（发育生物学专业论文）盐芥thcdpk9基因功能研究.pdf

山东师范大学硕士学位论文 盐芥砌a 脯9 基因功能研究 ( 山东师范大学生命科学学院，济南，2 5 0 0 1 4 ) 摘要 钙依赖蛋白激酶( c a l c i u m d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e c a l m o d u l i n 1 i k ed o m a i np r o t e i n k i n a s e ，c d p k ) 是植物和一些原生生物所特有的一类丝氨酸苏氨酸型蛋白激酶，可以不经 钙调素的作用而直接被钙信号激活。分子量一般为4 0 一- - 9 0k d a 。c d p k s 是一个多基因家族， 其中拟南芥有3 4 个c d p k s ，水稻中有3 1 个。 c a 2 + 作为植物细胞中的第二信使，在调节植物从感应环境胁迫信号到下游基因的表达 过程中有着关键作用，而c d p k s 在植物钙信号转导中具有非常重要的作用，c d p k 的活性 受c a “、可逆磷酸化、磷脂、1 4 3 3 蛋白的调节。c d p k 有许多不同的底物，这决定了它功 能的多样性。越来越多的证据表明c d p k 参与了植物碳氮代谢、磷脂合成、离子和水分跨 膜运输、细胞骨架调节、植物激素的信号转导和代谢、生长发育调节以及生物和非生物胁 迫应答反应。研究表明，拟南芥的c d p k s 能够在内质网膜、过氧化物酶体、细胞膜、细胞 质、细胞核、线粒体等部位分布。 拟南芥作为模式植物具有很多优点，但拟南芥是典型的甜土植物，其耐盐程度不高， 而盐芥是一种与拟南芥近缘的十字花科植物，具有很多与拟南芥相同的优点：如形态类似、 基因组小、生活史短、种子丰富和易于被转化等。但是，盐芥对多种胁迫的耐受能力远远 高于拟南芥，它在短时间内能耐受高达5 0 0m mn a c l 的冲击。 本实验从盐芥e s t 库中得到盐芥t h c d p k 9 基因，旨在研究盐芥死a 獬9 的生物学 功能，该基因全长1 6 1 4b p ，所编码的蛋白序列有5 3 7 个氨基酸( 约6 0k d a ) 。i p s o r t 软件 预测显示该蛋白既没有信号肽，也不是线粒体或叶绿体蛋白，又用p s o r t 软件进行分析， 发现该蛋白定位于内质网。 首先构建了盐芥t h c d p k 9 e g f p 融合蛋白植物表达载体，并对洋葱表皮进行了农杆 菌介导的转化，通过激光扫描共聚焦显微镜检测对盐芥t h c d p k 9 的亚细胞定位进行了初 步的分析，但是没有检测到g f p 信号。为了进一步研究该蛋白的定位，我们还浸染了拟南 芥，已得到3 0 株抗性苗。 构建了g s t t h c d p k 9 载体，转化至大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) ，发现2 8 ，o 8m m i p t g 诱导4h ，g s t t h c d p k 9 融合蛋白主要以可溶性形式存在于上清中，该蛋白进一步纯化后 可用于研究激酶活性的测定及互作蛋白、底物的鉴定等。 山东师范大学硕士学位论文 构建了盐芥t h c d p k 9 的基因沉默载体，导入农杆菌后，转化盐芥，用0 2 的除草剂 筛选，获得2 5 株转基因抗性苗。通过转基因盐芥中t h c d p k 9 的转录水平的检测及转基因 盐芥的表型分析，来研究该基因的功能。对转基因盐芥植株进行了分子生物学检测发现： 1 、各转基因株系中，以其基因组d n a 为模板，均能通过p c r 扩增出5 0 0b pb a r 基 因特异性条带，表明t d n a 已经携带b a r 基因及盐芥t h c d p k 9 基因片段整合进盐芥基因 组中。 2 、r t p c r 结果显示，我们已得到两株盐芥t h c d p k 9 基因表达下调的转基因株系。 关键词：盐芥、t h c d p k 9 、基因沉默、反转录p c r 分类号：q 7 8 2 山东师范大学硕士学位论文 t h ef u n c t i o n a ls t u d yo ft h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l ac d p k 9 ( c o l l e g eo fl i f es c i e n c e ，s h a n d o n gn o r m a lu n i v e r s i t y ，j i n a n ，2 5 0 0 1 4 ) a b s t r a c t c a l c i u md e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e s ( c d p k s ) a r eak i n do fs e r i n e t h r e o n i n ep r o t e i nk i n a s e s t h a ta r eo n l yp r e s e n ti np l a n t sa n ds o m ep r o t i s t t h ea c t i v i t yo fc