（动物遗传育种与繁殖专业论文）鸡多趾候选基因的SNPs及表达差异研究.pdf

四j l i ；托, il , 大学博上学位论文 摘要 摘要 多趾存在于少数鸡种中，便于实验操作和观察，是研究肢体发育过程中基因之间 年 | 互作用的极好材料。参考人和鼠多趾相关基因间的相互作用以及多趾同源区间，我 们将e n 2 , s h h 、l 用b r l 、t t l x b 9 和6 1 i 3 基因作为鸡多趾研究的候选基因，寻找与多趾 有关的s n p s ，并检测候选基因表达上的差异，希望揭示候选基因间的相互作用并阐 明鸡多趾形成的原因。 s n p 搜寻所用实验材料共6 组，有丝羽乌骨鸡( 五趾) 、a 系肉鸡( 四趾) 、四趾 菊花鸡、五趾菊花鸡、四趾北京油鸡和五趾北京油鸡。每组选5 个个体对候选基因进 行p c r 后分6 组混合回收产物并测序比对，在五个候选基因的外显子、内含子保守 区以及l m b r l 的5 上游区寻找能严格区剐四趾和五趾表型的s n p s 作为趾型相关 s n p s 。结果显示这五个候选基因的外显子相当保守，只发现l m b r l 外显子1 6 的一处 c t 变异和g h 3 外显子1 5 的g a 变异，没有造成氨基酸改变，但测序比对或s s c p 筛查排除了它们与趾型的关系。在候选基因的内含子保守区我们只发现l m b r l 的内 舍子5 有一处c a 变异与趾型相关，定位在c h r 2 ：7 9 0 1 5 8 6 b p 。所有的四趾鸡该位点都 为c ，所有的五趾鸡该位点都为a n 。对菊花鸡、北京油鸡、c a u 资源家系( 由a 系肉鸡和丝羽乌骨鸡建立) 共5 1 7 个体中进行了s s c p 群体分型，证实了这个s n i p 的确与趾型相关。在l m b r l5 上游区段的筛查中，我们从2 6 处变异中筛查出6 处趾 型相关s n p ，并将这6 处s n p 定位在c h r 2 ：7 9 2 2 6 5 5 c h r 2 ：7 9 2 8 7 4 2 b p 之间。 在m a t l n s p e c t o r 网上预测中，l m b r l5 上游的6 处s n p 中有3 处改变了同源异形 蛋白因子或胚胎形成有关的蛋白结合位点。l m b r l 内含子5 的变异至少改变了3 个同 源异形蛋白因子的结合位点，为其编码的h o x 基因家族在人和鼠多趾的发育与模式形 成中起着重要作用。预测结果也支持l m b r l 与趾型有关。 候选基因的表达研究采用白莱航( 四趾) 和丝羽乌骨鸡( 五趾) 的纯繁种蛋同批 孵化，选择同期发育的胚胎分为头、躯体和肢芽三部分提取r n a 。采用r t - p c r 法， 我们最早在l d ( 孵化2 4 小时) 检测到g l i 3 、l m b r l 和s h h 的表达，早于胚胎原位杂 韶川农业大学博士学位论文摘要 交最初可以检测到的时间25 d 3 d 。在l d 7 d 的胚胎都检测到这三个基因的表达，在 一些时期的表达存在强弱之分，但没有发现有和无的差别。 采用q p c r 方法检测到g l i 3 、l m b r l 和s h h 的表达量随时间而变。丝羽乌骨鸡 头部和躯体的6 1 i 3 在3 d 4 d 表达量较高( 4 d 最高，达7 1 8 倍) ，而肢芽g l i 3 的变 化4 i 大( 4 d 最高，为2 1 5 倍) ；4 5 d 后白莱航肢芽g l i 3 的表达快速上升达7 5 j 倍， 与头部和躯体( 变化不大，5 d 最高达2 5 4 倍) 以及丝羽乌骨鸡各部位的表达形成强 烈时比，重复实验得到相同的结果尚未见类似的报道。肢芽的l m b r l 和s h h 在两种 鸡随时间变化不大，尽管4 5 d 前l m b r l 在丝羽鸟骨鸡的头部和躯体表达量较高( 3 5 d 最高，达6 2 7 倍) 。 各基因的表达量在品种间也有差异。3 d 4 dg l i 3 在头部和肢芽都是丝羽乌骨鸡 高于白莱航，45 d 6 d 则是白莱航高于丝羽乌骨鸡；s h h 在肢芽各期的表达( 6 d 除外) 都显示出丝羽乌骨鸡高于白莱航，与躯体相反。而且总在6 1 1 3 增加较快时，国 下 降也快，呈现出对抗关系。4 d 6 d 这段时期正是鸡胚趾发育的关键时期，白莱航肢芽 6 1 i 3 在这期间快速上升，抑制了部分s h h 的表达，从而避免了五趾的形成。而丝羽 乌骨鸡这期间的s h h 的表达高于白莱航，可能有助于五趾的形成。 l m b r l 在两种鸡胶芽的表达差异不大，但我们在四趾和五趾鸡群中发现l m b r l 内 含子具有与趾型相关的s n p s ，预测能改变转录因子结合位点。结合l m b r l 在脊椎动 物七的定位、表达以及基因变异上研究，表明l m b r l 在鸡多趾的发育中也起着关键 作用可能通过改变转录因子结合位点来调节鸡趾型的发育。 控制鸡多趾的基因不止一个，g l i 3 通过表达量的变化、l m b r t 通过内含子的变异 都可能造成s h h 的异常表达从而产生多趾。 