细胞生命活动的调 控过程。 关键词：骨骼肌：w d 4 0 重复序列；w d r l ；m a p k ：转录活性 a b s t r a c t a b s t r a c t t h et r p - a s p ( w d ) m o ti fh a sb e e ns h o w nt oe x i s ti nan u m b e r o fp r o t e i n s i ti sn o wa c c e p t e dt h a tw d 4 0r e p e a td o m a i n sw i t h i n p r o t e i n sa c ta ss i t e sf o ri n t e r a c t i o nw i t ho t h e rp r o t e i n s t h i s c h a r a c t e r i s t i co fw d r sa l l o w sf o rt h r e eg e n e r a lf u n c t i o n a l r o l e s f i r s t ，i tcanp r o v i d eb i n d i n gs i t e sf o r p r o t e i n s s e c o n d ，i tc a nc o m p o s eo fa np r o t e i nc o m p l e x e s t h i r di tc a na c t a sam o d u l a ri n t e r a c t i o nd o m a i no fl a r g e rp r o t e i n s t h eg e n e s c o n t a i n i n gr e p e a t so ft h ew d 4 0 m o t i fc o m p o s eal a r g eg e n ef a m il y a s s o c i a t e dw i t hav a r i e t yo fc e l l u l a rf u n c t i o n ss u c ha sr n a p r o c e s s i n g ，g e n er e g u l a ti o n ，n u cl e o s o m e r e m o d e li n gs i g n a l t r a n s d u c t i o n ，a n da p o p t o sis w d 4 0r e p e a tp r o t e n1 ( w d r l ) i sc l o n e df r o mh u m a nh e a r tc d n a li b r a r y i tm a y b eo n eo ft h ec a n d i d a t eg e n e st h a ta f f e c tt h e d e v e l o p m e n to fs k e l e t a lm u s c l e w d r ii sh i g hc o n s e r v a t i v ei n e u k a r y o t i c t h ef u l ll e n g t hc d n ao fw d r li s3 1 6 0 b pa n di t c o n t a i n sa no p e nr e a d i n gf r a m eo f1 8 2 0b p i te n c o d e sap r o t e i n o f6 0 6a aa n dc o n t a i n sac o n s e n s u sd o m a i no f1 0w d 4 0r e p e a t s i nm a n ys p e c i e s ，t h eh o m o l o g u e so fw d r lp r e s e n th i g h l yc o n s e n s u s d u r i n ge v o l u ti o n ，w h i c hs u g g e s t st h ep o t e n ti a li m p o r t a n c eo f t h i sp r o t e i n e x p r e s s i o na s s a y si nm o u s ew h o l em o u n th y b r i da n d a b s t r a ( 可 n o r t h e r nb l o tp r e s e n tt h a tw d r li se x p r e s s e dw i t hd i f f e r e n t p a t t e r na tf e t a la n da d u l ts t a g e sb u tb o t hs t r o n g l ye x p r e s