（生物化学与分子生物学专业论文）外消旋布洛芬酶法拆分的研究.pdf

福建师范大学学位论文使用授权声明 2 0 0 5 9 2 9 王生物堂所呈交的论文( 论文题目：外消旋布洛芬酶法拆分的 研究) 是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不 包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。本人了解福建师范大学 有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交的学位论 文并允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容；学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 一签名盟止签名一呼 签名日期：型! 罗：! 丛 摘要 摘要 论文以有机介质中脂肪酶催化( r ，s ) 一布洛芬的高选择性拆分为目标，开 展了有关方面的研究： 首先，确立了h p l c 拆分( r ，s ) 一布洛芬两个对映体及布洛芬酯的方法， 并通过筛选得到一株高选择性拆分消旋布洛芬的脂肪酶产生菌一& n 记舭肌 e x p a n s u mt s 4 1 4 。 其次，研究游离脂肪酶催化布洛芬不对称酯化反应过程中，水分含量、有机 溶剂、底物醇种类及浓度、酶粉与水分的比例、反应温度等条件对拆分效果的影 响，确立的最佳反应体系为：异辛烷1 5m l ，布洛芬6 4 6m m o l l ，脂肪酶5 3 3g t , ， 酶量：水量= 1 0 ：1 ，正丙醇4 0m m o l l ，含水量0 5 ，6 0 反应5 0h 。在此条件 下，拆分反应的底物转化率和底物选择率分别为4 2 、4 2 9 6 3 。 然后，确立了p e n i c i l l i u me x p a n s u mt s 4 1 4 脂肪酶的固定化的最佳条件：a b 8 大孔树脂作为吸附载体，酶与树脂比例为6 ：1 、缓冲液p h 值为9 o 、吸附6h 、冻 干2h ；运用均匀实验优化了布洛芬、醇浓度和固定化酶的最佳用量：1 5m l 异辛 烷体系中，布洛芬2 0 8 4m g ，正丙醇4 2 2 6 , u l ，固定化酶0 6g ，在摇床转速和反 应温度分别为2 0 0r p m 和4 0 时，e e 。的预测值为7 5 4 5 。通过验证实验，得到 e e 。的实验值为8 1 1 2 。在此条件下，拆分反应的转化率和对映体选择率e 值分 别为4 8 1 5 和6 6 1 3 5 ；固定化酶对消旋布洛芬拆分的效果较为理想。 最后，研究并确定了固定化p e n i c i l l i u me x p a n s u mt s 4 1 4 脂肪酶催化( r ，s ) 一布洛芬酯化拆分的动力学方程。利用o r i g i n7 5 软件对原始数据进行非线性拟 合，得到了p e n i c i l l i u me x p a n s u mt s 4 1 4 脂肪酶催化酯化反应的动力学常数： v m a x = 1 1 1 1 7 3m m o l h l ，k a = 4 6 4 1 1 1m m o l l ，k b = 0 2 5 1 4 3m m o l l ，k i a = 1 8 2 3 1 5 3 7 m m o l l 。 关键词布洛芬，脂肪酶，h p l c ，拆分，酯化，固定化，动力学 a b s t r a c t a b s t r a c t i no r d e rt or e s o l u t er a c e m i ci b u p r o f e ne n a n t i o s e l e c t i v e l yi no r g a n i cs o l v e n t ，a s e r i e so fr e s e a r c h e sw e r ec a r r i e do u t ： f i r s t l y , t h ec o n d i t i o n so ft h eh p l ca n a l y s i sw e r eo p t i m i z e d ，a n das t r a i no f p e n i c i l l i u me x p a n s u mt s 4 1 4w a ss c r e e n e d ，w h i c hc o u l ds e c r e t eal i p a s ew i t hp e r f e c t e n a n t i o s e l e c t i v i t y s e c e n d l y , t h em a i nv a r i a b l e sa f f e c t i n gt h er e s o l u t i o nr e a c t i o nb yt h el i p a s ew e r e o p t i m i z e d ，i n c l u d i n gw a t e rc o n c e n t r a t i o n ，t e m p e r a t u r e ，t h eo r g a n i cs