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青岛科技大学研究生学位论文 金胶壳聚糖仿生膜界面上电化学生物传感器的制备 摘要 基于酶对特定底物响应而构建的电化学酶生物传感器，具有灵敏度高、响应快、 选择性好、无污染、易于微型化和自动化等优点，具有广泛的应用前景。在电化学 酶生物传感器的研制中，一项关键的技术就是如何将酶稳定地固定到基体电极表面 的生物敏感膜上并保持其生物活性不变。本论文工作致力于发展新型固定材料，以 达到改迸固定酶活性、降低传感器的成本等目的，结合流动注射分析技术，制备了 金胶壳聚糖仿生膜，用于固定辣根过氧化物酶( h r p ) 检测h 2 0 2 ，并在此基础上研制 了肿瘤标志物癌胚抗原( c e a ) 免疫传感器，应用于临床上血清中c e a 含量的测定。 主要研究工作如下： 1 、利用壳聚糖强的成膜能力，首先在掺铟氧化锡( i t o ) 电极表面修饰上壳聚 糖膜，然后通过膜表面丰富的氨基和羟基与纳米金强静电结合，在i t o 电极表面获 得掺杂纳米金胶粒子的壳聚糖仿生膜，用来固定h r p ，这层膜可以有效的保持酶原 有活性不变。结合流动注射分析，构建了一种可以快速测定h 2 0 2 的流动注射安培传 感器。该传感器分别用扫描电镜、原子力显微镜和电化学方法进行了表征，结果表 明，酶分子可以很好的固定在仿生膜上。在实验中，对下列实验条件进行了优化： 底物邻苯二胺( o - p h e n y l e n e d i a m i n e , o p d ) 浓度、缓冲溶液的p h 值和固定化酶的量 进行了优化。在优化的实验条件下检测h 2 0 2 ，在o 0 1r a m - 0 5m m 浓度范围内呈线 性，其线性相关系数为0 9 9 7 ( n = 8 ) ，检测限为0 0 0 5m 。用流动注射分析验证了制备 的传感器的稳定性，结果表明，在连续3 4 次测定同一浓度h 2 0 2 后，该传感器的安 培响应信号没有显示出明显的下降。由于工业上的大批量生产而使i t o 薄膜电极价 廉易得，这就大大降低了制备传感器的成本，所以该传感器具有成本低、制备简单、 灵敏度高、稳定性好的优点，可适用于批量生产。 2 、将c e a 抗原固定在纳米金胶壳聚糖仿生膜修饰的i t 0 电极上，研制了一种 新型的测定临床肿瘤标志物c e a 的免疫传感器。通过待测抗原和固定化抗原与有限 的酶标抗体活性点发生竞争性结合来进行免疫分析。和待测抗原反应的一部分标记 抗体留在溶液中，而和电极上固定化抗原结合的另一部分标记抗体则留在电极表面， 通过o p d h 2 0 2 h r p 电化学体系检测体系进行测定。随着样品中抗原浓度的增大， 金胶壳聚糖仿生膜界面上电化学生物传感器的制各 留在溶液中与其反应生成免疫复合物的标记抗体的量也越大，从而和固定于电极表 面的抗原发生免疫反应的标记抗体的量则减少，所以测定的微分脉冲伏安( d p v ) 峰电流信号随着待测抗原浓度的增大而呈线性下降趋势。在该实验中，对下列影响 免疫测定的参数如底物o p d 的浓度、h 2 0 2 的浓度、缓冲溶液的p h 值、酶标抗体的 稀释倍数、培育温度和培育时间进行了优化选择。在优化的实验条件下，c e a 的线 性检测范围为2 0 2 0n m i 。线性相关系数为0 9 9 7 ，检测限为1 0n g m l 。制备的c e a 免疫传感器具有成本低、制备简单、灵敏度高、稳定性好的优点，可适用于批量生 产，有望用于临床上血清中肿瘤标志物的测定。 关键词：电化学生物传感器，壳聚糖，纳米金胶，辣根过氧化物酶，癌胚 抗原，掺铟氧化锡电极。 青岛科技大学研究生学位论文 d i s p o s a b l ee l e c t r o c h e m i c a l b i o s e n s o rb a s e d0 n a u c h i t o s a n m o d i f i e di n d i u mt i n o x i d ee l e c t r o d e a b s t r a c t e l e c t r o c h e m i c a le n z y m eb i o s e n s o r sb a s e do nt h er e c o g n i t i o no fs p e c i f i cs u b s t r a t e s h a v et h ea d v a n t a g e so fh i g h s e n s i t i v i t y ，r a p i d - r e s p o n s e , n i c e - s e l e c t i v i t y ，n op o l l u t i o na s w e l la se a s ym i n i a t u r i z a t i o na n da u t o m a t i o n i nt h ed e s i g na n df a b r i c a t i o no ft h e e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o rt h ec r u c i a ls t e pi sh o wt od e v e l o pas i m p l ea n de f f e c t i v e s t r a t e g yf o rt h ec o n s t r u c t i o no fs e n s i t i v em e m b r a n e t h i sr e s e a r c hi sa i m e dt od e v e l o p n e wm a t e r i a lf o rt h ei m m o b i l i z a t i o no fb i o m o l e c u l e , s i i c ha se n z y m e 。