（发育生物学专业论文）盐芥thtrxh蛋白的亚细胞定位及attrxh突变体的表型分析.pdf

中文捅费 硫氧还蛋白是一类广泛存于原核生物和真核生物的热稳定、酸性小分子量 蛋白质( 其分子量约为1 2 k d a ) 。该蛋白质中含有保守的一c p ( g ) p c 一氨基酸活性 基序，其中的两个半胱氨酸残基可通过巯基二硫键的转换实现其氧化还原状态 的变化和电子氢的传递，对细胞中与氧化还原相关的多种生理过程的调节起重 要作用，是重要的氧化还原调节蛋白。 高等植物拥有复杂的硫氧还蛋白系统，它们广泛分布在细胞质、叶绿体和 线粒体中，这为它们参与调控多种生命活动提供了便利。存在于叶绿体中的硫 氧还蛋白参与光合作用中的电子传递过程，而存在于细胞质中的硫氧还蛋白可 能参与细胞的氧化还原调节。由于氧化胁迫是普遍发生于植物胁迫过程中的生 理现象，它会改变植物正常生理代谢所依赖的植物体内稳定的氧化还原内环 境，导致对细胞的直接损伤，影响植物的正常代谢生长，从而导致许多生物或 非生物的严重胁迫状态，严重时甚至导致植株死亡。 盐芥是一种与拟南芥近缘的十字花科植物，具有很多与拟南芥相同的优 点：如类似的形态、小的基因组、短的生活史、丰富的种子和易于被转化等。 但是，盐芥对多种胁迫的耐受能力远远高于拟南芥，它在短时间内能耐受高达 5 0 0 m m n a c i 的冲击，在盐适应前后既不产生盐腺也没有复杂的形态上的变化。 因此，对盐芥硫氧还蛋自的功能研究对于研究植物氧化性伤害的产生和应答机 制，对了解植物胁迫状态下的代谢变化和代谢调节，揭示植物的耐逆机理都具 有重要意义。 本实验室在盐芥e s t 库中得到劢t r x h 基因，并通过体外表达及活性实验证 明该硫氧还蛋白确实具有t r xh 的活性。t r x h 基因家族蛋白成员主要存在于植 物细胞质中，但也存在于内质网、线粒体中，不同的定位与其相应的功能相 关。为了解t h t r x h 的生物学功能，我们首先构建了砌豫砌- e g f p 融合基因瞬 时表达载体，并用p e g 法转化拟南芥叶肉原生质体，通过共聚焦显微镜检测对 t h t r x h 进行了初步的亚细胞定位。同时构建了t h t r x h 的g f p 植物双元表达载 体，并对洋葱表皮进行了农杆菌介导的转化，通过共聚焦显微镜检测对t h t r x h 进行了进一步的亚细胞定位。无论是拟南芥叶肉原生质体的瞬时表达实验还是 洋葱表皮的农杆菌转化实验都表明t h t r x h 定位于细胞质中，这与软件分析的结 果相一致。然后我们订购了t h t r x h 同源基因的拟南芥突变体，并对其进行了表 型检测，为下一步做t h t r x h 的表型互补实验奠定一定的基础。我们的结果显示 突变体萌发率明显低于野生型，但是早期生长较野生型要好，根长的生长率也 好于野生型，而叶片h 2 0 2 的直接定位结果表明与野生型相比，突变体比野生型 积累了更多的h 2 0 2 ，受到的氧化胁迫更为严重，这说明硫氧还蛋白参与种子的 萌发和早期生长，它可能作为一种信号分子参与植物体对氧化胁迫的应答。 中文关键词：氧化胁迫 硫氧还蛋白亚细胞定位原生质体突变体 分类号：q 7 8 a b s t r a g t s u b c e | l u i a r i o c a li z a t l o no ft h 耥a n d p h e n o t y p e a n a l y s i so fa t 厢鼢m u t a n t t h i o r e d o x i n s ，au b i q u i t o u sh e a t - s t a b l e ，a c i d u l o u ss m a l lp r o t e i n sw i t har e d o x a c t i v ed i s u l f i d eb r i d g ei ni t sc o n s e r v e dm o t i f c p ( g ) p c 一，d i s t r i b u t eu n i v e r s a l l yi n e u k a r y o t ea n dp r o k a r y o t ea n dh a v eam o l e c u l a rm a s so fa p p r o x i m a t e l y1 2 k d a t h e y a r eas o r to fr e d o xr e g u l a t i o np r o t e i n s ，w h i c hp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nr e g u l a t i n g v a r i o u sp h y s i o l o g i c a lr e a c t i o n sr e l a t e dt or e d o xs t a t u si nc e l l s b yt h ed i s u l f i d e d i t h i o l i n t e r c h a n g er e a c t i o n ，t h i o r e d o x i n sc a nt r u n s m