o l v e n t ，e n z y m e c o n c e n t r a t i o n ，t h es t r u c t u r e a n dt h ec o n c e n t r a t i o no fa l c o h 0 1 u n d e ro p t i m u m c o n d i t i o n s ( 6 4 6m m o l li b u p r o f e n ，5 3 3g ll i p a s e ，4 0m m o l l1 - p r o p a n o l ，1 5m l i s o o c t a n e ，0 5 ( v v ) w a t e r , 6 0 f o r5 0h ) ，t h et o t a lc o n v e r s i o nr a t ea n dt h e e n a n t i o m e r i cr a t i oc o u l dr e a c h4 2 a n d 4 2 9 6 3 ，r e s p e c t i v e l y t h i r d l y , t h ei m m o b i l i z a t i o nc o n d i t i o n so fp e n i c i l l i u me x p a n s u mt s 4 1 4l i p a s e w e r eo p t i m i z e d ，a n dm a c r o p o r o u sa d s o r p t i v er e s i o na b 一8w a sp r o v e dt ob eas u i t a b l e c a r r i e rf o ri m m o b i l i z a t i o no fp e n i c i l l i u me x p a n s u mt s 4 1 4l i p a s e t h eo p t i m i z e d c o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：l i p a s e ：r e s i o n = 6 ：1 ，p h9 0 ，a d s o r b i n g6h ，l y o p h i l i z i n g2h b yf u r t h e rs t u d y i n g , i tm a yb ep r o v e d t h a tt h ee f f e c to ft h er e s o l u t i o no ft h e ( r ，s ) - i b u p r o f e nw a sp e r f e c tw h e nt h er e a c t i o nt e m p e r a t u r ea n dr o t a t i o ns p e e dw a s4 0 a n d2 0 0r p m ，r e s p e c t i v e l y t h e nt h eo p t i m u mc o n c e n t r a t i o n so ft h ei b u p r o f e n ， n - p r o p a n o la n di m m o b i l i z e dl i p a s ew e r ed e t e r m i n e db yt h eu n i f o r md e s i g n u n d e rt h e o p t i m u mc o n d i t i o no f1 5m li s o o c t a n e ，2 0 8 4m gi b u p r o f e n ，4 2 2 6 弘ln - p r o p a n o la n d 0 6gi m m o b i l i z e dl i p a s e ，t h ed e t e r m i n ev a l u eo ft h ee e si s8 1 1 2 i nt h ee n d ，ak i n e t i c s t u d y o fe s t e r i f i c a t i o nr e a c t i o nf o rr e s o l u t i o no f ( r ，s ) 一i b u p r o f e nb y t h ei m m o b i l i z e dp e n i c i l l i u m e x p a n s u mt s 4 1 4l i p a s e w a s r e s e a r c h e d t h e n ，t h ee x p e r i m e n t a ld a t aw a sa n a l y s i sb yt h eo r i g i n7 5 ，a n dt h e p a r a m e t e r si nt h ek i n e c t i ce q u a t i o nw e r ed e t e r m i n e db yn o n - l i n e a rr e g r e s s i o n ： v 眦= 1 1 1 1 7 3m m o l h l ，k a = 4 6 4 1 1 1m m o l l ，k b = 0 2 5 1 4 3m m o l l ，k 沼= 1 8 2 3 1 5 3 7 m m o l l k e y w o r d s l b u p r o f e n ，l i p a s e ，h p l c ，r e s o l u t i o n ，e s t e r i f i c a t i o n ，i m m o b i l i z a t i o n i l 中文文摘 中文文摘 布洛芬( i b u p r o f e n ) 俗称芬必得，是一种重要的2 一芳基丙酸类非甾体抗炎药 物，具有解热镇痛的作用，可用于治疗风湿性关节炎等症。