（特种经济动物饲养专业论文）家蚕中球孢白僵菌结合蛋白ci7a的鉴定.pdf

d i s s e r t a t i o nf o rm a s t e r d e g r e eo f so u t h w es tu n i v e r s i t y i d e n t i f i c a t i o no fab e a u v e r i ab a s s i a n ab i n d i n g p r o t e i nc i 8 af r o ms i l k w o r m ，b o m b y x mo r i m a j o r ： f i e l d ： r a i s i n gs p e c i a le c o n o m i c a n i m a l s p r o t e o m i c s s u p e r v i s o r ：p r o f h en i n g j i a c a n d i d a t e ：j i al i n g c h o n g q i n g ，c h i n a m a y , 2 0 1 1 独创性声明 堂僮途窒星垦! 塞蚕主燮塑自堡萱缱金蛋自兰墨笪鉴定 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了 特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁 在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 学位论文作者：覆次 签字日期：如1 1 年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密，口 保密期限至年月止) 学位论文作者签名：凌凌 签字日期：细l1 年6 月2 日 导师签名： 吁告 签字日期：们、年l ，月 目录 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 第一章文献综述1 1 1 球孢白僵菌1 1 1 1 球孢白僵菌的特征1 1 1 2 球孢自僵菌在生防领域的应用：1 1 2 昆虫和真菌的相互作用2 1 2 1 真菌侵染昆虫的途径和机制2 1 2 2 昆虫抵御真菌侵染的研究进展3 1 3 家蚕抵御真菌侵染的研究进展，7 第二章引言9 2 1 研究背景9 2 2 研究目的和意义9 2 3 主要研究内容1o 2 4 技术路线1o 第三章与球孢白僵菌分生孢子结合的家蚕体液蛋白的鉴定1 3 3 1 材料和试剂1 3 3 1 1 实验材料。1 3 3 1 2 化学试剂。13 3 1 3 实验仪器1 4 3 1 4 溶液配制1 4 3 2 方法1 6 3 2 1 家蚕体液蛋白和球孢白僵菌分生孢子的结合实验1 6 3 2 2 结合蛋白的质谱鉴定。1 7 3 3 结果和分析1 8 3 3 1 家蚕体液蛋白和球孢白僵菌分生孢子的结合。1 8 3 3 2 与球孢白僵菌分生孢子相结合的家蚕体液蛋白的质谱鉴定。1 9 3 4 讨论2 2 第四章c 1 8 a 融合蛋白的表达纯化以及抗体制备2 5 4 1 材料和试剂2 5 4 1 1 实验材料2 5 4 1 2 化学试剂。2 5 4 1 3 实验仪器一2 6 4 1 4 溶液配制2 6 4 2 方法3 0 西南大学硕+ 学位论文 4 2 1 构建c 1 8 a 的原核表达载体3 0 4 2 2 原核表达c 1 8 a 蛋白的纯化3 3 4 2 3 融合蛋白c 1 8 a 的活性染色一3 4 4 2 4c 1 8 a 多克隆抗体的制备与纯化3 5 4 2 5c 1 8 a 多克隆抗体的特异性检测3 6 4 3 结果和分析一3 7 4 3 1c i s a p e t 2 8 a 原核表达载体的构建3 7 4 3 2c 1 8 a 融合蛋白的原核表达与纯化3 9 4 3 3c 1 8 a 多克隆抗体的制备与特异性检测。4 1 4 4 讨论4 ：! 第五章家蚕c 1 8 a 与真菌的结合4 5 5 1 材料和试剂4 5 5 1 1 实验材料4 5 5 1 2 化学试剂4 5 5 1 3 实验仪器4 5 5 1 4 溶液配制一4 6 5 2 方法4 6 5 2 1 球孢白僵菌诱导处理及材料的制备4 6 5 2 2 实时荧光定量r t - p c r 检测c 1 8 a 在球孢白僵茵诱导后m r n a 的表达4 6 5 2 3w e s t e r nb l o t t i n g 检测c 1 8 a 在球孢白僵菌诱导后蛋白水平的表达。