（植物营养学专业论文）水稻硅结合蛋白的鉴定及功能研究.pdf

摘要 本论文首次报道了水稻叶片中硅结合蛋白的分离提取方法、分子特征及其功能与分布，从 分子水平上揭示了水稻控制硅沉积的机制，并进一步探讨了硅结合蛋白与硅减轻水稻重金属镉 毒害的笑系。研究的主要结论如下： 通过低温捣碎分级分离法我们成功从水稻叶片中分离到天然硅体，进而分离到一种与硅紧 密结合的分子昔为1 1 7k d a 的蛋白，称之为硅结合蛋白( s i l i c a - b i n d i n g p r o t e i n1 1 7 ，s b p i l 7 ) 。 通过n - 末端测序和奄询n c b i 数据库，鉴定了s b p l l 7 是一种未知功能的富脯氨酸蛋白家族的 成员，其篮自质序列号为a a 0 7 2 5 5 7 1 ，它的氨基酸组成与硅藻和黄瓜中发现的硅结合蛋白相 似，但排列顺序明显不同，说明其可能是一种禾本科植物所特有的控制硅沉积代谢的蛋白。 体外实验证明s b p i1 7 具有明显的诱导硅酸沉淀的能力，其沉淀的硅酸量与加入的蛋白量 呈正相_ 芙，并且与加入的硅酸量也呈正相关在植物细胞生理d h 范围5 0 左右蛋白活性最强。 人j ：合成s b p i1 7 的两个肽段与匙孔嘁血蓝蛋白载体偶联后免疫兔子，获得了抗s b p i1 7 的专一性抗体。免疫印迹检测表明此抗体还能与其它累积硅的禾本科植物硅体中的蛋白发生交 义反应，但不能与般子叶植物( 如番茄叶) 蛋白反应，这说明与s b p i1 7 相似的硅结合蛋白广 泛存在于积累碎的乐本科植物之中，硅在高等植物中的积累具有系统发育上的特征。免疫细胞 化学检测s b p l l 7 主要分布在水稻叶片的泡状细胞中；组织印迹法显示s b p l l 7 主要分布在水 稻根茎叶的外表皮中，在根和叶的维管组织中也有分布，这与硅在水稻体内的分布是一致的， 说明此蛋白参与控制硅在水稻体内的沉积。 另外，我们还研究了硅结合蛋白与硅提高水稻抗重金属镉毒害的关系。水培实验发现施硅 能显著减轻水稻镉毒害症状，使镉向地上部的运输显著降低。质外体荧光示踪剂p t s ( t r i s o d i u m 一8 一h y d r o x y 一1 ，3 ，6 一p y r e n e s u l p h o n a t e ) 的测定结果表明加硅可以显著降低质外体途径的 运输鼍。进一步州x 一射线能谱分析和免疫细胞化学定位显示硅结合蛋白、硅和镉三者主要分布 在水稻根系的内皮层和纤维层细胞附近，说明硅结合蛋白可能通过诱导硅在以上两个部位沉积， 影响镉的质外体运输，减轻镉的毒害。 关键词：硅，硅结合蛋白，水稻，镉，免疫细胞化学定位 a b s t r a c t t h ep a p e rw a st h ef i r s tt i m et or e p o r tt h em e t h o do fi s o l a t i n ga n de x t r a c t i n gt h es i l i c a - b i n d i n g p r o t e i n ，i t sm o l e c u l a rc h a r a c t e r ，t h ef u n c t i o na n di t sd i s t r i b a t i o n w ee l u c i d a t e dt h em e c h a n i s mo f s i l i c ad e p o s i t i o ni nr i c ef r o mm o l e c u l a rl e v e l i na d d i t i o n ，w ei n v e s t i g a t e dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e n t h es i l i c a b i n d i n gp r o t e i na n dt h em e c h a n i s mt h a ts i l i c aa l l e v i a t e dt h et o x i c i t yo f c a d m i u mi nr i c e t h e m a i nr e s u l t sa r e “f o l l o w i n g ： w es u c c e e d e di n i s o l a t i n gt h en a t i v es i l i c a b o d i e sf r o mr i c el e a v e sb yl o wt e m p e r a t u r e h o m o g e n i z i n ga n ds i e v i n gm e t h o d f r o mn a t i v es i l i c ab o d i e sw ee x t r a c t e da11 7k d ap r o t e i nw h i c hi s t i g h t l yb i n d i n gw i t hs i l i c a ，n a m e l ys b p i1 7 ( s i l i c