（发育生物学专业论文）新生儿脑膜炎大肠杆菌毒力岛基因gima的功能研究.pdf

嬲炽必 目录 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要”8 二、英文缩略语15 三、论文 论文一、大肠杆菌k 1 毒力岛基因c g l d 在实验性新生儿脑膜炎中的作用 荀f 言1 。6日u 舌“o 材料与方法17 实验结果( 附论文图表) 2 3 结j 沦”3 2 本研究创新性的自我评价3 3 参考文献3 4 论文二、毒力岛基因i b e t 有助于大肠杆菌抵抗人脑微血管内皮细胞溶酶体的降解 请 言”3 7日u 舀”3 ， 材料与方法3 8 实验结果( 附论文图表) 4 2 讨论”4 9 结论”5 1 本研究创新性的自我评价5 2 参考文献5 3 四、附录 综述“5 5 在学期问科研成绩7 0 致谢71 个人简介7 2 中文论著摘要 新生儿脑膜炎大肠杆菌毒力岛 基因g im a 的功能研究 目的 新生儿细菌性脑膜炎是儿科严重感染性疾病之一，临床上尽管可以选用相应 的抗生素治疗，但是病死率仍然得不到显著的改善。幸存者常伴有失听、失明、 癫痫、智力和运动障碍后遗症。因此，探讨有效的新生儿细菌性脑膜炎的防治策 略具有重要意义。 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ，ec o l d 是导致新生儿脑膜炎最常见的革兰氏阴 性致病菌。从脑膜炎患儿脑脊液中分离的大肠杆菌中，8 0 以上均带有k 1 荚膜。 现已清楚，e c o l ik 1 通过血行播散入脑而引起脑膜炎。但是，血液中的ec o l ik 1 如何穿过主要由脑微血管内皮细胞( b r a i nm i c r o v a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l s ，b m e c s ) 组成的血脑屏障( b l o o db r a i nb a r r i e r ，b b b ) ，迄今尚不清楚。借助于体外分离培 养的人脑微血管内皮细胞( h u m a nb r a i nm i c r o v a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l s ，h b m e c s ) 单层血脑屏障模型，学者们先后鉴定了ec o l ik 1 中的参与侵袭h b m e c s 相 关基因，如疗，z 日，o m p a ，i b e a ，i b e b ，c n f l 等，并对参与ec o l ik 1 侵袭相关的 细胞内信号转导通路如p 1 3 k 、p k b 、p k c 、r h o g t p a s e 以及f a k 等细胞骨架组 装调控信号分子等进行了探讨。但已鉴定的这些ec o l ik 1 穿过b b b 的“决定因 子”，特别是每个ec o l ik 1 侵袭基因介导细菌侵袭h b m e c s 的功能差异、联系、 及详细机制尚有待进一步研究。 我们在先前的研究中，从致新生儿脑膜炎e c o l ik 1 株r s 2 1 8 ( 0 1 8 ：k 1 ：h 7 ) 中 克隆鉴定了一个e c o bk 1 毒力岛基因g i m a ( g e n e t i ci s l a n do fm e n i n g i t i ce c o l i c o n t a i n i n gi b e a ) ( 图1 ) 。g i m a 全长2 0 3 k b ，仅存在于e c o l ik 1 ，其他非脑膜炎 大肠杆菌中如e c o l ik 1 2 均不含g i m a 序列。g i r n a 含有四个操纵子，编码1 5 个 基因：( 1 ) p t n l p k c ( g i m a l ) ，包括p t n i 、p t n p ，p t n k 、p t n c ：( 2 ) c g l d t e c ( g i m a 2 ) , 包括c g l d ，c g l t ，c g l e 、c g l c ：( 3 ) g c x k r c ( c a m a 3 ) ，包括g c x k 、g c x r ，g c x c 、 g c x l ；( 4 ) i b e r a t ( g - i m a 4 ) ，包括f 抛r ，i b e a ，i b e 凡其中，i b e a 基因的功能已 得到初步研究，它在e c o l ik 1 侵袭h b m e c s 中起作用；其余1 4 个基因的功能尚 不清楚。g i m a 中推断的各基因编码蛋白与目前g e n e b a n k 库中功能已知蛋白之间 的同源性高低程度分析结果提示：g i m a l 中p m i 与磷酸烯醇型丙酮酸磷酸化转移 酶有很高的同源性；g h n a 2 中c g l d 与甘油脱氢酶的同源性为6 2 ；c f m a 3 中g c x c 与乙醛酸醛连接酶的同源性高达6 7 ；g i m a 4 中含有e c o l ik 1 侵袭h b m e c s 有 关的b e a ，而其中的两个基因i b e t 和i b e r 尚未发现与其他蛋白有较高的同源性， 鉴于这两个基因与i b e a 同处于一个操纵子，故提示可能参与e c o l ik 1 侵袭 h b m e c s 。探讨这些基因在e c o l ik l 致脑膜炎中的作用，可以使我们更好的了解 大肠杆菌性脑膜炎的发病机制。因此，我们选取了g i m a 2 中的c g l d 基因和g i m a 4 中的i b e t 基因作为研究对象，展开了本工作。 