s e d i ns k e l e t a lm u s e l e s o v e re x p r e s s i o no fw d r li nc o s - 7c e l l sc a nr e m a r k a b l yi n h i b i tt h et r a n s c r i p t i o n a la c t i v i t yo fs r fa n dp 2 1w h i c ha r e d o w n s t r e a me f f e c t o r so fr h op a t h w a y f u r t h e r m o r eo v e r e x p r e s s i o no fw d r li nc 2 c 1 2c e l l sc a ns l i g h t l ya c t i v a t et h et r a n s c r i p t i o n a la c t i v i t yo fs r fa n dp 21i nm y o g e n e s i s a tt h es a m et i m e ，w d r lc a ne n h a n c et h ea c t i v a t i o no fm u s c l em a r k e rg e n e ，顾硝c o o p e r a t i v e l yw i t hm y o d i na d d i t i o n ，膨肼c a ne n h a c et h et r a n s c r i p t i o n a la c t i v a t i o no fo t h e rn u c l e a rt r a n s c r i p t i o nf a c t o r ss u c ha se l k 一1 ，c j u na n da p ib e l o n g i n gt om a p kp a t h w a y i nc o n cl u s i o n ，i th a sb e e ns u g g e s t e dt h a tw d r lp r o b a b l yt a k ep a r ti nr e g u l a t i o no fm y o g e n e s i st h r o u g ha c t i n gar o l ei nm a p kp a t h w a y k e yw o r d s ：m u s c l e ；m y o g e n e s i s ：w d 4 0r e p e a t ；w d r i ；m a p k ： t r a n s c r i p t i o n a la c t i v i t y i v 附录3 原创性声明和版权使用授权书 湖南师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指 导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引 用的内容外，本论文不合任何其他个人或集体已经发表或撰 写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：杜晓燕2 0 0 6 年5月3 0 日 湖南师范大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和倍阅。本人授权湖南师范大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 ， 1 、保密趔，在一三一年解密后适用本授权书。 2 、不保密口 ( 请在以上相应方框内打“ 升) 作者签名：弋0 瓿弩 日期：泗l 年罗月3 口日 导师样糕弓 蝴：“年多月( 日 w d r l 基因的序列分析、表达、和功能研究 第一章引言和文献综述 1 1 骨骼肌发育 哺乳类动物骨骼肌( 除头部外) 都起源于体节 1 】。体节是位于神 经管和脊索旁暂时存在的致密化轴旁中胚层细胞。骨骼肌细胞生成经 历三个阶段：首先肌肉的祖先细胞决定成为成肌细胞；成肌细胞增殖 和迁移；分化成成熟的肌细胞。在第一阶段，胚胎体节中的一部分中 胚层细胞产生成肌细胞；体节的其它细胞也产生其它组织如骨组织和 皮肤的结缔组织。来自中轴结构( 包括神经管，脊索) 【2 】，侧面中胚 层和背侧外胚层的特异性信号对发育中的体节决定哪部分成为成肌 细胞起重要作用。成肌细胞虽然已定型为肌细胞，但尚未分化。可以 说成肌细胞已经决定。比如，将要形成肢体肌肉的成肌细胞从生肌节 迁移至发育中的肢芽。在此细胞排成行，停止分裂相互融合形成合胞 体细胞，合胞体细胞含有许多核，但共有一个胞质，并分化成肌肉。 这种多核的骨骼肌细胞称为肌管【3 】。在细胞融合的同时，对肌肉发育 和功能必需的基因表达大幅度增加。