d p k si sd e p e n d e n to nc a 2 + b u t n o to nc a l m o d u l i n c d p k sh a v eam o l e c u l a rm a s so fa p p r o x i m a t e l y4 0 - - - 9 0 k d a c d p k sa r ea m u l t i g e n ef a m i l ya n dt h e r ea r e3 4c d p k si na r a b i d o p s & t h a l i a n aa n d3 1c d p k si nr i c e a sas e c o n dm e s s e n g e ri np l a n tc e l l s ，c a 2 十p l a y sa k e yr o l ei nr e g u l a t i n gt h ep r o c e s s e sf r o m p e r c e i v i n ge n v i r o n m e n t a ls t r e s ss i g n a l st od o w n s t r e a mg e n ee x p r e s s i o n t h ea c t i v i t yo fc d p k s i s r e g u l a t e db yc a l c i u mi o n s ，r e v e r s i b l ep h o s p h o r y l a t i o n ，p h o s p h o l i p i d sa n d14 - 3 - 3p r o t e i n s c a l c i u m - d e p e n d e n tp r o t e i nl ( i n a s e s ( c d p k s ) a r e e s s e n t i a ls e n s o r - t r a n s d u c e r so fc a l c i u m s i g n a l i n gp a t h w a y si np l a n t s c d p k sh a v em a n yd i f f e r e n ts u b s t r a t e s ，w h i c hr e f l e c tt h ed i v e r s i t y o ft h e i rf u n c t i o n s p o t e n t i a lp r o t e i ns u b s t r a t e so fc d p ka r ei n v o l v e di nc a r b o na n dn i t r o g e n m e t a b o l i s m ，p h o s p h o l i p i ds y n t h e s i s ，i o n a n dw a t e rt r a n s p o r t ，c y t o s k e l e t o no r g a n i z a t i o n ， t r a n s c r i p t i o na n dh o r m o n er e s p o n s e s ，g r o w t ha n dd e v e l o p m e n tr e g u l a t i o n ，b i o t i ca n da b i o t i c s t r e s sr e s p o n s e si np l a n t s s o m es t u d ys h o w st h a tc d p k so f a r a b i d o p s i st h a l i a n aa r ed i s t r i b u t e d i ne n d o p l a s m i cr e t i c u l u m ( e r ) ，p e r o x i s o m e ，c e l lm e m b r 柚e ，c y t o p l a s m ，n u c l e u s ，m i t o c h o n d r i a a sam o d e lp l a n t ，a r a b i d o p s i st h a l i a n ah a sl o t so fm e r i t s b u ta r a b i d o p s i st h a l i a n ai sa t y p i c a lg l y c o p h y t e ，a n di t st o l e r a n c et os a l ti sl o w t h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l a ，w h i c hb e l o n g st o c r u c i f e r a e ，i sac l o s er e l a t i v et oa r a b i d o p s i sa n dh a sg o o dg e n e t i cf e a t u r e ss u c ha ss i m i l a r m