图1 ，e c o l ik 1g i m a 毒力岛基因定位和组成图谱 方法 一、大肠杆菌毒力岛基因c g l d 的功能研究 ( 一) 细菌培养 2 大肠杆菌以l b 培养基培养，在行细胞侵袭试验前，用含有利福平的b h i 培 养基培养e 4 4 。 ( 二) 细胞培养 h b m e c s 于含有1 0 f b s 、1 0 n u 血清的r p m i 1 6 4 0 培养液中，于3 7 、 5 c 0 2 、1 0 0 湿度的条件下培养。 ( 三) e 4 4 ：a c g l d 基因缺失突变株的构建 将携带打靶基因两侧d n a 片段的自杀性质粒p c v d 4 4 2 通过细菌间的接合传 递到e 4 4 中，利用菌体内同源交换，从e 4 4 中剔除c g l d 基因。 ( 四) 互补实验 将c g l d 基因的o r f 克隆到质粒p f n 4 7 6 上，将其与p g p l 2 共同转化给 e 4 4 ：c g l d 。 ( 五) 细菌黏附和侵袭试验 1 、细菌黏附试验 向h b m e c s 单层加入l x l 0 7 个过夜培养的大肠杆菌，作用1 5 h 后，收集细胞 内外的细菌，结果用相对黏附力表示； 2 、细菌侵袭试验 向h b m e c s 单层加入l x l 0 7 个过夜培养的大肠杆菌，作用1 5 h 后，杀死细胞 外的细菌，收集细胞内的细菌，结果用相对侵袭力表示。 ( 六) 半数致死量和生存分析 b l i s s 法计算大肠杆菌对新生鼠的半数致死量；k a p l a n m e i e r 方法绘制生存曲 线。 ( 七) 新生大鼠实验性细菌性脑膜炎模型的建立 皮下注射一定浓度的细菌，建立新生大鼠菌血症模型，脑膜炎模型由血行播 散而致。 ( 八) 脑脊液白细胞计数及蛋白和乳酸含量的测定 3 血细胞计数板计数脑脊液白细胞，b c a 蛋白定量法测定脑脊液蛋白含量，乳 酸脱氢酶比色法测定脑脊液乳酸含量。 ( 九) 组织病理学分析 新生大鼠脑切片经h e 染色后，显微镜观察脑膜以及大脑皮层区中性粒细胞 的浸润。 ( 十) 人多形核白细胞( p m n s ) 跨内皮迁移实验 从人新鲜的外周血中分离p m n s ，计数经大肠杆菌趋化后穿过h b m e c s 单层 的p m n s 。 ( 十一) 重组蛋白的表达和纯化 利用b l 2 1 ( d e 3 ) 表达含有c g l d 基因的重组质粒，用亲和层析法纯化融合 蛋白。 ( 十二) 甘油脱氢酶活性分析 比色法测定菌体裂解液和纯化蛋白的甘油脱氢酶活性。 二、大肠杆菌毒力岛基因i b e t 的功能研究 ( 一) 细菌培养 大肠杆菌以l b 培养基培养，在行细胞侵袭试验前，用含有利福平的b h i 培 养基培养e 4 4 。 ( 二) 细胞培养 h b m e c s 于含有1 0 f b s 、1 0 n u 血清的r p m i 1 6 4 0 培养液中，于3 7 。c 、 5 c 0 2 、1 0 0 湿度的条件下培养。 ( 三) e 4 4 ：a i b e t 基因缺失突变株的构建 将携带打靶基因两侧d n a 片段的自杀性质粒p c v d 4 4 2 通过细菌间的接合传 递到e 4 4 中，利用菌体内同源交换，从e 4 4 中剔除i b e t 基因。 ( 四) 互补实验 将i b e t 基因的o r f 克隆到质粒p f n 4 7 6 上，将其与p g p l 2 共同转化给e 4 4 ： 4 i b e t 。 ( 五) 细菌黏附和侵袭试验 1 、细菌黏附试验 向h b m e c s 单层加入l x l 0 7 个过夜培养的大肠杆菌，作用1 5 h 后，收集细胞 内外的细菌，结果用相对黏附力表示； 2 、细菌侵袭试验 向h b m e c s 单层加入l x l 0 7 个过夜培养的大肠杆菌，作用1 5 h 后，杀死细胞 外的细菌，收集细胞内的细菌，结果用相对侵袭力表示。 ( 六) 细菌在细胞内存活试验 向h b m e c s 单层加入l x l 0 7 个过夜培养的大肠杆菌，作用1 5 h 后，杀死细胞 外的细菌，在继续培养指定时间收集细胞内的细菌，结果用菌落数表示。 ( 七) 细菌生长曲线测定 将细菌接种于一定体积的培养基中培养，测定大肠杆菌在不同时问点波长为 6 0 0n i l 3 时的吸光度值，绘制生长曲线。 ( j k ) 免疫荧光实验 激光共聚焦扫描显微镜进行观察。 ( 九) 透射电镜观察 利用超薄切片机将包埋块切成7 0 , - - 8 0a m 的超薄切片，经染色后，利用透射电 子显微镜观察。 ( 十) 细菌缓冲容量测定 通过测定细菌胞内和胞外总的缓冲容量和细菌胞外缓冲容量，计算得到细菌 胞内缓冲容量。 结果 一、大肠杆菌毒力岛基因c g l d 在实验性新生儿脑膜炎中的作用 5 1 、e c o l ik 1 等位基因c g l d 缺失突变株的构建 2 、c g l d 基因缺失延长脑膜炎模型鼠的存活时间，但并不影响e c o l i k 1 穿过血脑屏障 3 、c g l d 基因的缺失减轻了脑膜炎模型鼠脑脊液的改变 4 、c g l d 基因的缺失减轻了脑膜炎模型鼠脑膜和脑皮质区中性粒 细胞的浸润 5 、c g l d 蛋白具有甘油脱氢酶的活性 二、毒力岛基因i b e t 有助于大肠杆菌抵抗人脑微血管内皮细胞 溶酶体的降解 1 、e c o l ik 1 等位基因i b e t 缺失突变株的构建 2 、e c o l ik 1i b e t 基因缺失影响e c o l ik 1 侵袭h b m e c s 3 、i b e t 基因缺失抑制了e c o l ik 1 在h b m e c s 中的生长 4 、i b e t 基因缺失导致e c o l ik 1 逃逸h b m e c s 溶酶体的能力发生 缺陷 5 、i b e t 基因有利于e c o l ik 1 从e c v 中逃逸入细胞浆 6 、敲除i b e t 基因后的e 4 4 ：a i b e t 突变株菌体胞内的缓冲容量下 降 结论 毒力岛基因c g l d 作为e c o l ik 1 的毒力因子，有利于e c o l ik 1 的体内毒力， 参与脑膜炎的炎症反应，但与穿越血脑屏障无关，c g l d 蛋白具有甘油脱氢酶的活 性。 