4 7 5 2 4 利用c 1 8 a 多克隆抗体对与球孢白僵菌分生孢子相结合的体液蛋白的检测4 7 5 2 5c 1 8 a 融合蛋白与三种多糖的体外结合测试4 8 5 2 6 球孢白僵菌分生孢子发芽率的测定4 8 5 3 结果与分析4 9 5 3 1c 1 8 a 基因在球孢白僵菌诱导后m r n a 和蛋白质水平的变化4 9 5 3 2 家蚕体液c i s a 蛋白与球孢白僵菌分生孢子的结合验证5 0 5 3 3 重组c 1 8 a 融合蛋白与真菌细胞壁三种多糖的体外结合测试5 1 5 3 4 发芽率的测定5 2 5 2 i 讨论5 ：! 第六章综合和结论5 5 参考文献5 7 研究生在读期间发表的论文以及参与的课题情况6 3 至谢6 5 摘要 鼻曼皇曼曼曼曼曼量鼍舅詈曼量曼皇曼曼曼量曼曼曼皇罾詈置冒罾量皇曼皇皇曼皇曼曼皇量蔓曼曼皇皇皇量曼皇曼曼曼曼量曼皇窖毫曼舅曼詈舅量寡皇舅鼍寡暑量鲁皇曼i 1 l 量i 家蚕中球孢白僵菌结合蛋白c 1 8 a 的鉴定 特种经济动物饲养专业硕士研究生贾凌 指导教师何宁佳教授 摘要 球孢白僵菌( b e a u v e r i ab a s s i a n a ) 是一种昆虫致病性真菌，由于其具有高效 低毒，宿主范围广的特点，现已被作为生物杀虫剂广泛应用。球孢白僵菌对昆虫 的侵染主要是利用发芽管分泌的表皮降解酶和机械压力穿透昆虫的表皮，进入宿 主体腔分泌蛋白酶和毒素，吸取宿主营养，最终导致昆虫死亡。昆虫与真菌协同 进化，形成了先天性免疫体系来抵御真菌的侵染。当微生物侵染昆虫时，昆虫能 通过t o l l 和i m d 信号途径产生不同的抗菌肽对其进行抑杀。此外，昆虫通过前酚 氧化酶级联系统产生的黑色素，体液免疫产生的抗真菌蛋白以及细胞免疫等对真 菌也具有防卫作用。虽然家蚕( b o m b y xm o r i ) 基因组框架序列在2 0 0 4 年已被测 定，极大地推动了家蚕先天性免疫方面的研究，但是家蚕抵御真菌方面的研究仍 然较少。 本研究将家蚕幼虫体液蛋白和球孢白僵菌分生孢子一起孵育，对家蚕体液中 存在的能与球孢白僵菌相结合的蛋白进行了m a l d i t o f m s 质谱鉴定，获得了 四个球孢白僵菌结合蛋白，其中b 1 ，3 葡聚糖识别蛋白，脂蛋白3 0 k ( 6 g 1 ) 和抗 菌肽a t t a c i n 三种蛋白是已知的能与真菌相互作用的蛋白。随后对首次鉴定得到的 真菌结合蛋白c 1 8 a 进行了较为深入的研究。首先原核表达并纯化了c i g a 融合蛋 白，制备了c 1 8 a 抗体。通过调查c 1 8 a 在被球孢白僵菌诱导后m r n a 和蛋白质 水平的变化，发现c 1 8 a 的m r n a 转录本诱导后上调，而蛋白质水平上基本没有 变化。此外，采用w e s t e mb l o t t i n g 手段证明了c 1 8 a 不仅能与球孢白僵菌结合， 而且能与真菌细胞壁的主要成分( 几丁质，葡聚糖和纤维素) 结合，暗示了c 1 8 a 蛋白可能在免疫应答中起着模式识别因子的功能。最后，通过发芽率测定的结果 表明，c 1 8 a 融合蛋白对真菌的生长有较弱的抑制作用。 两南大学硕士学位论文 关键词：球孢白僵菌；家蚕；c 1 8 a ；真菌结合蛋白 n a b s t r a c t t 一 一 no t l d e n t i t i c a t i o no tab e a u v e n a 勿口s s z 口刀口 b i n d i n gp r o t e i nc 1 8 a f r o ms i l k w o r m ， b o m b y x m o r i r a i s i n gs p e c i a le c o n o m i c a n i m a l sm a s t e rc a n d i d a t e ：j i al i n g s u p e r v i s o r ：h en i n g ji a ( p r o f e s s o r ) a b s t r a c t t h ee n t o m o p a t h o g e n i cf u n g u sb e a u v e r i ab a s s i a n ai sb e i n gd e v e l o p e da sa ni m p o r t a n t b i o i n s e e t i c i d ew i t hb r o a dh o s tr a n g e s ，w h i c hd e p e n d e do ni t sh i g he f f i c a c ya g a i n s t i n s e c tp e s t sa n dl o wv i r u l e n c eo nn o n - t a r g e ta n i m a l