布洛芬的a 位碳原子 为手性碳原子，具有r 型和s 型两种构象。现代药理学实验证明，布洛芬的药理 活性主要是由s 一布洛芬产生的，s 一布洛芬的活性是r 布洛芬的1 6 0 倍；同时， r 一布洛芬与辅酶a 结合会干扰正常的脂代谢和膜功能，因此，研制并生产光学 纯的s 一布洛芬就显得格外重要。 目前用于拆分布洛芬的方法主要有物理结晶法、化学法和微生物酶法。物理 结晶法操作条件难以控制，化学法往往需要昂贵的手性试剂，成本较高，而且容 易造成环境污染。生物酶法具有立体选择性高、反应条件温和、成本低、污染少 等优点，目前在手性药物拆分领域的应用越来越广。 论文采用有机相中脂肪酶催化( r ，s ) 一布洛芬不对称酯化的方法实现( r ，s ) 一布洛芬的拆分，主要的研究工作包括以下几方面： 第一，确立了( r ，s ) 一布洛芬两个对映体及布洛芬酯的h p l c 检测分析方 法。然后从本实验室保存的几种脂肪酶产生菌的筛选出发，获得了一株能够高选 择性拆分( r ，s ) 一布洛芬的脂肪酶产生菌一& 行记f 眈l me x p a n s u mt s 4 1 4 。利 用p e n i c i l l i u me x p a n s u mt s 4 1 4 脂肪酶催化( r ，s ) 一布洛芬的酯化拆分，反应5 0 h 左右，产物对映体过剩值为9 9 ，底物转化率达到4 2 ，e 值 2 0 0 ，表现出较 高的立体选择性。 第二，优化了p e n i c i l l i u me x p a n s u mt s 4 1 4 游离脂肪酶催化拆分外消旋布洛芬 的反应条件，确立了游离酶催化外消旋布洛芬拆分的最佳反应体系：异辛烷1 5 m l ，布洛芬6 4 6m m o l l ，脂肪酶5 3 3g l ，酶量：水量= 1 0 ：1 ，正丙醇4 0m m o l l ， 含水量0 5 ，6 0 。在此条件下，反应5 0 h ，底物转化率和e 值分别为4 2 、 4 2 9 6 3 。 第三，采用吸附法将p e n i c i l l i u me x p a n s u mt s 4 1 4 脂肪酶固定于几种理化性质 不同的载体上，通过考察固定化酶催化( r ，s ) 一布洛芬酯化拆分的底物转化率 和对映体过剩值，确定了a b 8 大孔吸附树脂是固定化p e n i c i l l i u me x p a n s u mt s 4 1 4 脂肪酶拆分( r ，s ) 布洛芬的理想载体。 i i i 中文文摘 第四，采用正交设计和单因素考察相结合的方法，探讨了酶粉与树脂比例、 缓冲液p h 值、吸附时间、冻干时间等因素对固定化效果的影响，确立了p e n i c i l l i u m e x p a n s u mt s 4 1 4 脂肪酶的最适固定化方法：酶粉与树脂比例为6 ：1 ，缓冲液p h 为9 0 ，2 0 c 吸附6h 后，冻干2h 。进一步的研究发现当摇床转速和反应温度分 别为2 0 0r p m 和4 0 时，固定化酶对消旋布洛芬拆分效果最为理想。 第五，考察固定化p e n i c i l l i u me x p a n s u mt s 4 1 4 脂肪酶操作稳定性。连续反应 8 批次后，拆分反应的c 、e c p 分别为3 8 6 3 和9 8 9 ，依然保持较高的催化活性 和对映体选择性。实验结果表明，固定化后的p e n i c i l l i u me x p a n s u mt s 4 1 4 脂肪酶 具有较好的操作稳定性。 第六，采用均匀设计表中的3 因素6 水平6 组试验方案考察布洛芬、正丙醇 和固定化酶浓度对酯化拆分反应的转化率( c ) 和底物对映体过剩值( e e 。) 的影 响：运用d p s 软件对实验数据进行处理分析，得到固定化酶催化拆分反应的最优 组合：1 5m l 异辛烷体系中，布洛芬2 0 8 4m g ，正丙醇4 2 2 6 肛l ，固定化酶0 6g ， c e s 的预测值为7 5 4 5 。通过验证实验，得到e e 。的实验值为8 1 1 2 ，误差仅为 6 9 9 ，说明建立的体系真实可信。 第七，利用固定化的p e n i c i l l i u me x p a n s u mt s 4 1 4 脂肪酶催化外消旋布洛芬的 酯化拆分时，反应温度由原来的6 0 降低为4 0 ，完成拆分的时间由原来的5 0 h 缩短为2 0h ，底物转化率由4 2 提高到4 9 7 3 。同时，连续反应8 批次，底 物转化率和对映体选择性依然较高，实现了脂肪酶的重复利用。 