（分析化学专业论文）cdc25b小分子抑制剂的发现及评价.pdf

摘要 c d c 2 5 蛋白酪氨酸酯酶( c e l ld i v i s i o nc y c l e2 5 ，c d c 2 5 ) 属于高保守的双位 点磷酸酯酶，它通过对c d k ( c y c l i n d e p e n d e n tk i n a s e ) 复合物某些磷酸化位点去 磷酸化来活化它，促使细胞过渡到下一个周期，从而参与了细胞周期调控，同时 它是损伤修复通路中的重要组成部分，对于遗传信息的稳定起着重要作用。在许 多癌症的组织中，c d c 2 5 是异常高表达的，而且有一些证据表明，这种高表达可 能对于肿瘤的发展起着促进作用。而如果下调c d c 2 5 的表达的话，会引起细胞周 期阻滞，从而抑制细胞增殖。所以c d c 2 5 现在已经被当作了一个潜在的药物作用 靶点。 我们从大肠杆菌系统中成功表达并纯化得到重组的c d c 2 5 b ，并建了 c d c 2 5 b 高通量筛选模型，对国家新药筛选中心的4 8 0 0 0 个化合物进行了筛选， 发现了两个新颖的c d c 2 5 b 的抑制剂- - l g h 0 0 0 3 1 和l g h 0 0 0 4 5 。其中l g h 0 0 0 3 1 是不可逆的抑制剂，l g h 0 0 0 4 5 是有较好选择性的、可逆的、混合型的抑制剂。 在细胞水平对它们进行评价发现，它们能抑制细胞增殖，引起细胞的g 2 m 期阻 滞，同时抑制了c d k l 的1 5 位酪氨酸的去磷酸化。对l g h 0 0 0 3 1 的作用机制进行 了研究，发现了l g h 0 0 0 3 1 在体外是通过与d i t 反应产生r o s 带来的这种抑制作 用，在细胞中l g h 0 0 0 3 1 能够诱导产生r o s ，r o s 的清除剂一谷胱甘肽的前体n a c 能够削弱l g h 0 0 0 3 1 在细胞中的作用。推测l g h 0 0 0 3 1 在细胞中带来的c d c 2 5 b 的 抑制是通过与细胞中的二氢硫辛酸反应产生r o s 而引起的。 这两个高活性的新型小分子c d c 2 5 b 抑制剂的发现、相关抑制性质的研究以 及在细胞水平的生物活性评价，为其进一步结构优化和药理学、药效学研究打下 坚实的基础，这对于进一步理解选择性所依存的分子机制及寻找高效特异的p t p s 抑制剂有着重要的意义，同时也为更加广泛地研究v h r 的生理及病理功能提供了 有力的工具。 另外工作是有关烟酸保护胰岛p 细胞的研究，发现烟酸能够保护链脲佐菌素 ( s t z ) 诱导的糖尿病大鼠的p 细胞，这个作用可能有烟酸的抗氧化应激作用有 关。 关键词：c d c 2 5 ，肿瘤，高通量筛选，抑制剂，周期阻滞，c d k l ，r o s 。 d i s c o v e r ya n dc h a r a c t e r i z a t i o no fn o v e lc d c 2 5 bi n h i b i t o r s c e l ld i v i s i o nc y c l e2 5 ( c d c 2 5 ) p h o s p h a t a s e sr e g u l a t ek e yt r a n s i t i o n s b e t w e e nc e l lc y c l ep h a s e sd u r i n gn o r m a lc e l ld i v i s i o nb yd e p h o s p h o r y l a t i n ga n d a c t i v a t i n gt h ec d k ( c y c l i n - d e p e n d e n tk i n a s e ) c o m p l e x e s a n di nt h ee v e n to f d n ad a m a g et h e ya r et h et a r g e t so ft h ec h e c k p o i n tm a c h i n e r yt h a te n s u r e s g e n e t i cs t a b i l i t y s i n c et h e n ，c d c 2 5w a sr e p o r t e dt ob eo v e r e x p r e s s e di np r i m a r y t i s s u es a m p l e sf r o mv a r i o u sh u m a nc a n c e r s s o m ee v i d e n c e ss u g g e s t e dt h a tt h e o v e r e x p r e s s i o no fc d c 2 5m a yc o n t r i b u t et oc a n c e la n dd o w n r e g u l a t i o no f c d c 2 5c a u s e dc e l lc y c l ea r r e s ta n di n h i b i t i o no fc e l lp r o l i f e r a t i o n t h e s ei nt u r n m a k