o r p h o l o g y ，s m a l lg e n o m es i z e ，s h o r t l i f e c y c l e ，h i g hs e e dn u m b e ra n d a ne f f i c i e n t t r a n s f o r m a t i o nm e t h o d h o w e v e r ，t h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l ai sa b l et ow i t h s t a n dd r a m a t i cs a l i n i t y s h o c ku pt o5 0 0m mn a c l t h ec d p k 9g e n ew a so b t a i n e df r o me s t s ( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g s ) a c q u i r e df r o m 入z a p c d n al i b r a r yo ft h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l ai n o u rl a b t h i sp r o j e c ta i m st os t u d yt h e f u n c t i o no ft h c d p k 9g e n e t h ef u l ll e n g t ho ft h i sg e n ei s1614 b p ，a n dt h ep r o t e i ne n c o d e db y t h i sg e n ei sc o n s t i t u t i v eo f5 3 7a m i n oa c i d s ( a b o u t6 0k d a ) i p s o r ts o f t w a r ep r e d i c t i o n i n d i c a t e dt h a tt h c d p k 9h a sn os i g n a lp e p t i d es e q u e n c ea n di sn o tm i t o c h o n d r i ao rc h l o r o p l a s t p r o t e i n i no r d e rt ou n d e r s t a n dt h eb i o l o g i c a lf u n c t i o no ft h c d p k 9g e n e ，w ef i r s t l yc o n s t r u c tp l a n t t h c d p k 9 - e g f pb i n a r ye x p r e s s i o nv e c t o r t h i sc o n s t r u c tw a st r a n s f o r m e di n t ot h eo n i o n e p i d e r m a lc e l l sb ya g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dt r a n s i e n tt r a n s f o r m a t i o n ，b u tw ed on o td e t e c tt h e 3 山东师范大学硕士学位论文 g f ps i g n a l t of u r t h e rv e r i f yt h er e s u l t ，t h i sc o n s t r u c tw a st r a n s f o r m e di n t ot h ea r a b i d o p s i sb y f l o r ad i p p i n ga n do b t a i n e d3 0l i n e s a tt h es a m et i m e w ec o n s t r u c t e dg s t t h c d p k 9v e c t o ra n dt r a n s d u c t e di n t oe c o l is t r a i n b l 2 1 ( d e 3 ) t h eb l 2 1c e l lg r e wf o r4ha t 2 8 a f t e r0 8m mi p t gi n d u c t i o n 。