i te l e c t r o n sa n dp r o t o n s ，t h e r e f o r ec a n t r a n s m i tt h e r e g u l a t o r y r e d o x s i g n a l s t os e l e c t e dt a r g e t s ( e n z y m e s ，p r o t e i n s ， t r a n s c r i p t i o n f a c t o r se t c ) a n de f f e c tm a n yp r o c e s s e s 、 p l a n t sh a v eam o r ec o m p l e xt h i o r e d o x i ns y s t e mt h a nd oa n i m a l sa n dp r o k a r y o t e t h e yd i s t r i b u t ew i d e l yi nc y t o p l a s m ，c h l o r o p l a s ta n dm i t o c h o n d r i a , w h i c hf a c i l i t a t e m e i ri n v o l v e m e n ti nm o d m a t i n gd i v e r s el i f ea c t i v i t i e s t i f f o r e d o x i n si nc h l o r o p l a s ta c t i nt h ee l e c t r o nt r a n s p o r tc h a i ni np h o t o s y n t h e s i sw h i l et h i o r e d o x i n si nc y t o p l a s m m i g h ti n v o l v ei nt h ec e l l u l a rr e d o xr e g u l a t i o n , w h i c hc a nb ed i s t u r b e db yo x i d a t i v e s t r e s s a si sk n o w n ，o x i d a t i v es t r e s si sc a u s e du b i q u i t o u s l yb yv a r i o u ss t r e s s e s i tc a n a l t e rm es t a m er e d o xc e l l u l a re n v i r o n m e n tw h i c hi se s s e r i t i a lf o rn o r m a lp l a n t p h y s i o l o g i c a lm e t a b o l i s m ，d a m a g et h ec e l ld i r e c t l ya n da f f e c tt h en o r m a lm e t a b o l i s m ， a n df i n a l l yl e a dt os e r i o u ss t r e s ss t a t u s ，s o m e t i m e se v e nc a l l s cd e a t h 强e l l u n g i e l l ah a l o p h i l ai sc l o s er e l a t i v et oa r a b i d o p s i sw h i c hi sa l s ob e l o n gt o c m c i f e r a ea n dh a sg o o dg e n e t i cf e a t u r e ss u c ha ss i m i l a rm o r p h o l o g y ，s m a l lg e n o m e s i z e s h o r tl i f ec y c l e ，h i g hs e e dn u m b e ra n da ne f f i c i e n tt r a n s f o r r n a t i o nm e t h o d h o w e v e r ，t h e i l u n g i e l l ah a l o p h i l ai sa b l et ow i t h s t a n dd r a m a t i cs a l i n i t ys h o c ku pt o 5 0 0 r a mn a c l t h i s p l a n t d o e sn o t p r o d u c e s a l t g l a n d s o ro t h e r c o m p l e x m o r p h o l o g i c a la l t e r a t i o n se i t h e rb e f o r eo ra f t e rs a l ta d a p t a t i o n t h e r e f o r e ，t h es t u d yo f f u n c t i o