a n t i g e ne r e a c c o r d i n gt o t h ea d v a n t a g e so fe x c e l l e n t f i l m - f o r m i n ga b i l i t y a n dg o o da d h e s i o n p r o p e r t i e s ，w eu s e dc h i t o s a nt om o d i f yt h ei n d i u m - t i no x i d e ( 1 t 0 ) e l e c t r o d e ，a n dt 1 1 朗 a b s o r be o l l o i d a ig o l dn a n o p a r t i c l e st oi m m o b i l i z eh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h e a l ) a n d c a r c i o n e m b r y o n i ca n t i g e n ( c e a ) t h ed e t a i l e dm a t e r i a l sa l es u m m a r i z e da sf o l l o w i n g ： 1 1 t oe l e c t r o d ei su s e dt of a b r i c a t eah o v e ld i s p o s a b l eb i o s e n s o rc o m b i n e dw i t h f l o wi n j e c t i o na n a l y s i sf o rt h er a p i dd e t e r m i n a t i o no fh 2 0 2 t h eb i o s e n s o ri sp r e p a r e db y e n t r a p p i n gh r pe n z y m ei nc o l l o i d a lg o l dn a n o p a r t i c l e - m o d i f i e dc h i t o s a nm e m b r a n e ( a u - e h i t o s a n ) t om o d i 母t h ei t oe l e c t r o d e t l l eb i o s e n s o ri sc h a r a e t e r i z e db ys c a n n i n g e l e c t r o nm i c r o s c o p e a t o m i cf o 瞄m i c r o s c o p e , a n de l e c t r o e h e m i c a lm e t h o d s p a r a m e t e r s a f f e c t i n g t h ep e r f o r m a n c eo f t h e b i o s e n s o r ,i n e l u d i n g c o n c e n t r a t i o n so f 0 p h e n y l e n e d i a m i n e ( o p d ) a n dp ho fs u b s t r a t es o l u t i o n w e r eo p t i m i z e d u n d e rt h e o p t i m a le x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s h 2 0 2c o u l db ed e t e r r n i n e di nt h el i n e a re a l i b r a t i o nr a n g e f r o m0 0 1t oo 5m mw i t hac o r r e l a t i o nc o e 塌e i e n to f0 9 9 7 ( n = 8 ) ，r h ed e t e c t i o nl i m i t w 嚣0 0 0 5m ma t3s i g n a l n o i s e t h ea m p e r o m e t r i cr e s p o n s eo ft h eb i o s e n s o rd i dn o t s h o wa no b v i o u sd e c r e a