et h e mi d e a lt a r g e t sf o ran e wa n t i c a n c e rt h e r a p y w ep u r i f i e dr e c o m b i n a n tc d c 2 5 b e x p r e s s e d i ne s c h e r i c h i ac o l i h i g h t h r o u g hs c r e e n i n g ( h t s ) a s s a yw a ss e tu pt of i n do u tn o v e li n h i b i t o r so f c d c 2 5 bf r o m4 8 0 0 0p u r ec h e m i c a l sc o l l e c t e df r o md i f f e r e n ts o u r c e sw i t hw i d e s t r u c t u r a ld i v e r s i t yo fn a t i o n a lc e n t e rf o rd r u gs c r e e n i n g l g h 0 0 0 3 1a n d l g h 0 0 0 4 5w e r ed i s c o v e r e da n dc h a r a c t e r i z e d l g h 0 0 0 3 1w a st h o u g h tt ob ea n i r r e v e r s i b l ei n h i b i t o r , a n dl g h 0 0 0 4 5w a sar e v e r s i b l ea n dm i x e d - t y p ei n h i b i t o r o fc d c 2 5w i t hr e l a t i v eg o o ds e l e c t i o n t h es t u d i e si nc e l l u l a rl e v e l ss h o w e dt h a t b o t ho ft h ei n h i b i t o r sc a u s e dag 2 mp h a s ea r r e s tw h i c hi nt u r nr e s u l t e di nt h e i n h i b i t i o no fc e l lp r o l i f e r a t o n , a n di n h i b i t e dd e p h o s p h o r y l a t i o no f t y r l 5o fc d k l t h em e c h a n i s mo ft h ei n h i b i t i o no fl g h 0 0 0 3 1a g a i n s tc d c 2 5 bw a sa l s os t u d i e d h e r e t h er e s u l ts h o w e dt h a ti nv i t r ot h ei n h i b i t i o nw a sc a u s e db yr o sw h i c hw a s g e n e r a t e db yt h er e a c t i o no fl g h 0 0 0 3 1a n dd i q i nc u l t u r e dc e l l s ，l g h 0 0 0 3 1 i n c r e a s e dt h eg e n e r a t i o no fr o s ，a n dn a c , a p r e c u r s o ro fg l u t a t h i o n e ，i m p a i r e d t h ea c t i o no fl g h 0 0 0 3 1i nc e l l s t h eg e n e r a t i o no fr o sb yt h er e a c t i o no f l g h 0 0 0 31a n dd i h y d r o l i p o i ca c i dw a sc o n j e c t u r e d ，w h i c hm a yb et h er e a s o nt h a t l g h 0 0 0 31i n h i b i t e dc d c 2 5 bi nt h ea b s e n c eo fd t ri nc u l t u r e dc e l l s t h ed i s c o v e r ya n dc h a r a c t e r i z a t i o no ft h en o v e l p o t e n t a n ds e l e c t i v e i n h i b i t o ra sw e l la si t se v a l u a t i o ni nc e l l u l a rl e v e l sw i l lb eg r o u n dw o r kf o rf u r t h e r s t r u c t u r em o d i f i c a t i o n ，c e l l - b a s e da n da n i m a l b a s e