t h e g s t t h c d p k 9a m a l g a m a t i o np r o t e i nw a ss o l u b l ea n de x i s t e di ns u p e r n a t e n t t h ep u r i f i e d p r o t e i nc a l lb eu s e dt op r o t e i nk i n a s ea c t i v i t ya s s a ya n do t h e r s t u d i e s w ec o n s t r u c tg e n es i l e n c i n gv e c t o ro ft h c d p k 9a n dt h i sc o n s t r u c th a sb e e nt r a n s f e r r e di n t o a g r o b a c t e r i u mm m e f a c i e n sg v 3 10 1 t h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l aw a st r a n s f o r m e dw i t hr e s u l t a n t g v 3 1 0 1b yf l o r a l - d i pm e t h o d ，a n dt ot r a n s f o r m a n t sw e r es c r e e n e dw i t hb a s t a f i n a l l y ，w e o b t a i n e d2 5b a s t a r e s i s t a n tl i n e s t h em o l e c u l a ri d e n t i f i c a t i o n so ft h e s eb a s r a r e s i s t a n tp l a n t sa r e a sb e l o w ： 1 p c rr e s u l ts h o w e dt h a ta l lb a s t a - r e s i s t a n tp l a n t sh a ds t r o n gp o s i t i v es i g n a l s ，a n dn os i g n a l w a ss h o w ni nw i l dt y p ep l a n t s 2 r t p c rr e s u l ts h o w e dt h a tw eh a v eo b t a i n e dt w ol i n e sw h e r et h el e v e lo fr n a e x p r e s s i o n i sw e a k e rt h a ni nw i d et y p e k e yw o r d s ：t h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l a ， g e n e s i l e n c i n g ，t h c d p k 9 ， r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n c a t e g o r y ：q 7 8 4 山东师范大学硕士学位论文 英文缩略表 5 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如没有其他需要特别声 明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 犯 导师签字： 学位论文版权使用授权书 巩瓠 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权登 丝可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名孥致 导师签字： 私丢c 签字日期：硼7 年月p 日 签字日期：矽7 年月尸日 山东师范大学硕士学位论文 第一部分文献综述 1 钙依赖的蛋白激酶 自然界中，植物常常因为受到生物和非生物条件的改变而改变，比如冷、干旱、盐渍 和病害。植物对这些胁迫的应答包括许多活性机制，这些机制包括加强胁迫诱导基因的表 达和积累与胁迫有关的蛋白。 钙离子作为植物信号传导中的第二信使与对外部及发育信号的生理应答相联【l 】。植物 细胞通常保持低的胞质c a 2 + 水平，胞质游离钙离子浓度在非生物刺激( 光、高温、低温、高 渗、氧化胁迫) 及生物刺激( 真菌引发子和节瘤因子) 引起的信号转导中有明显的改变【2 ，3 1 。胞 质c a 2 + 的特异性增加称为c a 2 + 信号【4 1 。质膜上特异的c a 2 + 介导的细胞进程的开始都通过通 道、泵、转运体，并伴随着一种c a 2 + 信号的产生。胞质自由c a 2 + 水平的改变通过一种专门 的蛋白钙传感器来感应。 1 1 作为钙传感器的植物蛋白激酶 植物蛋白激酶是一个差异性很大的钙传感器群。通过对1 2 6 4 种植物蛋白激酶序列的相 似性分析，我们定义了蛋白激酶中的c d p k s n r k 家族【5 1 。c d p k s n r k 超家族中的成员的n 端都具有一个相似长度和序列的激酶催化区，然后是连接区，连接区都有一个相似的结构。 区别9 个亚家族的主要标志是末端区域的主要结构和激酶调节模式( 图1 1 ) 【6 。 