a - b i n d i n gp r o t e i n11 7k d a ) b ya n a l y z i n gt h e n t e r m i n a la m i n oa c i ds e q u e n c ea n ds e a r c h i n gi nn c b id a t a b a s e w ef o u n ds b p i1 7i sam e m b e ro f p r o l i n e r i c hp r o t e i nf a m i l ya n di t sf u n c t i o ni su n k n o w n t h er e g i s t e r e dn u m b e ri sa a 0 7 2 5 5 7 ，i t h e c o m p o s i t i o no fa m i n oa c i d so ft h i sp r o t e i n i ss i m i l a rw i t ht h o s ep r o t e i n sf o u n di nd i a t o ma n d c u c u m b e r b u tt h es e q u e n c eo f a m i n oa c i d si sd i f f e r e n t i tm e a n st h a ts b p l1 7i sas p e c i a lp r o t e i nf o r g r a m i n a c e o u sp l a n t st oc o n t r o lt h es i l i c ad e p o s i t i o n w ef o u n ds b p i 】7c o u l dc a t a l y z et h es i l i c ap o l y m e r i z a t i o ni nv i t r o t h ea m o u n to fs i l i c a p r e c i p i t a t e dw a sp r o p o r t i o n a lt ot h ea m o u n to fs b p i1 7p r e s e n t , a n da l s ot ot h ea m o u n to fs i l i c a p r e s e n t a tp h5 0 ，w h i c hi sar a n g eo f p h y s i o l o g i c a ir a n g eo f p l a n t s ，p r o t e i ni sr a t h e ra c t i v e s p e c i f i cp o l y c l o n a la n t i b o d i e sa g a i n s ts b p i1 7a r es u c c e s s f u l l yr a i s e db ys y n t h e s i z e dp e p t i d e s w h i c hw e r ec o n j u g a t e dw i t hk e y h o l el i m p e th e m o e y a n i na n du s e da sa n t i g e n st oi m m u n i z er a b b i t s m m u n o b l o tr e s u l t si n d i c a t et h e a n t i b o d yc a na i s oc r o s sr e a c tw i t h t h e p r o t e i n s o fo t h e r s i l i c a - a c c u m u l a t e dg r a m i n a c e o u sp l a n t s ，w h i l ei td o e sn o tr e a c tw i t ht h ep r o t e i n so fd i c o t y l e d o n o u s p l a n t s ( s u c ha st o m a t ol e a v e s ) t h e s ef i n d i n g si n d i c a t et h a tt h eh o m o l o g o u sp r o t e i n so fs b p i1 7a r e w i d e l ye x i s t e di nt h eg r a m i n a c e o u sp l a n t s s t h i si n d i c a t e ds i l i c aa c c u m u l a t e di nh i g l l e rp l a n t sp o s s e s t h ec h a r a c t e ro f s y s t e m a t i cd e v e l o p m e n t 1 m m u n o c y t o c h e m i s t r yl o c a l i z a t i o ns h o w ss b p l 