第八，对p e n i c i l l i u me x p a n s u mt s 4 1 4 固定化脂肪酶催化( r ，s ) 一布洛芬的 动力学进行研究。在排除外界传质阻力的前提下，进行了一系列底物浓度的酶促 ( r ，s ) 布洛芬酯化反应。利用o r i g i n7 5 软件对原始数据进行非线性拟合，得 到了p e n i c i l l i u me x p a n s u mt s 4 1 4 固定化脂肪酶催化消旋布洛芬酯化拆分反应的 动力学常数：嗽= 1 1 1 1 7 3m m o l l ，k a = 4 6 4 1 1 1m m o l l ，k b = 0 2 5 1 4 3m m o l l ， k b = 1 8 2 31 5 3 7m m o l l 。 i v 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 脂肪酶的研究进展 1 1 1 脂肪酶的筛选 1 1 1 1 脂肪酶概述 脂肪酶( e c3 1 1 3 ) 是分解三脂酰甘油的水解酶类，被广泛用于催化三脂酰 甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化以及酯类逆向合成 反应【1 2 1 。脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，经常还能表现出磷脂酶、溶血磷 脂酶、胆固醇酯酶、酰胺水解酶等其他一些酶的活性。 脂肪酶的来源非常广泛，在许多动植物及微生物中存在【3 1 。脂肪酶是最早研 究的两类酶之一，自1 8 3 4 年兔胰脂肪酶报道至今已有上百年的历史。但是微生 物脂肪酶则是在上世纪初才被发现的。由于微生物较动植物易获得纯培养，制备 脂肪酶周期短，成本低，易于工业化生产，同时微生物脂肪酶具有更广泛的作用 p h 、作用温度范围、对底物的专一性等优点，因此近年来微生物脂肪酶的理论研 究以及在工业上的应用发展迅猛，极大地引起人们的关注。 迄今已报道的产脂肪酶的微生物有6 5 个属，其中细菌有2 8 个属，放线菌有4 个属，酵母菌有1 0 个属，以及其它2 3 个属的真菌【4 5 1 。目前已报道的用于产脂肪 酶的微生物主要有：皱褶假丝酵母( c a n d i d ar u g o s a ) 、解脂假丝酵母( c a n d i d a l i p o l y t i c a ) 、毛霉( m u c o rm i e h i ) 、米根霉( r h i z o p u so r y z a e ，r h i z o p u sm i e h i ) 、无根 根霉( r h i z o p u sa r r h i z u s f i s h e r 一2 9 ) 、扩展青霉( p e n i c i l l i u me x p a n s u m ) 、圆弧青霉 ( p e n i c i l l i u mc y c l o p i u m v a ra l b u m ) 、黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 、爪哇曲霉( a s p e r g i l l u s j a v a n i c u s ) 、烟色红曲霉( m o n a s c u sf u l g i n o s u s ) 、无花果丝孢酵母( t r i c h o s p f i g u e r i a e ) 、微球菌( m i c r o c o c c u sc o h n ) 、铜绿假单孢菌( p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ) 、 表皮葡萄球菌( s t a ph y l o c o c c u se p i d e r m i d i s ) 、华根霉( r h i z o p u sc h i n e n s 厶s a i t o ) 、地 霉( g e o t r i c h u ms p ) 等 微生物脂肪酶作为一种重要的工业用酶之一，广泛应用于有机合成、精细化 工、药物中间体合成、手性化合物拆分以及生物能源等诸多领域 6 - 8 1 。在油脂化工 和制药工业等领域，脂肪酶反应条件温和、能耗低、原料要求低，具有巨大的商 业前景。近年来，随着非水相酶学的研究和固定化技术的发展，脂肪酶的新特性 福建师范大学郭华颖硕士学位论文 不断被发掘，脂肪酶的应用领域不断拓宽，现己广泛应用于酯合成、手性化合物 的拆分、化工合成中间体的选择性基团保护、高聚物的合成、肽合成等方面，应 用前景广阔。 1 1 1 2 脂肪酶的筛选 优良的产酶菌株应该是短时、营养基质低廉、菌株易分离、胞外酶、非致病 菌、不产生毒素、遗传性状稳定，而且对噬菌体不敏感等。目前国内外脂肪酶的 筛选方法趋于准确、快速、针对性强。 筛选脂肪酸高产菌株常用的方法是以三丁酸甘油酯为底物的透明圈法，以及 在橄榄油琼脂平板中加入指示剂的变色圈法。通常在培养基中添加的指示剂包括 罗丹明、溴甲酚紫、维多利亚蓝等。透明圈和变色圈的有无与大小说明菌株产脂 肪酶能力，即透明圈和变色圈越大，菌株产脂肪酶能力可能越大。例如c a r d e n a 9 j 等人以三丁酸甘油酯为底物，通过观察菌落周围的透明圈筛选得到了六株脂肪酶 高产菌。