6 毒力岛侵袭基因i b e y 有利于大肠杆菌降解e c v 膜，避免与溶酶体融合，进而 促使大肠杆菌逃逸进入细胞浆并进行复制。 关键词 c g l d ，大肠杆菌k 1 株，新生儿脑膜炎，血脑屏障，脑脊液，甘油脱氢酶 i 抛r ，大肠杆菌k 1 株，人脑微血管内皮细胞，溶酶体，逃逸 7 英文论著摘要 f u n c t i o n a ls t u d yo fe s c h e r i c h i ac o i lk 1p a t h o g e n i c i t y i s l a n dg i m ai nn e o n a t a lm e n i n g i t i s p u r p o s e b a c t e r i a lm e n i n g i t i si sas e r i o u sa n ds o m e t i m e sf a t a li n f e c t i o na f f e c t i n gt h ec e n t r a l n e r v o u ss y s t e m ( c n s ) d e s p i t eg r e a ta d v a n c e si na n t i m i c r o b i a lc h e m o t h e r a p ya n d s u p p o r t i v ec a r e ，b a c t e r i a lm e n i n g i t i sr e m a i n sa ni m p o r t a n tc a u s eo fm o r t a l i t ya n d m o r b i d i t y t h es u r v i v o r so f t e na c c o m p a n yw i t ht h eh e a r i n gl o s e ，b l i n d n e s s ，e p i l e p t i c ， m e n t a lr e t a r d a t i o na n dd y s p r a x i a ab e t t e ru n d e r s t a n d i n go ft h eu n d e r l y i n gp a t h o g e n i c m e c h a n i s m so ft h i sd i s e a s em a yc o n t r i b u t et oc l i n i c a li n t e r v e n t i o n e s c h e r i c h i ac o l i ( ec o l i ) k 1i st h em o s tc o m m o ng r a m - n e g a t i v eo r g a n i s mc a u s i n g m e n i n g i t i sd u r i n g t h en e o n a t a l p e r i o d e c o l i s t r a i n sw i t ht h ek 1 c a p s u l a r p o l y s a c c h a r i d e a r et h ep r e d o m i n a n ti s o l a t e s ( a b o u t8 0 ) f r o mn e o n a t a lec o l i m e n i n g i t i s e v i d e n c e ss h o w e dt h a tm o s tc a s e so fe c o l im e n i n g i t i so c c u r a sar e s u l to f h e m a t o g e n o u ss p r e a d e n t r yo fc i r c u l a t i n ge c o bi n t ot h ec n sr e q u i r e sp a s s a g ea c r o s s t h eb l o o d b r a i nb a r r i e r ( b b b ) ，w h i c hi sm a i n l yc o m p o s e do fb r a i nm i c r o v a s c u l a r e n d o t h e l i a lc e l l s t od a t e ，s e v e r a lg e n e t i cd e t e r m i n a n t sc o n t r i b u t i n gt ob a c t e r i a l c r o s s i n gt h eb b b h a v eb e e ni d e n t i f i e di nec o l ik 1 ，s u c ha s f i m h , o m p a ，i b e a ，i b e b ， c n f l ，e r e b e s i d e s ，s t u d i e ss h o w e dt h a tr e o r g a n i z a t i o no ft h ea c t i n sc y t o s k e l e t o na n d i n t r a c e l l u l a rs i g n a l i n gs u c ha sp 1 3 k 、p