s b b a s s i a n ai n v a d e si n s e c t s m a i n l yt h r o u g hc u t i c l eb ym e c h a n i c a lp e n e t r a t i o na n de n z y m o l y s i s o n c et h eg e r m t u b e sg e ti n t o t h eh o s th c m o c o e l ，t h e yp r o l i f e r a t ei nt h eh e m o e o e lr e l e a s i n g e x t r a c e l l u l a r e n z y m e s a n db i o a c t i v em e t a b o l i t e sw i t hi n s e c t i c i d a lp r o p e r t i e s c o e v o l v e dw i t h 丑b a s s i a n a t h ei n s e c t sd e v e l o pe f f e c t i v ei n n a t ei m m u n es y s t e m st o f i g h to f ft h ef u n g i ，c o n t a i n i n gc e l l - m e d i a t e dr e s p o n s ea n dh u m o r a lr e p o m ei n c l u d i n g p h a g o c y t o s i s ，n o d u l a t i o n ，e n c a p s u l a t i o n , a n t i m i c r o b i a lp e p t i d es y n t h e s e sv i at o l lo r i m dp a t h w a y , a n dm e l a n i z a t i o no fp a t h o g e ns u r f a c e s a l t h o u g ht h es i l k w o r m ( b o m b y x m o r od r a f tg e n o m es e q u e n c ew a sc o m p l e t e di n2 0 0 4 ，t h em e c h a n i s mo fs i l k w o r m a g a i n s tf u n g a li n v a s i o ni ss t i l lu n c l e a r i nt h ep r e s e n tr e s e a r c h , w ei d e n t i f i e df o u rf u n g u s - b i n d i n gp r o t e i n sv i ab i n d i n ga s s a y a n dm a l d i t o f m sa n a l y s i s p r e v i o u ss t u d i e ss h o w e dt h a tt h r e eo f 也e l ni n c l u d i n ga p 一1 ，3 - g l u c a nr e c o g n i t i o np r o t e i n ( p g r p ) ，al o wm o l e c u l a rl i p o p r o t e i n3 0 k ( 6 g 1 ) a n d a na n t i m i c r o b i a lp e p t i d eh a v eb e e nr e p o r t e dt oi n t e r a c tw i t l lf u n g i w et h e nf o c u so u r s t u d yo nc i s a ，w h i c hi sas i l k w o r ms c r p i na n di d e n t i f i e da saf u n g u s - b i n d i n gp r o t e i n f o rt h ef i r s tt i m ei nt h i ss t u d y t ou n d e r s t a n dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nf u n g ia n dc i g a , i i i 两南大学硕士学位论文 w ep r o d u c e dt h ec 1 8 af u s i o np