6 j u n c t i o nd o m a l n ( a u t o i n h i b | t o r l k i n a s e l r e g u l a t o r y d o m i nl d o r n a i n l e f j n d 上 、 c d p k 叫：= = = ：= = = = = ：，幸 二= _ i 目譬= j c 疆i c h 胂) - d - n 嘶mp n a 嵋 nk n o 神 c a m - i 墩e 图1 1 ：c d p k - s 玎r k 超家族成员的激酶结构图6 ，7 1 调节区中的黑色方框：功能型e f 手型；调节区中的白色方框：非功能型e f 手型 f i g 1 - 1 ：d i a g r a mo f k i n a s es t r u c t u r e sf o rm e m b e r so f t h ec d p k - s n r ks u p e r f a m i l y b l a c kb o x e sw i t h i nt h er e g u l a t o r yd o m a i n ：f u n c t i o n a le f - h a n d s ；w h i t eb o x e sw i t h i nt h er e g u l a t o r yd o m a i n ： n o n f u n c t i o n a le f h 锄d s l 6 7 】 山东师范大学硕上学位论文 研究发现，五种c d p k s n r k 亚家族( c d p k ，c c a m k ，c a m k ，c r k 和s n r k 3 ) 直接或 间接调节钙离子。其中有两种( c d p k ，c c a m k ) 的c 末端含有e f 手型结构，三种( c c a m k ， c a m k ，c r k ) 结合钙调素，一种( s n r k 3 ) 结合钙调磷酸酶b 类似蛋i 刍c b l ( c a l c i n e u r i nb 1 i k e p r o t e i n s ) 。 c r k s 亚家族叫r k s ( c d p k - r e l a t e dk i n a s e s ) 与c d p k 结构大体相同，但是它的钙调 素类似结构却明显的退化。在拟南芥属的8 种c r k s 中，预测c r k s3 、5 和8 可能分别拥 有一对e f 手型结构，但是，目前还不清楚他们的功能【6 】。 c c a m k sq l ；家族- - - - - - - - c c a m k s ( c a l c i u mo rc a l c i u m c a l m o d u l i nr e g u l a t e dk i n a s e s ) 结构 与c d p k 的大体相同，其c a ：+ 结合结构域有三个e f 手型结构，但它们的结构类似于钙结合 脑蛋白，而不是钙调素。这种酶在烟草和百合中都有表达，但是在拟南芥中没有发现编码 c c a m k 的基因【8 】。c c a m k sf j s 够结合钙离子和钙调素，钙结合位点位于自抑制结构域的c 末端【9 】o c a m k s 、- i i ；家族叫a m k s ( c a l m o d u l i n d e p e n d e mp r o t e i nk i n a s e s ) 在动物中普遍存在， 植物中唯一有c a m k 的是苹果【1 0 1 。类似于c c a m k s ，拟南芥中也没有编码c a m k s 的基因。 c a m k s l l c c a m k s 少大约1 0 0 个氨基酸，并且没有e f 手型结构【8 1 。重组苹果的c a m k s f 毙结合 钙调素，但是c a 2 十钙调素对激酶活性的影响并没有决定作用【1 0 】。 s n r k 3 s 亚家族一一s n r k 3 s ( s n f l - r a l e t e dk i n a s e st y p e 3 ) 又叫做c i p k s ( c a l c i n e u r i n b - l i k ei n t e r a c t i n gp r o t e i nk i n a s e ) 或p k s ( p r o t e i nk i n a s e sr e l a t e dt os o s 2 ) ，包括催化、自抑制 和c 末端结构区。拟南芥属有2 5 个s n r k 3 s 1 1 】，并且大部分能够与e f 手型蛋白家族c b l s 或s c a b p ( c a l c i n e u r i nb l i k e s o s 3 1 i k ec a l c i u mb i n d i n gp r o t e i n s ) 1 0 个成员中的一个或多个相 互作用。s n r k 3 s 的c 末端结构不包含e f 手型结构，并且与c d p k s n r k 家族的其他成员 没有任何的相似性。 c d p k 亚家族c d p k s ，钙依赖钙调素不依赖的蛋白激酶( c a l c i u m d e p e n d e n ta n d c a l m o d u l i n i n d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e ) 或类钙调素结构域的蛋白激酶( c a l m o d u l i n l i k ep r o t e i n k i n a s e ) ，是唯一有c a m l d ( c a l m o d u l i n 1 i k ed o m a i n ) 的单节显性蛋白，c a m l d 能将钙传感 器直接偶联到应答元件上。