（生物化学与分子生物学专业论文）家蚕ras+oncogenebras2的表达、纯化以及特性分析.pdf

学位论文作 有关部门或机构 大学可以将本学 或扫描等复制手 本学位论文属于 学位论文作者签 日期： b f d 年 ( n o 沽弘理大学 硕士学位论文 作者姓名庄室堡 指导教师 韭耀浏熬援 昌垂基副塾援 学科( 专业)生塑丝堂皇盆王生塑堂 所在学院生金型堂堂医 提交日期2 q ! q 生兰目 at h e s i ss u b m i t t e dt oz h e j i a n gs c i - - t e c h u n i v e r s i t yf o rd e g r e eo fm a s t e r o fs c i e n c e c a n d i d a t e sn a m e ： 丕h 丛盆n g 型金n h 丛垒 s u b m i s s i o nd a t e ： m a 已2 q 1q 单位代码 研究生学号 1o338 0 7 2 0 2 0 1 10 9 浙江理工大学硕士学位论文 摘要 r a s 超家族是一类重要的功能蛋白，可介导生长因子、细胞因子和多种细胞外信号的 信息通路，对细胞生长、分化、存活、增殖等多种功能的调节发挥重要作用。通过n c b i 数据库分析，发现家蚕中有r a s 超家族的成员r a so n c o g e n e ( b r a s 2 ) 基因，并将其命名为 b m b r a s 2 。b m b r a s 2 基因的c d n a 序列全长为1 , 4 1 2b p ，开放阅读框( o r f ) 为6 0 3b p ， 编码2 0 0 个氨基酸残基，预测该蛋白的分子量为2 2 9k d ，等电点( p i ) 为6 6 2 。b m b r a s 2 基因的g e n e b a n k 登陆号为a b 2 0 6 9 6 0 。通过p c r 的方法扩增b m b r a s 2 基因的o r f 并插入 到载体p e t 2 8 a ( + ) 的e c o ri 和h i n di i i 位点，构建重组表达质粒p e t 2 8 a ( + ) - b m b r a s 2 ， 转化大肠杆菌r o s e t t a ( d e 3 ) 。筛选阳性克隆后，经i p t g 诱导，带有h i s 标签的重组蛋白 r b m b r a s 2 得以成功表达。表达的r b m b r a s 2 蛋白经过镍柱亲和纯化后，以纯化的重组蛋白 为抗原，免疫雄性新西兰大白兔获得该蛋白的多克隆抗体。经e l i s a 检测，抗体效价可达 1 ：1 2 。8 0 0 以上，w e s t e r nb l o t 检测抗体的特异性良好，说明该多克隆抗体符合进一步实验的 要求。我们对b m b r a s 2 基因在蛋白表达和基因转录两个水平进行了表达分析，w e s t e mb l o t 和荧光定量p c r 的结果说明b m b r a s 2 在四个发育时期都有表达，在蛹中的表达量最高， 在五龄幼虫、蛾和卵中的表达量相对较低；在家蚕的八个组织中也都有表达，在头、肠和 表皮中的表达量相对较高。用免疫荧光技术对目的蛋白进行亚细胞定位，发现b m b r a s 2 蛋 白主要定位在b m 5 ( 家蚕卵巢上皮细胞) 的细胞核中，部分定位于细胞质中而不存在于膜 上。相关的细胞增殖实验，显示r b m b r a s 2 能促进肝癌细胞p l c 及h e p g 2 的增殖而不能促 进正常肝细胞l 0 2 的增殖。该结果为进一步研究b m b r a s 2 蛋白的相关功能奠定了一定的基 础。 关键词：家蚕；b m b r a s 2 ；表达分析；亚细胞定位；细胞增殖 浙江理t 火学硕士学位论文 - _ - _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ - _ _ _ - _ _ - _ _ _ - _ _ - _ _ - _ _ _ _ _ _ - - _ _ - - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ - - _ - _ _ _ 。_ _ 。