（微生物与生化药学专业论文）虫生真菌蝉拟青霉发酵法生产透明质酸.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究在做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人 完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：越塞瘟 日期： ! q q ! 生3 旦 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅；本人授权贵州大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：星豳导师签名： 犁埠日期：一 摘要 透明质酸是极具实用价值的生物大分子，其高粘弹性和非牛顿 流体的流变学特性是其应用的基础，目前国际上对高纯度h a 的指标 是“1 ：分子量大于7 5 0 k d ，特性粘数大于1 4 0 0 c m 3 g ，葡糖醛酸含量 4 2 1 ) 卜4 8 ，蛋白含量小于0 5 ，核酸含量小于1 。 本文进行了虫生真菌蝉拟青霉发酵法制取透明质酸的研究，确 定了产透明质酸最佳菌株及发酵产h a 的最佳工艺条件，制备得到了 少量 l a 精品，并测定了其多项理化指标。结果如下： 1 产h a 最佳菌株：4 6 0 6 株 2 最佳工艺条件： 2 1 最佳发酵培养条件：转速2 5 0 r m i n ，发酵温度2 6 。c ，接种量5 ，装液量4 0 m l 。 2 2 最佳发酵培养基组成：乳糖6 ( m v ) ，酵母膏0 2 5 + 牛肉膏 0 2 5 ，k 。b p o 。0 1 ，m g s o 。7 h ：0 0 1 。 3 制备得h a 精品重5 2 4 m g 4 h a 精品理化指标：总糖含量8 3 4 7 ，g l c a 含量3 8 1 4 ，蛋白杂 质含量1 9 ，相对分子质量3 6 4 k d 。 关键词：透明质酸粘弹性非牛顿流体保水保湿链球菌动物 脏器提取法微生物发酵制取法 a b s t r a c t h y a l u r o n i ca c i d ( h a ) i sab i o l o g i c a l m a c r o m o l e c u l ew i t h p r a c t i c a l a p p l i c a h i l i t y ，i t sh i g l ls t i c ke l a s t i c i t ya n dt h ep r o p e r t yo fu o n - n e w t o n i a nf l u i dl a y s o l i df o u n d a t i o nf o ri t s a p p h c a t i o n i n t e r n a t i o n a l i n d e x e sf o rh i l g l l p a r eh a n o w a d a y si n c l u d e ：m o l e c u l a rw c i i 曲tw h i c hi sm o r et h a n7 5 0 k d , c h a r a c t e r i s t i cv i s c o s i t y w h i c hi sm o r e t h a nl # o o c m 谵, t l l ew e i g h tp e r c e n t a g eo fg l c aw h i c hi s 4 2 - - 4 8 ，p r o t e i nc o n t e n tw h i c hi sl e s st h a n0 5 ，a n dt h ep e r c e n t a g eo fn u c l c i ca c i d w h i c hi sl e s st h 柚l 1 h ep a p e rp r o c e e d e d t h er e s e a r c ho fp r e p a r a t i o no fh ab ym e a n so f f e r m e n t a t i o no f p a e c i l o m y c e sc i c a d a e w h i c hi sav a r i e t yo fe u m y c o t a ，a s c e r t a i n e d t h e o p t i m a ls t r a i na n dt h eo p t i m a lt e c h n i c a lc o n d i t i o n sf o rp r o d u c i n gh ab y f c r m e n t a t i p o nm e t h o d ，a t t a i n e das m a l la m o u l l to fh i 【g hp a r eh ab ye x t r a c t i o na n d p u r i