c d p k 首先在植物中发现，原生生物中只发现了与c d p k s 结构 类似的激酶，而真菌、昆虫和哺乳动物中均未发现c d p k 2 1 。c d p k s 与细胞c a 2 + 信号传递有 着密切的关系，是植物中研究较多、了解较为清楚的一类蛋白激酶。c d p k s 种类也很多， 目前已知拟南芥基因组至少能编码3 4 种不同类型的c d p k s 1 2 ，13 1 。 7 山东师范大学硕士学位论文 1 2c d p k s 在植物体内的分布及其结构特点 c d p k s 全称为钙依赖的蛋白激酶( c a l c i u m d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e s ) ，c d p k s 首先在豌 豆中报道【1 4 1 ，并且在大豆中第一次得到纯化和鉴定【1 5 】。c d p k s 存在于高等植物、藻类及部 分原生动物中，但在细菌、真菌、酵母、线虫和动物中还未发现。 在植物器官水平上，c d p k s 存在于包括根、茎、叶、果实和种子等在内的所有植物器 官中【1 6 。9 】。在细胞水平上，分生细胞、木质部细胞、花粉细胞、保卫细胞和胚细胞中也均 能检测到c d p k s 的存在【2 0 2 2 1 。 c d p k s 参与了植物的生长发育及对环境胁迫的应答过程。植物在长期演化过程中，其 体内的c d p k s 以众多成员组成的家族形式存在，并且通过各自的结构特征和功能，分别 介导不同的内部发育和外部逆境的信号转导过程。在模式植物拟南芥的基因组中，迄今已 鉴定了3 4 个c d p k s ，分别位于所有5 条染色体上。在水稻中，已鉴定出3 1 个c d p k s 家 族成员【2 3 1 。在大豆 2 4 】、玉米【2 5 】、番茄【2 q 和烟草2 7 】中也鉴定到了一些c d p k s 。 c d p k s 是高等植物中唯一的c a ：+ 传感器，在结构上不同于其它物种中c a 2 + 调节的蛋白 激酶。c d p k s 为单肽链，在结构上具有明显的特征，c d p k s 蛋白从n 端到c 端存在四个 功能区( 结构域) ，依次为：n 端可变区、s e r t h r 激酶催化区、连接区和调控区( 图1 2 ) 。 n h 一厂丁厂 - - - c 0 0 h n h ：一l |i i 一i 可变区催化区连接i 蔓调控区 v a r i a b l ek i n a s e a u t o i n h i b i t o r yc a l m d u li n d o m a i nd o m a i nd o m a i nli k ed o m a i n 图1 - 2 ：c d p k s 的典型结构 f i g 1 2 ：t y p i c a ls t r u c t u r eo f c d p k s t 2 8 】 c d p k s 的n 端为可变区，在该区域，不同植物种属间的氨基酸残基数量变化较大，且 在氨基酸水平上的同源性较低。 与可变区相接的催化区由3 0 0 多个氨基酸残基组成，具有典型的s e r t h r 蛋白激酶的催 化保守序列，催化区的同源性较高。 连接区紧靠催化区，由2 0 - 3 0 个氨基酸残基组成，在各类功能区中最为保守，富含碱 性氨基酸，紧靠催化区而以拟底物的方式与催化区结合起自抑制作用 1 5 , 2 9 ，所以该区又称 自抑制区。c a 2 + 不存在时，c d p k s 催化区可能与连接区结合，使其激酶活性被抑制。连接 区的突变能产生不依赖c a ：+ 的具有组成型活性的激酶3 0 1 。 调控区是钙结合区，也是c d p k s 有别于其他类型激酶的特有区域，保守性最差。调控 山东师范大学硕士学位论文 区有一段结构和功能类似于c a m 的氨基酸序列，因此又被称为钙调素类似区。一般包括四 个e f 手型结构来结合c a 2 + 。这个结构决定了c d p k s 的活性依赖于c a 2 + 而不是c a m 。当钙调 素类似区没有结合c a 2 + 时，包括拟底物序列的自我抑制区能够与激酶催化区的活性位点相 互作用来抑制酶的活性。c a 2 + 与钙调素类似区的结合能够引起自我抑制区结构的改变，进 而使酶的活性位点暴露。激活的c d p k s 通过特殊底物的磷酸化参与不同的信号转导途径。 从分子进化角度上看，c d 纠b 可能来自于蛋白激酶和c a m 的融合【3 l 】。 1 3c d p k s 的亚细胞定位和器官表达 植物c d p k s 以可溶性和膜结合两种形式存在，c d p k s 有多种亚细胞定位，包括胞质、 细胞核、质膜、内质网、过氧化物酶体、线粒体外膜和油体阴。在拟南芥中，有9 种c d p k s 定位在细胞核、细胞质或质膜上【3 2 3 3 1 。在烟草中发现一个2 6 s 蛋白酶体的调节亚基 n t r p n 3 ，能够与n t c d p k l 相互作用，n t r p n 3 和n t c d p k l 都定位于核、核周围和质膜的边 缘【3 4 1 。 