s ea f t e rt h es u b s t r a t e sw e l ei n j e c t e dc o n t i n u o u s l y3 4t i m e si n t ot h e f l o wc e l l t h ep r e p a r e db i o s e n s o rn o to n l yi se c o n o m i ca n dd i s p o s a b l e d u et ot h ei o w - c o s t l t 0f i l me l e c t r o d eo b t a i n e df r o mi n d u s t r i a lm a s sp r o d u c t i o n 。b u ta l s oi sc a p a b l ew i t h 金胶壳聚糖仿生膜界面上电化学生物传感器的制备 9 0 0 dd e t e c t i o np r e c i s i o n ，a c c e p t a b l ea c c u r a c y ，a n ds t o r a g es t a b i l i t yf o r t h ef a b r i c a t i o ni n b a t c h 2 an o v e ld i s p o s a b l ee l e e t r o e h e m i c a li m m u n o s e n s o rf o rt h ed e t e r m i n a t i o no f c e ai n h u m a ns e r u mw a sp r o p o s e db yu s i n gc o l l o i d a lg o l dn a n o p a r t i c l e sm o d i f i e da u - c h i t o s a nt o i m m o b i l i z ec e a a n t i g e no ni t oe l e c t r o d e ac o m p e t i t i v ei m m u n o a s s a yf o r m a tr e s u l t si n b i n d i n g o fh r p a n t i - c e a a n t i b o d y t ot h ei m m o b i l i z e dc e aa n t i g e n ，t h e i m m u n o c o n j u g a t ew a sf o r m e db yac o m p e t i t i v ei m m u n o r e a c t i o no fh r p - a n t i c e a a n t i b o d yw i t ha n a l y t ec e aw a sr e t a i n e di nt h ei n c u b a t i o ns o l u t i o n w h i l et h ec o n j u g a t e f o r m e do na u c h i t o s a nm o d i f i e di t oe l e c t r o d es u r f a c ew a sd e t e c t e db yu s i n gt h e o p d h 2 0 2 - h r pe l e c t r o c h e m i c a ls y s t e m p a r a m e t e r sa f f e c t i n gt h ep e r f o r m a n c eo ft h e i m m u n o a s s a ys y s t e mi n c l u d i n gc o n c e n t r a t i o n so f o p da n dh 2 0 2 ，p ho f s u b s t r a t es o l u t i o n ， d i l u t i o no fh r p a n t i c e a i n c u b a t i o nt e m p e r a t u r ea n dt i m ew e r eo p t i m i z e d u n d e rt h e o p t i m a le x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s ，t h ee l e c t r o c a t a l y t i cc u r r e n td e c r e a s e dl i n e a r l yw i t ht h e c o m p e t i t i v em e c h a n i s m c e ac o u l db ed e t e r m i n e di nt h el i n e a rr a n g ef r o m2 0t o2 0 n g m l ( c o r r e l a t i o nt o e f f i c i e n t0 9 9 7 ) w i t had e t e c t i o ni i m i to