】7i sm a i n l y l o c a t e da lt h eb u l l i f o r mc e l li nt h el e a f t i s s u ep r i n t i n gs t u d ys h o w e dt h a ts b p i1 7i sm a i n l yl o c a t e da t t h ee p i d e r m i so fr o o t s ，s h o o t sa n dl e a v e sa sw e l l8 si nt h ev a s c u l a rb u n d l eo f t h er i c er o o t sa n dl e a v e s t h ed i s t r i b u t i o no f s b p l l 7 i sc o i n c i d e d w i t h t h es i t e s o f s ia c c u m u l a t e d i nr i c ep l a n t s t h e r e f o r e i t i s c o n c l u d e dt h a ts b p ij7i si n v o l v e di nt h ec o n t r o lo f s i l i c ad e p o s l t i o ni nr i c ep l a n t s i na d d i t i o n ，w ea l s oi n v e s t i g a t e dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h es i l i c a - b i n d i n g p r o t e i na n dt h e m e c h a n i s mt h a ts i l i c ai n c r e a s e dt h er e s i s t a n c eo fr l c es e e d l i n g st ot o x i cm e t a l s ( c d ) s ia d d e d s i g n i f i c a n t l ya l l e v i a t e dt h et o x i c i t ys y m p t o mo fc di nr i c os e e d l i n g sg r o w nh y d r o p o n i c a i l y s i d r a m a t i c a l l yr e d u c e dt h et r a n s p o r to fc df r o mr o o t st os h o o t s t h er e s u l to ft h ea p o p l a s t i c f l u o r e s c e n c et r a c e r p t s ( t r i - s o d i u m - 8 - h y d r o x y l ，3 ，6 - p y r e n e s u l p h o n a t e ) s h o w e dt h es i g n i f i c a n t r e d u c t i o no f a p o p l a s t i ct r a n s p o r t i n+ s i p l a n t s e n e r g y d i s p e r s i v e x r a ya n a l y s i s a n d i m m u n o c y t o c h e m i s t r yl o c a l i z a t i o n s h o w e dt h es i l i c a - b i n d i n g p r o t e i n ，s ia n dc dw e r em a i n l y d e p o s i t e di nt h ev i c i n i t yo f t h ee n d o d e r m i sa n dt h ef i b e rc e l l ，w h i c hs u g g e s t ss b p i1 7m a y b ei n d u c e i i s ip r e c i p i t a t e di na b o v et w os i t e sa n dr e s t r a i nt h ea p o p l a s f i et r a n s p o r to fc d ，a n da l l e v i a t e dt h e t o x i c i t yo fc d k e yw o r d s ：s i l i c a ，s i l i c a - b i n d i n gp r o t e i n ，r i c e ，c a d m i u m ，i m m u n o c y t o c h e m i s t r yl o c a l i z a t i o n u i 英文缩写 a p b c i p b s a d d h ，0 d m s o d t p a e d t a