k b 、p k c 、r h o g t p a s ea n df a k i nh u m a nb r a i n m i c r o v a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l s ( h b m e c s ) a r ei n v o l v e di nec o l ik 1i n v a s i o no f h b m e c s h o w e v e r , t h em e c h a n i s mo ft h e s eg e n e t i cd e t e r m i n a n t sf o re c o l ik 1a c r o s s t h eb b bi sn o tc l e a r i no u rp r e v i o u ss t u d i e s ，ap a t h o g e n i c i t yi s l a n dg i m a ( g e n e t i ci s l a n do fm e n i n g i t i c 8 ec o l ic o n t a i n i n gi b e a ) ( f i g 1 ) w a si d e n t i f i e df r o mt h eg e n o m i cd n al i b r a r yo fe c o l i k 1s t r a i nr s 218 ( 0 18 ：k 1 ：h 7 ) ，ac e r e b r o s p i n a lf l u i d ( c s f ) i s o l a t ef r o man e o n a t e w i t hm e n i n g i t i s t h ed a t as u g g e s t e dt h a tg i m am a yc o n t r i b u t et oec o l ii n v a s i o no ft h e b b b t h ee n t i r eb l o c ko f2 0 3k bg i m as e q u e n c e sd o e sn o ts h a r es i g n i f i c a n th o m o l o g y w i t hg e n o m es e q u e n c e so fn o n p a t h o g e n i ce c o l ik 1 2 d n as e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e d t h a tg i m ac o n s i s t so ff o u ro p e r o n s ，( 1 ) p t n l p k c ( g i m a1 ) ，i n c l u d i n gp t n i 、p t n p 、p t n k 、 p m c ；( 2 ) c g l d t e c ( g i m a 2 ) ，i n c l u d i n gc g l d 、c g t t 、c g l e 、c g l c ；( 3 ) g c x k r c i ( g i m a 3 ) i n c l u d i n gg c x k 、g c x r 、g c x c 、g c x i ：( 4 ) l b e r at ( g i m a 4 ) ，i n c l u d i n g 汤出、i b e a 、i b e t t h er o l eo fi b e ah a sb e e ni d e n t i f i e da n di ti si n v o l v e di nt h ei n v a s i o n o fh b m e c s b l a s ta n a l y s i sr e s u l t ss h o w e dt h a tp t n ii ng i m a ls h a r es i g n i f i c a n t s e q u e n c eh o m o l o g yw i t hp h o s p h o e n o l p y r u v a t e p r o t e i np h o s p h o r y l t r a n s f e r a s e ；c g l di n g i m a 2i sap u t a t i v eg l y c e r o ld e h y d r o g e n a s e ( g l d h ) ，s h o w i n gh i g hh o m o l o g yt ot h e p a r a l o g u ei ne c o l ik12s t r a i n s ( 5 6 ) a n dg l d hi no t h e rb a c t e r i a ( u pt o6 2 ) g c x c i ng i m a 3s h a r es i g n i f i c a n ts e q u e n c eh o m o l o g yw i t hg l y c o x y l a t ec a r b o l i g a s e ( u pt o 6 7 ) ；o n eo ft h em a j o rf u n c t i o n so ft h eo p e r o ng i m a 4 i sb e i n gr e s p o n s i b l ef o rec o l i k 1i n v a s i o no fh o s tc e l l s 1 b e ta n di b e rs h a r ef e wh o m o l o g