f1 0n g m 1 1 1 1 ep r e p a r e d c e ai m m u n o s e n s o ri sn o to n l ye c o n o m i cd u et ot h el o w - c o s ti t of i l me l e c t r o d eo b t a i n e d f r o mi n d u s t r i a lm a s sp r o d u c t i o n ，b u ta l s oc a p a b l ew i t hg o o ds t a b i l 埘a n dr e p r o d u c i b i l i t y f o rt h ef a b r i c a t i o ni nb a t c h k e yw o r d s ：e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r s ；c h i t o s a nm e m b r a n e ；c o l l o i d a lg o l d n a n o p a r t i c l e ；h o r s e r a d i s hp e r o x i d e ；c a r c i o n e m b r y o n i ca n t i g e n ；i n d i u m - t i n o x i d e e l e c t r o d e 金胶壳聚糖仿生膜界面上电化学生物传感器的制备 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢中所罗列的内容以 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人已 用于其他学位申请的论文或成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 本人签名：l 仞铧 日期：2 7 幸占月f 2 ，日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解青岛科技大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论 文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学 位论文。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文 或成果时，署名单位仍然为青岛科技大学。( 保密的学位论文在解密后适用 本授权书) 本学位论文属于：保密口，在年解密后适用于本声明。 不保密口。( 请在以上方框内打“”) 本人签名：l 钓拚 铆签名：舭绛 日期：卿年g 月， 日 日期：a c 卿年6 月殷日 青岛科技大学研究生学位论文 第一章绪论 生物的基本特征之一，是能够对外界的各种刺激做出反应，所以生物能感受 外界的各类刺激信号，并将这些信号转换成体内信息处理系统所能接收并处理的 信号。在现代和未来的信息社会中，信息处理系统要对自然和社会的各种变化做 出反应，需要通过传感器将外界的各种信息接收下来并转换成信息系统中的信息 处理单元( 即计算机) 能够接收和处理的信号。生物传感器是传感器的一种，它是 一门由生物、化学、物理、医学、电子技术等多学科相互渗透而成长起来的高新 技术，在生物、医学，环境监测，食品检测及军事等领域有着重要的应用价值l l “， 已引起世界各国的极大关注。 1 1 生物传感器的概述 1 l 1 生物传感器的定义 生物传感器是以生物活性单元( 如酶、抗体、核酸、细胞等) 作为生物敏感基 元，对被测目标物具有高度选择性的检测器。它通过各种物理或化学型信号转换 器来捕捉目标物与敏感基元之间的反应，然后将反应的程度以一种可检测的信号 表达出来，从而检测出被测目标物的浓度同。 1 1 2 生物传感器的原理 生 - 4 化学物质h 化学电极等 i 物叫热卜， 热敏电阻 l 待 测 - 功 - 叶光f _ ，1 光化学装置l 物 能 - 叶质量f _ 1 压电晶体等l 膜 - 叶声波卜叫声波检测装置l 图l 1 生物传感嚣的工作原理 f i g 1 lt h ew o r kp r i n c i p l eo f b i o s e n s o r 1 金胶壳聚糖仿生膜界面上电化学生物传感器的制备 生物传感器一般由三个部分构成，即分子识别物质或生物功能物质构成的感 应器、信号传导或换能器、信号放大和处理器。其工作原理如图1 1 所示。具有 选择性识别能力的生物功能膜与待测物发生特异性相互作用后，所产生的物质的 量、热、光、质量、声等信号的变化通过相应的信号转换器转变成可以输出的信 号，从而达到分析检测的目的。 1 1 3 生物传感器的分类 生物传感器一般可从以下三个角度来进行分类： 根据生物传感器的信号转换器不同可分为：电化学生物传感器、光学生物传 感器、压电生物传感器、半导体生物传感器、热敏生物传感器、场效应晶体管生 物传感器、声波生物传感器等7 叫。 根据生物敏感物质相互作用的类型可分为：生物亲和型生物传感器、代谢型 生物传感器和催化型生物传感器。 