f i c a t i o nt e c h n o l o g y ，t h e ne x a m i n e ds e v e r a lp h y s i c a la n dc h e m i c a li n d e x e sf o r p a r ep r o d u c t t h e a l lr e s u l t sa l ea sf o f l o w s ： 1 o p t i m a ls w a i n ：4 1 6 0 6 2 o p t i m a lt e c h n i c a lc o n d i t i o n s ： 2 1 o p t i m a lf e r m e n t a t i v ec u l t u r a lc o u d i t i o n s ：r o t a r y v e l o c i t yi s2 5 0 f r a i n ， f e r m e n t a t i v et e m p c r a t a r ci s2 6 ，t h ep e r c e n t a g eo f i n o c u l a t i o ni s5 ，t h ev o l u m e o ff e r m e n t a t i v ec u l t u r em e , d i n mi s4 0 m 1 2 2 o p t i m a lc o m p o n e n to f f e r m e n t a t i v e c u l t u r em e d i u m ：l a c t o s e6 ( m ，v ) ，y e a s tc r e a l n0 2 5 a n db e e fc r e a m0 2 5 ，k z h p 0 4 0 1 ，m g s 0 4 7 h 2 0 o 1 ， 3 t h ew e i g h to fh i g hp a r eh ai s5 2 4 m g 4 t h ep h y s i c a la n dc h e m i c a li n d e x e so fp a r ep r o d u c t ：t h ec o n t e n to ft o t a l c a r b o h y d r a t e i s 8 3 4 7 ，t h e c o n t e n t o f g i c a i s 3 8 1 4 ，t h e p e r c e n t a g e o f p r o t e i n i s 1 9 ，r e l a t i v em o l e c u l a rw e i g h ti s3 6 4 k d k e yw o r d s ：h a n o n - n e w t o n i a nf l u i dm i c r o b i a l - f e r m e n t a t i o nm e t h o d s t r e p t o c o c c u ss f f 2 t i n n a t u r eo fp r e s e r v a t i n gm o i s t u r e s t i c ke l a s t i c i t ya n i m a l t i s s u ee x t r a c t i n gm e t h o d 2 第一部分前言 透明质酸的国内外研究进展 透明质酸又名玻璃酸，是一种高分子酸性粘多糖，其结构是糖胺聚糖中结构最简单的 一种，是由m e y e r 和p a l m e r 于1 9 3 4 年首先从牛眼玻璃体中分离出来的，广泛地存在于人 和动物的结缔组织”1 ，如脐带，关节滑液，淋巴液、表皮、牛眼玻璃体、尿、血清、公鸡冠、 兔皮、鲨鱼皮、牛鼻软骨、兔脑、免肌肉等，其中以脐带、公鸡冠、兔皮、鲨鱼皮，牛鼻软 骨、兔脑、免肌肉等，其中以人脐带、公鸡冠、关节滑液和动物眼玻璃体含量最高。卧以 其独特的分子结构和理化性质，在有机体内显强力保水作用，润滑和缓冲作用，参与水和 电解质的运输，调节通透性，促进血液循环，改善中间代谢，调节周围正负电荷浓度进而抑 制多种酶的活性等重要生理功能。因而已经广泛应用于临床诊断，眼科，骨科，烧伤科等医 学领域和化妆品领域”1 此外透明质酸所具有的对药物的分子囊状包埋作用以及体内部分细 胞具有的与i i a 高亲和力的受体，使透明质酸可作为药物缓释控释的新型基质和靶向给药系 统中的新型载体从而递送药物至特定组织细胞而治疗疾病。加之透明质酸价格昂贵，有“白 金”之称，其在国际市场上的价格为2 0 0 ( 0 - - 1 0 0 0 0 0 美元k g ，故研究和开发卧具有十分重 要的应用价值和经济价值。本部分综述了目前国内外对透明质酸的化学结构，理化性质，生 物合成，生理功能，应用，生产方法等方面的研究现状，介绍如下。 