关键词：鸡多趾候选基因 s n p 表达 a b s t r a c t p o l y d a c t y l yi sac h a r a c t e ri ns e v e r a lc h i c k e nb r e e d s w h i c hi sag o o d m a t e r i a lt os t u d yt h ei n t e r a c t i o na m o n gg e n e si nt h ep r o c e s so f l i m bg r o w t h f o ri ti se a s yt oo p e r a t ea n do b s e r v a t e c o n s i d e r i n gt h ei n t e r a c t i o na m o n g p o l y d a c t y l yr e l e v a n tg e n e sa n dt h ep o l y d a c t y l yh o m o l o g o u sr e g i o ni nh u m a n a n dm o u s e ，w es e l e c t e de n 2 、s h h 、l m b r l 、h l x b 9a n dg 1 i 3a sp o l y d a c t y l y c a n d i d a t eg e n e si nc h i c k e n t h es n p sr e l a t e dt ot o e sa n dt h ed i f f e r e n c ei nt h e g e n e se x p r e s s i o nw e r ef o u n da n dd e t e c t e d ，i no r d e rt ou n c o v e rt h ef u n c t i o n s o fc a n d i d a t eg e n e sa n de x p l a i nt h em e c h a n i s mo fc h i c k e np o l y d a c t y l y t h em a t e r i a l su s e df o rf i n d i n g ( 5 - t o e d ) ，as t r a i no fb r o i l e r s ( 4 - t o e d ) ， s n p si n c l u d e ds i x g r o u p s ：s i l k i e s j u h u ac h i c k e n s ( 4 - t e o da n d5 - t e o d ) a n db e i j i n g y o u j ic h i c k e n s( 4 t e o da n d5 - t e o d ) w i t h5c h i c k e n sf r o me a c h g r o u p e x o n sa n di n t r o n c o n s e r v e d d o m a i n s ( i c d s ) o ff i v ec a n d i d a t eg e n e s ， a n d5 u p s t r e a mo fl m b r lw e r ea m p l i f i e ds e p a r a t e l y t h e ne a c hs e q u e n c e w e r ep u r i f i e da n dc o m p a r e db y6g r o u p st os e a r c hf o rt h es n p sw h i c hc o u l d s t r i c t l yd i s t i n g u i s h 4 - t o e df r o m5 - t o e d t h ee x o n so ft h e5g e n e sw e r e c o n s e r v a t i v ea n do n l yt w os n p sw e r ef o u n d o n es n p ( c t ) i ne x o nl6o f l m b r l t h eo t h e rs n p ( g a ) i ne x o n l5o fg l i 3m o r es e q u e n c e sc o m p a r i s o n a n ds s c pr e s u l t se x c l u d et h e i rr e l a t i o nt ot o e s b u ti ni c d s o n l yo n es n p ( c a ) i nl m b r li n t r o n 5w a sf o u n da n dm a p p e dt oc h r 2 ：7 9 0l5 8 6 b p ，c v a r i a t i o nc o r r e l a t i n gw i t h4 t o e da n dav a r i a t i o nc o r r e l a t i n gw i t h5 - t o e d w h i c hw a sc o n s i s t e n tw i t hs s c pt y p i n gr e s u l t sf r o