根据生物传感器中生物分子识别元件上的敏感物质可分为：酶传感器【埘、免 疫传感器、微生物传感器、组织传感器【1 1 3 2 1 、基因传感器等。 1 1 4 生物传感器的特点 与传统分析方法相比，生物传感器这种新的检测手段具有以下优点： ( 1 ) 生物传感器是由选择性好的生物材料构成的分子识别元件，一般不需要 样品的预处理，样品中的被测组分的分离和检测同时完成，且测定时不需加入其 他试剂； ( 2 ) 由于它的体积小，可以实现连续在线监测； ( 3 ) 响应快，样品用量少，且由于敏感材料是固定化的，可以反复多次使用； ( 4 ) 灵敏度高； ( 5 ) 传感器连同测定仪的成本远低于大型的分析仪器，便于推广普及。 1 1 5 酶传感器 在生物传感器中，酶传感器是具有代表性的传感器之一，在微生物、食品检 测等领域中已经得到广泛应用【1 3 l 。在酶生物传感器的应用中，其中关键的核心技 术就是酶在载体上的固定，即酶的固定化技术。固定化的目的是使酶等活性物质 在保持生物活性的前提下，能很好的键合、包埋或吸附于载体上，处于不易脱落 的状态，以便同基底电极组装在一起。同常规方法相比，将生物酶固定于电极表 面制备的酶电极，其固定化酶具有很多优点，例如：当酶被固定化时，可以很快 从反应混合物中分离，且能重复使用；通过合适地控制固定化酶的微环境，可以 2 青岛科技大学研究生学位论文 增加酶电极的稳定性，提高灵敏度和响应速率，还可以防止溶液中其他物质的干 扰和对电极表面的玷污等1 4 】。有关酶在载体表面固定地一些常用方法列于下表： 包埋法聚合物包埋法( 如聚丙烯酰胺) l b 膜包埋法 双层类脂包埋法 支撑液膜包埋法 交联法使用偶联剂的共价结合法( 如戊二醛 1 5 - 2 0 1 ) 载体结合法吸附结合法1 2 1 , 2 2 共价键合法 2 3 - 2 6 1 膜隔离法如微胶囊鲫 自组装技术l b 膜技术 基于化学吸附的自组装技术 交替沉积技术 酶传感器是由酶电极发展而来，通常的酶传感器是出电化学检测装置和酶膜 ( 或酶电极) 组合而成，其测定原理r 叮以表述为：( 1 ) 先将酶固定化；( 2 ) 将酶膜 ( 或酶电极) 浸入待测物的溶液中，催化待测物的氧化或还原反应；( 3 ) 通过检 测电流或电位的方法确定反应过程中某一反应物的消耗或生成物产生的量1 4 】。 1 2 免疫分析技术 免疫分析技术是生物分析的一个重要分支，它是基于抗原抗体间高度选择性 反应而建立起来的检测抗原或抗体的技术。传统的基于抗原抗体结合形成抗原抗 体复合物沉淀来进行分析的方法，如絮状沉淀法、环状沉淀反应、单向扩散反应 和双向扩散反应等，灵敏度低，只能用于定性或半定量分析。1 9 5 9 年y a l o w 等利 用有放射性的i ”1 标记抗原，来测量参加免疫反应的i ”1 的酶生物传感器及酶联 荧光免疫技术的研究量来问接分析待测物，发展了一种灵敏度极高的放射性免疫 分析法( r i a ) 2 9 - 3 1 。但该方法不仅仪器药品价格昂贵，而且造成了放射性污染， 对分析人员身体健康有潜在危害。1 9 7 1 年瑞典学者e n g v a l l 和p e r l m a n n 发展了酶 联免疫吸附技术( e l i s a ，e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b a n ta s s a y ) 1 3 2 1 ，其基本原理与 r i a 相同。先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。 测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或 金胶壳聚糖仿生膜界面上电化学生物传感器的制各 抗原发生反应。用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分。然后加入底物， 在酶的催化作用下显色，通过光度法进行定性或定量测定。由于酶催化反应的专 一性和高效性，使该方法既在灵敏度上能与放射性方法相媲美，又同时避免了对 放射性废物的处理，因此这种方法得到人们的关注和推广应用口。 根据检测目的和操作步骤不同，e l i s a 有下列三种方法：间接法e l i s a 、夹 心法e l i s a 和竞争法e l l s a 。 1 2 1 间接法e l i s a 间接法e l i s a 是测定抗体最常用的方法，其测定原理如图1 2 所示。将己知 抗原吸附于固相载体上，然后加入待检标本( 含相应抗体) 与之结合。免疫反应 结束后再进行洗涤，最后加入酶标抗球蛋白抗体( 酶标抗抗体) 和底物进行测定。 操作步骤：包被固相载体，用己知抗原包被固相载体【3 4 】；加待检标本：经过 一定时间的培育，使相应抗体与固相抗原发生免疫结合。洗涤，除去未反应的物 质；加酶标抗抗体，再次培育与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去 未结合的酶标抗抗体；加入底物终止反应后，定量测定。 