_ _ _ _ - _ i _ _ _ _ _ _ _ _ _ - i _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ - _ _ _ _ - _ _ _ - _ - _ - _ - _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ - _ _ _ _ 一 a b s t r a c t t h er a ss u p e r f a m i l yi sa ni m p o r t a n tk i n do ff u n c t i o n a lp r o t e i n s t h e yp l a ye s s e n t i a lr o l e si n av a r i e t yo fc e l l u l a rr e s p o n s e si n c l u d i n gc e l lg r o w t h ，d i f f e r e n t i a t i o n ，s u r v i v a la n dp r o l i f e r a t i o n w ef o u n dam e m b e ro fr a ss u p e r f a m i l yn a m e dr a so n c o g e n e ( b r a s 2 ) f r o mb o m b y xm o r it h r o u g h a n a l y z i n gt h en c b id a t a b a s ea n dw ec a l l e dr a so n c o g e n e ( b r a s 2 ) a sb m b r a s 2 t h ee d n ao f b m b r a s 2f r o mb o m b y xm o r ic o n s i s t so f1 , 412b p t h eo p e nr e a d i n gf r a m e ( o r f ) c o n t a i n s6 0 3 b p ，e n c o d i n g2 0 0a m i n oa c i dr e s i d u e sw i t hap r e d i c t e dm o l e c u l a rw e i g h to f2 2 9k da n d t h e o r e t i c a li s o e l e c t f i cp o i n to p t lo f6 6 2 i t sa c c e s s i o nn u m b e ri ng e n b a n ki sa b 2 0 6 9 6 0 t h e o r fo fb m b r a s 2w a sc l o n e db yp c ra n dt h e ni n s e r t e di n t ot h es i t e so fe c o ria n dh i n di i io f p e t - 2 8 “+ ) ar e c o m b i n a n te x p r e s s i o np l a s m i d ，p e t - 2 8 “+ ) 一b m b r a s 2 ，w a sc o n s t r u c t e da n d t r a n s f o r m e di n t oe c o l ir o s s e t a ( d e 3 ) r e c o m b i n a n th i s - t a gb m b r a s 2 ( r b m b r a s 2 ) w a s e x p r e s s e ds u c c e s s f u l l yi ne c o l ir o s e t t a ( d e 3 ) i n d u c e db yi p t g t h ep u r i f i e dr b m b r a s 2w a s o b t a i n e dt h r o u g hn i 肘a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y t h e nt h i sr e c o m b i n a n tb m b r a s 2w a su s e da sa n a n t i g e nf o rp r e p a r a t i o no fr a b b i tp o l y c l o n a la n t i b o d y a f t e rp u r i f i e dw i mt h ep r o t e i na li p , t h e t i t e ro ft h ep o l y c l o n a la n t i b o d i e sr e a c h e s1 ：12 ，8 0 0m e a s u r e db ye l i s a t h ei m m u n o b l o t t i n g r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ea n t