dp h a r m a c o l o g i c a la n de f f i c a c y s t u d i e si nt h ef u t u r e i tm i g h tb ee x t r e m e l yp o w e r f u lt o o l st oe x p l o i tt h e p h y s i o l o g i c a la n dp a t h o l o g i c a lf u n c t i o no fc d c 2 5 b a n o t h e rp a r to fw o r ki st h es t u d yo nt h ep r o t e c t i o no fi s l e t s1 3c e l l sb y n i c o t i n i ca c i d n i c o t i n i ca c i dc o u l dp r o t e c ti s l e tbc e l l so fs t r e p t o z o c i ni n d u c e d d i a b e t i cr a t s t h i sp r o t e c t i o nm a yb er e l a t i v et ot h ea n t i o x i d a t i v es t r e s so f n i c o t i n i ca c i d k e yw o r d s ：c d c 2 5 ，t u r n o u tc e l l s ，h i g h t h r o u g hs c r e e n , i n h i b i t o r , c e l lc y c l ea r r e s t , c d k l r o s 原创性声明 本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立 进行研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发 表的成果、数据、观点等，均己明确注明出处。除文中已经注明 引用的内容外，不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研 成果。对本文的研究成果做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以 明确方式标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名： z 圣丛日期：竺! 篓：墨：兰7 关于学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归 属兰州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定， 同意学校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版， 允许论文被查阅和借阅；本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用任何复制手段保存和 汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该论文直接相 关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为兰州大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：z 岔丝喜师签名：趔日期： 兰州大学硕士学位论文 第一章前言 1 1 引言 细胞内蛋白质酪氨酸磷酸化是主要的蛋白质翻译后修饰方式之一，也是细胞 内信号传导的调控方式之一。酪氨酸磷酸化是可逆的，由蛋白质酪氨酸激酶 ( p r o t e i nt y r o s i n ek i n a s e s ，p t k s ) 和蛋白质酪氨酸磷酸酯酶( p r o t e i n t y r o s i n e p h o s p h a t a s e s ，v r p s ) 共同调控，前者催化酪氨酸残基磷酸化，后者使其去磷酸化。 蛋白质酪氨酸磷酸化及去磷酸化参与调控细胞生长、分化、代谢、细胞周期、细 胞间通讯、基因转录、离子通道活性及免疫反应等一系列细胞活动。酪氨酸磷酸 化异常会引发多种人类疾病，包括癌症和糖尿病 1 。自从第一个蛋白酪氨酸磷 酸酯酶p t p l b ( p r o t e i nt y r o s i n ep h o s p h a t a s e1 b ) 被克隆表达纯化以来 2 ，p t p 家族的众多成员被发现，特别是自从发现p t p l b 与糖尿病和肥胖之间的密切相 关 3 ，p t p s 激发人们极大的研究热情，成为炙手可热的药物靶点和治疗靶点， 并且近年来不断有激动人心的发现。 1 2 盯p 家族 通过人类基因组同源序列比对，目前发现1 0 7 个人类p 1 r p 家族成员【4 】。在 进化过程中m 家族的催化域有着较高的保守性，其特点是在催化活性域都含 有活性位点序列( h v ) c ( x ) 5 r ( s t ) ( x 表示任意氨基酸残基) ，也被称为p t p 环( s i g n a t u r em o t i f ) 。