1 透明质酸的化学结构 1 9 5 0 年，m e y e r 等人发现“1 ， i a 系由( 1 _ 4 ) o - d _ 葡糖醛酸一b ( 卜3 ) 一n - 乙酰基一d - 葡萄糖胺双糖单元交替聚合而成的无支链的直链多糖高分子，它具有交替的b ( 卜3 ) 葡萄 糖苷酸键和b ( 1 - 4 ) 氨基葡萄糖苷酸键，纯品眦含葡糖醛酸4 8 3 蹋，氨基葡糖4 4 6 5 粉 子式为( c 。h ：。n o ，) n ，具体分子结构式如图： 匕雠l i _ - 。d - l e i l l j i l l 圈2 1 h g 一级结构 ， 2 透明质酸的生物合成 i i a 是由尿苷二磷酸- n 一乙酰氨基葡糖( i j d p - g l c n a c ) 和尿苷二磷酸一葡糖醛酸 ( u d p - g l e a ) 合成而来。2 0 世纪8 0 年代，p r e h m 研究发现，细胞浆膜的膜内壁是合成 i a 的场所合成的方式为在i i a 合成酶的作用下，多糖链的还原未端所连的i j d p 释放，交替连 接上u d p - g 1 c n a c 或u d p - g l c a 来进行 i a 的合成，生成的卧链伸出细胞外，使其不受限制地 延伸，h a 的生物合成步骤如下图： 3 = 三弓浆震= 毒1 目， _ ；目 = = ；目， c = = = ；， = = = 二：= ， = = = = ， = = ：= = = j = = = = ， e = = = = 宣3 譬目 图2 - - 8p r e h m 提出的h a 生物合成过程 。o 一一乙殴氯基葡翱- 一镯糟畦酸 从成纤维细胞中提取得到卧合成酶，妇为4 4 2 0 0 0 ，由三个亚基组成，每个亚基含2 条多肽链，大亚基l i r 为2 0 0 0 0 0 另外2 个小亚基完全相同，叶为1 2 1 0 0 0 v a n d e r i j n 等发现，链球菌细胞膜内有三种蛋白质发挥u d p - g l c a 结合作用，在真核细 胞中也发现了一系列具眦合成活性的蛋白质，这些浆膜结合蛋白在i i a 合成过程中均发挥合 成及转运功能 在链球菌 中，发现一个含有三个涉及卧合成的基因的操纵子，这三个基因分别命名 为h a s a 、b 、c ，初步结果显示，h a s a 负责 l a 合成酶的编码，而h a s b 和h a s c 则分别负责 u d p - 。葡糖脱氢酶和u d p - 葡糖焦磷酸化酶的编码、h 在链球苗中合成路线如下图： 薯罱 m “三一竺。_ - 睁啊- 二爿一 h n r 7 l 占= _ 一 一鞠譬 山 。 黼 * 乙t 霸l 曩摹 ， n l u 许多因素可调控l i 的合成，如磷酸化在h a 合成过程中即具有重要的调节作用，通过调 节眦合成酶分子中大小亚基的磷酸化程度可以调节i i 合成酶活性，当存在合成l i 的前提 4 一 p 物质u d p - g l c n a c 或u d p - g l c a 时，合成酶的大亚基内的酪氨酸则发生自动磷酸化，这是引发 i l a 合成的必经步骤，小亚基内丝氨酸也可磷酸化，当丝氨酸磷酸化程度增高时，酶的活性 即降低，此外激素，炎症介质，生长因子，细胞活性物质，腺苷酸环化酶，肿瘤细胞等均可 通过调节 i a 合成酶的活性来调节| i 的合成，作用机理尚无定论。又在细胞增殖过程中，细 胞处于增殖期时， l 合成酶活性比静止期要强得多，h a 合成速率也明显加快。 3 透明质酸的理化性质 3 1 透明质酸的物理性质 3 1 1 透明质酸为白色纤维状或无定形粉末状固体。有较强吸湿性，能溶于于水而无油 腻感，不溶于一般有机溶剂，纤维状l i 溶解较困难，配成1 浓度的溶液需3 7 天才能完全 溶解，而无定形粉末状较易溶于水使用方便h a 分子链的长度及分子量是不均一的，相对 分子质量范围为2 x 1 0 ”7 1 0 6 ，一般可达到2 0 0 万左右，双糖单位数为3 0 0 1 1 0 0 0 对，属 于生物大分子，其水溶液比旋光度为一7 0 。- 8 0 。，各种不同来源的透明质酸均统一命名为 i l a ，不同动物组织和细菌来源的眦无种属差异，对人类及动物无抗原性，商品 l 一般为钠 盐形式，透明质酸与其反离子所生成的离子对或盐也称为h a ， i a 药用级分子量为1 o x 1 0 ”。4 o 1 0 6 ，其中药用注射级分子量须大于1 5 x 1 0 6 ，蛋白杂质含量小于0 1 ，葡萄糖醛 酸含量大于4 6 ：化妆品级分子量为5 x 1 0 ” 1 5 x 1 0 “” 3 1 2 透明质酸的高粘弹性是其最突出特点 3 1 2 1 i a 水溶液具有高粘度，这是由其结构所决定的，眦具有很长的线性分子链， 且分子链上等距离的葡糖醛酸上的羧基( 包括己成盐的) 在生理条件下离解为负离子，负离 子之间的相互排质使分子链具有很大的伸展程度两不卷缩成一团，这种疏松膨胀的分子形态 使它在溶液中占据较大的空间，故即使在较低浓度下i i a 水溶液也具有很高的粘度，此外当 i i 水溶液浓度再增大达到0 1 时，i i a 可通过分子间氢键及分子间疏水区相互作用等分子间 强烈的相互作用互相缠绕形成连续的网状结构占据巨大的空间，从而使粘度得到显著提高， 如w i k 报道，分子量为4 1 0 。