（内科学专业论文）结核分支杆菌16kda38kdaesat6融合蛋白的血清学评价.pdf

目录 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要3 二、英文缩略语5 三、论文 前言“6 一刖舌“ 材料与方法7 结果一9 讨论l2 、 结论14 四、本研究创新性的自我评价1 5 五、参考文献l6 六、附录 综j 苤l8 在校期间科研成绩2 6 致谢2 7 个人简介2 8 中文论著摘要 结核分支杆菌1 6 k d a 3 8 k d a e s a t - 6 融合蛋白的血清 学评价 目的 结核病是由结核分枝杆菌( m y c o b a c t e r i t u b e r c u l o s i s ，m t b ) 弓l 起的慢性传染病， 每年有9 0 0 多万新发病例，死亡人数约2 0 0 万。至今大约有2 0 亿人被感染，结核 病目前已成为全球严重的公共卫生和社会问题。现有的细菌学诊断是结核病诊断 的金标准，但由于涂片阳性率低、培养耗时时间长，远不能满足临床需要。血清 学检测以其简单、快速、准确受到广泛关注，寻找理想的靶抗原，一直是众多学 者研究的热点。近年来研究表明，只用单一抗原的结核病血清学诊断敏感性、特 异性往往不够，难以有效区分现患结核人群和结核菌感染。结核病融合蛋白抗原 1 6 k d a - 3 8 k d a 可以提高结核血清学诊断的特异性和敏感性的研究已经国外学者证 明，e s a t - 6 是刺激i f n r 应答的主要抗原，仅存在于结核分枝杆菌群及少数几种 致病性分支杆菌中。据此推测，1 6 k d a 3 8 k d a e s a t - 6 融合蛋白可能可以鉴别结核 病患病人群及非病人群。本研究目的以重组结核杆菌1 6 k d a - 3 8 k d a e s a t - 6 融合蛋 白( 以下简称重组蛋白) 为包被抗原，检测结核病人的血清，探讨该融合抗原对结核 病诊断敏感性和特异性，并与商品化结核抗体试剂盒做对比分析，以评价该抗原 诊断结核病的价值。为进一步诊断试剂盒的研发提供依据。 方法 实验对象包括全部病例1 5 0 例，其中临床确诊结核病例( t b ) 1 0 5 例、4 5 例控 制病例，以重组1 6 k d a - 3 8 k d a - e s a t - 6 融合蛋白作为包被抗原，采用酶联免疫吸附 试验( e l i s a ) 检测1 5 0 例血清中的1 6 k d a - 3 8 k d a - e s a t - 6 结核抗体水平，包括临床 确诊结核病例1 0 5 例( 菌阳2 6 、菌阴7 9 ) 、控制组2 0 例健康人、2 5 例非结核肺 病病例血清中的相关结核抗体，得出各组之间的o d 值及阳性率，并与商品化结 核抗体检测试剂盒( t b d o t ) 的阳性率进行比较，以此来评价重组 1 6 k d a - 3 8 k d e s a t - 6 融合蛋白对结核病诊断的价值，并建立r o c 曲线评价系统。 结果 1 6 k d a - 3 8 k d a e s a t - 6 融合蛋白检测4 5 例控制组的阳性率为6 6 3 ，与商品化 结核抗体检测试剂盒阳性率相比，有统计学差异( p 0 0 5 ) 。结 核病组( t b ) 与控制组的o d 值分别为2 2 2 - + 0 5 8 、1 3 5 士0 2 4 ，二组间o d 值对比有 显著性差异( f = 6 0 6 ，p 0 0 5 ) ；1 6 k d a - 3 8 k d a e s a t - 6 融合蛋白检测结核病的敏感 性、特异性、阳性预测值及阴性预测值分别为5 9 0 5 、9 3 3 3 、9 5 3 8 、4 9 4 1 。 应用r o c 曲线分析，得出曲线下面积为0 7 5 1 ，c u t o f f 值为2 5 2 ，此时敏感性及 特异性分别为6 5 4 、8 4 8 。 结论 1 6 k d a - 3 8 k d a e s a t - 6 融合蛋白检测血清结核抗体具有较高的特异性，可以更 好的区分有病者和无病者，可以作为结核病诊断的备选抗原之一。 关键词 分支杆菌；结核；重组1 6 k d a - 3 8 k d a e s a t - 6 融合蛋白；血清学诊断；e l i s a 方法 2 英文论著摘要 s e r o l o g i c a le v a l u a t eu s i n g r e c o m b i n a n t 1 6 k d a - 3 8 k d a - e s a t - 6p r o t e i no fm y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s o b j e c t i v e t bi sm y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s ( m y c o b a c t e r i t u b e r c u l o s i s ，m t