no ft h i o r e d o x i nf r o m t h e l l u n g i e t l ah a l o p h i l a i s q u i t es i g n i f i c a n t f o r e x p a t i a t i n gp l a n tr e s p o n s em e c h a n i s m o fo x i d a t i v e s t r e s s ，u n d e r s t a n d i n gt h e m e t a b o l i s ma l t e r a t i o na n da d j u s t m e n to fp l a n tu n d e rs t r e s s e sa n de x p o u n d i n gt h e s t r e s st o l e r a n c em e t a b o l i s m at h t ryhg e n ew a so b t a i n e df r o me s t s ( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g s ) a c q u i r e d f r o m z a p e d n al i b r a r yo ft h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l at r e a t e dw i t h2 0 0 r e t 0 0 1 l 。1 n a c li n 0 1 1 i l a b e x p r e s s i o ni nv i t r oa n da c t i v i t ye x p e r i m e n tw e r ep e r f o r m e da n dt h er e s u l t p r o v e dt h a tt h t r x hd i dh a v et r x ha c t i v i t y s i n c ef a m i l ym e m b e r so ft r x h e x i s t n o to n l yi nc y t o p l a s mb u ta l s oi ne n d o p l a s m i cr e t i c u l u ma n dm i t o c h o n d f i a ，a n d d i f f e r e n tl o c a l i z a t i o n sa f f e c tt h e i r p o t e n t i a l f u n c t i o n s w ef i r s ti d e n t i f l e dt 1 1 e s u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o no ft h t r ) ( hi no r d e rt ou n d e r s t a n di t sb i o l o g i c a lf i m c t i o n b y i j i c o n s t r u c t i n gt h eg f pt r a n s i e n te x p r e s s i o nv e c t o ro ft h t r x ha n dt r a n s f o r m i n gi ti n t o t h ea r a b i d o p s i sm e s o p h y l lp r o t o p l a s t s ，t h t r x hw a si n i t i a l l yl o c a l i z e di nc y t o p l a s m b yl a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p e t of n r t l l e rv e r i f yt h er e s u l t ，ag f pp l a n t b i n a r ye x p r e s s i o nv e c t o ro ft h 刀矗w a sc o n s t r u c t e da tt h es a m et i m e t 址sv e c t o r w a st r a n s f o r m e di n t ot h eo n i o ne p i d e r m a lc e l l sb ya g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dt r a n s i e n t t r a n s f o r m a t i o i - ia n dt h es c a n n i n gr e s u l to ft r a n s f o r m e dc e l l ss h o w e dt h a tt 1 l t r x hd i d l o c a l i z ei nt h ec y t o p l a s m b o 也t h es u b c e l l u l a