的h a ，浓度不到0 1 的水溶液， i a 分子连绵的网状结构即占 据了整个空间。 3 1 2 2i i a 水溶液不仅具有粘性还具有弹性。这是由于分子间存在着氢键、疏水区相 互作用，所产生的网状结构即具有凝胶的弹性也具有溶液的粘性，这种双重特征被称之为粘 弹性，g i b b s 等发现”。，低浓度的眦溶液主要表现粘性，而高浓度溶液则主要显示其弹性， 在粘性与弹性之间有一明确的临界浓度转变点，这个点与溶液p h 值有很大关系，此外，当 l i a 溶液受到不同速度的撞击或使其作振荡运动，可观察到其在粘性与弹性之间的相互转化， 当 i a 溶液受到较慢的撞击或振荡时，由于分子有时间解开分子间的缠绕，溶液主要显粘性 特征：若受到较快的撞击或振荡时，分子没有足够的时间解开分子间的缠绕，溶液则主要呈 弹性特征。 3 1 2 3 影响 i a 水溶液粘弹性的一些因素 3 1 2 3 1 对于眦水溶液的粘度，i i a 的浓度和m r 是两个主要影响因素。在低浓度或 低| l r 时，溶液的黏度随浓度或l l r 的增加变化相对较小，但浓度或l l r 达到一定值后，粘度 随浓度或叶的增加而显著提高，该现象是因为 i a 在较低浓度或l i r 时，分子间不发生缠绕， 以独立的单体存在。但达到一定的浓度或r 时，i i a 分子间相互缠绕形成网状结构，此时浓 度或l i r 提高1 - 2 倍可导致粘度提高1 0 倍。 3 1 2 3 2 i a 水溶液的粘度还明显依赖于切变力，同一浓度同一珩的f i a 水溶液在高 低切变力下，粘度可相差数千倍，这是因为眦溶液表现为非牛顿流体的流变学特性，即溶 液桔度随切变力的增加而明显减小( 假塑性) 。l i a 溶液的粘度可理解为分子问的摩擦，在高 切变力下，h a 分子被拉长，此时粘度的大小不再完全取决于m r 的大小，也取决于分子间 的空间大小即浓度，因此，同一浓度的h 溶液，即使其m r 不同，当切变力达到一定值时， 5 粘度可降至相同；而对同一l i r 的 i a 溶液，在任何切变力作用下，粘度总是与浓度呈正相关。 3 1 2 3 3 除 i a 浓度和m r 本身对溶液粘弹性影响以外，阳离子可降低h a 溶液的粘度， 离子强度越高，粘度下降越多，二价阳离子降低i 溶液粘度的作用大于一价阳离子，某些 三价阳离子( 如f e ) 可使h a 分子间发生交联，使溶液呈凝胶状，粘度大大增加。此外， 其它一些物理和化学因素如强酸、强碱、高温、透明质酸酶、自由基、紫外线，r 一射线等可 使 i a 大分子降解，导致粘度下降。在卧及其制剂的生产中，应尽量减少分子链的降解，保 持其大分子特性。 3 1 3h a 的强力保水作用 除其水溶液具有高粘弹性特性外，强力保水作用是眦又一突出特点。研究发现”， 在 l 稀溶液中，通过分子内氢键即直链链轴上单糖之间氢键的作用，i i a 分子在空间上形成 呈刚性的单螺旋结构，其半径为2 0 0 h m ，具有一定的机械强度，螺旋内侧因有大量羟基可与 水分子通过氢键缔合而产生强亲水性，这些水在螺旋结构内固内不动。不易流失。当 i a 水 溶液溶度增高到一定范围时，卧可通过分子间氢键和疏水键等分子间相互作用形成双螺旋 结构，浓度更高达到0 1 以上时，卧分子间还可相互缠绕形成连续的网状结构，水分子通 过极性链及氢键与其直接作用，使得透明质酸像分子海绵一样，可以吸收与保持其自身重量 上千倍的水份，是国际上公认的最好的保湿剂。理论上其保水量可达5 0 0 m l g ，在结缔组织 中，透明质酸分子的保水值大约为8 0 m l g ，它比其它任何天然或合成的聚合物都具有更强 的保水性，有天然保湿因子( n 肝) 的美称 3 1 4 l a 的润滑缓冲作用 | l a 水溶液高粘弹特性及i i a 强力保湿保水作用赋予肌分子具有良好的润滑和缓冲作用。 i 的高粘弹性，非牛顿流体的流变学特性，强力保水性质及润滑和缓冲作用是其在临 床和化妆护肤等领域应用的基础。 3 2 透明质酸的化学修饰 天然 i a 由于溶于水在体内易于降解，不易存留，限制了其疗效的发挥，因此，对m 进行修饰以获得生物活性保留体内留存时间延长的眦衍生物就成为一个重要的研究方向， 如h a 的硝化和乙酰化产物，可用来抵抗对卧的降解作用“”，姒中羧基完全或部分与脂肪 醇等酯化，同样也能抵抗降解“，延长体内作用时间，提高稳定性又可保留许多眦原有的 性质如粘弹性，生物相容性及生物降解性。对1 1 a 酯化的研究分为四个阶段“”。第一阶段的 酯化产物不具生物活性，主要利用酯化手段提高凇的稳定性。同姒反应的醇无药理活性。 第二阶段的产物主要是 i 同药物如甾体激素分子中的羟基发生酯化反应，生成的产物保留 了药物原有的药理活性，但具有作用持久，规律等特点，有明显的缓释作用。第三阶段的产 物是控制 i a 分子中部分羧基同药物的羟基酯化，其他的羧基与不具生物活性的醇类酯化， 所得的产物即具有第二阶段产物的特点，又由于 l 分子中其他的羧基被惰性醇酯化，使其 稳定性提高。第四阶段的产物为姒羧基同时与两种或两种以上具不同药理活性物质发生酯 化反应，例如一种可以是甾体激素。