b ) c a u s e db yc h r o n i c i n f e c t i o u sd i s e a s e s ，e a c hy e a rm o r et h a n9 0 0m i l l i o nn e wc a s e s ，a b o u tt w om i l l i o n d e a t h s s of a ra b o u t2 0m i l l i o np e o p l ea r ei n f e c t e d ，t u b e r c u l o s i sh a sb e c o m eas e r i o u s g l o b a lp u b l i ch e a l t ha n ds o c i a lp r o b l e m s ，t h ec u r r e n tg o l ds t a n d a r df o rd i a g n o s i so f t u b e r c u l o s i si ss m e a ro rc u l t u r ed i a g n o s i s h o w e v e r ，l o w e r s m e a r - p o s i t i v er a t ea n d l o n g c u l t u r et i m ec a nn o tm e e tt h ec l i n i c a ln e e d s s e r o l o g i c a lt e s t 堍f o ri t ss i m p l e ， f a s t , a c c u r a t ea n dr e c e i v e de x t e n s i v ea t t e n t i o n h o wt of i n dt h ei d e a lt a r g e ta n t i g e nh a s b e e nt h ef o c u so fm a n ya c a d e m i cr e s e a r c h r e c e n ts t u d i e ss h o wt h a to n l yas i n g l e a n t i g e ns e n s i t i v i t yo fs e r o l o g i c a ld i a g n o s i so ft bi so f t e nn o te n o u g h a tp r e s e n t , t h e t br e c o m b i n a n t p r o t e i n 16 k d a - 3 8 k d ai m p r o v et h es p e c i f i c i t ya n dt h es e n s i t i v i t yo f s e r o l o g i c a ld i a g n o s i so ft u b e r c u l o s i sh a v ep r o v e db yf o r e i g ns c h o l a r s b u to u rc o u n t r y 1 6 k d a - 3 8 k d ar e c o m b i n a n tf u s i o np r o t e i nw a sl i t t l er e s e a r c h t h ep u r p o s eo ft h i ss t u d y i su s eo f16 k d a - 38 k d a - e s a t - 6r e c o m b i n a n tp r o t e i no fm y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s f o rt h e c o a t e da n t i g e nt od e t e c t i o no fs e r u mt b ，g a i ns e r o l o g i c a le v a l u a t ea b o u t a n t i g e ni nt h ed i a g n o s i so ft u b e r c u l o s i s ，a n dc o m p a r a t et ot h ec o m m e r c i a lk i t ，t oa s s e s s t h ev a l u eo ft h ea n t i g e nf o rd i a g n o s i so ft u b e r c u l o s i si ns e r o d i a g n o s i s f o rt h ef u r t h e r d e v e l o p m e n to fd i a g n o s t i ck i t st op r o v i d et h eb a s i s m e t h o d s e l i s aw a su s e df o rt h ed e t e c t i