施巧琴【1 0 】利用脂肪酶作用于脂肪后产生的脂肪酸与维多利亚蓝反应呈蓝 绿色的特性，通过透明圈平板法经摇瓶发酵复筛得到产碱性脂肪酶的扩展青霉。 此外，利用物理化学诱变、细胞杂交、蛋白质定向进化、转基因技术等方法 可以筛选得到特殊性质的高酶活菌株。例如，t a n 1 1 】等通过紫外、 n g t ( n m e t h y l n n i t r o n n i t r o s o g u a n i d i n e ) 诱变、快中子辐射筛选得到一株 c a n d i d as p ，其酶活从1 1 2u m l 提高到1 1 0 8u m l 。m a n f r e dt r e e t z 1 2 1 等人利用 易错p c r 技术，经过四代的随机诱变，使得改造后的p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a 脂 肪酶分子的对映体选择性由原来的2 提高到8 1 。 1 1 2 脂肪酶的酶学特性 1 1 2 1 脂肪酶的分子结构 多数脂肪酶是糖蛋白，其糖基部分约占分子量2 1 5 ，以甘露糖为主，整 个分子由亲水部分和疏水部分组成，活性中心靠近分子疏水端【1 3 , 1 4 1 。研究表明， 来源不同，脂肪酶的氨基酸组成不同，分子量大小也相差很大。尽管脂肪酶具有 不同的氨基酸组成，但由于生物同源性和进化过程保守性，其活性中心具有相同 或相似结构【1 4 ，1 5 】。脂肪酶分子空间结构的中央是一个疏水的b 折叠，其周围包围 着两亲的a 螺旋，a 螺旋和b 折叠形成氧负离子洞，中心是高度保守的催化三联 体s e r - h i s a s p 或s e r - h i s g l u 。氧洞外有一个a 螺旋结构构成的亲水性“盖子， 2 第1 章绪论 对三联体催化部位起到保护作用。当脂肪酶与界面相接触时，a 螺旋“盖子打 开，酶的活性中心暴露出来，酶与底物结合发生催化反应【2 , 1 6 。脂肪酶的这种结 构有利于催化过程中底物对活性中心亲和力的提高以及活性中间体的稳定f 幡1 9 1 。 所以界面激活现象通常与“a 螺旋盖的重新定向排列有关。脂肪酶的化学修饰 和固定化对脂肪酶催化活性的改变，与“a 螺旋盖的重新定向排列不无关系。 界面 图l 一1 脂肪酶油一水界面定向假设模型 f i g 1 - 1o i l w a t e rs u r f a c eh y p o t h e s i sd i r e c t i o n a lm o d e lo fl i p a 脂肪酶作用于油一水界面时表现出特有的界面催化活性，b r o c k e r h o f f 提出了 脂肪酶在油一水界面定向的假说模型f 冽( 如图1 - 1 所示) 。界面活化现象提高了催 化部位附近的疏水性，导致a 螺旋再定向，从而暴露出催化部位；界面的存在使 酶形成不完全的水化层，有利于疏水性底物的脂肪族侧链折叠到酶分子表面，使 酶催化易于进行。 1 1 2 2 脂肪酶的底物特异性 大多数脂肪酶的活性中心是一个“手性 环境，具有高度的选择性。脂肪酶 催化反应时，将它的这种特性“传递”给手性化合物分子，使反应具有内在的选 择性。这种选择性是指酶催化一组底物中的某些组分发生反应的优先性，客观上 表现为不同竞争性底物反应速度的差异【2 1 l 。脂肪酶的底物特异性可分为脂肪酸特 异性、位置特异性、立体特异性。 脂肪酸特异性是指酶对不同碳链长度和饱和度的脂肪酸表现出特殊反应性， 不同来源脂肪酶水解不同甘油酯所表现出脂肪酸特异性很大。圆弧青霉 ( p e n i c i l l u mc y c l o p i u m ) 脂肪酶对短链( c 8 以下) 脂肪酸，黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e 厂) 和根霉( r h i z o p u s ) 对中等长链( c 8 c 1 2 ) 脂肪酸表现出强烈的特异性，猪胰脂肪 3 福建师范大学郭华颖硕士学位论文 酶对短链脂肪酸，特别是三丁酸甘油酯水解专一性较高。此外，脂肪酶对底物中 不饱和脂肪酸的双键位置也表现出不同的反应性。例如，白地霉( g e o t r i c h u m c a n d i d u m ) 脂肪酶对c i s 9 c 1 8 ：l 和c i s ，c i s 9 ，1 2 c 1 8 ：2 酸的酯键表现出特异水解活性 2 2 1 o 位置特异性是指在一定的反应条件下，酶优先选择对底物分子内不同位置的 某一相同功能基团进行催化反应，生成某一种异构体，而另一种异构体则很少生 成的性能。脂肪酶反应几乎是完全区域选择性，可以得到不同的异构体。但它对 甘油三酯中的$ 1 1 1 和s n 3 酯键的识别和水解能力$ 1 1 2 酯键的不同。m a t o r i 2 3 j 等 人比较了3 4 种脂肪酶的位置选择性，发现几乎所有的脂肪酶都倾向与s n 1 和s n 3 特异。迄今为止，能对甘油酯的s 1 1 2 有选择作用的脂肪酶很少，目前报道的主要 有c a n d i d aa n t a r c t i c al i p a s ea 【2 4 】和g e o t r i c h u ms p 1 i p a s e 2 5 】等。 