另一种可以是抗生素。甚至还可以使 i a 分子中一部分 羧基与两种药理活性不同的物质酯化，一部分羧基同惰性醇酯化，还有一部分羧基与金属离 子成盐从而兼顾到产品的稳定性及溶解度等多方面。 对眦修饰的常用部位为羧基，酵羟基，n 一乙酰氨基和还原末端等，n 一乙酰氨基中的乙 酰基脱掉后形成的氨基大大拓展了i i a 结构修饰的途径和方法，对卧进行修饰的方法有交联， 在分子上系挂一些基团以及复合等。交联的目的是使其分子显著增大，形成连绵的网状结构 在水中可溶胀但不溶解，h a 交联形成的大分子网状物质可作为药物缓释控释的基质。常用 的交联剂有碳二亚胺、酰肼、醛、醇等。如碳二亚胺( w s c ) 作为交联剂时，本身不与 i a 的多糖链进行化学结合，只参与促进多糖链上两个羧基之间形成酸酐，随即与另一链上的羟 基成酯，籍此使单链产生交联“”。该多糖链为含羟基和羧基的酸性多聚糖链，可以来自相同 6 。旷h + 吲希删。 睁删+ b 一州 系挂基团是为了改变 i a 的一些理化特性，如系挂疏水基团后，可降低 i a 的聚阴离子特 性或改变分子链相互间的聚集力。复合即是将h a 与多种材料相互结合，所形成的复合物可 同时具有多种材料的优异性能。 故根据 i a 的化学性质研究开发眦衍生物具有广阔的应用前景。 4 透明质酸的生理功能 h a 广泛存在于机体的各种组织中，是构成细胞外基质和细胞间质的主要成份， l 以其 独特的分子结构和理化性质，在有机体内显示出多种重要的生理功能 4 1 i a 在皮肤中主要表现为强力保水作用。其中大分子i 成膜于皮肤表面，起强的保 湿润滑作用；小分子 a 则渗入真皮组织，促进血液循环，改善组织中间代谢和营养供应。 从而使皮肤光滑柔嫩。此外，l i 还可以改变物质在皮肤中的扩散速率，参与水与电解质等 的运输。 4 2 i a 在关节滑液中主要表现为润滑缓冲作用。h 是关节滑液的主要成分赋予滑液 良好的粘弹性，是关节维持其生理功能的重要保证。 4 3i i a 在血管壁中主要表现为调节通透性 4 4i i a 分子上带有大量负电荷发挥类似离子交换剂的作用，调节周围环境中正负电 荷浓度，维持离子平衡，并可抑制多种酶的活性。 4 5 眦是构成细胞间质的主要成分，其在细胞间质中具有固定水，阻止水流失的功能。 另外，细胞间质内的f i a 所具有的大分子两状结构还可发挥分子筛样的作用，对生物大分子 的扩散具有阻作用。 4 6i i a 参与构成蛋白聚糖聚合体 在生理状态下，h a 与其他糖胺聚辖协同连接到核心蛋白上，构成蛋白聚糖聚合体这种 巨型聚合体占很大水压域，在外界压力下可减少体积，压力解除后，又扩张到原体积，从而 维持了组织的形状和体积保证了组织的可逆性和抗压缩性。此外，不同组织中蛋白聚糖聚 合体( p g ) 还有其特殊功能，如分布在结缔组织中的蛋白多蓿，通过氪基多糖与水结合，这 种h 蛋白质水形成的凝胶状态将细胞粘合在一起，发挥正常的细胞代谢作用及组 织保水作用，并保护细胞不受病原菌侵害，防止感染，使皮肤具有一定的韧性和弹性。 4 7 眦对免疫细胞的作用 i i a 对免疫细胞也有作用，卧对巨嗜细胞，粒细胞，淋巴细胞，自然杀伤细胞( n l ( ) 等 均有一定作用，低浓度的 l a 对吞噬细胞和n l 【的功能有轻度促进作用，但对淋巴细胞的转化， e 花环的形成有抑制作用：较高浓度的i i a 对淋巴细胞，n l ( 细胞，吞噬细胞功能都有明显抑 制作用，且有量效关系。高m r 的h a 可阻止成纤维细胞，琳巴细胞，中性白细胞等的移动， 并对细胞的增生和分化具有抑制作用；而低m r 的l i a 则可促进这些细胞的移动，增生和分化。 7 4 8h a 对创伤愈合的影响 i i a 还可加速创面愈合。1 9 9 1 年，k i n g 等发现，眦有益于伤口愈合，创伤早期局部 i i 浓度明显增高，并对多种炎性细胞有调节作用高浓度、高m r 的 i a ，具有较高的促愈合， 调控胶元合成，调节纤维活性和抗炎等作用。其原理是伤口中的i i 在酶的作用下，降解为 低分子量 l a ，进而促进伤口愈合。 4 9 已有文献报道称，体内部分细胞存在着具有与m 高亲合力的受体“”，这对其在医 疗领域的应j f 也具有一定意义。 5 i l a 的应用 5 1h a 在医药中的应用 5 1 1 l a 在l 临床医学上的应用 5 。1 ，1 1h a 制品的临床使用价值 5 1 1 1 1 眼科 5 1 1 1 1 1 i 在眼科手术中的应用 1 9 7 6 年，眼科手术黏弹剂 i a 上市，在眼科界形成了黏性手术这一领域，并被认为是2 0 世纪7 0 8 0 年代眼科界重大进展之一。迄今为止。对粘性手术领域，h a 仍是最理想和唯一 可用的材料。眼科临床上对手术黏弹剂有如下要求( 1 ) 当实旋眼前节手术时。由于房水的 流出，会造成前房塌陷，需有物质将前房填充起来；( 2 ) 要求具有缓冲机械力，覆盖于组织 表面形成一层保护膜，将组织有效地保护起来，避免手术器械及植入物对其造成损伤：( 3 ) 有助于去除组织碎片或血块，将组织隔离以预防粘连的发生；( 4 ) 具有清晰的手术视野，手 术器械应能够在其中活动自如( 5 ) 具有良好的生物相容性和安全性i 争- 3 的 l a 溶液可满 足上述要求。