o no fr e c o m b i n a n t16 l a - 38 k d a e s a r 6p r o t e i n o fa l lc a s e sa sc o a t e d a n t i g e ni ns e r u mo f15 0p a t i e n t s ，h u m o r a li m m u n er e s p o n s e w a sa n a l y s e di nag r o u po f10 5t bp a t i e n t s ( 2 6 s m e a r - p o s i t i v e ，7 9s m e a r - n e g a t i v e ) ，a n d i nc o n t r o lg r o u p sc o n s i s t i n go f 2 0h e a l t h yv o l u n t e e r sa n d2 5s u b j e c t s 、柝t hp u l m o n a r y d i s e a s e so t h e rt h a nt b ( n t b ) c o m p a r e dt h ep o s i t i v er a t e sa n do dv a l u ea n ds e n s i t i 一 3 v i t y 、s p e c i f i c i t y 、p o s i t i v ep r e d i c t i v ev a l u ea n dn e g a t i v ep r e d i c t i v ev a l u e ，t e e nt h es e r ao f t u b e r c u l o s i s ( t b ) p a t i e n t s ( n = 1 0 5 ) 、h e a l t h yc o n t r o l s ( n = 2 0 ) a n dn o n - t u b e r c u l o s i s ( n t b ) p a t i e n t s ( n _ 2 5 ) b ye l i s a ，c o m p a r e d 、析t l lt b - d o tt oe v a l u a t et h e v a l u eo ft h e r e c o m b i n a n t16 k d a - 38 k d a - e s a t - 6p r o t e i n a s s e s st h ev a l u eo ft h e a n t i g e n f o r d i a g n o s i so ft u b e r c u l o s i si ns e r o d i a g n o s i s ，a n de s t a b l i s har o ce v a l u a t i o ns y s t e m r e s u l t i nc o n t r o lg r o u p s ，t h ep o s i t i v er a t e so fa n t i - t h er e c o m b i n a n t16 k d a - 3 8 k d a e s a t - 6 p r o t e i n i sa n dc o m m e r c i a l i z a t i o no ft u b e r c u l o s i sa n t i b o d yt e s tk i th a ds t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( p 0 0 5 ) ；t h eo dv a l u eo ft ba n dc o n t r o lg r o u p si s 2 2 2 - 4 ：0 5 8 、 1 3 5 4 - 0 2 4 r e s p e c t i v e l y , t h e o dv a l u eo ft w o g r o u p sh a ds t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e ( f = 6 0 6 ，p 0 o1 ) ；t h es e n s i t i v i t y , s p e c i f i t y , p o s i t i v ep r e d i c t i v ev a l u ea n d n e g a t i v ep r e d i c t i v ev a l u eo ft h et e s tw e r ed e t e r m i n e da t5 9 0 5 、9 3 3 3 、9 5 3 8 、 4 9 41 ，r e s p e c t i v e l y a p p l i c a t i o no fr o cc u r v e s ，t h ea r e au n d e rt h ec u r v ef o r 0 7 51 ，t h ev