m517d n a so fj u h u a c h i c k e n s ，b e i j i n g y o u j i c h i c k e n s c a ur e s o u r c er e f e r e n c e p o p u l a t i o n ( e s t a b l i s h e db ys i l k i e sa n das t r a i no fb r o i l e r s ) f r o mt h e5 u p s t r e a mo f l m b r t ，6o u to f2 6s n p sw e r ef o u n dr e l a t e dt ot o e s ，m a p p e dt o c h r 2 ：7 9 2 2 6 5 5 c l l r 2 ：7 9 2 8 7 4 2 b p a c c o r d o n gt oi n t e r n e tm a t i n s p e c t o rp r e d i c t i o n ，3o ft h e6s n p sc o u l d c h a n g eh o m e o d o m a i n f a c t o ro r p r o t e i nb i n d i n g s i t e st h a tr e l e v a n tt o e m b r y o g e n e s i s ：t h es n pi n t h ei n t r o n 5o fl m b r lc o u l dc h a n g et h r e e h o m e o d o m a i nt r a n s c r i p t i o nf a c t o r sb i n d i n gs i t e s t h e i rc o d i n gg e n e s ，h o x g e n ef a m i l y ，p l a yi m p o r t a n tr o l e s i nt h e a n t e r i o r - p o s t e r i o r a x i si nt h e d e v e l o p m e n to fp o l y d a c t y l yi nh u m a na n dm o u s e t h ep r e d i c t i o nr e s u l t s s u p p o r t e dt h ei n f l u e n c eo f l m b r li nt h ed e v e l o p m e n to ft o e s t od e t e c tt h ed i f f e r e n c e si nc a n d i d a t eg e n e s e x p r e s s i o n ，r n a sw e r e 四jj i 农业大学博士学位论文a b s t r a c t 篁i i 簟詈舅詈目鼍舅舅曼曼| 曼曼曼曼皇笪曼| 邕皇曼曼量詈量曼曼詈詈曼曼! ! 皇笪邕皇篡舅皇寰自笪皇孽! 曼! 皇 u s e d ，w h i c hw e r ee x t r a c t e df r o mh e a d s b o d i e sa n dl i m bb u d so fw h i t e l e g h o ne m b r y o s ( 4 - t o e d ) a n ds i l k i ee m b r y o s ( 5 - t o e d ) a tt h es a m es t a g e t h e e x p r e s s i o no fg 1 i 3 ，l m b r la n ds h h w a si n i t i a l l yd e t e c t e di n1d ( 2 4 h i n c u b a t i o n ) b vr - t _ p c r ，a h e a do ft h ef i r s td e t e c t a b l et i m e2 5 d 3 di n w h o l e m o u n ti ns i t uh y b r i d i z a t i o n t h et h r e eg e n e sw e r ea l le x p r e s s e di n 1d - 7 d d i s t i n c ti ns o m es t a g e sa n dw e a ki no t h e rs t a g e s t h ee x p r e s s i o no fg l i 3 、l m b r la n ds h hv a r i e dw i t ht i m ei ns i l k i e s 。