p t p 家族根据其催化区的氨基酸序列可以分为四个亚家族 【4 j ：1 、一类基于半胱氨酸的蛋白酪氨酸磷酸酯酶( c l a s sic y s b a s e dp t p s ) ，2 、 二类基于半胱氨酸的蛋白酪氨酸磷酸酯酶( c l a s si ic y s b a s e dp t p s ) ，3 、三类基 于半胱氨酸的蛋白酪氨酸磷酸酯酶( c l a s si i ic y s b a s e dp t p s ) ，4 、基于天冬氨酸 的蛋白酪酸磷酸酯酶( a s p - b a s e ap t p s ) 。 一类基于半胱氨酸的蛋白酪氨酸磷酸酯酶亚家族包括9 9 个p t p 成员，根据其 结构和同源性分为：经典的蛋白酪氨酸磷酸酯酶( c l a s s i cp t p s ) 【5 】，双特异蛋 白酪氨酸磷酸酯酶( d u a ls p e c i f i c i t yp t p s ，d s p s ) 及其它。经典的蛋白酪氨酸磷 酸酯酶有3 8 个成员，只能特异性的水解酪氨酸残基上的磷酸基团，如p t p l b 、l a p , ( 1 e u k o c y t ea n t i g e nr e l a t e dt y r o s i n cp h o s p h a t a s e , l a r ) 、p t p q ( p r o t e i nt y r o s i n e p h a s p h a t a s eq ) 、s h p l ( s h 一2d o m a i nc o n t a i n i n gt y r o s i n ep h o s p h a s e1 ) 和c d 4 5 ( 1 e u k o c y t ec o n l n l o l la n t i g e n ) ：经典的蛋白酪氨酸磷酸酯酶按其结构又可以分为： 兰州大学硕士学位论文 a 、跨膜受体型( 2 1 个) ，如l a r 、p 1 甲泖c d 4 5 ；b 、胞内非受体型( 1 7 个) ，如 p t p l b 、s h p l 。前者含有一个胞外配体结合区、一个跨膜区和一个或两个p t p 胞浆区；后者包括一个单独的催化区和包括s h 2 ( s r ch o m o l o g y2 ) 在内的多种 氨基端或羧基端延伸区，该区可能有靶向和调控功能。双特异蛋白酪氨酸磷酸酯 酶不仅能水解酪氨酸残基上的磷酸基团，还能水解丝氨酸和苏氨酸残基上的磷酸 基团，如v h r ( h u m a nv a c c i n i ah 1 r e l a t e dp h o s p h a t a s e ) 和j s p l ( j n ks t i m u l a t e d p h o s p h a t a s e1 ) 等。基于半胱氨酸的蛋白酪氨酸磷酸酯酶与细菌坤酸还原酶结构 类似，目前仅包含a c p l 。基于半胱氨酸的蛋白酪氨酸磷酸酯酶可以水解酪氨酸 和苏氨酸残基上的磷酸基团，与细胞周期蛋白密切相关，包括a ) c 2 5 a 、c d c 2 5 b 和c d c 2 5 c 三个成员。因为其可以水解酪氨酸和苏氨酸残基上的磷酸基团，有时 也被归属为双特异蛋白酪氨酸磷酸酯酶。基于天冬氨酸的蛋白酪酸磷酸酯酶包括 e y a l ，e y a 2 ，e y a 3 ，e y a 4 0 迄今为止，很多p 1 曙的晶体结构( 大多数为蛋白催化区) 得以确定。虽然双 位点特异性磷酸酯酶与酪氨酸特异性磷酸酯酶在氨基酸序列和底物特异性上有 些差异，但他们的晶体结构都呈类似的折叠型。而且，一些重要的结构，如由特 征序列( h v ) c ( x ) s r ( s t ) 组成的活性部位和含酸的外部常见环状结构，在p 1 口中 高度保守，是p t p 发挥催化作用的重要结构基础。所有p t p 的催化机制基本上 相同，即利用活性部位的半胱氨酸作为亲核物质，以形成硫代磷酸共价酶中间产 物。作为p 1 m 特征结构的恒定组分，精氨酸残基具有结合底物及稳定状态转换 的作用。 p t p l b 的去磷酸催化作用机制在 w r p a s e s 家族的许多成员中具有代表性，现 以p t p l b 为代表做以介绍。整个催化过程包括两步。第一步是酶底物中间体的 形成。催化位点中的半胱氨酸的硫离子进攻底物上的磷离子，形成磷酸半胱氨 酸中间体。酶结构中质子化的酸即天冬氨酸协助酪氨酸磷酸释放；第二步是中间 体的水解以及酶的再生。被天冬氨酸激活的水分子进攻中间体，与磷酸的连接和 过渡态通过与精氨酸间形成的氢键加以稳定( f i g 1 ) p 1 限1 b 催化胰岛素受体以 及受体底物的去磷酸化，减弱了胰岛素信号的传导。 2 s t e p l 兰州大学硕十学位论文 “。， 。，。、式 蝥? 、+ 幕 s t 印2 。