a l u eo fc u t o f f 2 5 2 ，s e n s i t i v ea n ds p e c i f i cw e r e6 5 4 a n d 8 4 8 , r e s p e c t i v e l y c o n c u l u t i o n r e c o m b i n a n t16 k d a - 38 k d a - e s a t - 6p r o t e i no f m y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s 、析t l lh i g h e rs e n s i t i v i t ya n ds p e c i f i c i t y , t h e r ew a ss i g n i f i c a n t l yd i s t i n c t i o nb e t w e e nt b p a t i e n t sa n dn o n - t bp a t i e n t s s or e c o m b i n a n t16 k d a - 3 8 k d a - e s a t - 6p r o t e i nh a da n i m p o r t a n tv a l u ei nd i a g n o s i so ft u b e r c u l o s i s ，a n di tm i g h tb es e l e c t e da so n eo fd i a g n o s i s a n t i g e n so f t u b e r c u l o s i s k e vw o r d s ： m y e o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s ，r e c o m b i n a n t 16 k d a - 38 k d a - e s a t - 6p r o t e i n ， s e r o l o g i c a le v a l u a t e i m m u n er e s p o n s e 4 英文缩略语 5 论文主体 结核分支杆菌1 6 k d a 3 8 k d a e s a t - 6 融合蛋白的血清 学评价 刖置 结核病是由结核分枝杆菌( m y c o b a c t e r i t u b e r c u l o s i s ，m t b ) 弓l 起的慢性传染病， 世界上有三分之一的入口【l 】染上结核，至今大约有2 0 亿人被感染，每年有9 0 0 多 万新发病例，死亡人数约2 0 0 万。结核病目前已成为全球严重的公共卫生和社会 问题。目前结核病的标准诊断仍然依赖于临床资料、痰涂片镜检和细菌培养。现 有的细菌学诊断方法虽然是结核病诊断的金标准，但由于涂片阳性率低、培养耗 时时间长，远不能满足临床需要。随着结核病快速诊断技术的发展，血清学检测 以其简单、快速、经济、准确受到广泛关注，寻找一种快速、简单工具进行结核 病诊断是日益增加的活动性肺结核的迫切需要【2 叫 目前人们已逐渐认识到，结核病血清特异性抗体是快速诊断结核病的方法， 所以寻找结核特异性抗原已成为众多学者研究的热点。近年来，人们应用基因工 程技术分离、纯化抗原，已发现许多结核病特异性抗原，目前已发现的重要的结 核分枝杆菌抗原，大致有结核菌素蛋白衍生物( p p d ) 、抗原8 5 复合体、3 8 k d a 磷酸盐转运蛋白嘲( 3 8 k d a ) 、结核分枝杆菌培养滤液蛋白、免疫性蛋白、主要分泌 性免疫蛋白和分枝杆菌表面脂蛋白、小分子热休克蛋白( h s p ) 。研究表明，结核 病血清学只用单一抗原的结核病血清学诊断敏感性往往不够，难以有效区分现患 结核病或是结核菌感染人群。研究表吲1 7 1 ，用具有免疫互补性抗原组成的重组融 合蛋白抗原能提高抗原血清学诊断的特异性和敏感性，可能可以有效区分结核病 人及结核菌感染。 酶联免疫法【8 】是一种高度敏感性、不需复杂仪器、可以重复进行测试的成型 技术，广泛用于实验室检测。本研究以重组结核杆菌1 6 k d a - 3 8 k d a e s a t - 6 融合蛋 白( 以下简称重组蛋白) 为包被抗原，检测结核病人的血清，探讨该抗原对结核病病 6 人诊断的敏感性及特异性，并与商品化迪比多结核抗体试剂盒( 以下简称试剂盒) 做对比分析，并做r o c 曲线评价系统，以评价该抗原诊断结核病的价值。 资料与方法 1 、实验对象 ( 1 ) 全部入选病例选自中国医科大学附属四院2 0 0 9 年5 月2 0 0 9 年1 2 月住 院及门诊病人，共1 5 0 例。分组情况：1 0 5 份结核病例选自我院临床根据病史、 临床症状、x 线胸片及治疗转归情况而确诊的初治结核病例，男8 5 例，女2 0 例， 控制组4 5 例，男2 1 例，女4 例，均无结核病史。