g ：l i 3 e x p r e s s i o nw a sh i g h e ri nt h eh e a d sa n db o d i e s ( 4 du dt o7 18t i m e s ) t h a nl i m b b u d s ( 4 d u pt o2 15t i m e s ) i nw h i t el e g h o r n s g 1 i 3e x p r e s s i o ni nt h el i m b b u d sa f t e r45 dr o s er a p i d l yu pt o7 5 5t i m e s ，f o r m i n ga s h a r pc o n t r a s tt ot h o s e o ft h e i rh e a d sa n db o d i e s ( 1 i t t l ev a r i a t i o n ，5 du dt o2 5 4t i m e s ) a sw e l la s t h r e e p a r t so ft h e s i l k i e si n t e n s i v e l y r e p e a t e d e x p e r i m e n t sg o tt h es a m e r e s u l t s t h e r eh a sb e e nn os u c hs i m i l i a rr e p o r tu n t i ln o w l m b r la n ds h hi n l i m bb u d so ft w ob r e e d sv a r i e dl i t t l ew i t ht i m e a l t h o u g hl m b r lr e a c h e d h i g h e r ( 3 5 du pt o6 2 7t i m e s ) i nt h eh e a d sa n db o d i e so fs i l k i e sb e f o r e 45 d t h ee x p r e s s i o no ft h r e eg e n e sw a sa l s od i t i e r e n tb e t w e e nt h et w ob r e e d s t h ee x p r e s s i o no fg l i 3i nt h eh e a d sa n di i m bb u d sw a sh i g h e ri n3 d 4 da n d l o w e ri n4 5 d 6 di ns i l k i e st h a nt h a ti nw h i t el e g h o r n s t h ee x p r e s s i o no f s h hi nt h el i m bb u d sw a sh i g h e ri ns i l k i e st h a nt h a ti nw h i t el e g h o r n s ( e x c e p t6 d ) ，w h i c hi s i nr e v e r s et ot h a to ft h eb o d i e s w h e ng f ? 3r o s e r a p i d l y ，跏j c 2 d e s c e n d e d q u i c k l y a l lt h e t i m e ，p r e s e n t i n ga n t a g o n i s t i c r e l a t i o n s h i p 4 扎6 di st h ec r i t i c a ls t a g eo ft o ed e v e l o p m e n ta tt h ev e r yt i m e ， h i g h e rg l i 3a n dl o w e rs h he x p r e s s i o ni nt h el i m bb u d so fw h i t el e g h o r n s m i g h ta v o i df o r m i n g5 - t o e d ，w h i l eh i g h e rs h ha n dl o w e rg l i 3i nt h el i m bb u d s o fs i l k i e sm i g h th e l pt of o r m5 - t o e d t h el i t t l ee x p r e s s i o nd i f f e r e n c eo fl m b r li nt w ob r e e d sa n dt h es n p si n t h ei n t r o n so fl m b r lr e l a t e dt ot o e s ，l i n k i n gu po t h e rs t u d i e so nl m b r li n o r i e n t a t i o n ，e x p r e s s i o na n dv a r i a t i o ni nv e r t e b r a t e ，i n d i c a t e dt h a tl mb r lw a s ak e yg e n ei nc h i c k e nt o e sd e v e l o p m e n t ，l i k e l yt or e g u l a t et o e sg r o w t hb y c h a n g i n gt h eb i n d i n gs i t e so f t