4 ：舟一、镯 广式o ，聊 气一二 沓鲧 、：多、磷 图1c a t a l y t i cm e c h a n i s mo fp r o t e i nt y r o s i n ep h o s p h a t a s e s ：t h es t r u c t u r a lm o d e lo fp t p1b c a t a l y t i cs i t ec o n j u g a t e dw i t hp h o s p h a o c r o s i n e n i t r o g e na t o m sa r eb l a c k ；o x y g e na t o m sa r ed a r k g r e y s l a b e l st h es u l p h u ra t o m so fc y s ；p t a b l e sp h o s p h o r u s 1 3c d c 2 5 蛋白酪氨酸酯酶 c d c 2 5 蛋白酪氨酸酯酶( c e l ld i v i s i o nc y c l e2 5 ，c d c 2 5 ) 属：f 高度保守的双 位点磷酸酯酶，它主要有以f 几个作用：1 参与细胞周期调控，通过去磷酸化 c d k 复合物某些磷酸化位点来激活它，促使细胞进入卜一个周期时相；2 在细胞 损伤修复通路中起重要作用。当细胞持续性的受到可能致使d n a 损伤的一些胁 迫时，如紫外线照射、氧自由基大量产牛等，通常会启动损伤修复机制，引起细 胞周期阻滞，从而修复损伤的d n a 或者促使细胞死亡：3 对遗传信息的稳定性 起着重要作用。可以想象，如果以j - f d 号通路存在某种缺陷时，细胞将继续分裂， 损伤的d n a 将被传递给子细胞，从而导致染色体突变。而c d c 2 5 正是这些信 号通路的重要组成部分，这让我们不难得出结论- - c d c 2 5 对维持遗传信息的稳 定性起着重要作用。正是由于c d c 2 5 对细胞周期的调控作用以及在癌细胞中的 异常表达，它已被作为一个热门的癌症治疗靶点f 6 1 。 1 3 1c d c 2 5 家族的组成 c d c 2 5 存在于植物以外的所以真核生物中 7 1 。在哺乳动物细胞中，有三种 异构体已经被证实：c d c 2 5 a 、c d c 2 5 b 、c d c 2 5 c 8 1 0 】。不同种属中，c d c 2 5 的催化域高度保守，根据翻译后剪剀的不同，c d c 2 5 a 1 1 至少存在2 种剪切异 构体，c d c 2 5 b 1 2 、1 3 1 年nc d c 2 5 c i l 、1 4 】分别存在5 种不同的剪切异构体。 c d c 2 5 的非催化域主要调控c d c 2 5 的细胞内定位和酶的变构，但对于不同异构 体的特定功能还4 i 是很清楚。一j 能这l 卜好解释了，在低等的真核生物如酵母中只 兰州大学硕士学位论文 存在一种形式的c d c 2 5 ，在高等的哺乳动物细胞中存在多种c d c 2 5 的异构体。 1 3 2c d c 2 5 家族蛋白在细胞周期中的作用 c d k 蛋白复合体是细胞周期关键的调节者。在正常情况下，w e e l 和m y t l 可以磷酸化c d k 的a t p 结合区的两个氨基酸残基( 在c d k l 中是t h r l 4 和 t y r l 5 ) ，从而维持c d k 的无活性状态【1 5 】。当细胞要进入到下一个周期，需要 c d c 2 5 对c d k 的这两个氨基酸残基去磷酸化，从而激活c d k 复合物。c d k 复 合物再进一步被c d k 激酶磷酸化( c d k l 中是t h r l 6 1 ) 并活化，但是这个位点 的磷酸化不受细胞信号的调控 1 6 1 。 c d k - c y c l i n 复合物是目前己知的c d c 2 5 唯一的底物。在哺乳动物细胞中， c d c 2 5 通过磷酸化c d k 而在周期的过渡中起重要的调节作用。c d c 2 5 b 主要在 中心体中磷酸化c d k l c y c l i n b 复合物，从而起着起始有丝分裂的作用，同时也 有文章证明它在s 期调控中也起着重要作用。而c d c 2 5 a 在g 1 到s 期的过渡中， 活化c d k l - c y d i ne 和c d k 2 c y c l i n a 复合物，从而促进细胞从g 1 期过渡到s 期，另外，它也能够活化c d k l - c y c l i n b 复合物，促进细胞从g 2 期进入到m 期。 c d c 2 5 c 的作用则与c d c 2 5 b 相同。总而言之，c d c 2 5 在周期中的g 1 s 期和 g 2 m 期的过渡以及细胞分裂中起着重要的调节作用【6 】。 从上面的描述不难发现c d c 2 5 a 、c d c 2 5 b 、c d c 2 5 c 之间存在功能冗余的 现象。有实验表明，将c d c 2 5 b 、c d c 2 5 c 同时敲除的小鼠能够正常生长发育1 1 7 ， 这证明c d c 2 5 a 能起到所有c d c 2 5 的功能( 但是到目前为止还没有c d c 2 5 a 敲 除小鼠的报道) 。但是另外有人发现，c d c 2 5 b 是雌性小鼠生殖细胞减数分裂过 程所必须的，c d c 2 5 b 敲除的雌性小鼠会丧失生育能力【1 8 】。这或许表明c d c 2 5 的各个异构体之间尽管存在功能上的冗余，但是各个异构体之间还是存在各自特 异的功能。 1 3 3c d c 2 5 家族蛋白的活性调节 在细胞中c d c 2 5 本身的活性也受到多种机制的调节，如磷酸化水平、细胞 内蛋白丰度、细胞定位调节等，从而保证了c d c 2 5 在细胞内的精确调控以及细 胞周期正常有序的进行。 