其中结核病组又分为结核菌阳 病例2 6 例，菌阴病例7 9 例；控制组分为健康体检者2 0 例和2 5 例除结核以外的 肺部疾病病例，2 0 份健康体检者来自我院体检中心，均正常接种过卡介苗，无结 核病史；肺部疾病病例来自我院呼吸科，包括肺内感染病例1 2 例及肿瘤科肺癌病 例1 3 例，年龄情况如表1 所示。 ( 2 ) 分组及各组入选标准：控制组：胸片无结核病灶，无结核病相关症状及 体征；结核病组( t b ) ：( 1 ) 有结核病相关症状和或体征；( 2 ) 既往无结核病诊断及 治疗史；( 3 ) 有肺部x 线阳性表现；诊断标准均符合临床诊疗指南( 结核病分册) 【9 】 o 2 、主要试剂与仪器 ( 1 ) 试剂：重组1 6 k d a - 3 8 k d a - e s a t - 6 融合蛋白由上海领潮生物公司合成， 抗原纯度达9 6 以上；辣根过氧化物酶标记的羊抗人i g g 、牛血清白蛋白( b s a ) 均购自上海领潮生物公司，四甲基联苯胺( t m p ) 为s i g m a 进口分装；包被缓冲液、 p b s 、p b s t 和底物缓冲液为我院自行配制。f a s t p l a q u et b t m 结核分枝杆菌快 速诊断试剂盒( p h a b 法) 上海金浩公司提供，结核抗体商品化试剂盒迪比多由上 海奥普生物制品有限公司提供。 ( 2 ) 仪器 3 7 电热恒温箱( w m k - 0 2 )湖北黄石 离心机( s i g m a 3 k 1 5 型)德国 酶标仪( k h b s t 3 6 0 )上海科华 7 超低温冰箱( - 2 0 。c 7 0 ) 多功能全自动酶标洗板机( d z m x 8 0 ) 低速离心机( s c 3 6 1 2 ) 3 、标本采集和保存 日本s a n y o 沈阳 上海科大 住院患者于住院次日，门诊患者于就诊当日，正常对照组于体检日采集空腹 静脉血3 - 5 m l ，1 5 0 0 转分，离心5 分钟，提取上清液2 m l ，2 0 。c 7 0 。c 冰箱保存，集 中检测；入院次日留取痰标本2 组，分别按照实验操作规程检测，记录结果。 4 、细菌检测方法 ( 1 ) 集菌法：集菌法标本处理及判定标准按照2 0 0 6 年中国防痨协会制定的 结核病诊断实验室检验规程【1 川进行判定。 ( 2 ) 细菌培养方法：噬菌体生物扩增法( p l 加法) ：按照试剂说明进行操作 和结果判定，每次检测时必须设杀毒剂对照、阴性对照和阳性对照。 5 、16 k d a - 38 k d a e s a t - 6 融合蛋白检测方法 采用酶联免疫吸附试验( 间接法) 检测血清标本中融合蛋白。用p h 9 6 碳酸包被 缓冲液将重组蛋白从o 5u g 皿、1 0u g m l 、2u g m l 、5 u g m l 浓度梯度稀 释，经预实验找出最适浓度l u g m l ，每孔1 0 0 u l 包被9 6 孔板，每板均设空白对 照及阴性对照，p h 9 6 的碳酸缓冲液3 7 0 孵育2 小时；p h 7 4p b s t 的洗板( 洗 扳机程序设定为洗5 次) ，每次3 分钟；用含1 b s a 的p b s 封闭，3 7 c 孵育m ； p b s t 洗扳；用含1 b s a 、b s t 稀释血清( 稀释比例l ：1 0 0 ) ，每孔1 0 0 u l 敷育1 h ； 洗扳；用含1 b s a 的p b s t 稀释过氧化物酶标记的羊抗人i g g ( 稀释比例l ：1 0 0 0 ) 每孔l o o u l ，3 7 孵育l h ；p b s t 洗扳；将新配制的t m p 底物缓冲显色液每孔1 0 0 u l ， 避光显色3 0 m i n ，然后加入5 0 u l 的2 m m o l l h 2 s 0 4 。在4 5 0 n m 处以空白对照孔 调零后读取各孔吸光( o d 值) 。重复上述实验3 次。 6 、结果判定 以正常血清a + 2 s d 作为阳性标准，若待检血清标本o d 值大于此标准，即判 断阳性，低于此标准为阴性。应用s p s s l 6 0 统计软件进行统计学分析。计数应用 x 2 检验，以p o 0 5 为判断差异有显著性的标准；计量资料应用t 检验及f 检验。 8 勿七里 ：口木 本研究中，全部结核病例为1 0 5 例，结核病组年龄与控制组年龄相比无显著 性差异，菌阳组与控制组对比有显著性差异( p o 0 5 ) ( 见表2 所示) ；应用重组蛋白 抗原及试剂盒检测控制组结核抗体，阳性率分别为6 6 7 、5 1 1 1 ，二组阳性率 比较，差异有显著性意义( p o 0 1 ) ( 见表3 ) 。说明重组蛋白可以更好的鉴别结核 病与健康人及非结核病。 重组蛋白检测结核病组与控制组的o d 值对比，统计学有显著性差异 ( f = 6 0 6 ，p 0 0 1 ) ，说明重组蛋白在结核病及控制组的检测中，有统计学意义 ( 见表4 ) 。 重组蛋白检测结核病各组的o d 值与健康组对比，结核病组o d 值与健康组 对比，统计学有显著性差异( 见表5 ) ，说明重组蛋白的存在与结核菌感染有关； 重组蛋白检测结核病各组的o d 值与非结核病组对比，统计学也有显著性差异( 见 表6 ) 。 