位于生肌节背侧和中线区域的成 肌细胞并不发生迁移，它们形成躯干部位的肌组织细胞。 因此总的来说，一般可以把骨骼肌分化分为4 个阶段：首先，成 肌细胞定向到分化途径，以表达m y o g e n i n ( m y g ) 为标志，此时细胞 仍能从头合成d n a ，即有增殖能力；然后，细胞不可逆地退出细胞周 期，以表达p 2 1 为标志，此时已不能合成d n a ；进而，成肌细胞发生 硕士学位论文 表型分化出现肌特异性标志，如肌球蛋白重链m m c ) ；最后，分化的 肌细胞发生融合，形成多核肌管。 1 。1 1m y o d 家族生肌调节因子 在骨骼肌的发育过程中，生肌调节因子起到了很重要的作用。四 种生肌调节因子_ m y o d ，m y f 5 成肌素和m r f 4 都是碱性螺旋一环一 螺旋( b a s i ch e l i x - l o o p h e l i x ，b h l h ) d n a 结合转录因子家族的成员【4 】。 这些蛋白的中心区，即d n a 结合碱性区及靠近它的h l h 功能域，介导 二聚体形成。中心区的两边是启动功能域。这四种蛋白统称为生肌调 节因子【5 】( i v i r y s ) ，b h l h 蛋白可形成同二聚体或异型二聚体，结合 于d n a 保守序列的6 个碱基c a n n t g ( 称为e 框，eb o x ) 。这一序 列存在于基因组的许多部位( 每2 5 6 个核苷酸就有一个e 框序列) 6 】。 因此必须有某种机制以保证m r f s 特异性调节肌肉特异性基因，而不 是调节存在于其它转录调控区域的含有e 框序列的基因。以m y o d 为例子来说明如何实现这一生肌特异性。m y o d 与另外一种b h l h 蛋 白( e 2 a ) 结合成异型二聚体时，其对d n a 的亲和力是它以同型二 聚体存在时的l o 倍。在形成氮成肌细胞时，m y o d 与e 2 a 形成异型 二聚体。e 2 a 和m y o d 对c 3 h 1 0 t 1 2 细胞的成肌转化都是必需的。 e 2 a 和m y o d 的d n a 结合功能域很相似，但氨基酸顺序不完全一样。 这两个蛋白都能识别d n a 的e 框序列。但是，e 2 a 也在其它组织表 达，因此对e 2 a 的需要不足以实现成肌特异性。 1 1 2 肌肉增强子结合因子和生肌调节因子 只有当2 个或多个m y o d 分子结合于多个e 框序列时，m y o d 才 w d r l 基因的序列分析、表达、和功能研究 能激发转录。这种多部位的结合相互协同。虽然大多数肌肉特异的增 强子上都有多个e 框序列，但这种现象也存在于促进其它组织基因特 异性表达的增强子。所以，对于多个e 框和e 2 a 的需要都不足以实 现成肌特异性。成肌特异性的实现依赖于不同转录因子在不同的转录 调控位点上的组合。事实也证明如此：研究发现所有m r f s 的b h l h 功能域的特异氨基酸介导m r f e 2 a 复合物特异性结合于另一家族的 d n a 结合蛋白，即肌肉增强子结合因子( m e f s ) 7 ，8 1 ，而实现成肌 特异性。首先，发现m e f s 以同型二聚体的形式结合于肌肉特异性的 增强子上，后来，证明m e f s 属于m a d s 转录因子家族( m a d s 是 这一家族首先被发现的四种因子的首字母组合) 。除了含有n 端的 m a d s 功能域外，这些蛋白在m a d s 功能域的c 端有一短串氨基酸 称为m e f 功能域 9 】，和一个c 端转录启动功能域。由于以下两个原 因，m e f s 是与 v i r e s 相互作用的最佳候选蛋白。首先，很多肌肉特 异性基因含有m e f 和m r f 识别序列；其次，虽然m e f s 不能诱导 c 3 h 1 0 t 1 2 细胞成肌性转化，却能增强m r f s 的这一功能。这一增强 作用需要m e f 和m r f e 2 a 异二聚体之间直接的相互作用。这些不 同转录因子之间的相互作用需要m e f 同型二聚体的m a d s 和m e f 功能域，也需要m r f - e 2 a 异型二聚体b h l h 功能域的成肌特异性氨 基酸。m r f - e 2 a 复合体结合d n a 的晶体分析提示，这些特异性氨 基酸藏于d n a 的大沟中，不能与m e f s 直接接触。因此，似乎是这 些氨基酸使m r f - e 2 a 二聚体的其它区域具有特别的构象，从而特异 性地与m e f s 相互作用。值得注意的是，虽然m ：i _ f s 和m e f s 这两种 硕士学位论文 转录因子都能单独结合于d n a 上特异的序列，识别其中一种蛋白的 d n a 序列就足以作为组装m r f e 2 a - m e f 复合体的平台 7 】。这一发 现提示，这些因子所识别的d n a 序列的不同构型可能驱使高水平的 肌肉特异性基因的表达。