r a n s c r i p t i o nf a c t o r s c h i c k e np o l y d a c t y l yi sf o r m e db ye x t r as h he x p r e s s i o n ，w h i c hc a nb e a r o s eb yt h ee x p r e s s i o nq u a n t i t yo fg l i 3o ri n t r o nv a r i a t i o no f l m b r l k e yw o r d s ：c h i c k e np o l y d a c t y l y c a n d i d a t eg e n e ss n p e x p r e s s i o n i v 叫川农业大学博士学位论文 缩略词 缩略词 a c h p a c h e i r o p h i a ，无手无脚疾病 a e r a p i c a le c t o d e r m a lr i d g e ，外胚层项脊 a pa x i sa n t e r i o r - p o s t e r i o ra x i s ，前一后轴 b h l h b a s i c h e l i x l o o p h e l i x ，碱性- 螺旋- 环- 螺旋结构 b m p b o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n 骨骼成形蛋白 c d s c o d i n gs e q u e n c e ，编码序列 c s n p s i n g l e n u c l c e t i d e p o l y m o r p h i s m i nc o d i n gs e q u e n c e ，编码区单核昔酸多态性 d va x i s d o r s a l v e n t r a la x i s ，背一腹轴 e n 2 e n g r a i l e d2 基因 f 西 f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r ，纤维生长因子基因 g c p s g r e i gc e p h a l o p o l y s y n d a c t y l ys y n d r o m e g r e i g 多趾综合症 g h 3 g l i k r u p p e lf a m i l ym e m b e r3 基因 m 9h o m e b o xm o t i f - c o n t a i n i n gg e n e9 ，同源框基序基因9 h m h a m m e r t o e ，锤状趾 h xh e m i m e l i ce x t r a t o e s ，h x 多趾 l m b r ll i m br e g i o nl 基因 o r f o p e nr e a d i n gf r a m e ，开放阅读框 o z d o l i g o z e u g o d a c t y l y ，缺失尺骨删 骨及其相连趾头 p a p p o s t e r i o rp o l y d a c t y l y ，轴后多趾 p a p a p o s t a x i a lp o l y d a c t y l yt y p e - a ，a 型轴后多趾 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，聚合酶链式反应 p h s p a l l i s t e r - h a l ls y n d r o m e ，伴中轴或轴后多指的脑一肺一肾一消化道综合症 p p dp r e a x i a lp o l y d a c t y l y ，轴前多趾 p 卜da x i sp r o x i m a l - d i s t a la x i s ，近端一远端轴 【r a zr e p l i c a t e da n t e r i o rz e n g o p o d ，缺失尺骨腓骨，重复了轴前位的桡骨胫骨 r t - p c r r e v e r a s et r a n s c r i p tp c r ，反转录p c r r t - q p c r r e a lt i m eq u a n t i t a t i v ep c r ，实时定量p c r 鼢s o n i ch e d e g h o g 基因 s n p s i n g l en u e l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ，单核苷酸多态性 s s c p s i n g l e - s t r a n d e dc o n f o r m a t i o n a lp o l y m o r p h i s m ，单链构象多态性 s s qs a a q u a t c h ，一种多趾变异小鼠 u t r u n t r a n s l a t e dr e g i o n ，非翻译区 z p a z o n eo f p o l a r i z i n g a c t i v i t y ，极性活力区 v 论文独创性声明 并 7 8 3 4 5 9 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取 得的成果。