i b o d yw a s s p e c i f i ct or b m b r a s 2 w e s t e r nb l o ta n dr e a lt i m ep c r a n a l y s e s s h o w e dt h a tb m b r a s 2w a se x p r e s s e dd u r i n gf o u rd e v e l o p m e n t a ls t a g e s ，a n dt h e e x p r e s s i o nl e v e lo fb m b r a s 2w a sh i g h e s ti np u p a ea n dl o w e ri nt h ef i f t hi n s t a rl a r v a e ，m o t ha n d n a s c e n te g g ；b m b r a s 2w a se x p r e s s e di na l le i g h tt i s s u e s ，a n di tw a sh i g h l ye x p r e s s e di nh e a d ， i n t e s t i n ea n de p i d e r m i s t h er e s u l to fs u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o ni n d i c a t e dt h a tb m b r a s 2m a i n l y l o c a l i z e da tt h en u c l e io fb m 5c e l l s ，p a r t l ya tc y t o p l a s m s ，b u tn o ta tp l a s m am e m b r a n e s t h e r e l a t e dc e l lp r o l i f e r a t i o na s s a ys h o w e dt h a tr b m b r a s 2c o u l ds t i m u l a t et h e p r o l i f e r a t i o no f h e p a t o m ac e l l s ( h e p g 2a n dp l c ) b u tn o tt h en o r m a lh e p a t i cc e l l s ( l 0 2 ) t h e s er e s u l t sw i l ll a ya f o u n d a t i o nf o rf u r t h e rs t u d yo ft h ef u n c t i o no fc e l l u l a rb m b r a s 2 p r o t e i n k e y w o r d s ：b o m b y xm o r i ；b m b r a s 2 ；e x p r e s s i o na n a l y s i s ；s u b c e l l u l a rl o c a t i o n ；c e l l p r o l i f e r a t i o na s s a y i i 浙江理工大学硕士学位论文 目录 摘要i a b s t r a c t i i 缩略语v l 第一章r a s 原癌基因族的研究进展1 j ；i 言1 lf a s 基冈的发现。1 2r a s 原癌基因家族2 3r a s 蛋白的活化。3 4r r a s 亚家族的研究进展4 4 1r r a s 的研究进展。4 4 2t c 2 1 r r a s 2 的研究进展。5 4 3m r a s r r a s 3 的研究进展6 5 展望7 第二章实验方案设计8 1 研究的目的和意义8 2 研究内容8 3 实验流程。9 3 1b m b r a s 2 蛋白的原核表达和多克隆抗体的制备9 3 2b m b r a s 2 蛋白的表达情况以及功能分析9 第三章b m b r a s 2 基冈的生物信息学分析1 0 l 工具和软件1 0 2 方法1o 3 结果一l1 3 1b m b r a s 2 基冈的序列信息1l 3 2 氨基酸序列的同源性分析1 2 3 3 进化树14 3 4 疏水性分析1 4 3 5 跨膜区分析1 5 3 6 信号肽预测16 3 7b m b r a s 2 蛋白在细胞内定位的预测1 6 3 8 功能位点的分析1 7 2 i 讨论17 第四章b m b r a s 2 基因的克隆、原核表达和纯化1 9 l 材料与试剂一1 9 1 1 材料与设备1 9 1 ：! 试齐u 19 1 3 主要试剂的配制。