r o t e i na n da n t i c l 8 aa n t i b o d y n l ee x p r e s s i o n so fc 1 8 a o nb o mo ft h em r n aa n dp r o t e i nl e v e l sw e r ei n v e s t i g a t e db yr e a l - t i m ei u - p c ra n d w e s t e r nb l o t t i n g ，r e s p e c t i v e l y , u s i n gt h em a t e r i a l so b t a i n e df r o ms i l k w o r ml a r v a e c h a l l e n g e db y 丑b a s s i a n a t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h er n r n at r a n s c r i p t so fc 1 8 a w e r ei n c r e a s e d ，w h i l et h ec 1 8 ap r o t e i n ss h o w e dl i t t l ev a r i a t i o n i na d d i t i o n , t h e b i n d i n go fc 1 8 ap r o t e i nw i mt h em a j o rc o m p o n e n t so ff u n g ic e l lw a l lc o n t a i n i n gc h i t i n , c u r d l a na n dc e l l u l o s ew a sp r o v e db y 加v i t r ob i n d i n ga s s a ya n dw e s t e r nb l o t t i n g t 1 1 i s r e s u l ti n d i c a t e dt h a tc 1 8 am i g h tb ear e c o g n i t i o nf a c t o ri ns i l k w o r mi m m u n e r e s p o n s e f i n a l l y , t h ew e a ki n h i b i t i o no fc 1 8 a f u s i o np r o t e i no nt h eg r o w t ho f 丑b a s s i a n as p o r e s w a so b s e r v e db ys p o r eg e r m i n a t i o nr a t ea s s a y k e yw o r d ：b e a u v e r i ab a s s i a n a ；b o m b y xm o r i ；c 1 8 a ；f u n g u s b i n d i n gp r o t e i n i v 第一章文献综述 1 1 球孢白僵菌 1 1 1 球孢白僵菌的特征 第一章文献综述 球孢白僵菌( b e a u v e r i ab a s s i a n a ) 是一种重要的昆虫致病菌，在分类学上属 于半知菌亚门( d e u t e r o m y c o t i n a ) ，丝孢纲( h y p h o m y e e t e s ) ，丛梗孢目( m o n i l i a l e s ) ， 丛梗孢科( m o n i l i a c e a e ) ，白僵菌属( b e a u v e r i a ) 。真菌自己不能合成碳水化合物， 只能从其它生物有机体或人工培养基中获取营养以满足生长需要l l j 。 球孢白僵茵的生长发育对环境条件有一定的要求：在5 c 以下和3 3 以上球 孢白僵菌都不能发芽生长，2 4 - 2 8 c 为其最适生长温度；分生孢子发芽的湿度必须 在相对湿度7 5 以上；白僵菌对酸碱性要求不高，在p h 为3 0 9 4 的范围内，分 生孢子均能萌发，以微酸性条件最适合白僵菌孢子发芽和生长i l j 。 球孢白僵菌在不同的时期呈现不同的形态，有气生分生孢子( a e r i a lc o n d i a ) ， 芽生孢子( b l a s t o s p o r e ) ，节孢子( a r t h r o s p o r e ) ，营养菌丝和气生菌丝。分生孢子 大多为球形或近球形，着生在分生孢子梗上，分生孢子梗着生在气生菌丝上。