尽我所知，除了文中特孙j ；h n 以标注和致谢的地方外，学位论文中不包 含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业犬学 或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：尴，立! ! 圭年月日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使学位论文的规定，即：学饺有权保留并向国家有 关部f j 或机桕送交论文的复印竹干电子版，允许论文被查阅利借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学町以_ l | j 不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容。 研究生签名 导师签名 尴、 壁垒 立竺生年幽笪日 越年月_ 幺e t 口q 川农业大学博士学位论文第一部分文献综述 第一部分文献综述 一、多趾及其相关基因的研究概况 1 肢体发育概述 1 1为什么要研究肢体的发育 先天性肢体异常是人群中较为常见的遗传缺陷，每5 0 0 - 1 0 0 0 人中就有一例，是研究遗传学和 细胞生物学领域与模式形成和信号转导相关的重要模型。因为动物肢体结构简单，不是胚胎成活 必需的，发生于体表，便于实验操作和观察，是研究骨骼发育和模式形成过程中细胞和分子间相 互作用的极好材料，对l i 缶床诊断和治疗也有重要意义。而且，控制肢体发育的关键基因也会影响 其他部位的发育，从肢体发育得到的知识可以帮助我们认识其他组织和器官的发育。 多指趾是最常见的先天性肢体畸型，在人和鼠上进行了较为系统的研究，发现控制多趾性状 的基因在脊椎动物中是保守的，这将为鸡多趾的研究提供借鉴，而鸡作为种模式动物，其多趾 机制的阐明也能促进人类多趾的研究。 1 2 肢体发育的轴模式及其信号分子 121 鸡胚肢体发育简要过程 新鲜鸡蛋在3 8 - 3 8 5 。c ( 1 0 0 - 1 0 1 f ) 温度下孵育时，鸡胚发育按照l i l l i e 的外形分期标准共分 为4 5 个时期，孵化1 7 天的时期( s ) 与孵化日期( d ) 对应表见附表t( 蒋唏尔，薛社普等， 1 9 8 3 ) 。在第十五期( s t 5 ，约2 4 2 7 对体节孵化约5 0 5 5 小时) ，肢芽原基开始出现在左也外侧 体壁上，呈扁平状，但不明显。以后肢芽逐渐加宽增厚，由深部增殖的中胚层和表面的外胚层组 成，对称地向外突出( 见图1 - 1 ) 。到第十八期( 3 3 - 3 6 体节，孵化约3 天) 肢芽从胚体上突出的 围卜1 孵化4 天的鸡胚 f i g 1 - 1 c h i c ke m b r y oo f 4 di n c u b a t e d 说明：上下各一对突出于体壁的球状物为肢 芽( 箭头所示) 肢芽远端的外层表皮细胞 为外胚层顶替【a e r ) ， 高度约为其前后长度的1 ，6 以后后肢芽发育稍快：到第二十四期时( 孵化约4 天半) 前后肢芽 的长度超过了宽度，后肢芽的前端开始出现趾板：第二十五期( 孵化4 5 天到5 天) 前肢出现指 扳，后肢的第三趾已隐约可见。到第二十九期( 孵化6 天到6 5 天) ，前肢肘部显著弯曲，第一、 一、三指已分开；后肢各趾间的浅沟较明显，趾间有蹼，第五趾原基出现；以后备指，趾问沟更明 四川农业大学博士学位论文第一部分文献综述 显，趾指节开始分化趾脂伸长，蹼变得不明显。到第三十六期( 孵化约l o 天) ，趾端出现爪， 前肢形成翼，肢体己发育成形。 早在1 9 4 8 年，s a u n d e r s 等发现早期肢芽的外胚层顶部有一层狭窄的特化上皮细胞，称外胚层 顶嵴( a e r ，a p i c a le c t o d e r m a lr i d g e ) ，是在其下方的中胚层诱导下形成的一个控制肢体发育的 信号中心。如将肢芽中胚层组织移植到胚体体壁其它区域的外胚层下，该外胚层形成项嵴，进而 发育为肢体。如将前肢芽的中胚层挖除，把后肢芽中胚层移入其中则本应形成前肢的肢芽发育 为后肢；反之亦然。如切去肢芽顶嵴，代之以非肢芽外胚层，则肢芽生长停止。因此，肢体的形 成是中胚层和外胚层相互作用的结果。 1 2 2 轴模式及其信号分子 脊椎动物肢的发育是沿三个轴同时进行的。肢芽最初沿近端到远端轴( p r - d 轴，在上肢即 扶肩到指尖) 增长变粗，先后出现近端和远端两个收缩环，将每一肢芽分为三段：上肢芽棱分为 臂、前臂和掌，并在肘关节处弯曲：下肢芽被分为大腿、小腿和足，并在膝关节处弯曲。肢体中 轴的间充质先形成软骨，继而以软骨内成骨方式形成骨，周围的间充质分化形成肢体的肌群，脊 神经向肢体内长入。肢体的发育还沿另外两个轴同时进行；背腹轴( d v ，手背到手掌) 和前 一后轴( a p ，即拇指到小指，桡骨到尺骨) ，见图1 - 2 。 