1 9 2 方法2 2 2 1p c r 扩增目的片段2 2 2 2p c r 产物的纯化2 3 2 3 质粒的小量制备2 4 2 4 目的片段与表达载体p e t - 2 8 a ( + ) 的双酶切及回收2 4 2 5 连接反应。2 5 i i i 浙江理工大学硕士学位论文 2 6e c o l it g1 、r o s e t t a ( d e 3 ) 感受态细胞的制备( c a c l 2 法) 2 5 2 7 连接产物的转化2 6 2 8 重组p e t - 2 8 a ( + ) - b m b r a s 2 质粒的筛选与鉴定2 6 2 9 重组质粒的转化及鉴定一2 7 2 1 0 重组质粒在大肠杆菌中表达2 7 2 1 1s d s p a g e 电泳分析2 8 2 1 2 包涵体的溶解与复性。2 8 2 13 镍柱亲和层析2 9 3 结果2 9 3 1p c r 扩增目的片段2 9 3 2 重组质粒的p c r 扩增和双酶切鉴定3 0 3 3 序列测定。3 0 3 4 重组蛋白的诱导表达。3 0 3 5 重组蛋白的纯化3 2 3 6 融合蛋白的质谱分析。3 2 z i 讨论3 3 第五章多克隆抗体的制备及效价测定3 5 1 材料与试剂。3 5 l - l 材料3 5 1 2 试剂3 5 1 3 试剂的配制3 5 2 方法一3 7 2 1b r a d f o r d 检测蛋白浓度3 7 2 2 抗体制各3 7 2 5w e s t e r nb l o t 检测抗体特异性3 9 3 结果。4 0 3 1 抗体的纯化4 0 3 2 抗体的效价测定。4 1 3 3w e s t e r nb l o t 检测抗体特异性4 1 4 讨论4 2 第六章b m b r a s 2 蛋白的表达分析4 4 1 材料与试剂。4 4 1 1 材料与仪器。“ 1 2 试剂4 4 1 3 试剂的配制4 4 2 方法4 5 2 1 总蛋白质的提取及定量。4 5 2 2w e s t e r nb l o t 检测b m b r a s 2 蛋白的时期分布4 5 2 3w e s t e r nb l o t 检测b m b r a s 2 蛋白的组织分布4 5 2 4 荧光定量p c r 的引物设计4 5 2 5 总r n a 的提取及定量4 6 2 6 反转录反应4 6 2 7 荧光定量p c r 4 7 2 8 荧光定量p c r 数据处理方法4 7 3 结果4 8 i v 浙江理工人学硕士学位论文 3 1b m b r a s 2 蛋白在家蚕各发育时期的表达情况4 8 3 2b m b r a s 2 蛋白在五龄幼虫各组织的表达情况4 8 3 3 家蚕不同发育时期b m b r a s 2 基冈转录水平的变化4 9 3 4 家蚕五龄幼虫各组织中b m b r a s 2 基因转录水平的变化5 0 4 讨论5 2 第七章亚细胞定位5 4 1 材料与试剂5 4 1 1 材料5 4 1 2 试齐0 5 4 1 3 试剂配制5 4 2 方法5 5 3 结果5 5 4 讨论5 6 第八章b m b r a s 2 蛋白的功能研究5 7 1 试剂和材料5 7 1 1 材料与设备5 7 1 2 式剂。5 7 2 方法。5 7 2 1 细胞计数及铺板5 7 2 2r b m b r a s 2 蛋白的添加5 7 2 3c c k 8 法检测细胞增殖。5 8 3 结果5 8 z l 讨论! ；9 结论6 1 参考文献6 2 致谢6 6 v 浙江理工人学硕士学位论文 b s aa l b u m i nb o v i n ef r a c t i o nv o r f n c b i p c r e d t a 姆 s d s p a g k a n f c a f i a f p l c e l i s a d a p i p m s f i p t g h r p t e m e d 缩略语 o p e nr e a d i n gf r a m e n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n e t h y l e n ed i a m e m i n e t e t r a a c e t i ca c i d a m m o n i u mp e r s u l f a t e s o d i u md o d e c y ls u l f a l t ep o l ya c r y l a m i d eg e l e l e c t r o p h o r e s i s k a n a m y c i ns u l f a t e f r e u n d sc o m p l e t ea d j u v