磷酸化水平： c d c 2 5 活性的调节一般是通过一些激酶( 如c d k - c y c l i n 复 合物) 磷酸化n 端的调符区来实现的。c d c 2 5 b 首先在中心体和细胞之中被活 4 兰州大学硕士学位论文 化，在中心体中，a u r o r aa 就能够磷酸化c d c 2 5 b3 5 3 位的丝氨酸，从而活化 c d k l c y d i n b 1 9 ，活化的c d k l - c y c l i n b 进入细胞核，在极体样激酶1 ( p o l o - l i k e k i n a s e1 ，p l k l ) 的协助下进一步活化c d c 2 5 c ，从而形成自身正反馈环，启动 有丝分裂过程【2 0 】。同时实验表明，活化的c d k - c y c l i n b 能够磷酸化c d c 2 5 b 的 1 4 6 位丝氨酸，而且该位点的磷酸化对于c d c 2 5 b 启动有丝分裂过程是必须的 【2 1 。 细胞内蛋白丰度：c d c 2 5 a 和c d c 2 5 b 的表达水平随细胞周期变化而变化 【2 2 。c d c 2 5 b 在s 期的中期开始表达，在g 2 期向m 期转变时达到峰值，随后 被降解 2 2 1 ；降解过程依赖于c d k - c y c l i n a 对c d c 2 5 b 的磷酸化，磷酸化后的 c d c 2 5 b 会与s k p l c u l l f b o x ( s c f ) 弧c p ( s c f 泛素连接酶复合物的一部分) 结合，从而被蛋白酶降解 2 3 、2 4 。c d k l c y c l i n bo - i 以阻断这个降解过程。c d c 2 5 a 在g 1 期开始表达，到m 期被c d k l c y c l i n b 磷酸化而稳定，到m 期后期，被 a p c c ( a n a p h a s e - p r o m o t i n gc o m p l e x c y c l o s o m e ) 依赖的泛素化途径降解。在s 和g 2 期，c d c 2 5 a 能够被s k p l c u l l f b o x 捕获( s c f 豫口，s c f 泛素连接 酶复合物的一部分) ，从而被蛋白酶降解。这个过程也需要c h k l 和c h k 2 以及 一些未知的激酶先磷酸化c d c 2 5 a 上的丝氨酸簇 2 5 1 。 细胞定位调节：c d c 2 5 还能够被磷酸化或者与一些伴随蛋白结合，来影响 c d c 2 5 的定位，从而达到对c d c 2 5 的调控。如：p l k l 和p l k 3 被报道能够磷 酸化c d c 2 5 c 的核输出信号肽中的丝氨酸残基，从而促进其核输出1 2 5 。在g 1 s 期过渡中c d c = 2 5 a 和c d k 2 - c y c l i n e 之间也存在类似的机制。在正常的细胞周期 或d n a 被损伤后，c h k l 和c t a k l 激酶可以磷酸c d c 2 5 c 中的2 1 6 位的丝氨 酸残基，产生一个1 4 3 3 家族蛋白的结合位点，致使c d c 2 5 c 滞留在细胞质中， 从而引起细胞周期阻滞【2 6 】。相似的是，m e l k 和c h k l 在中心体中也能够磷酸 化c d c 2 5 b 的3 0 9 位丝氨酸残基，致使其滞留在细胞质中从而抑制了细胞进入 m 期 2 6 、2 7 。c h k l 还能够磷酸化c d c 2 5 a 的1 7 8 位的丝氨酸残基和5 0 7 位的 苏氨酸残基，促使其与1 4 3 3 蛋白结合，抑制1 4 3 - 3 蛋白与c d k l c y c l i n b 的结 合 2 6 1 。 c d c 2 5 在d n a 损伤时的调节：在d n a 损伤或环境胁迫时，多条损伤修复 信号通路会被激活，导致g 1 s 、g 2 m 或者s 期阻滞。不管是什么原因，周期阻 5 兰州大学硕士学位论文 滞都是c d k - c y c l i n 复合物被抑制的结果。d n a 不完全的复制或者损伤，如电子 辐射或紫外线带来的损伤，会通过a t m 激酶或者a t r 激酶激活d n a 损伤修复 通路。a t m 和a t r 能够磷酸化并激活c h k l 和c h k 2 ，c h k l 和c h k 2 能够 抑制或者降解c d c 2 5 。a t m 通路主要感应的是d n a 双链的损伤，而a t r 通路 主要针对的单链d n a 损伤，当然它们之间会存在一些功能上的冗余或者协同 【2 8 。 化学物质、紫外线或者电子辐射等引起的d n a 损伤会通过c h k l 途径降解 c d c 2 5 a ，从而导致s 期或者g 2 期阻滞。s o r e n s e n 等人【2 9 】证明当细胞受到电 子辐射时，c d c 2 5 a 会被c h k l 和c h k 2 磷酸化，s c f1 r 凹会进一步导致 c d c 2 5 a 构象发生变化，促进其降解【3 0 1 。在d n a 损伤或a t m 或a t r 通路被 激活时，c d c 2 5 c 也能够被c h k l 和c h k 2 激酶磷酸化，磷酸化的c d c 2 5 c 能 够与1 4 3 3 蛋白结合，从而被滞留在细胞质中，而不能活化c d k l c y c l i n b 复合 物。