r1 0 c a l i z a t i o nr e s u l t sw e r ei na c c o r d a n c e 、析t ht h er e s u l to fi p s o r ts o f t w a r e a t t r lm u t a n tw e r eo r d e r e df r o n lt h es a l k l i b r a r ya n dt h ep h e n o t y p eo ft h em u t a n tw a sa n a l y z e dt os e tt h ef o u n d a t i o nf o rt h e f o l l o w i n gw o r ko fm u t a n tp h e n o t y p ec o m p l e m e n t a t i o nb yt r a n s f o r m i n gr h t r , v hi n t o t h em u t a n t o u rr e s u l t ss h o w e dt h a tt h eg e r m i n a t i o nr a t eo fm u t a n tw a sm u c hl o w e r t h a nt h a to ft h ew i l dt y p e ，b u tt h es e e d l i n gg r o w t ho fm u t a n ta n dt h er o o tg r o w t hr a t e w e r eb o t hb e t t e r f r o mt h ed i r e c t1 0 c a l i z a t i o no fh 2 0 2i nl e a v e ，i tc a nb es e e nt h a tt h e r h u t a n tp l a n tl e a v e sa c c u m u l a t em u c hm o r eh 2 0 2 c o m p a r e dw i t ht h a to ft h ew i l dt y p e p l a n t ，w h i c hr e v e a l st h a tt h em u t a n ts u f f e r sm o r es e v e r eo x i d a t i v es t r e s s t h e s er e s u l t s d e m o n s t r a t e dt h a tt h i o r e d o x i nhi n v o l v e di ns e e dg e r m i n a t i o na n ds e e d l i n gg r o w t h i t m i g h ta c ta sal d n do f m a s s a g e ri n p l a n to x i d a t i v es t r e s sr e s p o n s e k e yw o r d s ：o x i d a t i v es t r e s s t h i o r e d o x i ns u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n p r o t o p l a s t m u t a n t c a t e g o r y ：q 7 8 v 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名j 导师签字： 厶 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂蕉有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权堂撞可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 学位论文储锑：备畿玄 签字日期：z 拍g ，年月7 日 导师签字： ；彳衫 蠢 签字日期：劲5 年f 月7 日 静 山东师范大学硕士学位论文 第一部分文献综述 植物在其生活史中不可避免地要受到各种环境胁迫因子的影响，包括干旱“1 、低温 或高温o 。3 、臭氧“1 和紫外照射嘲、离子辐射、重金属胁迫、病毒侵染等，这些胁迫因 子可以通过多种方式影响植物的生长、发育和胁迫的延续或加重还常常会伴随活性氧 ( r e a c t i r eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 的产生加剧“”和次生性氧化胁迫的发生，使细胞的 氧化还原内环境发生改变，并且会诱发包括硫氧还蛋白的表达增加在内的一系列应答 氧化胁迫的应急反应，即胁迫一一初级伤害和应答一一次级伤害( 活性氧产生加剧引起 氧化胁迫和细胞氧化还原内环境的变化) 一一次级伤害应答( 对氧化胁迫的应答) 这样一 个应急反应链。细胞产生的适量的r o s 可以作为胞内的信号体系或从细胞表面受体开 始的信号传导途径的调控因子。当细胞内产生过量的r o s 超过还原缓冲体系的缓冲能 力时则产生氧化胁迫，氧化胁迫是普遍发生在植物对各种生物和非生物胁迫因子进行胁 迫应答过程中的生理现象”。