作为眼科手术用黏弹剂，其具有良好的生物相容性，化学惰性，透明性，易注 入和吸出，稳定性好等特点，被认为是一种安全理想的眼科手术辅助剂。在眼科手术中，l l a 可保护角膜上皮，缓冲机械力，维护正常前房，保护眼内组织，防止玻璃体脱出，h a 的应 用使以前不能完成的手术操作成为可能，并大大降低了部分高难手术的难度。例如，当行使 视阿膜复位术时，应用f i a 溶液可将脱落的视网膜推回正常状态并维护一段时间直至视网膜 与色素上皮愈合，由于其黏稠故不易透过视网膜上的洞或裂缝进入视网膜下组织，而以往采 用生理盐水或空气时，上述现象是不可避免的。h a 可作为黏弹性手术“钳”分离视网膜前 膜，对组织没有损伤，这也是任何其他器械或方法所达不到的。 h 矗溶液在不同的国家以药品或手术器械获准应用于临床目前应用f i 的眼科手术有： ( 1 ) 白内障囊内摘出术；( 2 ) 白内障囊外摘出术；( 3 ) 白内障超声乳化抽吸；( 4 ) 人工晶 状体植入；( 5 ) 人工晶状体取出；( 6 ) 角膜移植：( 7 ) 虹膜周边粘连切开术；( 8 ) 虹膜囊 肿切除术；( 9 ) 小粱切除术；( 1 0 ) 前房、角膜及玻璃体异物取出术；( 1 1 ) 前房出血清除术； ( 1 2 ) 视网膜脱离手术；( 1 3 ) 玻璃体切割术：( 1 4 ) 视网膜前膜切除术等。 5 l1 1 1 2h a 在治疗眼干燥症方面的应用 i i a 与其它多种高分子聚合物己广泛用于制作人工泪液以改善眼干燥症状，其均具有跟 表存留时间长的特点，而h a 溶液由于其非牛顿流体的特性，显著的亲水能力及润滑作用而 具有明显的优势。 p o l a c k 报道“”。应用0 1 的i i a 治疗干燥综合症结果表明滴入h 溶液后。眼内疼痛 感立即消失，且只要角膜上留有 l 溶液就不会有疼痛感。m c d o n a l d 等，用0 i 蝴- a 和1 4 9 6 聚乙烯醇溶液治疗严重眼干燥症，采用随机交叉，多中心的方法治疗4 周，对眼睛的烧灼 感和砂砾感评价结果进行了比较。结果表明 i a 可明显改善烧灼感，虎红染色积分显著降低， 证实h 矗是缓解严重眼干燥症症状安全有效的药物。 5 1 1 1 1 _ 3 i 在眼用制剂中的作用 i i a 除了作为主要成分配成滴眼液治疗眼干燥症以外，还作为眼用制剂的媒介而广泛地 3 应用于眼用制剂中。眦稀溶液与泪液相似，呈非牛顿液体特性，具有与泪液相似的黏滞性 和伸缩性，具有很好的生物耐受性。研究发现，l i a 作为眼用制剂的媒介通过其物理增黏、 膜亲和以及与药物的结合等作用，可明显延长药物在眼部的存留时间，显著提高药物的生物 利用度，其优势是其它任何高分子材料所不能比拟的。在国内，将i i a 作为药物媒介，开发 了一系列含不同活性成分的滴眼液作为药物推上l 临床，其中含0 1 h a 的氯霉素滴眼液( 商 品名：润舒) 用于眼干燥症，可预防和治疗眼干燥症造成的继发性感染。 5 1 1 1 2 骨科” 透明质酸的润滑与缓冲作用，使其应用于骨关节炎、肩周炎与类风湿性关节炎的治疗， 具有独特的疗效2 1 。1 。 i a 凝胶用于骨关节腔内注射治疗骨关节病是近年来在骨关节病治疗 中的一大创举。大量的临床应用结果表明，应用 i a 作关节腔内注射治疗骨关节病，不仅克 服了以前用激素治疗的副作用，而且近期和远期效果均优于激素，成为激疗骨关节病的首选 材料。它的主要作用在于保护关节软骨，润滑关节腔，改善关节液和抑制疼痛。而且外源性 高分子量的l l a 注射在关节腔内，改善了关节腔的生物环境，促进患者自身体内合成高分子 量的 i a 。因此，一个疗程结束后，尽管外源性 i a 在数天后已进入代谢，但都可维持1 年半 - - 2 年。但注射低分子量 i a 时，则维持半年。现在临床应用于各种骨关节病、风湿性关节 炎以及骨骨头缺血坏死，均获得较好的效果。 5 1 1 1 3 防止术后粘连 在各种外科手术中，i i a 能有效预防术后粘结。外科手术后组织粘结迄今为止尚无有效 的预防和治疗方法。因此，如何预防外科手术后组织粘结和寻求治疗组织粘结是当今外科研 究的重要课题之一。j i a 作为外科手术后防治组织粘结，使粘结的发生率大大降低，其应用 效果在国内外的大量临床实践中均得到证明。h 防止术后组织粘结的机理是：1 、眦凝胶具 有高分子纤维网状结构，涂布于组织表面起到阻隔作用，在腹膜修复期起到一个暂时的屏障； 2 、抑制术后出血和渗血，减少能形成永久粘联骨架的数量，避免组织接触面的纤维蛋白沉 着；3 、高浓度、高分子量h a 抑制粒性白细胞迁徙和吞噬作用，并且抑制血小板的沉积，显 示出h a 的抗炎特性：4 、h a 与问质细胞和成纤维细胞表面的高亲和力的h 受体蛋白相互作 用，提高这些细胞的迁徙能力并使其迁徙定向，从而改善内源性修复过程；5 、 i 凝胶覆盖 于创伤浆膜表面，维持充足的时间不降解代谢，使早期的创伤组织修复规则而有序地生长， 直至形成一连续的间皮细胞层覆盖于刨伤表面，达到生理性修复。 