确实如此，一些肌肉特异性基因含有b h l h 结合位点( e 框) ，其它肌肉特异性基因含有m e f 结合位点，另一些 可能含有这两种蛋白的结合位点。m r f s 只在发育的肌肉表达 9 ，1 0 】， 而m e f s 也在其它组织表达，包括发育中的中枢神经系统。 1 1 3 生肌调节因子与其它因子的相互作用 实验证明，i d ，t w i s t ，l - m f ，f g f 2 ，t g f p ，p k a ，p k c ，r b ( 成视网膜细胞瘤) 蛋白，c y c l i n c d k 复合物等对m y o d 家族成员 具有负调节作用 1 1 。目前，实验证明有两种机制来解释t w i s t 对肌肉 发生的抑制作用：一是t w i s t 与e 一蛋白竞争，与生肌决定因子形成二 聚体，从而抑制了生肌决定因子与d n a 的高活性结合；二是t w i s t 直接干扰e 2 f 生肌决定因子复合体的形成 1 2 】，从而抑制生肌决定因 子的转录激活作用。果蝇中t w i s t 基因的作用与脊椎动物不n 1 3 ，其 体节肌肉的发生需要高水平的t w i s t 表达。i - m f 可以在生骨节中高度 表达，组织生肌作用的发生，其作用方式为：通过修饰m y o d 核定位 信号使之保留在细胞质中；干扰生肌b h l h 的转录因子的d n a 的结 合活性。 i d 蛋白可以与生肌决定因子形成异源二聚体，阻止它们与d n a 结合。目前，虽然钙依赖的钙调磷酸酶( c a l c i u m d e p e n d e n tp h o s p h a t a s e c a l c i n e u r i n ) 的下游效应分子并不十分清楚，但已经有实验证明其在 w d r i 基因的序列分析、表达、和功能研究 肌肉发生早期起着重要的作用：在转录水平上，钙及其钙调磷酸酶能 调节m y o g e n i n 的表达，而且能激活e r g l ，通过e r g l 对i d 的抑制 来解除i d 对m y o d 的抑s r j 1 3 ，1 4 ，1 5 1 ，间接激活m y o d 的表达。 1 1 4 生肌调节因子和肌肉增强子在成肌不同阶段的作用 表达四种m r f s 中的任意一种都可以诱导c 3 h 10 t 1 2 细胞在体 外向肌肉细胞分化。这些蛋白质在完整动物正常成肌过程中的功能已 经通过基因剔除实验进行了研究。研究表明：在细胞融合之前就有 m y f 5 1 9 和m y o d 的表达【1 6 ，1 7 】，并且它们之间的功能是可以相9 2 , b 救的，而成肌素只有在细胞融合形成合体细胞，分化形成肌管时才表 达 1 8 ，1 9 。由此可以得到以下结论：m y o d 和m y f 5 具有选择发育中 的体节细胞成为成肌细胞的功能，即在正常成肌过程中，成肌细胞的 决定需要m y o d 和m y f 5 ，然而，成肌细胞向肌管的分化需要成肌素。 m r f 4 在发育的晚期表达，可能在肌肉细胞的维持中起作用。对于 m e f ，科学家用只表达一种m e f 基因的果蝇做实验，以确定m e f s 在肌肉发育中的作用。发现m e f 基因缺失的果蝇虽然成肌细胞形成 正常，但无分化的肌肉形成。因此，分化而不是决定需要m e f s 。 1 1 5 成肌细胞的最后分化 己决定的但尚未分化的成肌细胞能够对胚胎发育中调节细胞增 殖( 细胞数目) 和细胞迁移( 肌肉的精确定位) 的细胞外信号作出反 应。相反，分化的肌肉细胞，即肌管，对这样的信号却无反应。在体 外的实验中，已经发现几种特异的因子，促进或抑制肌生成中的分化。 在筛选与m y o d 相关的基因时，发现了一种可形成螺旋二聚体结构的 硕士学位论文 蛋白。这一蛋白质缺乏d n a 结合碱性区，因此不能结合到d n a 的e 框序列。但它可以与m y o d 和e 2 a 相互作用，从而抑制m y o d e 2 a 异型二聚体形成和其高亲和地结合d n a 口因此，这一蛋白质被称为 i d ( i n h i b i t o ro fd n ab i n d i n g ) 。增生的氮成肌细胞表达m y o d ，e 2 a 和 i d 。分析其d n a 表明：编码肌肉特异性蛋白，肌酸激酶，基因启动子 上m y o d 结合部位( 或e 2 a 结合部位) 2 0 并不被占据。这可能反映 了无活性m y o d i d 或e 2 a - i d 复合物的形成，提示i d 能在增殖生长期 维持细胞处于决定状态。当这些细胞被诱导分化为肌肉时，( 如撤除 含有增殖生长所需的生长因子的血清时) ，i d 浓度下降。结果， m y o d - e 2 a 二聚体形成，并结合于驱动氮成肌细胞向肌管分化的目的 基因。由此可见，转录因子与不同的配偶体形成二聚体不仅调节其结 合于d n a 的特异性和亲和性，也能彻底阻断其结合 2 0 1 。 