立体特异性也称为对映体选择性，是指在一定反应条件下，酶优先催化生成 一对对映异构体中的某一对映体，或者是优先催化与外消旋体中的某一对映体反 应的性能，这种选择性是由两种对映体的非对映异构体的自由能差别造成的。在 有机相中酶促合成和酯交换时，酶对底物不同立体结构表现出不同的特异性。 正是由于脂肪酶的底物特异性，使其在手性化合物合成方面有着广泛的应用。 随着酶在有机相中催化活性研究的迅速发展，脂肪酶手性拆分技术的研究和应用 已成为当前科学研究的热点。 1 1 3 脂肪酶的固定化 1 1 3 1 固定化酶的意义 脂肪酶是一种重要的工业用酶之一，不但具有催化效率高、专一性强、无污 染等生物酶的一般特性，而且具有界面催化活性。许多高温高压条件下才能进行 的有机化学合成反应在脂肪酶的催化下可以在常温常压温和的条件下完成，大大 降低了生产成本。因此脂肪酶在油脂与食品加工、洗涤剂、化妆品、皮革与造纸 工业、制药业等方面有着广泛的应用，尤其是在对映异构体和手性化合物的生物 合成方面。然而将游离酶直接应用于工业化生产则存在着如下几个问题： ( 1 ) 酶在非水溶液中不溶解，反应过程中容易结块，大大降低了酶的利用率； ( 2 ) 酶催化反应的有机底物不溶于水，必须加入合适的溶剂或乳化剂使酶分子 与底物分子接触。这样容易造成产物被残余酶污染，不易储存，必须进行后处理； 4 第1 章绪论 ( 3 ) 酶与产物分离困难，较难回收未变性的酶并加以重复利用，难以实现过程 的连续化； ( 4 ) 对单反应器，酶的使用寿命受反应器空时的制约，使酶的部分潜在酶活受 到损失； ( 5 ) 酶的价格昂贵，使用一次就废弃，对酶的利用很不经济，成本太高。 因此，要实现酶的大规模的工业化应用，必须对酶进行适当加工，这就是酶的固 定化。 酶的固定化技术正是基于弥补游离酶的诸多不足诞生并发展起来的，并且越 来越受到人们的关注。酶的固定化是指用物理或化学方法将酶限制或定位在某一 特定空间范围内的、保留其固有的催化活性、可被重复使用的方法。相对于游离 酶，固定化酶的立体选择性、稳定性和催化活性均可大大提高，而且可以通过离 心或过滤等简单的操作实现酶和产物的分离，实现了酶的重复利用，简化了产物 提纯工艺，提高了生产效率，降低了生产成本，因此固定化脂肪酶具有更广阔的 应用前景。n o v o z y m e s 就是目前广泛应用的一种商业化的固定化脂肪酶。 国内外已有诸多关于脂肪酶固定化的报道。飚m 【2 6 1 等用c c l 酯化拆分布洛芬， 实验结果表明，将脂肪酶用凝胶固定化可以大大提高酶的催化效率和手性选择 性，转化率由2 5 提高到4 6 ，接近理论转化率。p a l o m o 2 7 等对不同载体固定 化酶催化拆分不同底物进行了研究，实验证明，通过表面吸附法得到的固定化酶 对于拆分结构简单的底物比较有效，而离子吸附法得到的固定化酶对于复杂底物 显示出更高的选择性。另外，对于同一底物，可以通过酶固定化过程中采用不同 载体改变酶的选择方向。如拆分与2 一芳香丙酸结构类似的( r s ) 2 苯基2 丁酰基 乙酸反应中，对c a n d i d ar u g o s a 脂肪酶采用吸附法固定与憎水载体上优先选择s 一对映体反应，采用共价法固定与戊二醛载体上优先选择r 一对映体反应f 捌。 1 1 3 2 固定化酶的方法 随着生物技术的发展，固定化方法日新月异，但是酶固定化方法的框架已经 形成。一般而言，固定化酶制备的方法主要有以下四种：吸附法、共价结合法、 包埋法、交联法。 一 一 1 吸附法 吸附法是最古老也最简单的固定化方法，依靠酶与载体之间的范德华力、氢 5 福建师范大学郭华颖硕士学位论文 键、离子键等亲和力将酶固定于载体上。吸附法分为物理吸附法和离子吸附法。 物理吸附法是使用对蛋白质具有高度吸附能力的非水溶性载体将酶固定到载 体表面的方法。常用的载体有活性炭、多孔陶瓷、酸性白土、淀粉、纤维素及其 衍生物、甲壳素及其衍生物等。这种方法操作简单，反应条件温和，酶活力部位 及其空间构象不易被破坏，但是结合不牢固，酶容易脱落。 离子吸附法是将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合 的固定化方法【2 9 】。常用的载体有多糖类离子交换剂和合成高分子离子交换树脂。 例如d e a e - 纤维素、t e a e - 纤维素、c m - 纤维素等。此法操作简单，反应条件 温和稳定，酶活性损失也少，但是载体和酶的结合力比较弱，容易受到缓冲液种 类或p h 的影响，在离子强度高的条件下进行反应时，酶往往会从载体上脱落。 在有机介质中，通过吸附法固定脂肪酶操作简单，酶活损失较少，重复利用 率也较高，因此被广泛应用，尤其在手性药物的拆分方面。h o n g w e iy u l 3 0 等人用 吸附法将c a n d i d ar u g o s a 脂肪酶固定于c r b 0 2 大孔树脂上，固定化脂肪酶在异 辛烷体系中催化布洛芬及月桂酸与正丙醇发生酯化反应时，其催化活性、稳定性 和对映体选择性较之游离酶都有明显提高，而且固定化酶重复利用2 0 批次后， 酶活无明显损失。m u n e h a r ug o t o 3 1 l 等人用吸附法将脂肪酶固定与中空纤维膜上， 固定化脂肪酶催化月桂酸和苯甲醇酯化反应的活性较游离酶提高了2 3 倍。 