，它会改变植物正常生理代谢所依赖的植物体内稳定的氧 化还原内环境，导致对细胞的直接损伤”1 ，如脂的过氧化、蛋白质氧化、d n a 损伤等， 使受胁迫的植物体内的许多代谢过程受到影响、干扰和破坏，从而导致许多生物或非 生物的严重胁迫状态”。，严重时引起生物生长抑制、代谢失调等病理过程或细胞死 亡。 、 1 、细胞功能的氧化还原调节 当多种胁迫因子引起氧化胁迫时，细胞的结构( 包括膜脂、膜蛋白结构，细胞器结 构，蛋白质分子、酶分子和脂分子等) 和功能( 包括代谢反应，生长、繁殖等) 都受到广 泛的影响，使细胞稳定的氧化还原内环境受到破坏并产生氧化性伤害，从而影响细胞 的代谢、生存和繁衍。生物体可通过多种调节途径和调节方式对生物体( 细胞) 的氧化 还原状态进行调节，以避免氧化性伤害的产生，其中主要的调节方式包括：活性氧的 酶促和非酶促清除：与谷胱甘肽相关的氧化还原调节；以及与硫氧还蛋白相关的氧化 还原调节。酶促反应系统主要包括超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、抗坏血 酸过氧化物酶( a p x ) 、谷光甘肽转移酶( g s t ) 、谷光甘肽过氧化物酶( g p o x ) 、硫氧还蛋 白( t r x ) 、等，非酶促反应系统包括抗坏血酸( v c ) 、谷胱甘肽、多元醇、n 一生育酚 ( v e ) 、类胡萝h 素和黄酮等抗氧化物。1 。谷胱甘肽还原体系构成了细胞内特别是真核细 胞内重要的氧化还原调控系统，它通过谷胱甘肽中的巯基提供还原力可还原细胞内的 许多物质。对t r x 系统的了解近年来也不断深入，两系统非常相似但也有许多区别和 功能上的不同。两系统通过相互协调并通过与活性氧清除酶系协调作用可完成活性氧 的清除“3 ：外源t r x 能够使细胞增加对半胱氨酸的摄入和上调胞内谷胱甘肽的水平 。“，由于半胱氨酸是谷胱甘肽合成所必需的，因此t r x 的细胞效应部分取决于胞内的谷 胱甘肽。另外一种可能就是：外源t r x 与细胞膜耦联的相关分子如t r x 还原酶( p r x q ) 和t r x 过氧化物酶协同作用。膜上的谷胱甘肽过氧化物酶可能是一个重要的抗氧化 剂，但是，膜上谷胱甘肽水平非常低，这也就是说膜上谷胱甘肽过氧化物酶的作用依 赖于其他的电子供体。最近，有研究结果表明，t r x 和谷氨酸氧化还原酶可能就是膜上 谷胱甘肽过氧化物酶的电子供体“，因此，膜上t r x 有可能与膜上的谷胱甘肽过氧化 物酶共同起到抗氧化作用。在众多的氧化还原调节途径及氧化还原调节方式中嘌呤核 山东师范大学硕士学位论文 苷酸( n a d ( p ) h n a d ( p ) + ) 和含巯基_ - 硫键的化合物特别引人关注，因为它们与多条代 谢网络、信号传导网络中的许多功能性蛋白包括众多酶类、膜转运蛋白、转录因子等 相连接并对其结构和功能具有氧化还原调节作用；硫氧还蛋白是一种含有巯基二硫键 的小分子蛋白，它广泛参与上述的诸多调节过程。 2 、硫氧还蛋白的结构与功能 2 1 硫氧还蛋白的组成结构 硫氧还蛋白( t h i o r e d o x i t r x ) 是广泛存于原核生物和真核生物( 包括动物、植 物、细菌和古细菌等) 并参与生物体的氧化还原调节的小分子蛋白质，最初由l a u r e n t e ta 1 ( 1 9 6 4 ) “? 从细菌中发现并描述为小的氧化还原蛋白，它作为核糖核苷还原酶有效 的供氢体。所有生物的t r x 。都具有b l ，a1 ，b 2 ，a2 ，b 3 ，d3 ，b 4 ，6 5 ，n4 这样一 个连续的共同二级结构。其分子量约1 2k d a ，具有保守的w c g p p c 基序，其中含有两 个相互邻近的活性半胱氨酸残基，可通过硫醇一二硫化物的相互转变参与生物体的氧化 还原调节。还原状态的t r x 是非常有效的二硫化物还原酶“，通过对靶蛋白进行翻译后 调节实现对蛋白质的功能和信号传导的氧化还原调节“1 “，从而参与多种细胞过程“”。 2 1 1 硫氧还蛋白的种类及分布 在不同的生物种类、同种生物不同类型的细胞以及同一类细胞的不同位置，t r x 的 类型存在着不同。在生物中已发现的t r x 共有三类：即f 型硫氧还蛋自( t r x ，) 、旷型 硫氧还蛋白( t r x ) 和h 一型硫氧还蛋白( t r x 。) 。细菌中的t r x 同植物中的m _ 型的t r x ( t r x 。) 类似，动物中的t r x 同植物中的h 一型t r x ( t r x n ) 类似o “1 ，而f - 型t r x 是植物 中所特有的，存在于叶绿体中。 植物拥有复杂的硫氧还蛋白系统而不同于其它生物体。拟南芥基因组有8 个h 一 型、4 个i l l 一型、两个f 一型、一个x 一型硫氧还蛋白，分别定位在细胞质、叶绿体或线粒 体中。还有一些与硫氧还蛋白紧密相关的蛋白质o “。 细胞质硫氧还蛋白t r x 。主要存在于植物细胞质中，也存在于内质网、线粒体中， t r x 。可能与细胞膜结合，韧皮部汁液中也发现它的存在。”。