e d x h p l c k d a k l h m b s m e s m s n b t n c o d p a g e p o d p t s p v d f s d s t r j s 缩略词 英文全称 a l k a l i n ep h o s p h a t a s e 5 一b r o m o 一4 c h l o r o - 3 一i n d o l y l - p h o s p h a t e b o v i n es e r u ma l b u m i n d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r d i m e t h y l s u l f o x i d e d i e t h y l e n e t r i a m i n i p e n t aa c e t i ca c i d e t h y l e n e d i a m i n e l e t r a - a c e t i ca c i d e n e r g y - d i s p e r s i v ex - r a ya n a l y s i s h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a m k i l od a l t o n k e y h o l el i m p e th e m o c y a n i n m m a l e i m i d o b e n z o y l - n - h y d r o x y s u c c m i m i d ee s t e r 2 - m o r p h o l i n o e l a n s s u l f o n i ca c i d s m e s ss p e c t r u m 4 - n i t r ob l u et e t r a z o l i u mc h l o r i d e n i t r o c e l l u l o s e o p t i c a ld e n s i t y p o l y a c r y l a m i d eg e le l e e t r o p h o r e s i s p e r o x i d a s e t r i s o d i u m 一8 - h y d r o x y - 1 ，3 ，6 - p y r e n e s u l p h o n a t e p o l y v i n y l i d e n ed i f l u o i d em e m b r a n c e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e t r i h y d r o x y m e t h y la m i n o m e t h a n e 中文名称 碱性磷酸酶 5 溴4 氯- 3 - 吲哚磷酸盐 牛血清蛋白 双蒸水 二甲亚砜 二乙三胺五乙酸 乙二胺四乙酸 x 射线能谱分析 高效液相色谱 干道尔顿 匙孔喊血蓝蛋白 间马来酰亚胺苯甲酸 - n - 羟基琥珀酰亚胺酯 2 - 吗啉代丙烷磺酸 质谱 氯化硝基四氮唑蓝 硝酸纤维素膜 光密度 聚丙烯酰胺凝胶电泳 过氧化物酶 硝酸纤维索膜 十二烷基磺酸钠 三羟甲基氨基甲烷 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 史新慧 时间：埘年月加日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 史妁煞 时间： 泐年占月日 导师签名： 时间：财年月钧目 中国农业人学顿j 二学位论文 第一章文献综述 1 1 硅在植物中的作用 第一章文献综述 硅是地球上继氧之后最为丰富的元素，也是植物体内最丰富的无机元素之一，大多数的陆 地和海洋生态系统中都存在着硅的生物循环( h o d s o na n de v a n s ，1 9 9 5 ) 。由于硅无处不在，因此 在技术上很难根据传统植物营养学“必需营养元素”的三个原则来证明硅的植物必需性 ( t a k a h a s h ie la t ，1 9 9 0 ) 。在动物和单细胞生物( 如硅藻) 中。硅的必需作用已经得到证明，即 硅能参与这些生物体众多的新陈代谢过程( w e m e ra n dr o t h ，1 9 8 3 ) ，但关于硅影响高等植物代 谢的研究不多。很久以来，人们把硅看作是随水分吸收而被动地进入植物体内的废物，其功能 很少受到人们的重视。然而，近年来的大量研究发现很多植物存在主动吸收硅的机制( t a m a ia n d m a ，2 0 0 3 ) ，硅参与植物体内的多种生理括动，对植物的健康生长及产量起重要作用( o k u d aa n d t a k a h a s h i ，1 9 6 5 ；s a v a n te ta 1 ，1 9 9 7 ) ，硅在维管组织及表皮细胞中的积累增强了组织的机械性 能，提离了叶片受光面积和群体光合效率，特别是在各种生物胁迫和非生物胁迫f 能提高植物 的抗逆性，包括抗倒伏、抗病虫害、抗旱、抗高温、抗紫外胁迫、减轻重金属毒害及盐胁迫等 ( e p s t e i n ，1 9 9 9 ；m ae la l ，2 0 0 1 ；n e u m a n na n dz u m i e d e n ，2 0 0 1 ；l i a n ge t a l ，2 0 0 5 ) 。