yw i t ho t h e rs e q u e n c e sa n d t h e ya r el o c a t e da tt h es a m eo p e r o nw i t hi b e a ，s ot h e ym a y b ec o n t r i b u t e dt oe c o bk 1 i n v a s i o no fh b m e c s e x p l o r et h er o l eo ft h e s eg e n e si nec o i lk 1m a yb ec o n t r i b u t e d t ou n d e r s t a n dt h em e c h a n i s mo fb a c t e r i a lm e n i n g i t i s t h e r e f o r e , w ec a r r i e do u r r e s e a r c ht os t u d yt h er o l eo fc g l di ng i m a 2a n di b e ti ng i m a 4i nt h ed e v e l o p m e n to f m e n i n g i t i s 9 i i i f i 一腻； _ _ l 一 p 一- _ - 一- 。l f i g 1r e l a t i v eg e n e t i cl o c a t i o na n do p e r o ns t r u c t u r e so f t h eg e n e t i ci s l a n dg i m a m e t h o d s 1 f u n c t i o n a ls t u d yo fe s c h e r i c h i ac o l ik 1p a t h o g e n i c i t yi s l a n d g e n e c g l d ( 1 ) b a c t e r i a lc u l t u r e b a c t e r i a ls t r a i n sw e r eg r o w ni nl bm e d i u m ；b e f o r eb a c t e r i a li n v a s i o na s s a y , e 4 4 w e l eg r o w ni nb h im e d i u m ( 2 ) c e l lc u l t u r e h b m f 已c sw c r ec u l t u r e di nr p m i1 6 4 0m e d i u m ，s u p p l e m e n t e dw i t h1 0 f e t a l b o v i n es e r u ma n d1 0 n us e n l ma t3 7 i na5 c 0 2 ，1 0 0 a i rh u m i d i f i e d ( 3 ) c o n s t r u c t i o no fi s o g e n i ci n l 臣a m ed e l e t i o nm u t a n t s t r a i n p l a g m i dp c v d - a c g l dw a si n t r o d u c e di n t oe 4 4b yp l a t em a t i n g e 4 4 ：a c g l dw e r e c o n s t n l e t e db yb a c t e r i a lh o m o l o g o u se x c h a n g e ( 4 ) c o m p l e m e n t a t i o na n a l y s i s o r fo fc g l dg e n ew a gc l o n e di n t op f n 4 7 6v e c t o ra n dw e r et r a n s f o r m e dw i t h 1 0 p g p 1 - 2t o g e t h e ri n t oe 4 4 ：ac g l d ( 5 ) b a c t e r i a la d h e s i o na n di n v a s i o na s s a y s b a c t e r i a la d h e s i o na s s a y s ：b a c t e r i a ( 10 7c f u w e u ) w e r ea d d e dt o c o n f l u e n t m o n o l a y e r so fh b m e c s ，b a c t e r i aw e r ec o l l e c t e da f t e r1 5 ha n dr e s u l t sw e r ee x p r e s s e d a sr e l a t i v ea d h e s i o n b a c t e r i a li n v a s i o na s s a y s ：b a c t e r i a ( 10 7c f u w e l l ) w e r ea d d e dt oc o n f l u e n t m o n o l a y e ro fh b m e c s f o r1 5 h t h en u m b e ro fi n t r a c e l l u l a rb a c t e r i aw a sd e t e r m i n e d a f t e rt h ee x t r a c e l l u l a rb a c t e r i aw e r ek i l l e d ，r e s u l t sw e r ee x p