2 共价结合法 共价结合法是利用酶蛋白分子上的功能基和固相支持物表面上的反应基团之 间形成化学共价键而将酶固定的方法。此种方法结合牢固，不易脱落，而且能经 受较剧烈的p h 和温度变化，稳定性好。但是固定化操作复杂，反应条件强烈， 酶的三维结构发生了变化，导致酶部分失活，因此较难获得比活高的固定化酶， 甚至酶的底物专一性等性质也会发生变化。 共价法的主要方法有酰化反应、芳化和烷基化反应、溴化氯法、重氮化反应 以及硅烷基化法等。氨基和羧基是用于共价法固定的酶蛋白上的最常用功能基 团。一般含羧基的载体可以通过化学修饰使羧基活化。 3 包埋法 包埋法是把酶定位于聚合物材料的格子结构或微胶囊结构中。常用的包埋剂 有海藻酸钠、凝胶等。包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应， 6 第1 章绪论 很少改变酶的空间构象，酶活回收率较高。但是该方法也有一定的局限性，只有 小分子的底物和产物可以通过高聚物网架扩散，对那些底物和产物是大分子的酶 并不适合。 4 交联法 交联法是用多功能试剂进行酶蛋白分子之间的交联，酶分子和多功能试剂之 间形成共价键，得到三向的交联网状结构【3 2 】。最常用的交联剂是戊二醛。交联法 的优点是酶与载体结合牢固，不易脱落，稳定性较高，试剂价格低廉，固定化成 本低；缺点是操作较为复杂，进行化学修饰时，易造成酶失活。 表1 - 1 酶的不同固定化方法的比较 t a b1 - 1t h ec o m p a r i s i o no fd i f f e r e n ti m m o b i l i z a t i o nm e t h o d sf o rl i p a s e 然而以上方法都存在不足之处，有人将几种方法结合起来使用，如天津大学 的宋宝东f 3 3 】等人，以a b 8 型大孔吸附树脂为载体，将c a n d i d ar u g o s a 脂肪酶用 吸附法固定化后用谷氨酸双十二烷基酯核糖醇进行包衣，在异辛烷中催化月桂酸 和月桂醇的酯化反应，结果表明，酶的比活较未包衣前提高了6 0 9 0 。 此外，在原有方法的基础上，新的固定化技术也不断涌现，如交联酶晶体法、 硅基质包埋法、脂质包埋法、分子印迹法等。固定化方法的不断改进必将使脂肪 酶的应用前景更加广阔。 1 2 布洛芬等手性药物拆分研究进展 1 2 1 手性药物研究概述 手性( c h i r a l i t y ) 是指含碳化合物分子由于四价碳原子的三维空间排列所引起 的结构不对称的特征，是自然界的基本属性。构成生物体的基本物质如核酸、蛋 7 福建师范大学郭华颖硕士学位论文 、 白质、糖类等都是手性分子。互为对映体的一对手性化合物具有基本相同的物理 化学性质，但是它们旋转平面偏振光的方向却恰好相反。因此，对映体也被称作 光学对映体。 手性药物( c h i r a ld r u g ) 是指其分子结构互为镜像关系而又不能重合的一对药 物对映体【州，又称为含手性因素的药物【3 5 1 。手性药物进入生物体后，其药理和生 理作用多是由它们与受体之间的手性匹配和分子识别能力有关。因此，手性药物 的对映体常常显示出不同的药理作用。一般就手性药物而言，可能存在四种不同 的行为：1 ) 只有一种对映体具有所希望的生物活性，另一种无显著生物活性；2 ) 两种对映体具有等同或近乎等同的定量和定性的生物活性；3 ) 两种对映体具有 定量上等同但定性上不同的生物活性；4 ) 各对映体具有定量上不同的活性。由 此我们可以看出，手性药物的两个对映体可能具有不同甚至是相反的生物活性， 如果使用不当，必将造成严重的后果。“反应停事件就是最典型的例子。反应 停的化学名为肽胺哌啶，2 0 世纪6 0 年代，“反应停”是一种广泛使用的镇静剂和 止吐药，用于缓解孕妇的妊娠反应，但是许多孕妇服用后产下四肢呈海豹状的畸 形婴儿。随后的研究发现肽胺哌啶酮是一个手性化合物，有r 一和s 一两个对映体， 起镇静功效的是r 一对映体，s 一对映体则具有强烈的致畸作用1 3 6 1 。 “反应停 类似事件的发生促使了单一构型手性药物的研究和开发，也引起 了社会各界的重视，如美国和欧洲的新药管理部门就己做出特别法规，要求在申 报手性药物时必须给出其各个异构体的具体含量，并尽可能提供各纯对映体及其 混旋体的毒理学和药理学数据【3 7 1 。2 0 0 1 年诺贝尔化学奖授予了w s 诺尔斯、k b 夏普利斯、野依良治三位化学家，以表彰他们在手性催化研究领域做出的卓越贡 献，他们的研究成果已经在手性药物合成中得到了应用【3 引。 目前，单一对映体药物的合成和药理研究已经成为有机合成和医药工业的热 点研究领域。手性药物市场以每年7 8 的速度增长。1 9 9 9 年单一对映体药物 销售额达n 1 1 5 0 亿美元，占世界药品市场3 6 0 0 亿美元的3 2 。2 0 0 3 年达至1 j 1 4 6 0 亿 美元，在世界最畅销的前1 0 0 、3 0 0 、5 0 0 种药物中，单一对映体药物都达到或超 过5 0 。到2 0 0 5 年，全球上市的化学合成新药中，约有6 0 为单一对映体药物。 预计到2 0 0 8 年将突破2 0 0 0 亿美元大关。 因此，为了适应市场的需求，不断开发和研究光学纯手性药物，降低生产成 8 第1 章绪论 本，发展适用于大规模工业生产的手性拆分技术具有重要意义。 