重组蛋白检测结核抗体的敏感性、特异性、阳性预测值及阴性预测值情况分 别为5 9 0 5 、9 3 3 3 、9 5 3 8 、4 9 4 1 ；其中菌阳结核组检测敏感性为8 4 6 2 ， 明显高于菌阴组的敏感性5 0 6 3 。( 见表6 所示) 。由表6 可知，1 6 k d a 3 8 k d a - e s a t - 6 融合蛋白对菌阳的结核标本检测敏感性较高，明显高于菌阴组及控制组。 应用敏感性为纵坐标，1 特异度为横坐标，做受试者工作曲线( 如附图1 所 示) ，得出曲线下面积为o 7 5 1 ，c m o f f 值为2 5 2 ，当o d 值大于2 5 2 时，即可判 定患者的抗原相应抗体的检测结果为阳性。此时敏感性为6 5 4 ，特异度为8 4 8 。 9 附表 表l ，结核病各组与控制组平均年龄比较表 注：平均年龄为均数土标准差 表2 ，结核病例融合蛋白与奥普试剂盒检测结果阳性率比较 注：p 0 0 5 ，为有显著性差异，p 0 0 5 ，无显著性差异。 表3 ，控制组融合蛋白与奥普试剂盒检测结果阳性率比较 注：p 0 0 5 ，为有显著性差异，p 0 0 5 ，无显著性差异。 表4 ，重组蛋白检测结核病组与控制组的o d 值比较 注：p 0 0 5 ，为有显著性差异，p 0 0 5 ，无显著性差异。 1 0 表5 ，重组蛋白检测结核病各组与健康组的o d 值比较 组别 例数 o dt p 2 62 5 0 - 1 - 05 0 1 29 90 1 菌阳组 o i 菌阴组 7 92 0 6 土0 5 9 11 9 5 0 0 1 健康组 2 0 1 0 4 ：l - 0 2 7 注：p 0 0 5 ，为有显著性差异，p 0 0 5 ，无显著性差异。 表6 ，重组蛋白检测结核病各组与非结核病组的o d 值比较 组别 例数 o dt p 2 65 0 - i - 05 0 11 80 0 1 菌阳组 2 1 菌阴组 7 9 2 0 6 - 士0 5 98 31 o 0 1 非结核组 2 5 1 3 9 - 士- 0 2 1 注：p 0 0 5 ，为有显著性差异，p 0 0 5 ，无显著性差异。 表7 ，融合蛋白检测敏感性、特异性、阳性预测值及阴性预测值检测 菌阳组 2 6 2 28 4 6 29 3 3 3 8 8 09 1 3 菌阴组 7 94 05 0 6 3 9 3 3 39 3 0 25 1 8 5 量 2 兰 罢 r o cc l , i i v 8 1 - s p e c i f i c 畸 图1 ，重组蛋白的r o c 曲线 讨论 随着免疫诊断技术的发展，结核病血清学诊断已成为结核病诊断的重要手段 之一。目前己知的诊断用抗原主要有结核菌素蛋白衍生物( p p d ) 、抗原8 5 复合 体、3 8 k d a 磷酸盐转运蛋白、结核分枝杆菌培养滤液蛋白、免疫性蛋白、主要分 泌性免疫蛋白和分枝杆菌表面脂蛋白等，这些抗原均有一定的特异性，而结核的 血清学诊断技术最大的问题是所选抗原的特异性问题。 目前国内外都在寻找有效的结核特异性抗体，3 8 k d a 蛋白是结核菌特异的 分泌蛋白，是一种磷酸盐转运蛋白。缺乏抗3 8 k d a 抗体的血清很难与结核菌其它 抗原发生反应，并且由于3 8 k d a 抗原检测简单、快速，国外已用于结核病的检测， 目前我国已有相关诊断试剂盒，但因其特异性差异较大，极不稳定，因此临床应 用效果欠佳。1 6 k d a 是指结核分枝杆菌主要蛋白抗原6 3 ( m a j o rp r o t e i na n t i g e n 6 3o f t u b e r c u l o s i s ，m p t 6 3 ) 抗原，因为其分子量为1 6 k d ，故名1 6 k d a ，主要存在于 培养滤液中，具有m p t 6 3 抗原的种特异性：非m t c 分枝杆菌缺乏m p t 6 3 ，m p t 6 3 没有环境中常见的分枝杆菌抗原表位，其可作为非常有潜力的免疫诊断用抗原。 而e s a t 巧产生于结核病早期的感染浸润阶段，仅存在于致病性分枝杆菌中，1 9 9 7 年p o l l o c k 1 l 】等证实e s a t - 6 是刺激i f n r 应答的主要抗原，仅存在于结核分枝杆 菌群及少数几种致病性分支杆菌中。在9 0 以上的的人非致病性分支杆菌中缺乏 编码此蛋白的基因( 除堪萨斯分支杆菌、海水分支杆菌和苏加分支杆菌外) ，此外该 基因在所有卡介苗中也均缺乏。考虑到该抗原只存在于致病性结核分枝杆菌中， 因此可能可以区分结核菌感染或结核病患病人群，因此是很有前景的诊断用抗原。 近几年人们应用基因工程载体技术构建结核分支杆菌融合蛋白来进行结核 病血清学检测，即将多种可能的诊断抗原优势肽段通过载体连接，用于结核病血 清学检测并取得一定成效。