圈卜2肢体发育的三个轴( 来自( l o g a n ，2 0 0 3 ) f i g 1 2 t h et h r e ea , x e 5o f l i m bd e v e l o p m e n t 近年来，有相当多的研究关注肢体轴的发育，也发现许多信号分子调节三个轴的发育。已经 明确的是p f - d 轴由外胚层顶脊( a e r ) 产生的成纤维细胞生长因子( f g f s ，蓝色，见图1 - 3 ) 控 豳卜3 肢体发膏三个轴的信号分子 f i g 1 3 t h es i g n a lm o l e c u l eo f t h r e e a x e si nl i m bd e v e l o p m e n t ( n i s w a n d e r ，2 0 0 3 ) 制，f g f 2 ，f g f 4 ，f g f 8 ，f g f l 0 在a e r 特异表达，是肢体p r - d 轴发育必须的；d v 轴由背侧 外胚层产生的w n t 7 a ( 绿色) 和腹侧外胚层产生的骨骼成形紊( b m p s ) 和e n l ( 都为粉红色) 2 控制：a p 轴由轴后间充质产生的s h h ( s o n i c h e d e g h o g 红色) 控制( n i s w a n d e r ，2 0 0 3 ) 。 i2 21 p r d 轴 p r - d 轴的发育依赖于外胚层项脊( a e r ) 。若在鸡的肢芽发育早期用显微外科手术去掉a e r ， 结果会火去几乎所有的肢结构；若在稍晚时期去掉a e r ，则只失去远肢结构而不影响近肢发育， 此a e r 是形成p r - d 轴必须的。植入浸有f g f 2 或f g f 4 的小珠取代a e r 可以恢复鸡胚p r - d 轴的发育，完全缺失，妒和f g f i 的基因敲除小鼠不能形成肢体，说明f g f s 是a e r 发挥作用的 关键信号( f a l l o n ，1 9 9 4 ；n i s w a n d e r ，1 9 9 3 ) 。这个家族有4 个成员( f g f 4 ，f g f 8 。f g t 9 ，f g f l 7 ) 在a e r 特异表达，而且是持久的表达以保证接个p r - d 轴的完成( s u n 等，2 0 0 2 ) 。 12 2 2a - p 轴 肢的发育中。一般把桡骨胫骨及其对应的拇指趾和食指趾称为轴前，尺腓骨及其对 应的其余3 指趾称为轴后。肢芽的轴后存在一个关键的信号中心极性活力区( z p a ) ，负 责调节四足动物手和脚指趾头的前一后轴模式。z p a 可移植到肢芽的不同部位，除正常z p a 外 肢芽轴前还有额外的z p a 时会形成多趾。移植可表达s h h 的细胞或重组s h h 蛋白到鸡肢芽轴 前也得到多指馒( r i d d l e 等，1 9 9 3 ) ；敲出s h h 基因会导致骨骼元素沿a p 轴人大减少，s h h 4 胚胎的轴后间充质缺乏极性活力，表明z p a 是靠产生信号分子s h h 发挥作用的( c h i a n g 等，2 0 0 1 ： r o s 等，2 0 0 3 ) 。 近年多数模型显示s h h 在脊椎动物前后轴发育过程中起决定作用，如h x 型多趾小鼠在胚胎 发育l i 5 天时s h h 在整个外胚层顶脊异位表达( b l a n c ，2 0 0 2 ) ，o z d 表型鸡( 缺失尺骨，腓骨及 其相连趾头，o l i g o z e u g o d a c t y l y ) 肢芽中胚层发育异常是因为该部位缺乏s h h 表达( r o s ，2 0 0 3 ) ， r a z 表犁小鼠( 纯合子完全缺失尺骨腓骨，而重复了轴前位的桡骨胫骨，多指罡呈中心对称) 肢芽表达的s h hm r n a 及s h h 蛋向比野生犁减少2 0 ( k r e b s ，2 0 0 3 ) 。这些研究表明，远肢骨 豁形成和趾头特性需要s h h 蛋白的指导，后者通过剂量依赖激活靶基因的表达来规定指罡的前 后轴模式。 12 23d v 轴 肢芽发育起动时，间充质把信号传到相应的外胚层上，随后，由外胚层调节d v 轴的发育， 若把外胚层绕间充质旋转1 8 0 度，间充质的结构( 骨骼、肌肉、腱) 会反转以符合外胚层的极性 发育( n i s w a n d e r2 0 0 3 ) 。 d - v 轴的分子作用模式已经明朗了：转录因子l m x l b 在肢芽的背侧间充质表达并维持细胞 的背侧特性，它是由背侧外胚层表达的w n t 7 a 诱导的。如果缺乏w n t 7 a 。指趾的背侧特性消 失而出现双腹侧特性。受腹侧转录因子e n l 的抑制，w n t 7 a 只局限在背侧外胚层表达。在e n l - 一 胚胎中，w n t 7 a 在腹侧错误表达使远肢结构出现双背侧特性。e n i 是由腹侧的骨骼成形蛋白l 型受体b m p r l a 诱导的。缺失b m p 信号也会导致w n t 7 a 错误表达丽出现双背侧远艘( n i s w a n d e r 2 0 0 3 ) 。 