s u b s t r a t e - - - - - - - - - - - - - + _ 3 0 ，a 2 5 0 单 位，毫克) 购于自上海雪螨生物科技公司，邻苯二胺( o p d ，o - p h e n y l e n e d i a m i n e ) 购于五联化工厂，h 2 0 2 ( 3 0 ) 购于烟台三和化学试剂有限公司，壳聚糖溶液( 1 ， 1 i ) 通过将壳聚糖粉末在l 乙酸中超声获得。以上均为分析纯，用的时候没有 进行进一步纯化。实验中所用水均为二次水。不同p h 值的浓度为0 1m 的磷酸缓 冲液( p b s ) 通过混合磷酸二氢钠和磷酸氢二钠储备液来制备，并用0 1m 的n a o h 和h 3 p 0 4 来校正。试剂在室温( t o 。c ) 下使用。 2 2 3 纳米金胶粒子的制备 所有在本实验中要用到的玻璃仪器应先用新配制的王水( h n 0 3 ：h c l 1 ：3 ) 清洗，然后用二次蒸馏水彻底的冲洗干净并晾干。按照文献报道的方法制备纳米 金胶粒子。具体制备方法如下：h a u c h 和柠檬酸三钠溶液先用0 2 2 p r o 的多孔滤 膜过滤，然后将1 0 m l1 的柠檬酸三钠加到1 0 0 m l0 0 1 的沸腾的h a u c l 4 溶液中， 并在沸点下搅拌l o 分钟。制得的纳米金胶粒子通过透射电镜检测( t e m ) 进行 金胶壳聚糖仿生膜界面上电化学生物传感器的制备 了表征，结果如图所示，纳米金胶粒子颗粒均匀，粒径大约为9 r i m ( 图2 - 1 ) 制备好的金胶被保存在4o c 备用。 图2 一i 纳米金胶粒子的t e m 电镜图 f i g 2 一it e mm i c r o g r a p ho f t h cp r e p a r e dg o l dc o l l o i dn a n o p a r t i c l e s 2 2 4 固定有h r p 的金胶壳聚糖仿生膜修饰的i t o 电极的制备 按照文献报道的方法进行i t o 电极的表面预处理【1 1 筇】。将切好的薄片电极 ( 5 x 2 5c m 2 ) 在丙酮中超声1 0 分钟，二氯甲烷中超声1 0 分钟，最后在清水中超 声2 分钟。将洗涤好的薄片电极放入比例为5 ：1 ：l 的h 2 0 ，h 2 0 2 ( 3 0 ) 和 n h 3 h 2 0 ( 2 5 ) 的混合溶液中，7 0o c 搅拌- d , 时，待反应完毕，取出电极，用 二次水洗涤，放入烘箱干燥i ( 1 0 0o c ) 4 小时。首先在准备好的i t o 电极上滴加 1 0 山l 的壳聚糖，干后再将修饰壳聚糖膜的i t o 电极在纳米金胶溶液中浸泡3 0 分钟，形成金胶壳聚糖仿生膜。将0 1m u m lh r p 溶液l o 山滴到修饰电极上，制 备酶生物传感器，保存在47 c 备用。 青岛科技大学研究生学位论文 2 3h 2 0 2 分析过程 6 n z w n e a un a n o p t i c l e e n z y m em o d i f i e di t oe l e c b o d e 图2 2 在流动注射体系中检测h 2 0 2 的酶传感器的电化学池示意图 f i g 2 - 2s c h e m a t i cd i a g r a mo f t h ee l e c t r o c h e m i c a le n z y m eb i o s e n s o rf o rt h ed e t e r m i n a t i o no f h 2 0 2 i naf l o wi n j e c t i o ns y s t e m h 2 0 2 流动注射分析如图2 2 所示。实验中所用的溶液均用高纯氮除氧1 5 分钟， 在整个检测过程中一直维持氮气氛围。电化学检测是室温下在电化学流通池中进 行。将h 2 0 2 储备液稀释成浓度为0 0 1m m 到1 0m m 的溶液，将这一系列溶液通过 流动注射多向阀，与由另一条管路进入的底物o p d 经过一个三通混合，然后一起 注射到电化学流通池中( - - 通与流通池的距离要非常近) ，和流通池中固定的辣 根过氧化物酶发生电催化反应。安培分析中的电压为5 1 0m v ，信号由电分析仪 记录。 2 4 结果与讨论 2 4 1 固定有h r p 的i t o 电极电镜表征 生物传感器的响应与其表面物理性质有关，对制备的固定有h r p 的金胶壳聚 金胶壳聚糖舫生膜界面上电化学生物传感器的制备 糖仿生膜修饰的i t o 电极分别进行扫描电镜( s e m ) 和原子力显微镜( a f m ) 表征。 如图2 3 所示，金胶壳聚糖仿生膜和固定有h r p 的金胶壳聚糖仿生膜修饰的i t o 电极的s e m 和a f m 表征图。从s e m 和a f m 图( 图2 - 3 a 和2 - 3 c ) 我们可以看 出金胶壳聚糖仿生膜修饰的i t o 电极表面呈现均匀、洁净的表面。