r e s s e da sr e l a t i v ei n v a s i o n ( 6 ) m e d i a nl e t h a ld o s e ( l d s 0 ) a n ds u r v i v a la n a l y s i s l d 5 0w a sd e t e r m i n e db yb l i s sm e t h o da n ds u r v i v a la n a l y s i sw e r ed e t e r m i n e db y k a p l a n m e i e rs u r v i v a lc u r v e ( 7 ) e x p e r i m e n t a lr a tm o d e lo fn e o n a t a lm e n i n g i t i s b a c t e r e m i ar a tm o d e lw a se s t a b l i s h e da n de c o l im o d e lo fn e o n a t a lm e n i n g i t i s w a sar e s u l to fh e m a t o g e n o u ss p r e a d ( 8 ) w h i t eb l o o dc e l l ( w b c ) c o u n t ，p r o t e i na n d l a c t a t el e v e l si nc s f w b cc o u n tw a sd e t e r m i n e db yh e m o c y t o m e t e r t h ec o n c e n t r a t i o n so fp r o t e i na n d l a c t a t ei nc s fw e r em e a s u r e db yb c ap r o t e i na s s a yk i ta n dl a c t a t ea s s a yk i t ( 9 ) h i s t o l o g i c a la n a l y s i s ( 10 ) p o l y m o r p h o n u c l e a rn e u t r o p h i l s ( p m n s ) t r a n s e n d o t h e l i a l m i g r a t i o na s s a y f r e s hh u m a np m n sw e r ei s o l a t e df r o mh u m a np e r i p h e r a lb l o o d m i g r a t e dp m n s w e r ec o u n t e di nah e m a c y t ：o m e t e r ( 11 ) r e c o m b i n a n tp r o t e i ne x p r e s s i o na n dp u r i f i c a t i o n r e c o m b i n a n tp l a s m i dw a se x p r e s s e di nb l 2 1 ( d e 3 ) a n dg s t - c g l dw a sp u r i f i e d b ya f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y 1 1 ( 12 ) g l y c e r o ld e h y d r o g e n a s e ( g l d h ) a s s a y t h ea c t i v i t yo f g l y c e r o ld e h y d r o g e n a s ew a s d e t e r m i n e db yc o l o r i m e t r i cm e t h o d s 2 f u n c t i o n a ls t u d yo fe s c h e r i c h i ac o l ik 1p a t h o g e n i c i t yi s l a n d g e n ei b e t ( 1 ) b a c t e r i a lc u l t u r e b a c t e r i a ls t r a i n sw e r eg r o w ni nl bm e d i u m ，b e f o r eb a c t e r i a li n v a s i o na s s a y , e 4 4 w e r eg r o w ni nb h im e d i u m ( 2 ) c e l lc u l t u r e h b m e c sw e r ec u l t u r e di nr p m i16 4 0m e d i u m s u p p l e m e n t e dw i t h10 f e t a l b o v i n es e r u ma n d10 n us e r u m ( 3 ) c o n s t r u c t i o no fi s o g e n i ci n f l a m ed e l e t i o nm u t a n ts t r a i n p l a s m i dp c v d a i b e tw a si n t r o d u c e di n t oe 4 4b yp l a t em a t i n g e 4 4 ：a i b e tw e r e c o n s t r u c t e db yb a c t e r i a lh o m o l o g o u se x c h