目前硅元素 已被列为“有益元素”，在一定条件下，硅对许多植物的生长都是有益的。去掉营养液中的硅元 素会导致一种1 f 典型环境胁迫( a t y p i c a le n v i r o n m e n t a ls t r e s s ) ( e p s t e i n ，1 9 9 4 ) 。硅是唯一在植物 体内过量也无毒害作削并且是一种具有广谱抗性的元素，现在硅肥已经成为世界上曾遍使用的 具有增产抗逆作j i ；| 的新型肥料，也是无任何毒副作用的天然“农药”( m ee t a l ，2 0 0 1 ) ，在农业 的可持续发展中起着越来越重要的作用。 1 2 植物体内硅的含量、分布和存在形态 1 2 1 植物硅含量的特点 不同植物种类含硅量差异很大，作物体内硅元素浓度变化范围一般为o 1 - 1 0 ( e p s t e i n ， 1 9 9 4 ) ，按其s i 0 2 含鼍可分为三类( t a k a h a s h ia n dm i y a k e ，1 9 7 7 ) ：( 1 ) 硅累积型植物：莎草科 中的一些植物如小贼，禾本科的湿生种如水稻，其含硅量为1 0 1 5 ，稻属植物有2 3 个种，是 典型的嗜硅植物：( 2 ) 硅非累积型；禾本科早生植物，如甘蔗、大部分谷粒作物及几种双子a t 。 植物，其含硅鲑为1 3 ；( 3 ) 拒硅型植物：大部分双子叶植物，特别是豆科植物，其含硅量则 小于o 5 。 同一植物的不同部位，硅含量也有极大的差异。硅的分布遵循末端分布规律，即含硅越地 上部高下根系，如水稻体内颖壳 叶片 叶鞘 茎 根，y o s h i d a 等( 1 9 6 2 ) 结果表明水稻根、1 1 - 鞘、叶中s i 0 2 含量占于物重的酉分比分别为2 0 7 t1 2 3 和1 3 4 。 中国农业夫学硕卜学位论文 第一章文献综述 1 2 2 硅在植物中的分布 植物体内的硅主要有三个沉积位点：( 1 ) 细胞壁；f ( 2 ) 硅化细胞：( 3 ) 胞间隙或角质层( k i m e ta l 2 0 0 2 ；s a n g s t e ra n dh o d s o n ，1 9 8 6 ) 。在草的叶鞘睁存在有不同的硅体，主要存在于硅化细 胞、泡状细胞、硅质化表皮细胞以及硅质化表皮毛等l ( k r i s h n a nc ta 1 ，2 0 0 0 ) ，泡状细胞在横切 面上为人的圆形细胞，在表面观察时为方形细胞，它南部的扇彤硅体是在细胞分化完成后沉积； 硅化细胞s t u d , ，它是在叶片发生时期就形成并开始沉积硅；与以上两种细胞不同，大部分硅质 化表皮细胞为长形细胞，具体见图1 - 1 。表皮细胞和表皮毛壁中的硅可能是通过蒸腾作用被动 的由水携带的单石丰酸沉积而成；而位于泡状细胞和硅细胞腔中的硅体可能是主动控制所形成， 因为当硅体充入胞腔后细胞最终死亡( k a u f a r n a n 耵靠，1 9 8 5 ) 。y o s h i d a 等( 1 9 6 2 ) 发现在水稻 叶片中叶尖含量最高，硅主要沉积于叶片的上下表皮、维管束鞘以及相连的厚壁细胞，其中上 下表皮和维管束鞘含鼙最高；茎中主要分布在表皮、维管束鞘、厚壁组织以及薄壁细胞的细胞 壁：而根中备组织均含有硅，其中主要分布在内皮层及中柱鞘。小麦幼叶中的硅主要沉积在下 表皮细胞，老叶则主要在上表皮细胞，在小麦外稃和颗壳的外表皮细胞壁硅化最为明显，毛状 体也是主要的硅化部位( h o d s o na n ds a n g s t e r , 1 9 8 8 ) 。k a u f a m a n 等( 1 9 8 5 ) 发现某些草类植物 的叶肉细胞砗含量比周围表皮细胞高，这些特化结构也称作硅化细胞。c 4 植物中硅化细胞多于 c 3 植物，前者主要分布在泡状细胞、硅细胞和长的表皮细胞，而后者主要位于表皮毛。在高粱 属( s o r g h a s t r u mn u l a n s ) 、( s o u g h a s t r u mb i c o l o r ) 和其它草的根部，氧化硅团聚体主要沉积在内 皮层内切向壁( s a n g s t e r , 1 9 7 8 ) 。另外甘蔗( s a c c h a r u r ao f f i c i n a r u m ) 中从内皮层内切向壁直到 细胞纤维素，加厚时才发生硅化( p a r r ya n dk e l s o ，1 9 7 7 ) 。在埘硼n 缸c a e r u l e a 中，s i 0 2 沉积也 仅在皮层细胞间隙中发现，早期沉积是以球形硅体在胞间隙内排列，最后完全填充胞内空隙 ( m o n t g o m e r ya n dp a r r y 1 9 7 9 ) 。 