相比较而言， 在此基础上，由图2 3 b 和2 3 d 可以看出，金胶壳聚糖仿生膜吸附的酶生物分子 图2 - 3 ( a ) 金胶壳聚糖仿生膜修饰的i t o 电极的s e m 表征图( b ) 固定有h r p 的金胶壳聚 糖仿生膜修饰的i t o 电极的s e m 表征图( c ) 金胶壳聚糖仿生膜修饰的i t o 电板的a f m 表 征图( d ) 固定有h r p 的金胶壳聚糖仿生膜修饰的i t o 电极的a f m 表征图 f 培2 3s e mm i c r o g r a p h so f t h ei t oe l e c t r o d em o d i f i e dw i t ha u - - c h i t o s a am e m b r a n e ( a ) a n d h r p a u - - e h i t o s a nm e m b r a n e ( b ) a n da f mm i c r o g r a p h so f t h ei t oe l e c t r o d em o d i f i e dw i t h a u _ c h i t o s a nm e m b r a n e ( c ) a n dh r p a t p c h i t o s a nm e m b r a n e0 3 ) h r p 有规则的分布在修饰的1 3 o 电极表面。因此，在固定h r p 酶生物大分子上， 掺杂纳米金胶粒子的壳聚糖仿生膜起到了重要的作用。这个多孔渗水的结构使得 青岛科技大学研究生学位论文 固定的h r p 酶更易暴露活性点，使得底物更易与酶反应，从而使这个生物传感器 得到一个良好的安培响应信号。 2 4 2 修饰电极的循环伏安电化学行为 h r p 能催化h 2 0 2 氧化o p d 的酶促反应，并且酶促反应桃理在文献中已有报 道1 3 - h 。图2 - 4 向我们展示了修饰不同物质的i t o 电极在不同溶液中的循环伏安图。 图2 _ 4 不同电极在5 0 m v s 的扫速下的循环伏安图：( a ) 为金胶壳聚糖仿生膜修饰i t o 电极 在o i m p h5 0 p b s 中的图形i b ) 为固定有h r p 的金胶壳聚糖膜修饰i t o 电极在o 1 m p h5 0 p b s 中的图形：( c ) 为金胶壳聚糖仿生膜修饰i t o 电极在0 1 m p h5 0 p b s + 2 0 m m o p d 中 的图形式d ) 为固定有h r p 的金胶壳聚耱膜修饰i t o 电极在0i m p h 5 0 p b s 中的图形+ 2 0 1 1 1 m o p d 中的图形：( e ) 为金胶壳聚糖仿生膜修饰i t o 电极在0 1 m p h5 , 0 p b s + 2 , 0r a m o p d + 0 , 2 m m h 2 0 2 中的图形；( f ) 为固定有h r p 的金胶壳聚糖膜修饰i t o 电板在o 1 m p h5 o p b s 中 的图形+ 2 0 r a m o p d + 0 2 m m 啦0 2 中的图形；( g ) 为固定有h r p 的金胶壳聚糖膜修饰的i t o 电极在0 i m p h5 , 0 p b s + 2 0 m m o p d + 0 3 m m h 2 0 t 中的图形 f i g 2 - 4c y c l i cv o l t a m m o g r a m s o f d i f f e r e n te m c t r o d c sa t5 0m v s ：a u - c h i t o m n - m o d i f i c di t o e l e c t r o d e ( a ) a n de n z y m c a w - c h i t o s a n - m o d i f i e , d l t oe l e c t r o d e i n0 i mp h5 0p b s ； a u - c h i t o s a n - m o d i f i e d t o e l e c t r o d e ( c ) a n de n z y r n e a u - - c h i t o s a n - m o d i f i e d t oe l e c t r o d ei n ( a ) + 2 0r a m o p d ；( e ) a u - - c h i t o s a n - m t a d i f i t n t i t o e | e c n o d e 城a ) 4 - 2 0t l 州o p d + 0 2 m m h 2 0 2 ； me n z y m e a u - c h i t o s a n - m o d i f i e d i t oe l e c t r o d e i n ( b ) + 2 0 m m o p d + 0 2 m m h 2 0 2 ； ( f ) + 0 3 m m h 2 0 2 3 1 金胶壳聚糖仿生膜界面上电化学生物传感器的制备 金胶壳聚糖膜修饰的i t o 电极与固定有h r p 的金胶壳聚糖膜修饰的i t o 电极 在没有o p d 与h 2 0 2 存在的0 1mp h = 5 0 拘p b s 缓冲液中没有信号( 图a 和b ) 。仅在 修饰了h r p 后，电极才显示了一个较大的充电电流( 图b ) 。当往p b s 中加入2 0m m 的o p d 后，金胶壳聚糖膜修饰的i t o 电极与固定有h r p 的金胶壳聚糖膜修饰的i t o 电极没有显示出明显的氧化还原峰( 图c 和d ) 。