分 生孢子进入宿主体内繁殖为营养菌丝，营养菌丝分化产生芽生孢子和节孢子，芽 生孢子和节孢子吸收宿主的营养发育为营养菌丝，球孢白僵菌以“营养菌丝一芽生 孢子和节孢子营养菌丝的方式在宿主体内循环增殖。寄主死亡后，营养菌丝穿 透宿主体表产生气生菌丝，气生菌丝生长发育长出分生孢子梗，继而产生气生分 生孢子粘附在宿主体壁上，如此循环，周而复始【l 】。 1 1 2 球孢白僵菌在生防领域的应用 1 8 3 5 年，巴斯德( b a s s i ) 首次在他的专著中提到了一种在家蚕中发现的真菌， 该真菌后来被命名为球孢白僵菌( b e a u v e r i ab a s s i a n a ) ，他预言人们会利用微生物 来控制害虫的数量【2 】。随着实践的检验，人们逐渐认识到化学农药给人类的健康带 来不利影响，希望开发有效的替代防治方法促进人类身体健康，发展了微生物杀 虫剂。微生物杀虫剂包括细菌类杀虫剂、真菌类杀虫剂、病毒类杀虫剂和抗生素 类杀虫剂，其中球孢白僵菌是真菌类杀虫剂的主要代表，这是因为球孢白僵菌有 三个特点：( 1 ) 宿主范围非常广泛，可以寄生1 5 个目1 4 9 个科的7 0 0 多种昆虫以 及螨类【3 ，4 1 ；( 2 ) 能高效杀灭宿主：( 3 ) 对非宿主不具有毒性作用1 5 1 。目前生产上 应用球孢白僵菌防治松毛虫、玉米螟和水稻叶蝉等害虫，年均防治面积达5 0 万h m 2 左右，已取得了较大的成效 6 1 。 两南大学硕十学位论文 1 2 昆虫和真菌的相互作用 1 2 1 真菌侵染昆虫的途径和机制 中国的生物防治工作者利用球孢白僵菌等真菌防控农林业害虫，取得一些成 效，但是也有一些问题有待改进，比如：如何能快速有效地利用真菌杀死害虫? 为了达到这个目的，研究者们对真菌侵染昆虫的过程和机制进行了研究，以此希 望能找出真菌侵染昆虫的关键决定子，结合生物技术手段改造真菌或宿主加速害 虫的死亡。 研究表明，真菌侵染昆虫有两条途径：一是通过体表接触，即真菌分生孢子 粘附在宿主昆虫的体壁、气门、气孔和节间膜上，进而穿透昆虫体表进入体内感 染昆虫；另一途径与其它微生物感染宿主的方式相同，通过食下病原菌进入消化 道感染。在自然界中真菌侵染昆虫大多以“体表接触”为主要方式【l 一。 真菌穿透宿主表皮的主要过程包括：真菌分生孢子首先附着在昆虫表皮上， 接着发育为特化的侵染结构，通过酶解作用和机械压力穿透表皮【刀。发芽管进入 宿主体腔后，吸收宿主的营养物质继续生长，形成芽生孢子、节孢子以及菌丝。 由于真菌争夺宿主营养迫使宿主处于生理饥饿状态，此外，真菌还分泌具有生物 活性的毒素和代谢产物，致使昆虫内部生理环境遭受破坏，最终使昆虫死亡。大 多数情况下，一旦真菌进入宿主体腔中繁殖，宿主都会死亡【3 】。 1 2 1 1 真菌附着 由于分生孢子和昆虫表皮都具有强烈的疏水性，半知菌纲( f u n g ii m p e r f i c t i ) 的孢子在侵染的初期会紧紧地粘附在宿主表面【引。虫霉目( e n t o m o p h t h o r a l e s ) 和 一些半知菌纲的物种会分泌一些粘液增强真菌孢子与宿主表皮的结合。当真菌在 宿主表面生长一段时间之后，其分生孢子形成发芽管或产生附着胞。 1 2 1 2 真菌穿透宿主体壁 昆虫表皮构造和真菌穿透宿主表皮过程的光学和电子显微镜观察的结果表 明：昆虫表皮是一个化学络合物集成的组织，它的表面覆盖一层蜡质，包括脂肪 酸、脂质和甾醇。上表皮包括苯酚稳定的蛋白基质以及嵌合在其中的几丁质原纤 维。真菌的机械穿透和酶解作用协同合作穿透宿主表皮，发芽管或由附着胞发育 形成的穿透钉通过机械压力挤过表皮：大多数内源性真菌( 绿僵菌属 ( m e t a r h i z i u m ) 、白僵菌属( b e a u v e r i a ) 和轮枝孢属( v e r t i c i l l i u m ) ) 根据宿主表 皮的结构产生一系列的表皮降解酶促进侵染【9 】。这些酶作用的底物就是昆虫表皮 的主要成分，如蛋白质，几丁质和脂类等。真菌产生的表皮降解酶具有一定的顺 2 第一罩文献综述 序性：在早期的侵染过程中( 2 4 小时之内) ，先产生酯酶和蛋白水解酶类( 包括 蛋白内切酶、氨肽酶和羧肽酶) ，接着产生n 乙酰葡萄糖胺酶，在3 - 5 天之间， 产生几丁质酶和脂酶1 2 】。 研究者调查了绿僵菌的主要几个蛋白酶：枯草杆菌蛋白酶p ，f 、胰样丝氨酸蛋 白酶川、内切蛋白酶3 和胰样半胱氨酸蛋白酶4 【lo 】。其中，已克隆获得t p r l 的c d n a 序列，其序列信息表i t 目p r l 含有信号肽，以前体的形式存在，成熟肽大小 为2 9 k d a t l l 】。s t l e g e r 等人采用基因工程的方法在烟草天蛾幼虫里过量表达基 因，加速了宿主昆虫死亡【1 2 】，这为生物防治研究提供了一定的参考。 