肌肉细胞的分化除了受上述抑制性蛋白影响外，还受细胞周期蛋 白和c d k s 的控制。它们共同控制着成肌细胞的决定状态向分化状态 的转折。研究发现：某些细胞周期蛋白一c d k 2 1 蛋白激酶抑制因子 在细胞培养中能诱导肌肉分化。并且，在体内分化的肌肉中这些抑制 因子表达明显上调。相反，将编码细胞周期蛋白d 1 的d n a 在其固 有活性启动子控制下转入正常情况下分化的成肌细胞，其分化将会受 到抑制。 1 1 6 小结 骨骼肌肌肉的发生是一个受到多种生长因子、生肌决定因子及其 它转录因子和细胞内钙信号等复杂的调控网络影响的结果，例如 w d r l 基因的序列分析、表达、和功能研究 m y o g e n i n 基因的表达在转录水平上受到m a p k ( 丝裂原激活的蛋白 激酶) 信号通路、c a 2 + ，c a m 依赖的蛋白激酶信号通路、钙调磷酸酶 信号通路的调节，m y o g e n i n 启动子附近的3 个顺式作用元件( e b o x ， m b f 2 ，m e f 3 ) 与此3 条途径相关，此3 条途径的作用是平行但并非冗 余的，任何一种信号的抑制都会降低或消除m y o g e n i n 的表达及随后 分化事件的发生，此外，生肌调节因子m y o d 与e 蛋白形成的二聚 体，也受到p 3 8m a p k 的影响。 1 2m a p k 信号转导途径 有丝分裂原活化蛋白激酶( m a p k ) 信号途径是细胞信号转导过 程的重要组成部分。目前的研究表明，在细胞水平上，m a p k 将g 蛋白耦联的受体等膜转导蛋白与其细胞内的关键调控靶蛋白联系起 来，从而介导胞外的多种信号，如胰岛素信号、表皮生长因子等，并 将这些信号级联放大后传递给相应的下游因子，通过激活包括s r e 、 e l k - 1 、c - j t m 、c 1 0 s 、m e f 2 、a t f 2 ，p 5 3 等在内的多种转录因子 【2 2 ，2 3 ，2 4 1 ，最终开启细胞特定功能基因的表达。同时它还可以对多种 化学或生理性的压力作出反应，从而调控细胞的生存及对外界的适应 能力。在个体水平，m a p k 信号途径涉及了包括肌肉和神经系统在 内的多种组织器官的发育过程。而且，研究发现它的激活或者抑制与 系列的病理反应相关，包括慢性炎症、心肌肥大、糖尿病及癌症治 疗的副反应等。对于许多基因来说，整体水平的调节方式也与细胞水 平的作用方式存在很大程度的相似性，因而，阐明m a p k 信号途径 在细胞层次的作用对于研究它与骨骼肌肌肉发育的关系是必要的。 硕士学位论文 1 2 1m a p k 家族 哺乳动物的m a p k 家族至少包括4 个亚类：胞外信号激酶 ( e r k l 2 ) ，j u n 氨基端激酶( j n k l 2 3 ) ，p 3 8 蛋白( p 3 8 a 1 3 7 5 ) 和 e r k 5 。其中j n k 和p 3 8 又被称为刺激激活蛋白激酶( s t r e s s a c t i v a t e d 蛋白激酶，s a p k ) 。每一种m a p k 的激活由一个三层的磷酸化级联放 大反应完成。该反应链包括m a p 激酶( m a p k ) 丝氨酸苏氨酸 激酶、m a p k 激酶( m a p k k ，m k k 或m e k ) 识别苏氨酸一x 一 酪氨酸的双特异性激酶和m a p k k 激酶( m a p 豳姒或m e k k ) 。在 特定的外界刺激下，被活化的m a p k k 激酶可激活m a p k 激酶，后 者随之激活m a p k ，使其磷酸化一系列特异性靶蛋白，包括各种转录 因子及m a p k 激活性蛋白激酶( m a p k a p k ) 2 2 ，从而形成_ 连串 逐级放大的磷酸化反应。每一种m a p k 分别由特异性的m a p k 激酶 激活，如m e k l 2 通过磷酸化苏氨酸一谷氨酸一酪氨酸位点激活e r k l 2 ， m k k 3 6 通过磷酸化苏氨酸一甘氨酸酪氨酸位点激活p 3 8 蛋白， m k k 4 7 ( j n k k l 2 ) 通过磷酸化苏氨酸一脯氨酸一酪氨酸位点激活 j n k ，m e k 5 激活e i 5 ；而每一个m a p k 激酶却可以被一种以上的 m a p k k 激酶活化，使得同一种m a p k 能响应不同的胞外刺激 2 4 】， 这样就形成了一个复杂多样化的m a p k 信号网络。如图1 1 肋尺- 基因的序列分析、表达、和功能研究 a 姻嘲铂薯| 蝴 曩 口 号 融懒d 澍雠n t l | 赫l 飘翮晦彰醐臼钠盼副地秘 善喜 i 譬嚣舞m 慧 m 淼氐勘岔 燃 ii 黼麴嘏协叠j c 瓴鹣 ” i 1 i 毒3 喜 裟 蚺淄 嘲婚射燃蠛粼髓 3喜雾3 3 | 一豪鬻蝴喋一一举瓣 扩秘帆辆m 静2 c 坤粥曲d 科啦a 2 霸 取留咪嗍甑 翰1 薯弹l 确魄强甜黼椭 陬a t i g , 2 铙- l 。