5 1 1 1 4 烧伤科：促进创口愈合 i i 作为细胞外基质的重要成分通过调节细胞与细胞，细胞与基质的相互作用，促进创 伤愈合抑制胶原过度沉积导致瘢痕生成，研究表明创伤早期可发现局部h a 浓度明显提高， 同时研究发现，早期胚胎创口修复过程中局部l i a 高浓度状态由创伤初期直至完全愈合，可 再生性修复，不留疤痕。i l 缶床上通过延长h a 在创面作用时问，对软组织修复已见成效。 5 1 1 1 5 皮肤科“1 i i a 能用来治疗皮肤炎症，它对皮肤炎症主要调节作用为：抑制前列腺素e 的水平；抑 制炎症的酯化性和移动，抑制吞噬细胞的吞噬作用，抑制自由基的产生 5 1 1 1 6 耳鼓膜修补。1 鼓膜穿孔是临床中常见的疾病，由急、慢性中耳炎，外伤等；f 起。虽然大多数鼓膜穿孔 可自行愈合，但有些则无法自行愈合，必须通过手术修补才能恢复。手术修复鼓膜常会引起 术后原有鼓膜结构改变，影响听力的恢复程度，这主要与瘢痕组织形成及使用的移植材料有 关。为了改善修复鼓膜的质量使听觉功能最大程度的恢复，需要建立一种新的更好的治疗 手段。近年来，国内外探索医用透明质酸钠在耳鼓膜修补中的应用，取得了可喜的成果总 结大量的临床结果，表明透明质酸钠治疗鼓膜穿孔是可行的，无任何副作用，是冶疗干性鼓 膜小穿孔的良好手段 9 5 1 i 1 7 鼻鼾阻止剂 透明质酸与吡咯酮羧酸，山梨醇一起有防止鼻腔粘膜干燥的作用，可有效防止鼻鼾，本 剂可以在睡前或睡中以气溶胶，喷雾器或滴管滴鼻 5 1 1 2 l 在临床诊断学上的价值”1 i i a 水平在许多疾病中，呈现出明显的升高，而且血中卧很容易检测，于时它可以作为 一种观察指标辅助诊断某些疾病、临床上检测m 的血清含量水平，能反映出各种疾病的变 化，现已证实，血清中 i a 含量水平的变化与肝脏疾病的病程和肝细胞损害程度密切相关， i i a 是反映肝内皮细胞功能和肝硬化的有实用价值的新指标。 5 1 2h a 在药学领域的应用 5 1 2 1 诱导靶向技术 透明质酸衍生物诱导靶向技术( h i t ) 是以透明质酸或其衍生物作为载体与各类治疗药 物组成复方，将各种药物导向送到各病理部位，使药物定位于作用部位并发挥药效，从而减 少药物的全身性副作用。 5 1 2 2 缓释控释新型基质 队对各种物质具有分子囊状包埋作用，可作为固定剂与药物结合；减缓释放，从而大 大增强药物疗效，同时减少被包裹物对人体的过敏等刺激作用。 5 2 i 在化妆品中的应用 i i a 的保水作用，除保水能力强外，研究者发现其保水性受环境影响小，在低湿度时表 现高吸水性，而在高湿度时表现低吸水性，因而被称为理想保湿因子。与传统保湿剂相比 当h a 加入化妆品中涂于皮肤表面时，会形成一层粘弹性透明水化膜，保湿效果更好，且无 油腻感和阻塞毛孔等缺点。透明质酸不仅广泛用于配制各种护肤霜、防晒霜和增白霜等产品， 近年由于发现其消除皮肤皱纹功能，使含透明质酸的化妆品成为国际上。第四代化妆品”和 “仿生化妆品”。 5 2 1 浴剂 在浴剂中加入透明质酸浴后仍能保持水分，使皮肤富有光泽和滑润感觉。使用时可将 分子量l o - _ 2 0 0 万的透明质酸按l o g l 配成水溶液作浴剂，再以l o o m l 浴剂加入4 0 0 l 热水 中即可；也可用固体粉末按l ：4 0 0 比例直接入浴。 5 2 2 粉末状增白剂 增白基质主要由水溶性粉末和具有增白效应的抗坏血酸组成，如配合透明质酸，效果 更佳。主要是透明质酸可调节细胞代谢，保护组织柔嫩性，使增白剂有更好的皮肤保护性能。 5 2 3 粉饼 固体粉末状化妆品用于皮肤应舒适、滑润、附着力好，搽于皮肤能成均匀，细腻的粉层 为此，耪末化妆品原料中应加入界面活性剂或油剂。但时间一久，界面活性剂或油剂挥发， 变硬缩小，成碎颗粒。这种化妆品原料在高压下难以成型。透明质酸可提高加压化妆品( 如 粉饼) 的成型性，不易产生颗粒，改善对肌肤的附着力。使用时可加用表面处理剂( 单硬脂 酸甘油、山梨醇脂肪酸酯、角鲨烯等) ，不仅能改善透明质酸的物性，其本身也可缓慢渗入 皮肤，起营养和润泽作用。 5 2 4 乳、霜剂 固体透明质酸为纤维状，作为乳剂，霜剂等水性化妆品的原料，使用时需粉碎，配制将 透明质酸滴于凝固液，得悬浮胶粒，真空干燥，避免降解。 5 3 眦用作美容保健食品 在日本，胜从上世纪9 0 年代开始用作具有美容作用的保健食品，服用后可增加人体内 i i a 的合成，提高皮肤中h 的含量。使皮肤保水量增加，光滑细嫩而富有弹性。 5 4i i 在墨水中的应用 h a 还被用于油墨中，a r i s a w a 等研究发现，在普通墨水中加入0 5 的h 后，墨水就不 易风干失水，自来水笔吸取普通墨水后拔去笔帽放置于空气中，4 h 后笔尖即被封而出水不 畅。使用加 i 的墨水，l o 天内自来水笔均可正常作用。 6 卧的生产 6 1 动物脏器提取法 这是生产透明质酸的传统方法，主要从雄鸡冠、人脐带、动物眼玻璃体等含i i 丰富的 动物组织中分离精制，如占据世界眼科市场的h a 制齐卜瑞典p h a r m a c i a 公司的h e a l o n 就仍是采取这种方法以雄鸡冠中制取的精品。