拟南芥大部分c d p 心的n 末端序列的第二个氨基酸残基均为甘氨酸【1 3 】，在适当的条件 下，n 末端的甘氨酸残基能被豆蔻酸共价修饰，如南瓜中 c p c d p k l 3 5 1 ，拟南芥中的 a t c p k 2 3 3 1 ，和西红柿中的l e c p k l 3 6 1 。这种肉豆蔻酰基化作用对c d p k s 定位在内质网【3 3 1 、 质膜【3 6 】上有重要的作用。 有研究证实某些c d p k s 在胁迫应答时能改变它们的定位。我们用绿色荧光蛋i 兰t ( g f p ) 标记，发现冰叶日中花在应答盐或脱水胁迫时，叶中表达的m c c d p k l 从质膜转移到核中【3 7 ， 3 8 】 0 c d p k s 在许多植物和植物器官中都有表达。很多情况下，c d p k s 在增生组织中有很强 的表达。在烟草中，n t c d p k l 主要在增生组织中快速表达，包括茎和根分生组织以及发育 的花芽，而，a 胪肼则在快速生长的组织中表达，如根尖，侧根，叶维管束，推测这种表 达差异可能与细胞分化和特殊的代谢功能有关【3 2 ，3 9 1 。水稻胞质o s c d p k l 3 在幼小的组织中 高水平表达【4 0 1 ，玉米z m c p k l l 在幼苗和快速生长的组织中高水平转录4 1 1 。此外，c d p k s 的转录物在种子和花粉中也检测到，水稻c d 蹦野，豳只在未成熟种子的胚乳中表达【4 2 1 。 1 4c d p k s 的底物 对c d p k s 的研究表明，不同的c d p k s 同系物具有不同的内源底物，因此在钙信号转 导中具有不同的生理功能。在非生物胁迫刺激下，植物细胞中c a 2 + 浓度发生变化，变化的 c a ：+ 激活c d p k s ，活化c d p k s 磷酸化相应的底物，这些底物在基因表达、酶代谢、离子 9 山东师范大学硕士学位论文 和水分的跨膜运输、细胞骨架的动态变化等微观方面具有潜在的调节作用，从而将钙信 表1 1 ：已知的潜在的c d p k 底物【h 1 t a b l e1 1 ：k n o w np o t e n t i a lc d p ks u b s t r a t e s i j 鹿物磷酸化位点底物来源( 物种) -c d p k 物种( c d p k r 潜在作用4 代谢 1 0 硝酸还原酶 磷酸烯醇式丙酮酸羧化爵 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 p s n 反应中心蛋白d 1 蔗糖磷酸合成酶 蔗糖台酶 蔗糖合酶2 蔗糖合酶( n o d u l i n - i 0 0 ) 胁迫相关的蛋白质 苯丙氨酸氨裂合酶 僚反应调节物 抗真菌的蛋白质 羧肚酶抑制剂 y 麓堇 脂质转运蛋自 n a p i n s 蛋白酶抑制剂 离子，水分转运 s o f r l k r t a s t p f m n a p o p o 唧a q l t x ( 琅m r r i s s v 既o d a t d r l t r 咖 g d r v l s r l i - i s v r e r i a t d r l t r 咖r l v s x v 它一鼍 、。? ”f u l t 睢 y 、一。t ? w 。基一 削i - 3 ：c d p k s 激活模式l ”j l ( = 撇酶结构域；c a m - l d ；钙调紊类似结构域：c a m - l d 中有白色点的是没有结合钙离子的n - 和c - h i b e s ； 黑色点是己结台钙离子的n 和c - l o b e s f i g1 - 3 ：a c t i v a t i o n m o d e l s f o r c d p k s ( t q k k i n a l s ed o m a i n ；c a m - l d c a l m o d u l i n j l k e d o m a i n ；w h i t e d o t s w i t h i n na n d c - l o b e s e m p t y c a 2 + b i n d i n g s i t e s ；b l a c k d o t s w i t h i n na n d c - l o b e s c a 2 + b i n d i n gs i t e s w i t h b o u n d c d c a m - l d f l j 两个e f 手型结构组成( n 1 0 b e ，c 1 0 b e ) ，每一个包含一对钙离子结舍位点， 与激酶结构域相连j 。钙离子激活后，c a m - l d 结台到连接区，并且代替了自抑制区域( 模 式j ) 。在第二种模式，目前已有证据证明，基底水平钙离子浓度下，c a m l d 预先与连接 山东师范大学硕士学位论文 区结合【4 3 1 。这说明了在体内基底钙离子浓度下，c 一末端l o b e 先与钙离子结合后，再结合到 连接区域。 1 5 2 可逆磷酸化的调节 除了钙离子之外，可逆磷酸化和自体磷酸化也可能会调节c d p k s 活性【13 1 。磷酸化调节 在烟草n t c d p k 中发现。