a n t f r e u n d si n c o m p l e t ea d j u v a n t f a s tp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h i c e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y 4 - 6 d i a m i d i n o 一2 一p h e n y l i n d o l e p h e n y l m e t h a n e s u l f o n y lf l u o r i d e i s o p r o p y l t h i o p - d - g a l a c t o s i d e h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e n ，n ，n ，n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e v i 牛血清白蛋白( 组分v ) 开放阅读框 美国国立生物技术信息中心 聚合酶链式反应 乙二胺四乙酸 过硫酸铵 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺 凝胶电泳 硫酸卡那霉素 弗氏完全佐剂 弗氏不完全佐剂 高效液相色谱 酶联免疫吸附实验 4 , 6 联咪2 一苯基吲哚 苯甲基磺酰氟 异丙基硫代p d 半乳糖苷 辣根过氧化物酶 n 。n n ，n 四甲基乙二胺 浙江理工大学硕十学位论文 引言 第一章r a s 原癌基因族的研究进展 原癌基因，有时又称细胞癌基因，指正常细胞基因组中与病毒癌基因同源性很高的基 因片段，能编码一些与细胞分裂调控有关的蛋白激酶，是维持机体正常生命活动所必须的， 在进化上高度保剞h j 。在生理状态下，这些基因不表达或者表达受抑制，处于非激活状态， 不具有致癌能力，但在某些环境或其他因子( 如病毒、射线、化学致癌物) 的影响下，这 些基因会发生d n a 扩增、重排或调控序列改变而被“激活”成为癌基剧4 5 】( 更准确地说是 致癌基因之中的细胞转化基因) ，这样细胞生长分化失去控制，具有了致癌能力，因此导 致细胞持续分裂和癌变1 6 】。目前已知的原癌基因有6 0 多种，了解较多的有r a s 基因族、s c r 基因族、s i s 基因族、m g c 和m y b 基因族【7 培j 。 r a s 基因是最早被确定的原癌基因，原癌基因r a s 是一种多功能的细胞因子【9 】，在多种 细胞生命活动中起极为重要的作用，包括细胞的增殖、分化和细胞骨架的构建等【l 啦j 。r a s 癌基因参与细胞生长和分化的调控，参与多种肿瘤的形成与发展【l2 1 。r a s 基因编码的r a s 蛋白介导生长因子、细胞因子和多种细胞外信号的信息通路【l 引，对细胞生长、分化、存活、 增殖等多种功能的调节发挥重要作用【l4 1 。g a s 基因是人们最先证实与肿瘤发生有关的基因 之一，分布范围广，没有组织特异性，但有细胞信息传导地位的特殊性，成为目前致癌研 究的热点之一。 1l a s 基因的发现 r a s 基因即r a ts a r c o m a 基因的缩写，它最先从大鼠肉瘤的急性逆转录病毒( h a r v e y m u r i n es a r c o m av i r u s 和k i s t e rm u r i n es a r c o m av i r u s ) 中分离出来。在这种子代病毒中发现 含有来源于宿主细胞的基因组的新基因序列，此后人们将这种宿主细胞基因称为r a s 基因 【1 5 】。1 9 8 2 年w e i n b e r g 等人在人膀胱癌细胞株中检测出具有转化能力的r a s 基因【婚17 1 。随 后，s a n t o s 与p a r a d a 发现上述转化基因并非新型基因，而是h a r v e r y 鼠肉瘤病毒r a s 基因 的人类同源基因，命名为h a r a s 。同年，k r o n t i r i s 在人肺癌细胞中发现k i r s t e n 鼠肉瘤病毒 基因的同系物，称为k i r a s 。另一种相似的基因是在人神经母细胞瘤d n a 感染n i h 3 t 3 细胞时发现的与r a s 类似的基因，称为n - r a s ，此种基因和病毒无关。哺乳类r a s 基因有5 浙江理t 大学硕士学位论文 个成员，其中h a 船一j ，k i r a s 一2 和n - r a s 是功能基因，h a r a s 2 和1 0 r a s ，是无功能基因， 又称为假基因，这些基因己在人和啮齿类染色体定位。