1 2 1 3 真菌产生的毒素 真菌分泌的毒素包括：环孢菌素a ( c y c l o s p o r i n sa ) 、腐败菌素( d e s t r u x i n s ) 、 环孢菌素c ( c y c l o s p o r i n sc ) 、白僵菌素( b e a u v e r i c i n ) 、球孢交酯( b a s s i a n o l i d e ) 以及恩镰孢菌素( e n n i a t i n s ) 等【1 3 】。将这些毒素注射到宿主幼虫体内后，会抑制 血细胞的扩散，降低正在循环的粒细胞和浆细胞的数量1 3 。以上毒素并不是对所 有的昆虫都有抑杀作用。比如环孢菌素a 能杀死蚊子的幼虫，但是对鳞翅目昆虫 却没有作用。环孢菌素a 使蚊子( a n o p h e l e sg a m b i a e ) 的组织发生了病理性症状： 比如线粒体肿大，内质网形成空泡【1 4 1 。腐败菌素是由绿僵菌分泌的一种环状缩酚 肽，它对宿主具有免疫抑制作用，主要表现在以下几个方面：影响宿主浆细胞的 循环和吞噬活性，诱发血细胞凋亡，干扰宿主细胞骨架的形成，诱导表皮细胞超 微结构发生改变，影响钙离子平衡和胞内高分子量蛋白质短暂磷酸化【3 j 。白僵菌 素和球孢交酯分别是球孢白僵菌分泌的环状三肽和环状四肽，白僵菌素对家蚕的 毒性较小，球孢交酯对家蚕的毒性较大，二者均能与钙、镁等阳离子发生络合作 用，使蛋白质变性，导致家蚕的组织和体液的理化性质发生改变，但是其对昆虫 作用的具体机制还不是很清楚【l 】。 1 2 2 昆虫抵御真菌侵染的研究进展 昆虫抵御真菌侵染，主要从两个方面进行：一是昆虫体壁，二是昆虫的先天 性免疫，后者能对病原菌做出快速的反应。昆虫的先天性免疫系统包括细胞免疫 和体液免疫i l5 1 。 1 2 2 1 体壁防御 当真菌侵染昆虫时，昆虫复杂的体壁结构就是一道天然的物理屏障1 9 ，此外， 昆虫表皮上的一些脂类物质，如短链脂肪酸，尤其是辛酸和葵酸，对真菌的萌发 具有抑制作用【1 5 】。昆虫表皮上的酚氧化酶会在真菌的入侵部位产生黑化作用，形 两南大学硕十学位论文 成黑斑，这对真菌的入侵有一定的抑制作用【9 1 。然而，昆虫的体壁上也存在一些 能促进真菌生长的物质，如长链脂肪酣1 5 1 。 1 2 2 2 细胞防御 当外来入侵物进入昆虫的体腔后，昆虫的血细胞快速对其吞噬( p h a g o e y t o s i s ) 、 囊化( e n c a p s u l a t i o n ) 和结节( n o d u l m i o n ) ，以达到防卫自身的效果，这些防御作 用主要由原血细胞( p r o h a e m o c y t e s ) 、颗粒细胞( g r a n u l o c y t e s ) 、浆细胞 ( p l a s m a t o c y t e s ) 、珠血细胞( s p h e r u l o c y t e s ) 和类绛色细胞( o e n o c y t o i d s ) 等血细 胞完成u 6 1 。 吞噬作用是一种比较保守的细胞防御方式，普遍存在于哺乳动物和无脊椎动物 中。哺乳动物的吞噬作用是由单核吞噬细胞( 单核细胞和吞噬细胞) 和多行核细 胞( 中性白细胞) 完成，在昆虫中，则一般是由浆细胞和颗粒细胞完成。此外， 其它的血细胞也能进行吞噬作用，如类绛色细胞能吸收病原菌【l 7 1 。不同的昆虫中 吞噬同样的病原菌的血细胞不尽相同，粘虫( s p o d o p t e r ae x i g u a ) 用颗粒细胞对 球孢白僵菌的分生孢子和芽生孢子进行吞噬，而蜡螟( g a l l e r i am e l l o n e l l a ) 则是 用浆细胞吞噬球孢白僵菌【1 8 ，- 9 1 。昆虫对外源物的吞噬主要涉及识别：摄入，胞内 破坏以及细胞凋亡等过程【1 7 1 ，但是其相关生化过程还不是很清楚。 囊化作用即是指当外来入侵物太大不适合吞噬时，昆虫的血细胞结合到目标 上，并在其周围形成多层被囊的过程。这个被囊将入侵物包裹起来，通过产生氧 自由基和限制入侵者的营养，抑制其新陈代谢并导致其死亡【9 】。 结节作用就是把血细胞聚集起来在外来入侵物的表面形成瘤结。结节作用是 由凝集素介导的，但是其作用机制还不是很清楚。有研究表明有些昆虫的结节作 用还可以由类花生酸介导。此外，地中海实蝇( c e r a t i t i sc a p i t a t a ) 的前酚氧化酶 和多巴脱羧酶也参与结节过程【2 0 1 。 ： 1 2 2 3 体液防御 昆虫体液防御是由体液免疫因子完成，包括抗菌肽，前酚氧化酶级联系统相 关因子，蛋白酶抑制剂以及其它对微生物有抵御作用的免疫蛋白。 