这种磷酸化激活在应答特定的病原体时发生，可能通过 m a p k ( m i t o g e n a c t i v a t e d p r o t e i nk i n a s e ) 催化，但是上游的激酶和磷酸化调节位点还没有确 定r 刀。 在天然和重组的c d p k s 中都存在自体磷酸化现象。尽管许多c d p k s 的自体磷酸化位点 已经确定，但是对于c d p k s 的体外磷酸化的作用却知之甚少，而体内的生理或机理作用也 基本是未知的4 5 1 。例如体外自体磷酸化对花生c d p k s 的激活是必要的，但是，与之相反， 在翼翅豆中发现自体磷酸化会抑制啪c d p k 活性，而翼翅豆茎上部分的可溶性磷酸化丝氨 酸磷酸酶却可以通过去磷酸化作用激活体外自体磷酸化i 拘w b c d p k l 4 6 。因此认为这一作用 改变了自体磷酸化作用的抑制效果。 大部分研究中，自体磷酸化作用是钙离子依赖的，但w b c d p k 除外，它的自体磷酸化 激酶活性是不依赖钙离子的f 4 7 1 。有趣的是，翼翅豆中的另一种c d p k 的异构体w b p k ( p r o t e i n k i n a s e ) ，是唯一的一个没有自体磷酸化激酶活性的c d p k 4 8 1 。烟草c d p k s 的激活既需要c a ：+ 也需要磷酸化作用，但是这种磷酸化不是自体磷酸化，很可能是一种上游蛋白激酶的直接 磷酸化【4 9 】。 1 5 3 磷脂调节 生化分析表明，在特异性的磷脂和c 2 + 同时存在时与只有c a 2 + 存在时相比，燕麦 c d p k s ，拟南芥a t c d p k l ，胡萝卜d c c d p k l ，玉米z m c d p k l1 ，在体外磷酸化底物的水 平增强【5 0 1 。膜脂质对c d p k s 的激活说明了膜结合可能激活c d p k s 的一个因子，此外，不同 c d p k s 磷脂激酶的活性调节是不同的，有证据表明c d p k 能够诱发磷脂作为第二信使在植 物信号转导中发挥重要作用【1 3 】。? 一 一。 。、： 1 5 41 4 3 3 蛋白的调节 研究发现，仅仅有磷酸化对于信号转导调节的完成是远远不够的，许多磷酸化的靶蛋 白必须与一个接头蛋白相联，而研究的最多的就是1 4 3 3 蛋白，它能够完成磷酸化调节作 用，1 4 3 3 蛋白最初在脑蛋白中被鉴定，目前的研究发现它在真核生物中广泛存在【5 1 1 。植 物中存在许多1 4 3 3 的亚型，如拟南芥中有1 2 种【5 2 1 。钙离子存在时，有三种1 4 3 3 亚型能够 1 2 山东师范大学硕士学位论文 在体外特异结合并激活a t c p k l ，然而，酶一旦被激活后，1 4 3 3 蛋白就不仅仅起钙离子的 作用，还能提供一种额外的刺激【5 3 】。由于1 4 3 3 蛋白能够通过结合特异性磷酸化残基来调 节许多酶的活性，因此钙离子可部分地诱导c d p k s 的自体磷酸化。a t c p k l 的自体磷酸化 位点及其与1 4 3 3 的相互作用已阐明。这样的1 4 3 3 结合位点还存在于a t c p k 2 4 和a t c p k 2 8 由【1 3 】 io 1 6c d p k 的生理作用 c d p k 是一类具有多种底物的多功能激酶，参与了植物体的多个生命活动。通过体外 磷酸化试验【5 4 】、蛋白蛋白相互作用【3 7 】和相似位点预测【5 5 1 可以鉴定多种c d p k 底物，这些底 物能够参与碳氮代谢，磷脂合成，防御反应，离子和水的运输，细胞骨架合成反应，转录， 受精及蛋白酶体调控反应【。例如，在碳氮代谢中，c d p k 通过磷酸化作用为植物体存储 碳和合成氨基酸提供碳源和氮源5 6 1 。植物体遭受病原体侵害时，体内会产生多种防御化合 物来调控膜相关的离子转运体，进而改变信号传导及营养运输途径，达到自我保护的目的。 与苯丙氨酸氨裂合酶及羟甲基戊二酸单酰辅酶a ( 3 一h y d r o x y 一3 一m e t h y l g l u t a r y l - c o a ) j 丕原酶相 关i 拘c d p k s 通过磷酸化作用能够刺激这些防御化合物的产生1 2 】。植物体遭遇胁迫时会释放 出一种气体激素乙烯。a c c # 酶通过磷酸化可以催化乙烯合成过程中的决定性步5 7 1 。 1 6 1 参与植株的碳氮代谢 与碳氮代谢有关的酶，如蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、 硝酸还原酶等大多是c d p k s 的底物【1 3 】，蔗糖磷酸合成酶( s p s ) 是蔗糖合成途径中的关键酶， 硝酸还原酶( n r ) 是从硝酸盐同化氮素的限速酶。研究发现，c d p k 在黑暗中能抑制s p s 和 n r 的磷酸化，表明c d p k s 介导 堑j c a 2 + 信号的传递参与了上述酶的磷酸化抑制过程【5 8 1 。活化 的s p s 可增加胞内蔗糖的浓度，降低细胞水势，从而有助于保水。这些结果表明，由不同 刺激激活的不同c d p k 途径可反向调节s p s 活性。 研究发现，在低渗胁迫应答过程中，c d p k s 也可以