此外，还发现一些与r a s 相关性远 近不同的r r a s 和r a s 相关新家族( r h o ) 1 8 】。r a s 基因是个大家族，在生物进化过程中是 高度保守的【1 9 】。除了人和其它哺乳动物外，在鸡、果蝇、软体动物、粘菌、植物和酵母等 单细胞和多细胞生物基因组内也发现了相关的膦基因【2 0 - 2 1 1 ，提示它们具有重要的生理功 能。 2r a s 原癌基因家族 r a s 原癌基因家族是一类相对分子质量为2 1 l ( d 左右的小g 蛋白，在人类肿瘤的形成 中发挥着重要作用【2 2 1 ，r a s 原癌基因家族包括k r a s 、h r a s 、n r a s 、r r a s 亚家族等2 3 1 。 其中h r a s 、k r a s 和n r a s ，被称为经典的r a s 2 4 珊】，是在人类肿瘤中最常见的癌基因， 并且在大约1 5 的人类恶性肿瘤中被检出【2 。r r a s 亚家族又称为r a s 相关蛋白家族，包 括r r a s 、t c 2 1 r r a s 2 和m r a s r r a s 3 ，它们有5 0 - 5 5 的氨基酸序列与r a s 同源f 2 8 - 2 9 。 其中t c 2 1 r r a s 2 与r r a s 有高达7 0 的氨基酸序列是同源的，而t c 2 1 爪r a s 2 包括核心 效应子区域在内，有5 5 的氨基酸序列与h r a s 同源 3 0 - 3 1j 。 z 黧黢 靠_ 棘霸峄# i q 哮；瞬 2 翟戤 佬_ o 辫 嘲r 峨7 夕 ”沁脚g i 自， 图i ir a s 超家族一览表3 2 i f i g 1 1t h e r a ss u p e r f a m i l ya tag l a n c e 2 浙江理丁大学硕十学位论文 尽管r a s 超家族各成员之间存在差异，但它们也具有一些共同的特征( 图1 1 ) ：首 先，它们都是单体小g 蛋白，在n 端拥有高度保守的g t p g d p 结合域“g ”盒( g 1 ： g x x x x g k s t ；g 2 - t ；g 3 ：d x x g q h t ；g 4 - t n k x dg 5 ：c s a k l t ) 1 3 4 】；其次， 它们都有水解g t p 生成g d p 的内源性g t p 酶活性【3 2 】；最后，大多数的r a s 超家族成员可 通过翻译后的脂酰化修饰与细胞膜结合【3 3 】。r a s 超家族在细胞信号转导中可作为信号转换 器或分子开关，它们通过与g t p 结合( 激活态) 和g d p 结合( 失活态) 的转换导致信号 的转导或终止【3 4 1 。该家族许多成员是癌基因，当其被异常激活后会导致细胞无限制地增殖， 引起肿瘤。 3r a s 蛋白的活化 r a s 基因编码的小g t p 结合蛋白r a s 是调节细胞生长的重要转导蛋白。r a s 蛋白位于 细胞膜内侧，它在传递细胞生长分化信号方面起重要作用。它属于g t p 结合蛋自【2 6 l ( 一 种细胞信息传递的耦联因子) ，通过g t p 与g d p 的相互转化来调节信息的传递。r a s 蛋白 与g t p 和g d p 有很强的亲和性，而且有较弱的g t p 酶活性。正常情况下r a s 蛋白和g d p 结合并没有活性，当细胞外的生长分化因子把信号传导到胞膜内侧的r a s 蛋白时，可增强 r a s 蛋白与g t p 结合的活性，使r a s 蛋白和g t p 结合成为激活状态，信号系统开放。因 为r a s 蛋白有g t p 酶活性，可使g t p 水解成g d p ，r a s 蛋白和g d p 结合后r a s 蛋白失活 1 3 2 】，信号系统关闭。正常情况下r a s 蛋白的g t p 酶活性很弱，当和g t p 酶激活蛋白( g a p ) 结合后其水解速度可提高1 万倍而使r a s 蛋白失活。r a s 蛋白和g d p 结合后可以激活鸟苷 酸释放因子( g r f ) ，g r f 使r a s 蛋白释放g d p 结合g t p ，因此通过g t p 和g d p 的相互 转化可以有节制地调节r a s 蛋白对信号系统的开启和关闭，完成生长分化信号传入细胞内 的过程。 细胞膜是r a s 与上游衔接蛋白和鸟苷酸交换因子作用的部位，也是与下游底物作用部 位。定位于细胞膜是r a s 蛋白发挥“分子开关”作用的前提【2 引，r a s 蛋白与细胞膜的结合有 赖于r a s 蛋白的翻译后修饰，这一过程包括三个步骤：第一，r a s 蛋白羧基末端半胱氨酸 残基的法尼酯化，是r a s 蛋白翻译后修饰的关键步骤【3 5 】，法尼基蛋白转移酶( f p t ) 是催 化半胱氨酸法尼酯化的关键酶；第二，蛋白代谢清除羧基末端的脂溶性氨基酸残基；第三， 经法尼酯化的半胱氨酸残基的甲基化。