c h k l 也能够增加w e e l 的活性来抑制c d c 2 5 ，进一步的抑制c d k - c y c l i n 复合物。在紫外辐射或渗透压改变下，p 3 8 信号通路激活导致的g 2 m 期阻滞， 也是通过c d c 2 5 介导的 2 6 1 。体外或体内实验证明，在紫外线导致的d n a 损伤 后，p 3 8 的下游m a p k a p k 2 能够磷酸化c d c 2 5 b 或者c d c 2 5 c 。在c i s p l a t i n 处 理后，也会通过这条通路导致c d c 2 5 a 降解。在p 5 3 缺失的细胞中，这条通路 被认为是紫外损伤后的主要的损伤修复通路。d n a 损伤后p 3 8 m a p k a p k 2 通 路被直接激活，这条通路也被认为是对化疗诱导的p 5 3 缺失的癌细胞死亡是必需 的【3 1 】。d n a 损伤修复后c d c 2 5 b ( 不是c d c 2 5 a 或c ) 和p l k l 会解除损伤 诱导的g 2 期阻滞。紫外、电子辐射或基因毒剂导致d n a 损伤后c d c 2 5 b 表达 水平会上升，增加c d c 2 5 b 的表达水平也会解除基因毒剂所带来的g 2 m 期阻滞 【3 2 1 。 因此，不管在正常的细胞周期过程中还是在损伤修复通路被活化时，c d c 2 5 的磷酸化是被高度调控的，以保证c d k - c y c l i n 正确的去磷酸化，从而保证细胞 周期的正确进行和遗传密码的稳定。这些通路的失控会导致基因突变。 1 3 4c d c 2 5 与癌症 上面讲到，c d c 2 5 必须被严格的调控，以保证c d k c y c l i n 的活性在时空上 的精确性，另外，在应对损伤修复通路被激活时，c d c 2 5 必须维持无活性状态 6 兰州大学硕士学位论文 来阻断细胞周期进行，以利于d n a 的修复或者导致细胞凋亡。这些过程如果失 控，会导致遗传的不稳定。正因如此，在多种癌症中发现c d c 2 5 是高表达的， 同时它也伴随了疾病的恶化和不可预测性。 c d c 2 5 ：癌症中永恒的话题。第一个将c d c 2 5 表达与癌症联系起来的是 n a g a t a 等人。他们发现在癌细胞株和s v 4 0 转化了的纤维原细胞中，c d c 2 5 b 是 高表达的( 与c d c 2 5 c 和p a c t i n 比较) 1 1 0 。自从以后，在许多癌症中发现c d c 2 5 ( 特别是c d c 2 5 a 和c d c 2 5 b ) 高表达。 一些关于c d c 2 5 与癌症之间关系的实验结果表明，c d c 2 5 表达水平与一些 特殊的临床特征存在一定联系，如：高级别的肿瘤、低的无病生存率。然而在一 些组织中c d c 2 5 的表达量不足以被现有的常规方法检测出来，这也是在研究 c d c 2 5 与癌症之间关系的一大技术限制。所以一些其他杂乱的技术被应用于检 测c d c 2 5 的r n a 和蛋白表达水平，然而这却限制了数据之间的可比性。一个 限制就是在研究中发现r n a 水平和蛋白水平之间的缺乏相关性，在同一病人对 这两者同时评价时表现最明显。例如比如在神经胶质母细胞瘤中c d c 2 5 的 m r n a 水平高于正常水平8 0 ，而蛋白水平仅仅提高了5 3 3 1 。这就导致了对 于c d c 2 5 高表达是否是癌症的一个指标的不同结论。例如有两篇文献报道了在 乳腺癌中c d c 2 5 b 的m r n a 和蛋白表达水平分别比正常的高3 2 和5 7 ，前者 认为它的高表达与高等级的癌症相关，而后者认为它的高表达与低等级的癌症相 关。类似的情况在c d c 2 5 a 上也有，它被报道在转录水平和蛋白表达水平上分 别高于正常5 2 和7 0 ，而其转录水平上的增加被认为伴随低可预性，而蛋白 水平上的提高却无法与临床病理特征联系起来。另外，人们不能确定c d c 2 5 表 达量增加就一定会导致c d k - c y c l i n 的活性增加，这也限制了我们对各文章中的 数据进行比较。因此，尽管我们知道在乳腺癌中c d c 2 5 a 和c d c 2 5 b 高表达， 但是一些来自不同文献中的矛盾的结论使得它对癌症的意义仍然不明确，其他癌 症中也是如此f 6 1 。 不同癌症中，一般表现为特定的c d c 2 5 异构体的表达，在相同的癌症中， 不同异构体的高表达是通过相互独立信号通路导致的。例如，c d c 2 5 a 和 c d c 2 5 b 在结肠癌中都高表达，而只有c d c 2 5 b 的高表达可以作为结肠癌的预 兆。事实上，c d c 2 5 b 比c d c 2 5 a 更多的被报道与高度的或者晚期癌症同时出 7 兰州大学硕士学位论文 现，而c d c 2 5 b 和c d c 2 5 a 都被报道与低的无病存活率伴随出现【6 】。 一些实验结果表明各个异构体的高表达是通过不同的信号通路引起的，例 如，只有c d c 2 5 a 的高表达与p 2 7 相关，非霍奇金淋巴瘤和乳腺癌的高侵略性 以及低可预性一般伴随着c d c 2 5 a 的m r n a 增加和p 2 7m r n a 和蛋白水平上的 减少。