1 2 2 布洛芬等手性药物的拆分方法 手性药物的生产方法通常是利用物理、化学和生物的方法进行不对称合成、 外消旋药物的拆分或无效对映体转化。 1 2 2 1 物理结晶法 结晶法是最早用于拆分对映体的方法，主要指优先结晶法。该方法就是利用 化合物的消旋异构体在一定温度下较外消旋体溶解度小，易析出的性质，在外消 旋体溶液中加入某一种旋光异构体作为晶种，诱使与晶种相同的异构体先行析 出，以此达到分离目的【3 8 1 。优先结晶过程中，溶液伴随着同时外消旋化，理论上 产率可以达到1 0 0 。但是该方法单程收率比较低，且不能用于拆分大多数的外 消旋体混合物。该方法操作条件不易控制，在拆分过程中，往往因对映体浓度增 大而导致夹带析出现象，无法保证光学纯度。 1 2 2 2 化学法 经典的化学拆分法是利用手性试剂与外消旋体反应，生成两个非对映异构体， 在利用产物的物理性质差异将其拆分【3 9 】。但是这种拆分法收率较低，拆分剂消耗 量大，并且在拆分的化合物类型上也受到很大限制。化学法包括化学不对称法、 化学拆分法、化学不对称转化法。 化学不对称法需要在不对称催化剂作用下，高度立体选择性地不对称合成手 性药物1 4 0 1 。该方法工艺简单，适用范围有限，而且需要手性试剂手性催化剂或手 性溶剂，成本高。由于手性催化剂往往含有重金属，导致这种方法在医药方面的 应用受到一定限制。 化学拆分法又成为非对映体盐法，该方法利用手性酸、碱试剂成盐形成非对 映立体异构体盐后，经逐级结晶而拆分手性化合物，是目前制备手性化合物最重 要和最普遍的方法之一，其理论最高收率为5 0 【4 1 1 。在化学拆分法中，化学拆分 剂的筛选、回收以及新型手性拆分剂的设计和合成是该方法拆分效果的关键。长 期以来，化学拆分法一直存在着拆分剂筛选上的盲目性，并且在拆分化合物的类 型上也存在着一定的局限性。 化学不对称转化方法是利用非手性试剂或手性试剂将无效对映体不对称转化 成有效对映体【4 2 , 4 3 1 。这种方法的理论收率可达1 0 0 ，但由于手性试剂一般价格比 9 福建师范大学郭华颖硕士学位论文 较昂贵，一定程度上阻碍了该方法的实际应用。与其他方法比较，该方法发展比 较晚，而且不对称转化过程中的动力学及热力学研究不够，还没有一个系统的理 论来指导人们选择高效易得的拆分剂和拆分体系。 1 2 2 3 生物学法 随着酶固定化技术、多相反应器、分子生物学技术和化学修饰等新技术的日 趋成熟，利用生物酶的高度立体选择性制备手性化合物逐渐受到研究人员的重 视。1 9 6 9 年，日本用固定化酶法生产出l 一氨基酸，是酶法拆分手性化合物发展 过程中的一个重要里程碑。生物学法相对于物理、化学方法具有价格低廉、拆分 效率高、立体选择性强、反应条件温和、操作简单以及环境污染小等优点，相信 随着生物酶拆分方法的不断发展，将会对手性药物合成与应用起到积极的推动作 用。 表1 - 2 手性化合物制备方法的比较 t a b1 - 2t h ec o m p a r i s o no fm e t h o d so fp r o d u c i n gc h i r a lc o m p o u n d s 1 32 芳香丙酸类手性药物的酶法拆分 1 3 12 一芳香丙酸类手性药物概述 2 一芳香丙酸( 2 a r y l p r o p i o n i c a c i d ，2 - a p a ) 类手性药物，或称为洛芬类 ( p r o f e n s ) ，是非甾体抗炎药中重要的一大类，主要用于治疗炎症、缓解疼痛以 及关节炎和类风湿性关节炎等症状【删】。临床上已经广泛应用的包括萘普生 ( n a p r o x e n ) 、布洛芬( i b u p r o f e n ) 、酮洛芬( k c t o p r o f c n ) 、氟比洛芬( f l u r b i p r o f e n ) 、 氟诺洛芬( f l u n o x a p r o f e n ) 和吲哚洛芬( i n d o p r f e n ) 等二十余种。此类药物的a 位 含有一个手性碳原子，存在一对光学异构体。近代分子药理学研究表明，对映体 构型和生理活性密切相关，其中s ( + ) 一构型具有生理活性，而r ( - - ) - - 构型活性低 第1 章绪论 或无活性。以外消旋体直接服用无疑会加重体内代谢的负担降低药效，而且还会 对胃肠道和肾脏造成一定的损伤【4 7 1 。因此，将外消旋体拆分为光学纯的2 a p a 是 极其必要的。 c o o h f l u n o x a p r o f e n c o o hn u n a p r o f e n k e t o p r o f e n o n 伙。h i n d o p r o f e n 圈1 - 2 几种2 芳基丙酸类药物的结构式 f i g 1 - 2c o n s t i t u t i o n a lf o r m u l ao fs a v a r a l l2 - a p ad r u g s 在有关2 一芳香丙酸类药物的酶促拆分的报道中，所使用的酶大多数为脂肪酶 ( l i p a s e ，e c 3 113 ) ，这是由于脂肪酶不仅在水溶液中有较好的催化活性，而且在 非水介质中