r a s 蛋白羧基端含有特征性的结构域，称为“c a a x 盒，【2 5 】( 其中c 为半胱氨酸，a 为脂肪族氨基酸，x 为甲硫氨酸、丝氨酸或末端带有羧基 的其他氨基酸) ，这一特征性的氨基酸序列成为r a s 蛋白法尼酯化的信号。f p t 催化焦磷 3 质相互作用，包括两个g a p s ：p 1 2 0 r a s g a p 和神经纤维瘤蛋白；交换因子r a s g r f 和三 个下游的效应蛋白：r a f 、tp 1 3 k 和r a l g d s ，但是r r a s 不能够和r a s 的交换因子s o s l 和 r a s g r p 相互作用 4 2 4 5 1 。 图1 2 三种不同的r a sg e f s i 拍l f i g 1 2t h r e ed i s t i n c tr a sg e f s 4 浙江理工大学硕士学位论文 s o s i 能够活化r a s 、t c 2 1 和m r a s ：r a s g r f i 是r a s 、r r a s 、m r a s 和t c 2 1 的活化剂，r a s g r p 能 够活化r a s 而不能r r a s 。 r a s g r f c d c 2 5 m m 、m s o s 和c 3 g 是已经被鉴定出来的r a s 家族蛋白的鸟苷酸释放因子 ( g u a n i n en u c l e o t i d e r e l e a s i n gf a c t o r s ，g r f ) ，其作用是催化g d p 与d , g 蛋白分离，使d , g 蛋白与g t p 结合而活化【4 。在催化结构域，r a s g r f ，m s o s 和c 3 g 三者之间大约有3 0 的 氨基酸残基序列是相同的，但是他们在底物特异性上却有明显不同。r a s g r f 和m s o s 都能 够有效地活化r a s ，而c 3 g 活化r a s 的效率要比活化r a p l 低。g o t p h 等通过实验研究这三种 g r f 对r r a s 的作用，结果说明r a s g i u 能够显著刺激g d p 从r r a s 上分离，同时c 3 g 也能 够促进r r a s 结合的g d p 的释放，而在相同的条件下，m s o s 很少的影响这一反应【36 。通过 反转录聚合酶链式反应( r e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h m nr e a c t i o n ，r t - p c r ) 发现 r a s g r f 仅在脑和睾丸中表达，而m s o s 和c 3 g 在各组织中广泛存在。推测在脑和睾丸中 r r a s 是r a s g r f 活化，而在其他的组织中r r a s 是i 扫c 3 g 活化的1 4 8 】。 4 2t c 2 1 r r a s 2 的研究进展 t c 2 1 ，也称作r r a s 2 ( m i m e dr a sv i r a lo n c o g e n eh o m o l o g 2 ) ，t c 2 1 r r a s 2 最早于 1 9 9 0 年由d r i v a s 等从畸胎瘤中通过c d n a 文库克隆获得的。t c 2 1 r r a s 2 定位于人染色体 ll p l 5 2 1 4 9 ，基因全长1 5 1 0 b p ，相对分子质量约为2 4 1 0 3 ，其5 5 的氨基酸包括核心的效 应子区域与h r a s 是同源的( h r a s 的3 2 一- - 4 0 位的残基与t c 2 1 的4 3 - - - - 5 1 位的残基是同 源的) 5 0 】。c h a n 等从卵巢肿瘤细胞系的c d n a 文库中检测到相同的癌基因，进一步的研 究发现其7 2 位的一个点突变( 谷氨酰胺- 亮氨酸) 使其更具转化特性【5 1 】。 t c 2 1 r r a s 2 虽然是一种肿瘤相关基因，但对其作用机制目前仍不完全清楚。除了 h r a s 、k r a s 和n r a s 外，在己知的r a s 超家族中，t c 2 l 瓜r a s 2 是唯一一个能够转化上 皮和成纤维细胞系，并在体内诱导肿瘤的形成的成员【5 2 1 。在乳腺癌细胞中，检测到 t c 2 1 r r a s 2 的表达量增加，并且t c 2 1 r r a s 2 的突变体也出现在子宫内瘤、卵巢和乳腺 肿瘤细胞中。t c 2 1 r r a s 2 也存在于口腔和食道癌的上调中，说明t c 2 1 r r