类似的，只有c d c 2 5 b 的高表达与食道癌对放射治疗敏感度增加相随。 c d c 2 5 c 的高表达很少被报道，它在癌症中的高表达率比c d c 2 5 a 和c d c 2 5 b 少。 尽管在m r n a 和蛋白水平上的一些矛盾的报道反映了我们在研究中的一些 问题，但是随着一些检测技术和工具的发展，使得对c d c 2 5 表达检测更加接近 于c d c 2 5 基因的真实情况，结合现在的对于c d c 2 5 在周期中作用的了解，将会 给我们带来针对不同癌症的检测或治疗的工具。 什么导致了c d c 2 5 的高表达? c d c 2 5 在癌症发生过程中失调的原因还不 是很清楚。没有证据证明重组或者是突变导致了c d c 2 5 的高表达。另外，在转 录水平和蛋白水平上的高表达不存在必然的联系，这可能暗示c d c 2 5 在从转录、 翻译甚至是翻译后的过程中任何环节上都有可能有机会出现失调。 在用无血清饥饿的纤维原细胞中，c d c 2 5 a 和b 是m y c 原癌基因的直接转 录靶点，m y c 活化会导致c d c 2 5 a 和b 的m r n a 和蛋白表达的增加【3 4 1 。 c d c 2 5 a 和b 含有m y c m a x 结合位点，从而被认为能与m y c 共同作用在细 胞周期上 3 4 1 。随后有文献证明，在培养的乳腺癌细胞中，c d c 2 5 a 和m y c 表 达增加【3 5 】，而在非霍奇金淋巴瘤细1 1 1 1 3 6 1 和肺癌细胞 3 7 q ac d c 2 5 b 和m y c 的 m r n a 增加，在神经胶质母细胞瘤细胞中c d c 2 5 b 和n m y c 的m r n a 增! 1 1 3 8 j 。 c d c 2 5 a 也被报道在翻译水平上受e 2 f r b l 通路的调节 3 9 1 。 在细胞被转染后，c d c 2 5 的转录水平也增加了。纤维原细胞在转染s v 4 0 、 e 6 或e 7 乳突淋瘤病毒转染蛋白后，c d c 2 5 bm r n a 明显提高，从而导致染色体 失常，细胞转化【1 0 】。类似的，在纤维原细胞被e i a 线病毒转染后c d c 2 5 a m r n a 表达量和活性增加。这些数据表明c d c 2 5 是一些转录因子和转染过程中 转染病毒的靶点【4 0 】。 在c d c 2 5 a 高表达的乳腺癌细胞中，c d c 2 5 a 的半衰期比在那些低表达的细 胞中长。因此c d c 2 5 a 的稳定性增加被认为是在乳腺癌中c d c 2 5 a 蛋白表达量和 8 兰州大学硕士学位论文 活性增加的原因，而非转录水平增加所带来 4 1 1 。a t r 或者其下游抑癌基因 m i c r o c e p h a l i n 突变时，不管在正常情况下还是在紫外照射下，c d c 2 5 a 的稳定性 都增加了1 4 2 。蛋白酶信号通路对c d c 2 5 a 和b 蛋白稳定性的调节也是癌症中 c d c 2 5 增加的原因。有报道在前列腺癌、肺癌、胃癌中，t r c p 基因是突变的， 这直接导致了它的表达下降【4 3 4 5 。在肺癌中用r n a i 的方法抑制t r c p 的表达 会提高c d c 2 5 a 的稳定性1 4 4 ，这些都只是间接的证据，还需要一些直接的证据。 同样，c h k 激酶( c l m 2 比c h k l 更频繁) 被报道在一些癌症中突变或表达下调。 如乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌以及子宫癌【6 】。同样这样缺乏直接的证据，也 可能有一些其他未知的机制引起c d c 2 5 高表达。 c d c 2 5 高表达对于肿瘤的贡献有证据显示c d c 2 5 高表达对于癌症产生有 一些贡献，但是它并足以导致癌症产生。在体外，在小鼠的胚胎纤维原细胞中， c d c 2 5 a 或2 5 b 与h 砒峪共表达或是同时下调r b l ，这种处理的细胞可以在体 内形成高等级肿瘤1 4 6 1 。类似的，乳腺组织中转入c d c 2 5 a 会导致乳腺小泡增生， 但不会自发地产生肿瘤，当c d c 2 5 a 在m m v h a r a s 或者m m t v - c n e u 转基因 小鼠中高表达时，会明显增加肿瘤生长速度，并导致错误的细胞协同增殖以及多 种染色体异常。在小鼠乳腺组织中过表达c d c 2 5 b 会导致乳腺内皮细胞的增殖 速度增加和乳腺肥大【4 7 】，如果再加入致癌d m b a 处理，则会诱导肿瘤z - - l ：长 4 8 。 上面说到，在各个周期转换位点，7 必须在时间和空间上精密的调控。可以想 象，如果c d c 2 5 a 或者是2 5 b 过表达，那它一定会导致酶活性增加以及 c d k - e y c l i n 复合物活性增加，从而细胞过早的通过周期转换位点，引起染色体 异常。一些实验证据证明了这一观点，过表达c d c 2 5 b 会导致细胞快速地从s 期或g 2 期进入到分裂期，从而导致d n a 复制不完全【4 9 】。过表达c d c 2 5 a 会 导致细胞加速进入s 期或者导致分裂出现问题【5 0 】。相反地，当