硫氧还蛋白h 的还原依赖予 n a d p h ，由n a d p h - 硫氧还蛋白还原酶( n t r ) 催化，三者组成n t r t r x 氧化还原系统( n t s ) 。 硫氧还蛋白h 由多基因家族编码，目前发现拟南芥基因组中有8 个成员0 3 。“1 一级结构序 列分析表明它们的进化起源非常接近，。它们在特异细胞中表达且表达水平不同，表明 它们有特异的功能u 。 叶绿体硫氧还蛋白( c p t r x ) 最初被鉴定为光依赖的光合作用关键酶的调节蛋白，主 要有两种类型：卜型和m 一型。两者系统起源、一级结构、专一性作用的蛋白各不相 同。除了红藻m 一型硫氧还蛋白是叶绿体基因组编码的，这两类蛋白都由核基因组编 码。所有光合真核生物都有这两类硫氧还蛋白；但是光合原核生物缺乏f - 型硫氧还蛋 白o 。拟南芥基因组测序的完成，揭示了叶绿体还存在另外两种硫氧还蛋自：x 一型和 y 型0 7 删。x 一型硫氧还蛋白可能是原核起源，蓝细菌有其同源基因。拟南芥有四个m - 型、两个f r 型，而x 一型硫氧还蛋白只有一个。 t r xf 是果糖- 1 ，6 - - - 磷酸酶( f b p a s e ) 特异的激活蛋白，具有真核起源”5 。t r x ，一 级结构表现出广泛的序列同源性，双子叶植物中其氨基酸具有7 5 一9 0 的同源性，而 山东师范大学硕士学位论文 单子叶植物和双子叶植物间同源性为6 0 一6 7 。由于它具有段附加的n - 端肽链序列 使它的长度比其它类型的t r x 要长，但c 一端序列部分同典型的动物硫氧还蛋白有高度 的相似性，这表现在它们都含有严格保守的第三位的半胱氨酸( c y s ) 残基( 在菠菜中是 c y s 7 3 ) 。尽管t r x ，的整体结构同别的类型的t r x 无明显区别，但其拓扑构象同其它的 t r x 却存在明显区别。“：绕在其活性位点处的正电荷可能有助于t r x ，同它的靶蛋白的正 确定向作用，其亲水性残基对于t r x ，同具有多种类型的硫氧还蛋白还原还原能力的f t r 的相互作用可能更重要，最显著的不同还是暴露于表面的第三位c y s 的存在( 菠菜中是 c y s 7 3 ) 。它距离t r x 活性序列二硫键中易受影响的c y s ( c y s 4 6 ) 有9 7a 的距离。结构 分析表明最靠近n 一端的活性位点的c y s ( 菠菜中是c y s 4 6 ) 是暴露在表面的，而与它构成 二硫键的c y s 残基( 菠菜中是c y 4 9 ) 是埋在内部。这同许多实验证实的c y s 4 6 是能还原 靶蛋白二硫键的具有攻击作用的亲核物这一结果相吻合。 t r xm 是c 4 和c 3 植物叶绿体中n a d p 一苹果酸脱氢酶的激活蛋白。它存在于蓝细菌 及蓝藻、单子叶植物、双子叶植物的叶绿体中。与不产氧的原核生物的t r x 非常相 似，因此这种m 一型t r x 被认为是细菌型。由于它们结构相关、功能相似，细菌硫氧还 蛋白和旷型t r x 可以互换使用。但是各种m 一型t r x 其一级结构序列相似性要比f 一型 t r x 低得多。t r x 。广泛存在于进行产氧光合作用的原核生物、藻类、单子叶植物、双子 叶植物中，它同异养原核生物和不产氧原核生物中的硫氧还蛋白类似。植物和绿藻中 t r 蕊是核基因编码的，而红藻叶绿体基因组中有编码t r x 。的基因o ”。t r x 。同t r x ，的序 列的相似性较低。现已获得了绿藻、菠菜和豌豆的重组t r 瓦。“，通过对绿藻的t r x 。核 磁共振分析表明它同ec o l i 中的t r x 的二级结构和主要的折叠相似，在菠菜中已得到 2 露和2 3a 的氧化型和还原型重组t r k 的晶体结构。菠菜中的t r k 衣藻 & 益a m y d o m o n a sr e i n h a r d t i i 中获得的t r ) ( m 一样，都具有与ec o l i 中的t r x 类似的结 构，并且其二级结构极其相似，正是由于结构上的相似，因此它们的硫氧还蛋白能 互相替换完成相同的功能。m 一型硫氧还蛋白氧化态和还原态的活性位点的构型区别也 很小，但在其活性位点主链构型上的一些细小的变化使得还原态的t r k 分子中的半胱 氨酸残基( c y s 3 7 ) 更容易同溶剂接触。 t r xx 只在拟南芥中出现，且仅有一个。这种新的x 一型t r x 是叶绿体过氧还蛋白 ( p e r o x i r e d o x i n ，p r x q ) 有效的底物，它并不作用于其它两个目标蛋白：果糖一1 ，6 一二 磷酸酶和n a d p 一苹果酸脱氢酶。这表明x 一型t r x 与氧化胁迫抗性有关。 近来，植物线粒体硫氧还蛋白系统也由l a l o ie ta 1 ( 2 0 0 1 ) ”鉴定出来，该系统包 括。_ 型硫氧还蛋白和n a d p h 一硫氧还蛋白还原酶。植物线粒体中的t r x 的作用可能是激活 或稳定在这些细胞器中2 一氧代酸脱氢酶复合体o ”或者是对植物电子传递链中抗氰化物交 替氧化酶( a l t e r n a t i v eo x i d a s e ) 进行氧化还原调节“。 2 1 2 硫氧还蛋白系统的组成及结构 不同类型的t r x 具有不同的电子供体，这与t r x 在细胞中的分布部位不同密切相 关。