以下分别以动物眼玻璃体、雄鸡冠、人脐带为 原料来介绍提取法的工艺流程。 6 1 1 以雄鸡冠为原料的生产工艺“1 冻鸡冠旦墅! b 脱水鸡冠墨滤液塑垡鲤堕马水相墨墅! 马透明质 酸 丝垄王生 粗品型丝堕堕生溶解液苎型墅坠望盟墨墼 水相 些堂堂业型堕墅堡专酶解液皇塑 墨一水相旦旦苎堕墨哼沉淀坐型型堕童s 二上清 液竺坚璺沉与沉淀旦查马i l a 精品 6 1 2 以动物眼玻璃体为原料的生产工艺m 】 牛眼玻璃体墨蔓查 上清液三苎塑堕墅i 薹寸沉淀些丝堡兰一上清液 苎兰堕墅马上清液旦型些苎沉与沉淀里塑：鸟租品一! 墨型些些堡生，上清液 型丝壁坐! i 滤液旦翌堕堑斗h a - c p b 络合物些坚坚型! o 上清液 塑盟竖璺耍i 屿沉淀里旺鸟l i 半精品苎马l i a 精品 6 1 3 以人脐带为原料的生产工艺 脐带- 旦牛脱水脐带马脐带碎块型坠堡马提取液型垡笪堕一水相 型堑i 马沉淀旦塑兰斗h a 粗品型型型堕马溶解液苎丝塑! ! 吗水相 丝幽塑坚塑型堕墨专酶解液马水相堡垡望马沉淀坐型趔塑乌上清液 至型马沉淀垦苤马h a 精品 6 1 4 工艺说明 ( 1 ) 原料经丙酮脱水脱脂并绞碎后须蒸馏水提取2 - 3 次，合并提取液。 ( 2 ) 在制备h a 过程中，尽可能采用温和条件，以盐析，酶解等方法去除蛋白与核酸， 避免可能使h a 大分子降解的处理，如加热、强酸、强碱。 ( 3 ) 蛋白水解酶不可以采用胃蛋白酶。因胃蛋白酶最适p h 太低，为1 5 ，易导致透明 质酸的酸水解 ( 4 ) 采用专一性比较低的蛋白酶如木瓜蛋白酶或链霉蛋白酶以进行广泛的蛋白质水解， 酶解的另一重要作用是切断透明质酸与蛋白质分子的结合。 l l ( 5 ) 选择活性较高的蛋白水解酶，因酶本身是一种蛋白质，在保证酶的总活性单位的 前提下，酶总重量越少越好，这样可减少产品中的蛋白杂质。 ( 6 ) 醇沉淀是分离提取 i a 、肝素、硫酸软骨素等粘多糖最常用的方法，每次醇沉淀操 作，都会使h a 的纯度有所提高。 ( 7 ) 乙醇沉淀h a 时，i i a 溶液中一定要有盐的存在，否则不产生沉淀，这是酸性粘多 糖的共性。 ( 8 ) 乙醇沉淀i i 还有一重要作用是脱色经多次乙醇沉淀后，卧为纯白色。 ( 9 ) 不同最终浓度的乙醇沉淀操作还可对不同l i r 的h a 进行分级分离，在较低乙醇浓 度下，低m r 的f l a 不易被沉淀出来1 i r 越高，越容易被沉淀。 ( 1 0 ) 工艺过程中采用氯仿的作用是使蛋白变性沉淀，故可除去蛋白杂质，氯仿处理的 另一个重要作用，是除去致炎物质，如细菌内毒素是一种脂多塘，兼具水溶性和脂溶性，在 进行氯仿处理时，聚集在氯仿和水的界面，利用这一性质可除去细菌内毒素。另外，加快搅 拌速度，可提高氯仿在水中的分散度，极大地扩大氯仿和水的界面面积，提高去除细菌内毒 素等致炎物质的效率。 ( 1 1 ) 三氯醋酸亦可发挥同氯仿相同的作用，可沉淀除去蛋白杂质。 ( 1 2 ) 卧与其它酸性粘多糖聚阴离子的电荷密度不同，与c p c 或c p b 络台生成沉淀时 盐浓度得以不同，络合沉淀物解离所需最低盐浓度也不同，故使用c p c 络合沉淀法，可实现 透明质酸与肝素、硫酸软骨素等其它粘多糖的分离。 ( 1 3 ) 氯化十六烷基毗啶( c p c ) 、溴化十六烷基吡啶( c p b ) 、十六烷基三甲基溴化铵( c t a b ) 三者在腿的生产中可相互代用。 ( 1 4 ) 透明质酸在干燥前要充分脱水，否则有机溶济挥发后，残存的水分过多，会导致 被干燥的产品粘结，不易于干燥，干燥时间延长，干燥后产品变硬、变黄。脱水所用的溶剂 为无水乙醇、9 5 乙醇、丙酮等。丙酮沸点低，挥发性高，用丙酮脱水后易于干燥，但干燥 后的产品带有特殊气味。干燥的产品量较少时，可采用p 舡真空干燥，产品量较多时，可采 用动态真空干燥，温度控制在5 0 - 6 5 ，不用p 舡。 ( 1 5 ) 以人脐带为原料所制取的i i a 精品，应用时引起抗原反应的可能性较小。 ( 1 6 ) 以动物眼玻璃体为原料制得的透明质酸，其质量较以雄鸡冠和人脐带为原料者差， 相对分子质量l i r 较小，一般不适于作注射剂使用 ( 1 7 ) 动物组织必须是新鲜采集并经冷冻处理 传统动物脏器提取法存在许多缺点：原料来源困难，价格昂贵；这些动物组织中i i a 含 量很低，产品收率低；i l a 在原料中与蛋白质和其它粘多糖形成复合体，在提取过程中必须 使用大量有机溶剂和酶，工艺复杂，操作单元多，造成生产成本大大增加。产物h a 分子量 取决于原料，难以控制其品质，一般小于l0 1 0 5 ，保湿性较差；且最终制品中混有硫酸软 骨素等不纯物，杂质含量高，精制困难。加之高生产成本造成i l 价格昂贵，制约了透明质 酸在化妆品和医药上的广泛应用，无法满足日益扩大的需要。自2 0 世纪8 0 年代以来，一种 新的 l a 生产工艺微生物发酵提取法，因其相对于动物脏器提取