螂哮 翻陷瑚潮 秘捌鼍饼萨轴糯斛复 取- l 。蹶酝隅醵e 终 幽瞪婚。国时科眠棚韩鲥科嘲戮l a 1 翻陶，韬附钟期知霸确_ ， 棚暇钎翻哇细睇随翻堋黼| 如睁懈翻掬翻蝻 图1 - 1 姒p k 信号转导途径的四种主要途径 1 2 2g a p k 信号途径的主要通路 1 2 2 1e r k 这是脊椎动物中克隆的第一个m a p k 途径，也是阐述最完全的 经典途径。e r k 信号途径主要通过在细胞核中激活转录来对生长因 子和有丝分裂原信号做出响应。e r k l 2 是研究得最多的m a p k ，它 们的激活起始于该途径的m a p k k k l r a f 激活m e k l 2 ，而后者 随之激活e r k l 2 。依据不同胞外刺激，e r k 激酶可使一系列特异性 底物磷酸化，包括转录激活因子p 9 0r s ks 6 激酶 2 3 】、 m a p k a p k 1 、磷脂酶a 2 、s o s 、m s k 、转录因子叫l k 1 、e t sl 、 口 硕士学位论文 s a p la 和m m y c 等、s t a t ( s i g n a lt r a n s d u c e r sa n da c t i v a t o r so f t r a n s c r i p t i o n ) 蛋白s t a t 3 、生长因子受体表皮生长因子受体( e g f ) 和雌激素受体 2 4 。在介导细胞分裂、迁移和生存等方面，e r k 信号 传导途径起到了重要的作用。 1 2 2 1 2 激活因素及上游分子的募集 e r k 途径的激活多由细胞表面受体激活引发。这些受体包括： 生长因子酪氨酸激酶受体( e g f 受体、p d g f 受体、胰岛素受体) 、 细胞因子受体、t c r 、c d 2 8 、b c r 、g 蛋白偶联受体等等。e r k 途 径最主要的激活信号来自酪氨酸激酶受体。以e g f 受体为例，自身 酪氨酸磷酸化激活之后，接头分子s h c 通过其p t b 结构域结合于受 体特定的磷酸化酪氨酸上，被受体激酶磷酸化 2 5 】。s h c 磷酸化激活 后，又通过其s h 2 结构域结合另一接头分子g r b 2 。而g r b 2 已通过其 s h 3 结构域与s o s ( 鸟昔酸交换因子) 稳定结合。这样，受体自身磷 酸化激活就召集了s o s 分子。s o s 与受体的结合使质膜r a s g d p 转换 为r a s g t p ，r a s 分子与m k k k r a f l 相作用，激活了e r k 级联反应途 径 2 5 ，2 6 。见图l 一2 没有激酶活性的细胞因子受体通过召集胞内激酶如l c k 、f y n 、 l y n 使自身磷酸化，引发相同的反应，通过r a s g t p 这个重要分子激 活e r k 途径。j a k 也可以激活此途径。目前发现，j a k 的作用体现 在两个水平：磷酸化s h c 接头分子、直接磷酸化m k k k 。这些上游 分子的募集对于不同信号激活m a p k 途径是非常重要的。但也并不 是所有的e r k 途径都必需r a s 的参与，最近的一项研究表明，在i l 3 w d r l 基l 灭i 的序列分析、表达、和功能研究 依赖的小鼠前b 细胞株b a f 3 中，4 2 * ( 2 热击可以激活一条未知的不需 要r a s 激活的e r k 途径，这同时也证明e r k 途径也可以介导一些应 激刺激信号。 细胞因吊 受绺 g 铷阮绷融辩r 主舅l o 髓 图卜2e r k 通路的上游分子的募集 1 2 2 1 4 作用底物 由于e r k 激活之后可以转位入核，e r k i 2 的底物也分别定位于 胞质中、核中。胞质中：e r k i 2 苏氨酸磷酸化激活p 9 0 r s k 激酶 2 6 】。 p 9 0 r s k 随后转位入核，磷酸化c f o s ( s e r 3 6 2 ) 。同时磷酸化抑制g s 瞄 活性，减弱了g s k 3 对c j u n 的负调作用，放大了e i 的信号。磷酸化 激活磷脂酶a 2 ，加速其催化反应( 类二十烷酸合成中的限速步骤) 的进行，提高了参与细胞了许多重要的生理现象的调节分子一花生四 硕士学位论文 烯酸的合成。e r k l 2 还可以磷酸化抑制途径上游分子。它们包括：e g f 受体、r a s 交换因子s o s 、r a f - 1 、m e k 。这些分子都参与了对e r k 的调节，e r k 对它们的影响体现了一种负反馈机制。核中：e r k l 2 核 中的底物多为转录因子。它转位入核磷酸化激活的转录因子包括：e l k l , e t s l 、s a p 、c m y c 、t a l 、s t a t 。而对m y b ，则发挥抑制作用。 在这里，简单介绍一下e t s 转录因子家族，它的许多成员都是m a p k 途径的重要底物。