abcd 图1 - 1 叶鞘中不同种类的硅体 a ：泡状细胞；b ：硅细胞；c ：硅质化表皮毛；d ：硅质化表皮细胞 f i g u r el - 1d i g r a mo f d i f f e r e n t k i n d s o f p h y t o l i * h s f o u n d i ng r a s s l e a f b l a d e ab u l l i f o r mc e l l ：bs i l i c ac e l l ；c ：s i l i e i f i e dt r i c h o m e ；d ：s i l i c i f l e de p i d e r m a lc e l l ( k r i s h n a ne ta l 2 0 0 0 ) 对丁人多数植物米说，硅大多分布在质外体中，如禾本科植物主要在叶表皮细胞中( j o n e s a n dh a n d r e c k ，1 9 6 7 ) ，硅积累在水稻叶片的表皮细胞上形成“角质双硅层”结构，一层在表皮 细胞壁与角质层之间另一层在表皮细胞壁内与纤维素相结合。禾本科、莎草科和c o m m e l i n a s 2 中国农业人学坝一i j 学位论文第一章文献综述 中硅体大部分分布于表皮细胞中，这些含硅表皮细胞又与表皮下的厚壁纤维细胞相连，而禾本 科的泡状细胞中的硅体与厚壁细胞无关它属于次生生长时形成的硅体，即叶片成熟后形成； 在兰科、棕榈及香蕉树中，硅体在维管束鞘后壁细胞中：而在双子叶植物细胞内硅体只在瓜类 硬皮中有，其余硅都存在于细胞壁中，但病原体侵染可诱导表皮细胞内形成硅体，瓜类硬皮细 胞中的硅体也与厚壁细胞相连，所以硅体与厚壁细胞的关系值得研究( p r y c h i de t a l ，2 0 0 4 ) 。 1 2 3 硅在植物体中的形态 植物体中，砖存在的主要形态是水化无定形二氧化硅( s i o r r d - 1 2 0 ) 和二氧化硅( s i 0 2 ) ， 其次是硅酸和胶状硅酸( l a n n i n ga n de l e u t e r i u s ，1 9 8 3 ) 。水化无定形二氧化硅也称为硅胶或多聚 硅酸，或称为具有明显三维结构的植物蛋白石( p a r r ya n ds m i t h s o n ，1 9 6 4 ) 。不同的植物蛋白柏 形状明显不同，如针叶林中植物蛋白石一般呈立方形、不规则形或多面体；而阔叶林则呈拼板 玩具状、a 角形或是五角形状，呈弯曲或枝状、纺缍状、片状、不规则状或椭圆状以及空心茸 毛细胞形。但无定形硅本身没有规则的内在形态结构，人们观测到的各种各样的蛋白石的三维 结构很可能烂由外部因子一即硅沉积部位有机基质控制的。硅体里也包含大量的氢和碳，可能 是胞质或纤维素木质素物质( p r y c h i de ta 1 ，2 0 0 4 ) 。硅在细胞壁上的沉积受代谢严格的和即时 的调控，如在草本植物叶片的表皮中，硅沉积的亚显微结构随初生壁转变为次生壁而由纸张状 转变为球状，这些变化明显受细胞壁代谢与硅酸相互作用的控制，使硅在成熟细胞壁上沉积成 球形( 下荔军等，2 0 0 2 ) 。 s a n g s t e r 利p a r r y ( 1 9 7 6 ) 发现在禾草叶片个体发育的初期，硅的沉积限于特化的表皮细胞 如绒毛、毛状体和异细胞，异细胞的空腔完全为硅所充斥，沉积物形成特定的形状，这在种的 水平上具有分类学价值。p e r r y 等( 1 9 8 4 b ) 研究指出植物体内有多种s i 0 2 形式，但大多数结构 体均由s i o 。( o h ) 4 m 球形成纳米粒子( 1 0 r i m ) 最后组装成各种形状的硅体。张文绪和裴鑫德 ( 1 9 9 8 ) 对早稻中的7 个稻种叶片中的扇形硅体进行了研究，发现扇形硅体只存在于叶片的维 管束旁边的泡状细胞。稻属植物体内和体表存在三种形态的硅即表面硅、哑铃形硅体、扇形 硅体。每一个扇形硅体是由长2 5y m 宽0 4l u n 的s i 0 2 杆状颗粒组成，每一个s i 0 2 杆状颗粒的 直径在1 2i l n l 左右，由于每一个s i 0 2 纳米粒子上的s i - o h 可和许多金属阳离子作用，因此每 一个硅体就是一个阳离子吸附“库”( k a u f m a ne t a l ，1 9 8 5 ) 。由于纳米结构s i 0 2 独有的特性，它 在质外体的沉积势必影响细胞原有的一些理化性质，如细胞壁的空隙度、比表面积及细胞内环 境等。英国皇家科学院院士r a v e n ( 1 9 8 3 ) 对能量损耗的比较指出，硅的生物合成及以硅质体沉 积所损耗的能量仅为术质素合成所需能量的1 2 0 ，因此某些植物在特定场合可能利用这种节省 能量的纳米结构s i 0 2 来适应外界恶劣的环境。 1 3 植物对硅的吸收、运输和沉积 1 3 1 植物对硅的吸收 所有生长在土壤中的植物都含有硅( t a k a h a s h ie t a l ，1 9 9 0 ) ，但不同植物种间硅含量的差异 中国农业大学硕卜学位论文 第一章文献综述 很大，这种差异士要是由于不同植物根系对硅吸收能力的差异引起的( m ae ta l ，2 0 0 1 ) ，植物 对于硅的吸收能力冈不同的基因型和环境而变化。在p h9 以下时。