当p b s 中加入2 0m m 的o p d 和0 2 m m 的h 2 0 2 后，金胶壳聚糖膜修饰的i t o 电极与固定有h r p 的金胶壳聚糖膜修饰的 i t o 电极在5 0 m v s 的扫速下均显示出o p d 的一对稳定的良好的氧化还原峰，其中 金胶壳聚糖膜修饰的i t o 电极的峰电位为- 4 9 5m v ，3 7 4m v ；固定有h r p 的金胶 壳聚糖膜修饰的i t o 电极的峰电位为5 2 3m v ，3 8 7m v ( 图e 和f ) 。当底物溶液中 h 2 0 2 的浓度增加到o 3m m 后，固定有h r p 的金胶壳聚糖修饰的i t o 电极的还原峰 明显增大，而其氧化峰则减少( 图g ) ，这表示在传感器的表面发生了电催化反应。 2 4 3i - 1 2 0 2 流动注射分析的条件优化 通过流动注射电化学检测h 2 0 2 的条件由电化学与流动体系来决定。i t o 电极 上的h r p 的固定量也是影响灵敏度与重现性的一个重要因素。在这里我们选择了 o p d 的浓度，底物溶液的p h 值和h r p 的固定量。结果如图2 5 所示。当在含有 0 2 5m mh 2 0 2 的p h 值为5 0 的p b s 缓冲液中增加o p d 的浓度时，其微分脉冲伏 安法( d p v ) 检测到的峰电流信号也相应的增加，并在2 0m m 浓度达到一个最 大值( 图2 - 5 a ) 。因此，这个浓度被选为最佳的o p d 浓度值。溶液浓度的酸性对 酶活性有很大的影响。所以，对于电流的响应值底物溶液的酸性是一个重要影响 因素。如图2 5 b 所示，生物传感器在含有2 0 m m 的o p d 和0 2 5 m m 的h 2 0 2 的 p h 值为5 0 的o 1m 的p b s 中有最大的响应信号。因此，此酶反应p h 值的最优 点为5 0 ，并应用在所有实验中。 传感器的性能部分决定于固定在金胶壳聚糖膜上h r p 的稳定性。如图2 5 c 所示，当h r p 的浓度从o 1 2 0 x 1 0 7 9 m l 增加时d p v 的峰电流急速增大，在较高 的浓度时电流维持在一个最大响应信号。h r p 的最优量选定为l o 山2 0 x1 0 7 9 m l 。 底物流过电化学池与酶反应的流速对h 2 0 2 的检测影响很大。在高流速下，记录 的信号显示为一个高强度的尖峰。但是太高的流速会影响电化学检测。因此，2 5 m l m i n 的流速被发现是流动注射i - 1 2 0 2 的合适速度。 2 4 4 流动注射安培法测定h 2 0 2 的标准曲线 在恒电位5 1 0m v 下，将一系列不同浓度的h 2 0 2 溶液通过流动注射多向阀， 与底物o p d 经过一个三通混合，和流通池中固定的辣根过氧化物酶发生电催化 反应，随着h 2 0 2 的浓度增大，生物传感器的安培响应信号逐渐增大。如图2 - 6 青岛科技大学研究生学位论文 所示的流动注射电化学信号。生物传感器对h 2 0 2 从o 0 1 0 5m m 的线性响应范围 如图2 - 6 中插入图所示，其线性相关系数为o 9 9 7 ( n - 8 ) ，检测限为o 0 0 5 m m 。 ( a ) c ( o p d ym m( b ) p ho fs u b s t r a 惦 ( c ) c ( e n z y m e ) lo t g m 图2 5 ( a ) 为o p d 浓度的选择( b ) 为底物溶液的p h 选择 ( c ) i t o 电极上的h r p 酶的固定量的选择 f i g 2 - 5e f f e c t so f c o n c e n t r a t i o no f o p d ( a ) ，p ho f s u b s t r a t es o l u t i o n ( b x a n dc o n c e n t r a t i o no f i m m o b i l i z e dh i l t , e n z y m eo i lm o d i f i e di t o e l e c t r o d e ( c ) 毒甚d i 毒葚d i 金胶壳聚糖仿生膜界面上电化学生物传感器的制备 范围内，生物传感器由于其始终如一的多孔渗水的金胶壳聚糖膜结构使得底物在 酶的溶液中快速扩散而显示出很高的灵敏度。 1 0 8 6 司 毒 意4 一西 2 0 0 5 0 0 1 0 1 5 t i m e ( s ) 图2 _ 6 流动注射电化学生物传感器以进样闻隔为8 0s 的状态来注射不同浓度的h 2 0 2 和舍有 2 0 m m o p d 的p h5 0 p b s 溶液检测h 2 0 2 ，内图：在最优务件下检测h 2 0 2 的标准曲线 f i g 2 - 6t y p i c a ls i g n a l so f t h ef l o w i n ge l e c t r o c h e m i c a lb i o s e m o rt od e t e c th 2 0 2 砒d i f f e r e n th e 0 2 c o n c e n t r a t i o n s 缸as a m p l i n gi n t e r v a lo f 8 0sw i t h2 0m mo p di np h5 0p b