s e n o lg 1 6 】研究发现，应用1 6 k d a - 3 8 k d a 重组抗原检测 1 7 9 例结核病例，得到敏感性、特异性分别为5 2 5 、9 3 3 3 ，较单一3 8 k d a 抗原 检测的敏感性3 3 - 8 9 、特异性1 0 一- 5 4 明显升高，我国拾莉【1 2 】等应用构建 1 9 k d - - - e s a t 6 融合重组体，在大肠埃希菌中表达该融合蛋白后进行纯化，并检测 出其具有抗原特异性，可以进行结核病的诊断。k o z i o w s k a i l 3 l 应用1 6 k d a - 3 8 k d a 抗原检测结核病人获得敏感性4 9 、特异性8 7 。本研究应用1 6 k d a - 3 8 k d a - e s a t - 6 1 2 融合蛋白抗原检测相关结核抗体，目前国内外尚未见同类报道，阳性检出率为 5 9 0 5 ( 6 2 1 0 5 ) ，敏感性高于s e n o lg 1 6 3 报道的1 6 - k d a - 3 8 k d a ，但该重组抗原与商 品化试剂盒迪比多相比，对现患结核病人群诊断无显著性意义，但在非结核病例 诊断中，差异有显著性意义，该抗原在控制组阳性率为6 6 7 ，远低于迪比多检 测的阳性率5 1 1 1 ，说明该融合蛋白抗原可以有效区分结核病现患人群与非结核 病；应用该抗原检测菌阳病例的敏感性、特异性分别为8 4 6 2 、9 3 3 3 ，阳性率 明显高于w ux 1 4 】所报道的3 8 k 拯e s a t - 6 c f p l o m p t 4 8 的7 3 6 ，特异性与刘贤 杰5 1 、冯雪鸣【1 6 1 、s e n o lg 6 3 等所作相关实验3 8 k d a 、3 8 1 6 k d a 较接近，但低于 r a j a t l 。7 】所做的相关实验，符合文献报道。 h a r b o e 螺】发现，e s a t - 6 抗原是区别结核杆菌和非结核分枝杆菌的最佳候选 抗原。e s a t - 6 明显提高了i f n r 试验特异性( 可达9 9 一1 0 0 ) ，而敏感性却有 所降低( 为8 4 一8 8 ) 。然而，研究表明【1 9 i e s a t - 6 抗原作为抗原检测抗结核抗体 阳性率只有1 2 2 0 左右，因此，单独作为诊断抗原意义不大，但该蛋白可以有效 区分卡介苗接种阳转者及结核病人，并可以区分既往曾患结核病人与新发感染情 况，因此可以应用鉴别陈旧结核或现患结核。本研究证实了这一点。本研究应用 酶联免疫法检测结核病例1 6 k d a - 3 8 k d a e s a t - 6 融合蛋白相关抗体，得出结核病组 与控制组的o d 值有显著性差异，证明该重组蛋白可以更好的鉴别结核病患病人 群与非病人群，减少结核误诊率，符合文献报道。k u m a r 2 0 】应用酶免法检测活动 性肺结核e s a t 6 ，获得敏感性及特异性分别为6 4 9 及8 8 9 。本研究应用含有 e s a t - 6 的融合蛋白抗原，敏感性与k u m a r 2 0 1 报道较接近，特异性( 9 3 3 3 ) 高于 其检测，说明16 k d a - 3 8 k d a - e s a t - 6 融合蛋白检测结核病特异性较好；应用r o c 曲 线，发现最佳临界值为1 9 9 5 时，敏感性及特异性最好，因此可以用来检测结核 抗体。经检测控制组标本，结果发现在控制组病例中阳性率较低6 6 7 ( 3 4 5 ) ， 明显优于t b d o t 试剂盒的5 1 1 1 ( 2 3 4 5 ) ，说明该融合抗原检测可以有效区分 结核病与非结核病人，而t b d o t 试剂盒难以有效区分现患病结核病人与卡介苗接 种阳转者，也证明该抗原特异性高，与韩伟1 2 l 】报道相一致。本研究从血清学方面 为结核病诊断提供依据，并由于检验快速、简单，可以为下一步试剂盒的研制提 供理论依据。 1 3 结论 总之，应用1 6 k d a - 3 8 k d a - e s a t - 6 融合蛋白抗原进行结核病血清学检测，可 以有效提高结核病血清学诊断的敏感性和特异性，优于单抗原检测，并可以有效 区分现患结核与非结核病例及卡介苗接种者，可以提高结核病诊断阳性率及特异 性，将是结核病血清学诊断的发展方向之一，该检测蛋自有待于进一步研究及推 广。 1 4 本研究创新性自我评价 结核分枝杆菌相关抗原检测在诊断结核、治疗效果及预后判断等方面的临床 意义愈加被研究及重视。本文针对1 6 k d a 3 8 k d a - e s a t - 6 融合蛋白抗原进行结核病 血清学检测，得到r o c 工作曲线，得出该抗原对结核病血清学诊断敏感性和特异 性较高，优于单抗原检测。 本抗原可以有效区分现患结核与非结核肺病及健康人群，可以有效提高诊断 阳性率及特异性，将是结核病血清学诊断的发展方向之一，有待于进一步研究及 推广。 上述两方面为本研究的创新性所在。 