1 2 2 3 1 模式识别受体 研究发现，昆虫通过模式识别受体( p a t h o g e nr e c o g n i t i o np r o t e i n s ，p r r s ) 识 别外源微生物的病原相关模式因子( p a t h o g e n - a s s o c i a t e dm o l e c u l a rp a a e m s ， p a m p s ) 区分“自我和“非我 【2 l 】。模式识别受体与微生物细胞壁上的糖类分 子具有对应性：肽聚糖识别蛋白( p g i 冲) 识别革兰氏阳性茵的肽聚糖( p g n ) ， 4 第一章文献综述 革兰氏阴性菌结合蛋白( g n b p ) 识别革兰氏阴性菌的脂多糖( l p s ) ，p 葡聚糖 识别蛋白( p 研冲) 识别真菌的葡聚糖( g l u c a n ) 。此类“识别 可以开启前酚氧 化酶级联系统或t o l l 或i m d 等免疫途径圈。 自上世纪8 0 年代日本研究者证实家蚕的b 1 ，3 葡聚糖识别蛋白能激活前酚氧 化酶级联系统以来】，大多数昆虫的葡聚糖识别蛋白相继被鉴定得到，如烟草天 蛾( m a n d u c as e x t a ) 2 4 , 2 5 】，果蝇( d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ) t 2 6 和蚊子( a r m i g e r e $ s u b a l b a t u s ) 2 7 】等，这些葡聚糖识别蛋白都含有保守的p 1 ，3 葡聚糖结合结构域。 家蚕的基因组中有四种b g r p 基因，以前日本研究者发现的是1 3 g e d 2 基因，果 蝇三个g n b p 基因中以g n b p 3 与家蚕的p g r p 的同源性最高，是属于b 葡聚糖 识别蛋白的一种 2 8 1 。人们已通过解析家蚕的b g 】冲2 和果蝇的g n b p 3 蛋白结构， 揭示了这两个蛋白能与b 1 ，3 葡聚糖结合的原因是它们能特异识别b 1 ，3 葡聚糖 的三元螺旋结构1 2 9 j 。 1 2 2 3 2t 0 1 1 信号途径 大多数昆虫的t o l l 信号途径都有相似的通路：处于上游的模式识别受体与相 应的病原模式相关因子结合，激活丝氨酸蛋白酶级联系统，将信号传递至跨膜受 体t o l l 因子上，接着信号传递至细胞膜内，最后激活调控抗菌肽基因的转录因子， 促使表达相应的抗菌肽蛋白抑杀病原体 2 2 , 3 0 , 3 1 】。 果蝇中，阳性菌和真菌激活t o l l 信号途径，阴性菌激活i m d 信号途径。果 蝇的t o l l 信号途径如下：模式识别蛋白q 蛆p 3 识别真菌或是p g r p 与g n b p l 复合体识别阳性菌后，激活丝氨酸蛋白酶级联系统郾】，切割蛋白酶的前体形成成 熟肽，成熟肽又切割下一个蛋白酶前体形成成熟肽，依次进行，最后将前体s p a t z l e ( p r o s p i i t z l e ) 剪切为s p i t z l e 并与跨膜受体t o h 结合，将信号传递到细胞膜内， 最后激活转录调控因子d o o m 和d i f , d o r s a l 蛋白调控果蝇的背腹轴发育，而d i f 调控抗真菌和抗阳性菌小肽基因的表达，如d r o s o m i c i n ，碧蝽金属肽 ( m e t c h n i k o w i n ) 和防卫素( d e f e n s e ) 等田j 。 丝氨酸蛋白酶抑制剂( s e r p i n ) 通过抑制丝氨酸蛋白酶活性反向调节t o l l 途 径。已有报道证实果蝇的s e r p i n 4 3 a c 和s e r p i n 5 t 3 2 , 3 3 】，黄粉虫( t e n e b r i om o l i t o r ) 的s e r p i n 4 0 、s e r p i n 5 5 、s e r p i n 4 8 瞰1 以及烟草天蛾的s e r p i n 5 、s e r p i n l j 、s e r p m 6 均能 调节t o l l 途径瞰j 。 1 2 2 3 3 烟草天蛾的前酚氧化酶级联系统( p p oc a s c a d es y s t e m ) 当病原菌入侵宿主昆虫体内时，宿主除了产生抗菌肽以外，还能产生黑色素 抑杀外来入侵者，并利用黑色素修复伤口【3 5 】。这些黑色素是通过宿主的前酚氧化 5 西南大学硕士学位论文 酶级联系统形成的。与昆虫的t o l l 信号途径相似，p p o 系统中模式识别蛋白识别 外来病原菌，引发丝氨酸蛋白酶级联反应，使信号不断放大。