根据电子供体的不同可将硫氧还蛋白分为两类：依赖于n a d p h 的硫氧还蛋白系统 和依赖于铁氧还蛋白的硫氧还蛋白系统。 山东师范大学硕士学位论文 ( 1 ) 依赖于n a d p h 的硫氧还蛋白系统：在非光合组织和植物光合组织的细胞质中， t r x 电子供体是n a d p h 。依赖于n a d p h 的硫氧还蛋白系统存在于细菌、动物细胞和植物 的细胞质中，也存在于动植物细胞的线粒体中，是由t r x 、依赖于n a d p h 的硫氧还蛋 白还原酶( n t r ) 和电子供体( n a d p h ) 组成。 依赖于n a d p h 的硫氧还蛋白还原酶( n t r ) ，是一种黄素蛋白，它的基本结构同 ec o l i 中的n t r 具有高度的同源性，该酶是由3 5 k d a 亚单位构成的二聚体，每个亚单 位拥有两个亚区域：一个是中央的n a d p h 结合域，另一个是由n 一和c 一端组成的f a d 结 合域，每个亚单位都含有能组成氧化还原活性二硫键的c a t c 序列。同叵c o l i 中的 n t r 类似，n t r 的活性位点朝向黄素的异咯嗪环这使得氧化还原实体能密切接触，利于 电子从黄素腺嘌呤二核苷酸转到二硫键。通过比较ec o l i 中的n t r 和拟南芥中的n t r 的晶体结构可以看出：为容纳t r x 分子，n t r 必须经过结构变化，这可能发生在位于 f a d 和n a d p h 亚区域的连接处的关键部位。植物的n t r 同原核类型的n t r 的关系要近于 同哺乳动物的n t r ，哺乳动物的n t r 具有一段n - 端延伸序列和硒半胱胺酸。 t s t a d t m a n 和他的同事发现：人的硫氧还蛋白还原酶中含有硒半胱氨酸残基，是属于 含硒酶类0 7 “，在人的肺癌细胞、t 细胞以及h e l a 细胞中均分离出了含硒的n t r 。象 许多别的黄素蛋白一样，拟南芥中的n t r 也具有硫辛酸脱氢酶活性并能还原醌和硝基 化合物。 ( 2 ) 依赖于铁氧还蛋白的硫氧还蛋白系统：在植物的叶绿体、真核藻类以及进行产 氧光合作用的原核生物中，t r x 的电子供体是还原型铁氧还蛋白( 还原型f d ) 。依赖于 铁氧还蛋白的硫氧还蛋白系统只存在于叶绿体、蓝藻中，由t r x 、依赖于铁氧还蛋白的 硫氧还蛋白还原酶( f t r ) 和电子供体：还原态的铁氧还蛋白组成。在依赖于铁氧还蛋的 硫氧还蛋白系统中，硫氧还蛋白的还原是间接通过光途径还原：由光驱动的光合电子 传递中产生还原态的铁氧还蛋白为f t r 提供电子，再由f t r 还原t r x 。 依赖于铁氧还蛋白的硫氧还蛋白还原酶( f t r ) ，是铁氧还蛋白硫氧还蛋白系统的核 心酶，它能将还原态的铁氧还蛋白接受的光合成电子信号转换成巯基信号并传给硫氧 还蛋白，该酶同细胞质中的n t r 不同，它是由两个不同的亚单位组成，两个亚单位分 别起催化和变构作用，催化亚单位在不同的光合生物中大小恒定为1 3k d a ；可变亚单 位的分子量可在8 1 3k d a 之问变化o 。在植物中两个f t r 亚单位都是核编码的，在紫 菜( p o r p h y r ap u r p u r e a ，一种红藻) o ”和一种隐藻g u i l l a r d i at h e t a 中发现，催化亚 单位由叶绿体基因组编码。通过微孢藻( s y n e c h o c y s t f ss p ) 的重组f t r 已得到了f t r 的结晶和晶体结构h 0 1 ，晶体结构表明f i r 的铁氧还蛋白附着位点含有4 个带正电荷的 残基可同带负电荷的铁氧还蛋白特异性互作，而硫氧还蛋白附着位点含有主要的亲水 性残基，使得该位点能与不同的硫氧还蛋白相兼容。 铁氧还蛋白( f d ) 是基质可溶性的电子载体，从光系统i 获得电子。植物型的铁氧还 蛋白是可溶性的酸性蛋白，分子量1 2k d ，其2 f e 一2 s 铁硫中心氧化还原电位大约为 - 4 0 0 m y ，能携带一个电子。其三维结构信息己从几种铁氧还蛋白中得到，表现出很大的 相似性，它们有相同的折叠方式在菠菜中，f d 和f t r 构成1 ：1 的高度亲和体“，在菠 菜和绿藻的f d 中已确定了参与复合体形成的负电荷残基的位点，铁硫中心的任何一面都 4 山东师范大学硕士学位论文 暴露出两片负的表面电荷，这是与其它蛋白相互作用所必需的，这种负的表面电荷赋予 与电子受体蛋白相互作用的专一性。这就是铁氧还蛋白与来自不同有机体的f t r 亲和力 明显不同的原因所在。 所有生物的t r x 都具有f 3 1 ，a1 ，b 2 ，2 ，b 3 ，a3 ，8 4 ，b 5 ，a4 这样一个连续 的共同二级结构。菠菜叶绿体t r xf 和t r xm 以及c h j a r n y d o m o n a st r xm 的三维结构 已经测定，它们具有与原核生物、动物相同的典型空间结构，即中间有5 个9 一折叠 片，四周环绕着4 个n 一螺旋。旷型t r x 结构上与大肠杆菌硫氧还蛋白相似，并且围绕 活性部位半胱氨酸的表面也很相似，这些生化证据表明硫氧还蛋白功能上是可以互换 的。t r xf 的整体结构与典型的t r x 没有显著的差别，但其表面拓扑结构跟其它硫氧还 蛋白明显不同。