植物吸收硅的形态是不带电 荷的水溶性单硅酸s i ( o h ) 4 。目前认为高等植物有三种吸收硅的形式：被动吸收、主动吸收和 拒绝吸收，这种分歧主要是由于硅和不同植物种类的关系不同( p i p e m o ，1 9 8 8 ) 。过去一些学者 认为硅酸是通过水流被动吸收的，其证据是蒸腾吸收量与硅的总含量相近以及硅的分布部位主 要集中在蒸腾簧人的部位( r a v e n ，1 9 8 3 ) 。然而近来越来越多的证据表明植物对水和对硅的吸 收并无直接的比例关系，在一些种类中也有主动吸收的证据，如水稻根中硅酸可以逆浓度梯度 进入术质部汁液，不积累硅的植物根表皮细胞抑制硅进入根中或抑制硅由根向地上部运输 ( h o d s o na n de v a n s ，1 9 9 5 ) 。另外某些双子叶植物对硅的吸收也可由于某些呼吸抑制剂的作用而 减少( o k u d aa n dt a k a h a s h i ，1 9 6 5 ) 。双子叶植物所摄取的二氧化硅虽少于经质流带到根部的量 但在水质部汁液中，二氧化硅的浓度却显著大于土壤溶液中的浓度，如蚕豆木质部汁液中二氧 化硅的浓度比 壤溶液中的高5 倍( 邹邦基和何雪晖，1 9 8 5 ) 。p i p e n o ( 1 9 8 8 ) 认为主动吸收可 能存在于不同种类甚至同一种植物不同部位。 h i l d e r b r a n d 等( 1 9 9 7 ) 在硅藻( c y l i n e r o t h e c a f u s i f o t r o i s ) 体内克隆了5 种编码硅酸运载蛋 白的基冈( s i t ) ，对于可饱和的吸收动力学测定，说明硅藻中硅的吸收是离子载体调节的，n r 年【i 硅酸共载体，运输可以被巯基阻断试剂所抑制，吸收运输是需要能量的，主要来自好气呼吸 而不是直接来自光合作用的能量，这与氮磷的吸收不同。在细胞壁合成时，5 种运载蛋白基因 s i t s 以不同的表达数茸和表达形式出现，这和研究的硅酸运载活性被诱导是一致的，并且不同 基因有不同运载特性且在细胞内位置不同，因此s i t s 合成及位置的调控可能在全面的调控硅藻 运载方面起重要作用。 n e u m a n n 和f i g u e i r e d o ( 2 0 0 2 ) 介绍了高等植物中吸收硅的两种路径，一是通过质膜上的 尚未知的返载蛋白运输到细胞质，另一个是通过小泡内吞机制直接吸收到液泡。最近已有报道 利用水稻突变体己经鉴定了水稻中硅的大量吸收在侧裉。而不是根毛( m ae l a l ，2 0 0 1 ；2 0 0 2 ) ， m a 等( 2 0 0 4 ) 认为至少存在两个运载硅的蛋白，其中一个从外部溶液吸收硅酸并将其释放到 中柱鞘，另一个将石丰酸释放到木质部，现在他己通过微卫星标记及表达序列标签等方法将第一 个运载蛋白定位在2 号染色体。总结禾本科植物根吸收硅的特点为：( 1 ) 组成型，而非诱导型 ( t a m a ia n d m a ，2 0 0 3 ) ；( 2 ) 除了5 m m n i - h + 能引起3 0 的抑制以外，其它高浓度阴阳离子( k + ， c a ”，m 9 2 + ，c i ，s 0 4 。，h 2 p 0 4 ) 的存在不影响硅的吸收( t a k a h a s h i ，1 9 9 0 ) ；( 3 ) n a c n 等代谢抑 制剂和低温抑制硅的吸收( m ae t a l ，2 0 0 2 ) ；( 4 ) 硅的吸收可被水通道抑制剂( h g c l 2 和p h l o r e t i n ) 所抑制，并能被还原剂部分解除，但不受高浓度硼酸的影响，说明硅的运载蛋白含有半胱氨酸 残基，其与水通道蛋白不完全一致( t a m a ia n d m a ，2 0 0 3 ) ；( 5 ) 根毛不参与硅的吸收( m a e l a l ， 2 0 0 1 ) i ( 6 ) 硅吸收的的高峰期在营养生长完成之后及生殖生长阶段( m o t o m u r a8 t a l 。2 0 0 2 ) 。 1 3 2 硅在植物体内的运输和沉积 自然界中硅通常与其他元素结合形成氧化物或硅酸盐，游离的很少，植物吸收的硅酸主要 是没有电荷的单硅酸s i ( o h ) 4 ，并最终在植物体内聚合以水化无定形二氧化硅( s i 0 2 n l - 1 2 0 ) 形 式存在( l a n n i n ga n de l e u t e r i u s ，1 9 8 3 ) 。硅藻细胞壁硅质化的整个过程涉及到可溶性硅的吸收、 4 中国农业大学硕士学位论文 第一章文献综述 跨膜运输以及通过细胞质运输到达硅沉积胞而发生聚合从而形成独特的形态类型，细胞必须 吸收运输足够的硅以形成细胞壁，但需防止在细胞质运输过程中发生硅的自动聚合，因此，硅 藻细胞内硅的代谢过程受到严格的生理控制，目前讨论其可能的机制为：一是与一些有机化合 物( 硅酸i 基载体) 结合而运输，二是通过专一的小泡囊来运输，这些小泡囊分子内可以保持硅 酸的可溶性( m a r t i ne ta l 。2 0 0 0 ) 。细胞壁中的硅是以硅胶的形式存在，硅体中硅的沉积是一个 逐步完成，而且是受细胞调控的。