研究者们已对多种 昆虫的p p o 系统进行了研究，其中以烟草天蛾研究得最为透彻，其p p o 途径中 大部分丝氨酸蛋白和相应抑制剂都已经被鉴定清楚( 图1 1 ) 。当真菌入侵时，烟 草天蛾的p 葡聚糖识别蛋白就会识别真菌，从而切割丝氨酸蛋白酶前体形成成熟 的蛋白酶，成熟的蛋白酶又去切割其下游的蛋白酶前体，依次进行。p p o 途径中 各个丝氨酸蛋白酶的顺序依次是血液蛋白酶1 4 的前体( p r o h p l 4 ) 变成血液蛋白 酶1 4 ( h p l 4 ，h e m o l y m p hp r o t e a s e1 4 ) 3 6 1 ，肿1 4 切割血液蛋白酶2 1 的前体 ( p r o h p 2 1 ) 变成血液蛋白酶2 1 ( h p 2 1 ) 1 3 7 】，h p 2 1 剪切前酚氧化酶激活酶2 和 3 的前体( p r o p a p 2 和p r o p a p 3 ) 形成前酚氧化酶激活酶2 和3 ( p a p 2 和p a p 3 ) 【了7 ，3 引，p a p 2 和p a p 3 切割前酚氧化酶( p r o p o ) 变为酚氧化酶( p o ) ，酚氧化 酶将多巴氧化为多巴胺，最后被氧化为黑色素。此外，还有一条没有鉴定完善的 黑化途径，它包含有i - i p 6 ，p r o p a p l 以及其它因子【3 引。 图1 1 烟草天蛾前酚氧化酶级联系统和t o l l 途径模式图【j 刈 f i g u r e1 1a m o d e lf o rt h er e g u l a t i o no f m s e x t ap r o p oa c t i v a t i o nc a s c a d ea n dt o l l l i k e p a t h w a y 在p p o 途径中还有一种重要的因子参与调控，即丝氨酸蛋白酶抑制剂，它与 丝氨酸蛋白酶共价结合，产生不可逆的反应，从而抑制丝氨酸蛋白酶的活性，以 此调节p p o 途径【3 9 】。目前，烟草天蛾的大部分s e r p i n 已鉴定得到，它们和对应的 6 第一章文献综述 蛋白酶的配对如下：s e r p i n l i h p l 4 ，s e r p i n 3 1 j - p a p s ，s e r p i n 4 一h p l h p 6 h p 2 1 以及 s e r p i n 5 肿1 h p 6 【舡删。此外，果蝇的s e r p i n 7 7 b a 和s e r p i n 2 7 a 也能调节p p o 途径 【4 5 ，硐 1 2 2 3 4 抗真菌蛋白 当真菌侵入宿主体内，宿主快速产生一些具有抑制真菌活性的蛋白质。如麻 蝇( s a r c o p h a g ap e r e g r i n a ) 体内的一种小肽a f p ( a n t i - f u n g a lp e p t i d e ) 能够抑制 白色假丝酵母( c a n d i d aa l b i c a n s ) 的生长，原因是a f p 能使白色假丝酵母的细胞 质物质外泄，从而使其死亡【4 刀。果蝇体内有m e t c l l i l 如、咖【4 8 1 和d r o s o m i c i n 等抗真 菌蛋白，d r o s o m i t i n 能抑制广谱真菌的萌发和生长，这种抑制作用可能与 d r o s o m i c i n 结构中的c s a l 3 结构域( c y s t e i n es t a b l i z e d 伍bm o t i f ) 有关，在2 0 0 0 年 果蝇的基因组序列测定后发现果蝇中有6 个d r o s o m i c i n 基因，它们对真菌的抑制 效果各有不同【4 9 】。天蚕( h y a l o p h o r ac e c r o p i a ) 产生的天蚕素( e e c r o p i n s ) 可以 通过裂解大豆尖孢镰刀菌( f u s a r i u m o x y s p o r u m ) 的细胞膜将其杀死【5 0 l 。刺肩蝽 ( p o d i s u sm a c u l i v e r n t r i s ) 产生的抗菌肽t h a n a t i n 对真菌和细菌都具有很强的活性 【5 1 1 。家蚕体内的a b p c m 4 对串珠镰刀菌( f u s a r i u mm o n i l i f o r m e ) 有抑制活性【5 0 1 。 黄粉虫( t e n e b r i om o l i t o r ) 通过t o l l 途径产生的两个抗菌肽，t e n e c i n l 和t e n e c i n 2 ， 对真菌也可能有一定的抑制作用【3 。 1 2 2 3 5 其它免疫