t r xf 带更多的正电荷，一些正电荷处于活性部位周围或许保证t r xf 与目标蛋白的正确定向，而疏水残基也明显分布在接触面上，这可能对与f t r ( 铁氧还 蛋白硫氧还蛋白还原酶) 的低特异性相互作用更为重要，以保证f r r 对t r xf 和t r x m 两种硫氧还蛋白都能高效还原。一个显著的差异就是暴露在表面靠近活性中心的第三 位保守的半胱氨酸( 菠菜是c y s 7 3 ) 。结构分析表明低序号的半胱氨酸残基( 菠菜是 c y s 4 6 ) 处于水可及的表面，而与其形成二硫键的另一个半胱氨酸残基c y s 4 9 埋藏在内 部，这些生化证据证实c y s 4 6 与目标蛋白形成异源二硫键。同原核生物1 7 c o i l 中的原 始型t r x 相比较，植物中的t r x 。因为具有一段n 一或和 c 一端摭展序列而长于原核生物的t r x 。植物中的t r x 。同哺乳动物中的硫氧还蛋白的亲 缘关系要近于同6 0 l i 中的t r x 的亲缘关系，这一结果与一级结构分析相一致。 2 2 硫氧还蛋白的功能 硫氧还蛋白通过其分子结构中活性半胱氨酸残基的一s h 与细胞中活性因子( 包括 n a d ( p ) h n a d ( p ) + 和一些含巯基的的活性因子) 构成功能上密切相关的代谢调节和信号传 导网络，对细胞的氧化还原状态、细胞的氧化还原内环境、众多的细胞代谢途径和信 号传导通路进行调节。现已发现硫氧还蛋白与十几种不同的生化代谢途径系统相联 系，是参与细胞应答多种胁迫的重要调节因子。在不同类型的生物中，t r x 的生理功能 涉及：细胞内和细胞间信号传导、转录因子活性、叶绿体光合酶类和许多其它酶类活 性“2 “、多种生物和非生物胁迫应答和调控、细胞凋亡“和细胞生长、t 7 噬菌体d n a 复制、丝状噬菌体f c o l i 噬菌体的组装“3 等多个方面，其功能涉及从一般基础 反应到一些高度特化的功能。 下面分三个方面来阐述硫氧还蛋白的生物学功能。 2 2 1 硫氧还蛋白对细胞的氧化还原调控作用 硫氧还蛋白通过硫醇一二硫键的转换对细胞进行氧化还原调节是硫氧还蛋白最主要 的细胞功能“6 。一方面，t r x 中一s h 一s s 一的氧化还原变换可影响许多酶的活性，还 可通过影响一些含有关键一s h - s - s - 基团的蛋白质的巯基和二硫键的氧化还原状态，对 这些蛋白质实现后转录调节“；另一方面，n a d ( p ) h n a d ( p ) + 和一s h 一s s 一的比例同细胞 的r o s 的水平密切相关：还原态的吡啶核苷酸和巯基都参与r o s 的形成和降解。r o s 的 山东师范大学硕士学位论文 形成受多种n a d p h 氧化酶影响“”和巯基氧化的影响。1 ，而r o s 的降解则可通过依赖于 g s h 的过氧化物酶和依赖于巯基的过氧化物酶利用n a d p h 和巯基完成。“。 2 2 1 1 硫氧还蛋白氧化还原调控机理 硫氧还蛋白对细胞的氧化还原调节是与硫氧还蛋白中氧化还原活性中心序列中的 半胱氢酸残基的氧化还原转换密切相关。t r x 活性序列中的半胱氨酸残基可通过一s h 至u - s - s - 状态的可逆转换完成电子传递和氧化还原转换：还原态硫氧还蛋白( t r x 一( s h ) ；) 可将电子( 氢) 传递给被作用的底物转化成氧化态硫氧还蛋白( t r z - s ：) ；氧化态的硫氧 还蛋白( t r x - s 。) 又可在硫氧还蛋白还原酶的作用下以n a d p h 或还原态的铁氧还蛋白作为 氢电子供体被重新还原成还原态的硫氧还蛋白( t r x 一( s h ) 。) ，其活性基序中的c y s 残 基闽的二硫键被还原戍- s h 。通过这种转换，硫氧还蛋白氧化还原调节系统可实现t r x 同其调节的底物之间的- 电子传递，最终的结果是电子经过n a d p h 还原态的铁氧还蛋 白、硫氧还蛋白传给底物，实现硫氧还蛋白的氧化还原调节作用。硫氧还蛋白对目标 酶的还原也是通过对酶分子中的二硫键的调节进行的，其还原方式类似于t r x 的还 原：通过在两个反应物之间形成暂时性的异二硫键( h e t e r o d i s u l f i d e ) 复合体，靠近 t r xn 一末端的活性c y s 残基( 溶液可触及) 通过亲核性攻击并断开被作用的二硫键，形 成共价连接的混合二硫键，随后，第二个巯基( 溶液不可触及的) 攻击混合二硫键形成 了氧化态的t r x 和还原态的靶酶。蛋白质中的半胱胺酸残基的可逆性的还原在许多蛋 白质中被认为起着氧化还原感受器的作用“。：上述过程可被概括为下图： 2 2 1 2 硫氧还蛋白对蛋白质酶类的氧化还原调节作用 t r x 中s h $ 一s 的氧化还原变换可通过对蛋白质酶的影响进而对多种受氧化还原影 响的细胞功能进行调节：包括对转录因子的活性调节、对各种胁迫( 如病毒与细菌或真 菌侵染、u v 、离子辐射、渗透、低温干旱等) 的应答、对细胞内氧化物的清除、对细胞 信号传导的调节等，最终会影响细胞的氧化还原内环境、影响细胞的生存、生长、信 号传导等多种生理机能。 t r x 对蛋白质中的二硫键进行氧化还原调节，可引起蛋白分子的构型改变，并