在对r a s r a f m a p k 途径的研究中，e t s 家族不 断有新成员被发现 2 7 】。这是一个非常古老的转录因子家族，和m a p k 途径一样进化保守。 这个家族所有成员的共同点是拥有一个e t s 结构域，负责与d n a 序列以单体形式相结合。e t s 结构域形成一仰h t h 结构，识别并结合 核心区为g g a a t 的1 0 碱基序列，称之为e b s 。根据e t s 结构域构象 和位置不同，e t s 家族分为多个亚家族。( 见图1 3 ) 。它们都具有n 端保守调控区n c r ，m a p k 正是通过磷酸化n c r 中一个t h r 残基，特 异性地激活e t s 。e t s 转录因子家族激活后对特定基因表达的调节是 通过与其它种类的转录因子在d n a 元件上形成某种特异的复合物实? 现的。目前已发现有多种此类复合物，例如：e b s 位点结合的“e t s a p 1 ”复合物 2 8 】，s r e 位点结合的“s r f - - t c f ”复合物，组织 特异的r a s 反应元件结合的“e t s 。l - - p i t - 1 ”复合物等等 e t s 转录因子家族在m a p k 信号途径下游发挥着非常重要的作 用，它的许多成员都与细胞转化相关，并关系到人类的许多疾病。这 也从侧面反应了m a p k 途径的重要性。 1 2 w d r l 基因的序列分析、表达、和功能研究 p e t s 1 厂= l 。 ll 图1 3e t s 家族成员与其它转录因子协同作用 1 2 2 1 5e r k 途径功能 培养细胞中，e r k 途径与细胞的增殖相关，但e r k 途径对增殖 促进或抑制，因细胞而异，因它在不同的细胞环境中激活的基因而异。 在一些特定的细胞中，e r k 途径还可以介导分化信号，p c i 2 细胞中， 神经生长因子n g f 诱导的m e k l 和e r k 2 分子的持续激活可诱导细 胞分化，同样在p c i 2 细胞中，生长因子e g f 和神经因子n g f 都可 以激活e r k 途径。e r k 途径还参与了细胞周期调节 2 5 ，2 6 。c y e l i n d 1 的转录依赖于e r k 的持续激活和核内滞留。在中国仓鼠卵巢细胞 中，e r k l 2 在g 1 期和m 期被激活，并定位于微管组织中心，但它 的下游底物还未发现。e r k 途径的激活可以抗凋亡目前已发现途径 两个成员与凋亡相关：e r k 与b r a f o 在l 9 2 9 细胞中，e r k 的激活 硕士学位论文 削弱了t n f q 诱导的凋亡信号。在j u r k a t 细胞中，它的激活又对抗 了f a s 诱导的凋亡信号，但这种对抗很弱，而且很快就被凋亡引发的 r a f t 降解削弱了 2 7 】。小鼠基因敲除实验证实b - r a f 是血管系统发育 的关键分子，它的功能推测为保护成熟的红细胞抵抗凋亡。 1 2 2 2j n k j n k l 2 3 主要是对热激、渗透压、前炎症因子、缺血和紫外线辐 射等各种刺激信号及生长因子和细胞周期蛋白做出反应 2 8 ，2 9 ，3 0 。 r h o 家族的g 蛋白叫a c ，r h o 和c d c 4 2 s 可以激活这一途径中的各 种m a p k k k ，包括m e k k s1 - 4 ，a s k 和一种m l k 1 7 。j n k 以二 聚体的活化形式转移到核内，激活一系列靶蛋白的表达。其中包括转 录因子一c j u n 、a t f 一2 、e l k - 1 、m y c 和s m a d 3 、肿瘤抑制因子p 5 3 、 n f a t 4 、d p c 4 和m a d d 及细胞死亡蛋1 刍 3 1 ，3 2 】。与可以同时作用 于细胞质和细胞核的e r k 和p 3 8 不同，j n k 磷酸化的底物主要是转 录因子。这一途径的激活对于细胞的生存和凋亡、后生动物发育过程 中的细胞命运决定、肿瘤发生及炎症过程都有重要影响。 1 2 2 2 1 激活因素及上游分子的募集 这条途径可被多种应激因素激活：热击、丫射线导致的d n a 损伤、 过氧化物体的产生、高渗等等。同时，和e r k 途径一样，它也可被 多种类型的细胞表面受体激活：t n f 受体家族、g p c r 、酪氨酸激酶 受体、细胞因子受体都可激活j n k 途径。更多的激活因子仍在探索 中。 r a s 对j n k 途径的激活只可达到1 3 。而其它小分子量g t p 结合蛋 1 4 w d r l 基因的序列分析、表达、和功能研究 白家族成员r a e 和c d e 4 2 却是j n k 途径的强激动剂 2 8 ，2 9 ，它们也 可与r a s 相协同，最大限度地激活j n k 途径。