1 2 3 信号分予间的协同作用 p q 川i 农业大学博士学位论文第一部分文献综述 肢体三个轴的形成和生长是由肢体组织中心和它们产生的信号分子协同完成的( a e r f g f s ， z p a $ h h ，背侧外胚层w n t 7 a ) ，是相互关联的( 见图1 4 ) 。如p r - d 轴和a p 轴通过s h h 和 f g f 之间的相互作用建立联系。在敲除了f g f 4 8 的小鼠中，没有s h h 表达，直观地证明了s h h 的表达需要a e r ：若去掉a e r 会造成s h h 快速下降，而这种状况可由f g f 浸润珠补救。s h h 反过来又可以维持f g f 4 在a e r 的表达。f g f 4 是一个反映分子间相互作用的有用标记，它的表 达经常被扰乱从而引起a p 轴的改变( n i s w a n d e r ，2 0 0 3 ) 。 m h 帐啊f i d h m i i _ a - p 脚“ s h h j o 州一黼嚣”p r o 删 、 、 b p 1 e d o d 日 圈卜4 肢体三个轴信号分子间的关联( n i s w a n d e r ，2 0 0 3 ) f i g 1 4 t h er e l a t i o n s h i po f t h es i g n a lm o l e c u l eo f t h r e ea x e si nl i m bd e v e l o p m e n t 去掉背侧外胚层或通过基因干涉使w n t 7 a 沉默会导致s h h 表达减少或沉默。因此，背侧外 胚层和a e r 一起维持着s h h 的表达。f g f s 、s h h 和w n t 7 a 之间的相互作用使来自a e r 、z p a 和背侧外胚层的信号相互协调，从而使三个轴的发育关联起来。 另外，a e r 和d v 轴的形成在肢芽发育早期已经结合起来了。用功能获得和丢失法研究鸡 胚b m p 功能以及条件性失活小鼠的b p r l a ，都显示了：若缺乏b m p 信号，a e r 则不能形成，f g f 8 也不能表达。因此，b m p 是形成a e r 和d v 轴的上游信号( n i s w a n d e r ，2 0 0 3 ) 。 2 多趾( 指) 的研究概况 多趾在不同物种有相似的表型，在人上的研究最为系统，鼠和鸡作为模型动物也有较多研究 在牛、羊上只有零星报道。 2 1 人类多趾的研究概况 21 1 人类多趾的分类及发生频率 多趾是最常见的先天性肢畸形。既可以独立发生，又可以作为综合症的一部分出现。人类多 趾的研究在2 0 世纪5 0 年代就有文献记载，许多人对多趾畸形进行过分类，目前最广泛采用的是 t e n t a m y 和m c k u s i c k 的分类方法( z g u r i c a s ，1 9 9 4 ) 。这种方法按照受累趾的位置，首先分为轴 前多趾( p r e a x i a lp o l y d a c t y l y ，p p d ) 和轴后多趾( p o s t e r i o rp o l y d a c t y l y ，p a p ) 两大类，见图1 - 5 。 轴前多趾( 见图l 一6 ) 多为常染色体显性遗传，分为四型：i 型为拇趾多趾，有一个或多个姆趾 4 四川农业大学博士学位论文第一部分文献综述 二：趾节重复，它的严重程度从仅有拇趾尖端变宽伴轻微分叉到包括掌骨在内的完全重复，这种多 趾类型最为常见；i i 型为拇趾三趾骨多趾，这一畸形拇趾可并拢掌骨正常，多趾由远端趾骨重 复组成呈现“鸭嘴”外观：型表现为食趾多趾；i v 型为多趾并趾，在这种情况下，如果没有多 趾存在，并趾也不会发生。轴后多趾又分为a 型和b 型：a 型中，额外趾发育良好，并与第五 或一个额外的跖骨相接，这种类型按显性性状遗传；b 型中，额外趾生长不良，常见皮肤蒂形式 外显率约为6 5 ( 赵红珊，1 9 9 8 ) 。当然，以上分类不能包括所有多趾类型。 f i g1 - 5t h ec l a s s i f i c a t i o no f p o l y d a c t y l yw i t h o u ts o m es y n d r o m e 围1 - 6p p d 病人的手和脚 f i g i - 6 t h eh a n d a n d f o o t o f a p p d p a t i e n t a ：左手拇指三指节一一i i 型 b ：脚拇趾多出2 个一一i 型( 来自l c n i c c 等，2 0 0 2 ) 不同类型的多趾出现的频率是不同的。c a s t i l l a 等( 1 9 9 6 ) 报道了一个长达2 0 多年的大型流 行病学调查，统计了4 0 0 多万拉t 美洲和西班牙婴儿的多趾表型，发现多趾畸形的总发生率分别 为o 1 8 9 和o 1 0 3 ，其中轴后多趾分别为o 。1 5 0 和0 0 6 7 。前者较高是因为黑人有较高的轴后 多趾比例。在6 5 9 9 个多趾指婴儿中细分出了9 个多趾表型，分别为轴后六趾( 5 3 4 5 例) ，轴前 i 型六趾( 1 0 1 8 例) ，七趾及更多趾( 6 1 例) ，多趾并趾( 1 8 例) ，交叉多趾( 4 5 例) ，母趾 5 p q 川农业大学博士学位论文第一部分文献综述 三趾骨( 3 3 例)