a n g e ( 4 ) c o m p l e m e n t a t i o na n a l y s i s o r fo fi b e tg e n ew a sc l o n e di n t op f n 4 7 6v e c t o ra n dw e r et r a n s f o r m e dw i t h p g p l 2t o g e t h e ri n t oe 4 4 ：a i b e t ( 5 ) b a c t e r i a la d h e s i o na n di n v a s i o na s s a y s b a c t e r i a la d h e s i o na s s a y s ：b a c t e r i a ( 1 0 7c f u w e l l ) w e r ea d d e dt oc o n f l u e n t m o n o l a y e r so fh b m e c s ，b a c t e r i aw e r ec o l l e c t e da f t e r1 5 ha n dr e s u l t sw e r ee x p r e s s e d a sr e l a t i v ea d h e s i o n b a c t e r i a li n v a s i o na s s a y s ：b a c t e r i a ( 1 0 7c f u w e l i ) w e r ea d d e dt oc o n f l u e n t m o n o l a y e ro fh b m e c sf o r1 5 h t h en u m b e ro fi n t r a c e l l u l a rb a c t e r i aw a sd e t e r m i n e d a f t e rt h ee x t r a c e l l u l a rb a c t e r i aw e r ek i l l e d ，a n dt h er e s u l t sw e r ee x p r e s s e da sr e l a t i v e l n v a s l o n ( 6 ) b a c t e r i a ls u r v i v a li nh b m e c sa s s a y 1 2 b a c t e r i a ( 10 7 c f u w e l l ) w e r ea d d e dt oc o n f l u e n tm o n o l a y e ro fh b m e c sf o r1 5 h ， a n di n t r a c e l l u l a rb a c t e r i aw e r ed e t e r m i n e da f t e rt h ee x t r a c e l l u l a rb a c t e r i aw e r ek i l l e da t t h ei n d i c a t e dt i m e ，a n dr e s u l t sw e r ee x p r e s s e dw i t hb a c t e r i a lc f u ( 7 ) b a c t e r i a lg r o wc u r v e s b a c t e r i a lg r o w nc u r v e sw e r ed e t e r m i n e db yt h ea b s o r b a n c ev a l u e sa ta 6 0 0 n m ( 8 ) i m m u n o f l u o r e s c e n tt e c h n i q u e ( 9 ) t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e ( t e m ) t h ee m b e d d i n gb l o c kw e r ec u ti n t o7 0 - 8 0 h mt h i c k ，s t a i n e d ，a n dw e r es c a n n e d w i m t e m ( 10 ) d e t e r m i n et h ec y t o p l a s m i cb u f f e r i n gc a p a c i t yo ft h eb a c t e r i a c y t o p l a s m i cb u f f e r i n gc a p a c i t yw a sc a l c u l a t e db yt h ed i f f e r e n c eb e t w e e nt o t a l b u f f e r i n gc a p a c i t ya n de x t r a c e l l u l a rb u f f e r i n gc a p a c i t y r e s u l t s 1 t h er o l eo fe s c h e r i c h i ac o l ik 1p a t h o g e n i c i t yi s l a n dg e n e c g l di ne x p e r i m e n t a ln e o n a t a lm e n i n g i t i s ( 1 ) i s o g e n i ci n f r a m ed e l e t i o no f c g l dg e n ei nec o l ik 1 ( 2 ) c g t dd e l e t i o ni ne c o l ik 1l e a d st op r o l