1 5 参考文献 1 d y ec ，s c h e e l es ，d o l i n 只p a t h a n i avr a v i g l 【i o n em c c o n s e n s u ss t a t e m e n t g l o b a lb u r d e no f t u b e r c u l o s i s ：e s t i m a t e di n c i d e n c e ，p r e v a l e n c e ，a n dm o r t a l i t yb y c o u n t r y w h og l o b a l s u r v e i l l a n c ea n dm o n i t o r i n gp r o j e e t j a m a 1 9 9 9 ；2 8 2 ：6 7 7 - 6 8 6 2d e m k o wu ，z i o k o w s k ij ，f i l e w s k am ，e ta 1 d i a g n o s t i cv a l u eo fd i f f e r e n ts e r o l o g i c a lt e s t sf o r t u b e r c u l o s i si np o l a n d jp h y s i o lp h a r m a c o l2 0 0 4 ；5 5 ：3 5 7 - 3 6 6 3w i l k i n se t a , i v a n y ij p o t e n t i a lv a l u eo fs e r o l o g yf o rd i a g n o s i so fe x t r a p u l m o n a r yt u b e r c u l o s i s l a n c e t19 9 0 ；3 3 6 ：6 41 - - 6 4 4s i l v av m c ，k a n a u j i agg e n n a r om l ，m e n z i e sd f a c t o r sa s s o c i a t e dw i t hh u m o r a lr e s p o n s et o e s a t - 6 ，3 8k d aa n d1 4k d ai np a t i e n t sw i t has p e c t r u mo ft u b e r c u l o s i s i n tjt u b e r cl u n g d i s 2 0 0 3 ；7 ：4 7 8 - 4 8 4 5d e r n k o wu ，z i e l o n k at m ，n o w a k - m i s i a km ，e ta 1 h u m o r a li m m u n er e s p o n s ea g a i n s t3 8 k d a a n d16 - k d am y c o b a c t e r i a la n t i g e n si nb o n ea n dj o i n tt u b e r c u l o s i s i n tjt u b e r cl u n g d i s 2 0 0 2 ；6 ：10 2 3 10 2 8 6s e n o lg ，e r e ro f ，y a l c i ny a ，c o s k u nmh u m o r a li m m u n er e s p o n s ea g a i n s t3 8 - k d aa n d 1 6 - k d am y c o b a c t e r i a la n t i g e n si nt u b e r c u l o s i s e u rr e s p i rj 2 0 0 7 ；2 9 ( 1 ) ：14 3 14 8 7 c h i a n gi h ，s u oj ，b a ik j ，e ta 1 s e r o d i a g n o s i so ft u b e r c u l o s i s as t u d yc o m p a r i n gt h r e es p e c i f i c m y c o b a c t e r i a la n t i g e n s a mjr e s p i rc r i tc a r em e d 19 9 7 ；15 6 ：9 0 6 - 911 8o k u d aym a e k u r a 心h i r o t a n ia ，e ta 1 r a p i ds e r o d i a g n o s i so fa c t i v e p u l m o n a r y m y c o b a c t e d u mt u b e r c u l o s i sb ya n a l y s i so fr e s u l t sf r o mm u l t i p l ea n t i g e n s p e c i f i ct e s t s jc l i n m i c r o b i o l2 0 0 4 ；4 2 ：1 1 3 6 - 11 4 1 9中华医学会编著、临床诊疗指南( 结核病分册) 。北京：人民卫生出版社，2 0 0 5 ： l o 中国防痨协会基础专业委员会编著、结核病诊断实验室检验规程。中国教育文化出版社， 2 0 0