实验证实，舒缓肽等g 蛋白偶联受体可以激活c d c 4 2 ，生长因子酪氨酸激酶受体e g f 可激 活r a c ，r a c 结合并激活下游分子p a k 6 5 p a k l ( m k k k ) ，传递特异 信号。 1 2 。2 2 3 作用底物 j n k 对底物具有双重识别机制。首先和其它m a p k 一样，它 识别底物的“s e r t h r - x - p r o 模序并将其磷酸化。j n k 和e r k 不同之处还在于它没有胞质底物，它的底物均为核内的转录因 子。它们是：c j u n 、a t f 2 、e l k - 1 、p 5 3 、d p c 4 、n f a t 4 。 以c j u n 为例，j n k 磷酸化它的s e r 6 3 和s e r 7 3 ，增强了j u n j u n 同源二聚体和j u n a t f 2 异源二聚体的形成 31 】，也增强了c j u n 抗泛肽降解的能力。因此，j n k 不仅可以激活转录因子，而且可 以提高它们的稳定性，从而促进目的基因表达。但也有相反的情 况。j n k 磷酸化转录因子n f a h 抑制其入核发挥作用。证据是 其磷酸化位点的突变，可以使n f a t 4 持续性激活，并滞留于核 内。 1 2 2 2 4 删【途径功能 生长因子缺乏、应激刺激、d n a 损伤、凋亡因子f a s 在细胞 表面的连接引发的凋亡信号都有j n k 途径的参与。对途径中关键 分子如m k k 一4 、c j u n 3 2 功能的干扰可以在某种程度上抵抗凋 亡。 硕士学位论文 在一些情况下，y n k 途径也参与细胞存活和生长调节，b a f 3 前b 细胞中，j n 途径与i l 3 诱导的细胞增殖有关。t 9 8 g 细胞中， 它又参与了对d n a 损伤的修复。另有证据表明，在t 细胞中， j n k 途径的激活和t c r 与c d 2 8 的信号整合相关。两个受体的共 同作用激活了j n k 途径，参与细胞因子i l 2 表达调节。 1 2 2 3p 3 8 p 3 8 信号途径一般由环境刺激所激活，包括热激、渗透压、氧化、 致电离辐射、缺血导致的血管压力，也可响应来自细胞因子和 t n f ( t u m o rn e c r o s i sf a c t o r ) 受体的的信号转导。g t p a s e 叫a c ，r h o 和c d c 4 2 s 可以转导这些刺激来激活p 3 8 信号途径的m e k k s , m l t c s ( m i x e d 1 i n e a g ek i n a s e s ) 和a s k l 3 3 。该途径的磷酸化底物包括热激 蛋i 兰l ( h s p ) 、m a p k a p 一( 2 3 5 ) 、a t f 2 和s a p l a 3 4 】s t a t l ，m a x m y c c o m p l e x e s ，m e f 一2 a c ，e l k - 1 和c r e b 、c h o p 3 5 ，3 6 ，3 7 。 1 2 3e z t p k 通路发挥生肌促进作用 成肌发生是一个多步骤的过程，其中主要是中胚层细胞起着影响 分化和改变表型的作用，包括延伸、分化和融合并最终导致有功能性 肌肉的形成。科学家们经过近2 0 年的探索，终于鉴定了两个与肌肉发 生的转录因子家族 3 8 】，生肌调节因子沁s ) 和肌肉细胞增强因子眦 e f s ) ，在哺乳动物中，m r f 包括m y o d 、m y o g e n i n ，m y f 5 和m r f 4 h e r c u l i n m y f 6 3 8 ，这些生肌调节因子可以转激活肌肉特异性基因的表 达，除此之外，m e f 2 家族成r 员( m e f 2 a ，b ，c 和d ) 通过与m r f s 协同作 用结合于肌肉特异性基因的启动子区域而引起成肌发生 3 9 】。 w d r l 基因的序列分析、表达、和功能研究 许多细胞外因子可以调节m i 讧s 和m e f 2 的表达，如信号转导分子 有丝分裂原激活蛋白激酶( m a p k s ) ，包括细胞外信号调节激酶 ( e r k i 和2 ) ，j u n - n 端激酶( j n k l ，2 ，和3 ) 及p 3 8 的各种异构体 1 3 ，7 和 d 。许多研究 i e l j f j p 3 8m a p k 在肌肉生成过程中的必要作用 4 0 】。p 3 8 的 上游激活因子m k k 6 在大部分骨骼肌细胞中是过量表达的，而且p 3 8 的转录本7 形式在这个组织中也是高度表达的。更有甚者，p 3 8 各转录 本和上游激活因子的过量表达可以导致生肌标记基因的表达上调，增 强肌肉报告基因的活性并加速肌管的形成。在缺失p 3 8m a p k 活性的 横纹肌肉瘤细胞中，强制进行p 3 8 1 拘诱导可以恢复m y o d 的功能并可以 增强m e f 2 的活性，并最终导致