许多硅的沉积均发生木质化( 次生细胞壁) 之后，n e u m a n n 等( 1 9 9 9 ) 发现表皮细胞的外向壁含有大量以硅酸形式存在的硅，面且细胞壁的初生壁没有检测 到硅，而在次生壁却能检测到大量的硅。b l a c k m a n ( 1 9 6 9 ) 报道细胞壁次生化后硅开始大量的沉 积，但在细胞腔中的沉积则发生在叶片完全后。如果硅的沉积发生在细胞壁次生化之后，那么 在次生细胞鼙中可能存在硅的另类蛋白，负责硅在细胞壁内的沉积及随后的硅质体构筑。 高等植物中关丁落代谢( 吸收和沉积) 的研究远远落后子硅藻的研究( z u r z o i oa n db o w l e r , 2 0 0 1 ；f a l e i a t o r ea n db o w l e r , 2 0 0 2 ) ，尽管关于硅在植物体内沉积的部位和形状已有了大量研究， 但是其沉积的分子机制还不了解。硅沉积部位有植物细胞壁、细胞腔，壁膜之间、胞间隙，原 来认为这些沉积主要是通过蒸腾作用( m o t o m u m e t a l ，2 0 0 2 ) ，这个假设的证据是硅体沉积的部 位与主要发生蒸腾作用的部位是一致的。然而一些证据表明植物体内的大分子有机物在硅体的 形成过程中起作_ i ：i j ( h a r r i s o n ，1 9 9 6 ；l n a n a g aa n do k a s a k a , 1 9 9 5 ；i n a n a g ae td ，1 9 9 5 ) ，这些有机大 分子已经在醚藻和海绵中鉴定出来了。 在导管中，硅的运输形态主要是单硅酸，也可能是可溶性络合物，包括与酚羟基络合 ( t a k a h a s h i ，1 9 9 0 ) 。由茎输送到地上部的硅最后以无定形二氧化硅的形式沉积在叶片上下两面 表皮细胞的外肇，形成硅化细胞；硅也可沉积在木质部导管，以加强导管的坚韧性( r a v e n ， 1 9 8 3 ) ；硅沉积在内皮层细胞，可抑制寄生虫和病原菌的侵入( s a v a n te t a l ，1 9 9 7 ) 。 细胞壁是s i 0 2 沉积的重要有机模板。w a t e r k e y n 等( 1 9 8 2 ) 利用特殊染色技术证明b d 1 ， 3 葡聚糖的合成是在毛状体硅化过程之前发生的。木质部汁液中的硅是单硅酸( t a k a h a s h i ， 1 9 9 0 ) ，其进入植物体后，其亲水羟基可与各种亲水组分通过分子间弱相互作用力形成s i o ( o h ) 单元，然厉水解最后形成氧化硅溶胶。由硅酸聚合成硅胶状态可以分为两个步骤( k a u f m a ne t a l ， 1 9 8 5 ) ：( i ) 超饱和单硅酸溶液首先聚合成直径为2 0 3 0a 的大粒子，这时硅的表面分布约为 5 0 0 1 0 0 0m 2 g 一；( 2 ) 硅的聚合粒子联接在一起形成框架。在这一变化过程中，硅的分布面积减 少，最终面积可能由p h 和温度决定。 随着拟南芥和水稻的基因组测序完成，以及基因芯片技术和基因敲除等反向遗传学手段筛 选突变体以鉴定与硅有关的生物学基因，阐明硅的运载蛋白和控制硅沉积的蛋白可以加速植物 硅学( s i l i c o n o l o g y ) 研究的步速( r i c h m o n da n ds u s s m a n ，2 0 0 3 ) 。 1 4 硅的沉积机理 树脂、分子筛、催化剂和光子学晶体等硅基材料的化学合成需要高温、高压或强酸、强碱 等苛刻条件，目前人们在设计和制备特定结构与功能的纳米材料的技术方面仍处于较低的水平。 因此，为了寻找到新的技术手段。使人们能够在温和的生产条件下。精确的调控纳米材料的结 构与性能，材料化学家近年来把注意力转向自然界中能够准确调节与控制纳米材料合成的生物 5 中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述 体系。生物体内的二氧化硅矿化物是以1 2 纳米的氧化硅颗粒为基本单元在纳米和微米尺度上 构建的，每种积累砘的生物都具有独特的纳米硅排列图案随着细胞的繁殖过程，这些特定结 构的纳米硅材料可以在常温常压、中性p h 、低浓度硅酸溶液等温和条件下被高效准确的完成 ( m a n np fa l ，1 9 9 3 ；m a n na n do z i n ，1 9 9 6 ) ，现代生物矿化机理的研究显示，所有生物体内的矿 化物都是由无机物和与之紧密结合的有机大分子物质组成的复合材料，其中的有机大分子作为 无机纳米材料白组装合成过程的模板，对诱导无机分子的聚集成核、生长和形态建成起着决定 性的控制作用( 图1 - 2 ) ( p e r r ya n d t u c k e r 2 0 0 0 ) ，因此近来许多致力于模拟生物硅合成的研究 已经开始了。 壁缓冲区 模板蛋白 图1 - 2 硅生物矿化的有机模板控制模式图 f i g u r e l - 2 m o d e o f b i o s i l i c i f i c a t i o nc o n t r o l l i n g b y p r o t e i n a e e o u s m a