（林木遗传育种专业论文）纤维素酶基因的克隆与遗传转化以及creloxp系统的研究.pdf

摘要 利用纤维素酶使大量纤维素资源转变成人类生活所需要的物质，对于解决 世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义。另外，生物 安全问题随着现代生物技术，特别是重组d n a 技术和基因工程的发展而逐渐成 为全球关注的话题。利用c r e l o x p 系统，删除标记基因( 抗除草剂基因) ，对 于生物安全问题具有重要意义。本论文的具体工作如下： l 、利用r t p c r 方法，从绿色木霉菌里克隆出了内切葡聚糖苷酶基因( e g i i ) 和外切葡聚糖苷酶基因( c b hi i ) ，序列全长分别为1 2 5 7 b p 和1 5 8 9 b p 。其蛋 白序列长度为4 1 8 和4 7 1 氨基酸。外切葡聚糖酶基因( c b hi i ) 具有三个内 含子和四个外显子，而内切葡聚糖酶基因( e g ) 没有发现内含子。 2 、通过在e g l l 基因3 端添加内质网滞留信号( k d e l 序列) ，构建了p 3 3 0 0 - 3 5 s - e g i i t n o s 载体，并将其转入烟草内，经p c r 鉴定获得7 株转基因植株。 3 、利用c r e l o x p 系统同雄性不育基因构建表达载体，删除标记基因( 抗除草 剂基因) ，并将植物表达载体p 3 3 0 0c r e l o x - o s 9 6 b - b a r n a s e - t n o s 转入到剪 股颖内，经p c r 鉴定获得6 株转基因植株。 关键词：内切葡聚糖酶基因( e gi i ) ；外切葡聚糖酶基因( c b hi i ) ；雄性不育； 内质网滞留信号；绒毡层特异性启动子；c r e l o x p 重组系统 c e l l u l a s eg e n ec l o n e ，p l a n tt r a n s f o r m a t i o na n dt h er e s e a r c ho n c r e l o x ps y s t e m a b s t r a e t al a r g en u m b e ro fc e l l u l o s eb e c o m ee s s e n t i a li nt h el i v e so fh u m a nb e i n g 、航廿lt h e u s eo fc e l l u l o s ee m z y m e s i th a sg r e a ti m p o r t a n c et os o l v i n gt h e - w o r l d se n e r g y c r i s i s ，f o o ds h o r t a g e sa n de n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n , e t e i na d d i t i o n , b i o s e c u r i t y i s s u e sh a v eg r a d u a l l yb e c o m eat o p i co fg l o b a lc o n c e r nw i t ht h ed e v e l o p m e n to f m o d e mb i o t e c h n o l o g y , e s p e c i a l l yr e c o m b i n a n td n a t e c h n o l o g ya n dt h eg e n e t i c e n g i n e e r i n g d e l e t i n gt h em a r k e rg e n e ( h e r b i c i d e - r e s i s t a n tg e n e ) u s i n gc r e l o x p s y s t e mi sv i t a lt ob i o - s e c u r i t yi s s u e s i nt h i sp a p e r , t h es p e c i f i cw o r ka sf o l l o w s ： 1 u s i n gr t - p c rm e t h o d ，e n d o - g l u c a n a s eg e n ef e gi i ) a n de x o g l u c a n a s eg e n e ( c b hi i ) h a v eb e e nc l o n e df r o mt h eg r e e nt r i c h o d c r m a e x og l u c a n a s eg e n e ( c b hi i ) h a st h r e ei n t r o n sa n df o u re x o n s ，w h i l et h ee n d o g l u c a n a s eg e n el e gi i ) n oi n t r o n 2 t h r o u g ha d d i n ge n d o p l a s m i cr e t i c u l u ms t r a n d e ds i g n a li ne gi ig e n e ，a p 3 3 0 0 3 5 s e gi i t n o sv e c t o ri sb u i l ta n dt h e nt r a n s f e r r e dt ot o b a c c o 7 t r a n s g e n i cp l a n t sh a v eb e e ni d e n t i f i e db yp c r 3 u s i n gt h ec r e l o x ps y s t e ma n dt h em a l es t e r i l i t yg e n et ob u i l de x p r e s s i o nv e c t o r s ， d e l e t et h em a r k e rg e n e ( h e r b i c i d e r e s i s t a n tg e n e ) a n dt r a n s f e rp l a n te x p r e s s i o n v e c t o rp 3 3 0 0c r e l o x - o s 酌b - b a r n a s e - t n o si n t ob e n tg r a s s 6t r a n s g e n i cp l a n t s p a s st h o u g hp c r i d e n t i f i c a t i o n k e yw o r d s ：e n d o - g l u c a n a s eg e n e ( e g ) ： s t e r i l i t y ；e n d o p l a s m i c r e t i c u l u mr e 招n h o n c r e l o x pr e c o m b i n a t i o ns y s t e m ； e x o - g l u c a n a s eg e n e ( c b hf f ) ；e m a l e s i g n a l ；t a p e t a l - s p e c i f i cp r o m o t e r ， d ir e t t e d b y ：p r o f o iz h o n gl n g a p p i ic a n tf o rm a s t e rd e g r e e ：g e xig e t u ( t r e e g g e n e t i c sa n db r e e d i n g ) ( f o r e s t 巧c o l l e g e ，i n n = m o n g o l i aa 鲥c l l l 缸i l 硼u n i v e r s i t y ，h u h h o t0 1 0 0 1 8 ，c h i n a ) 缩写 a s 6 一b a b a r b p ( k b ) c b c h c t a b 2 。4 一d d n t p e b e d t a i p t g k a n n 从 m s p c r p p t p r o r i f s d s s m t r i s u b i 翮硼 主要缩略词表 英文名 a c e t o s y r i n 9 0 n e 6 一b e n z y l a d e n i n e b i a l a p h o s b a s t ar e s is t a n c eg e n e b a s ep a i r ( k i1 0 b a e s ) c a r b e n i c i l l i n c a s e i nh y d r o l y s a t e c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e 2 ，4 一d i c h l o r o p h e n o x ya c e t i ca c i d d e o x y n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d 中文名 乙酰丁香酮 6 苄基腺嘌呤 抗除草剂p p t 的基因 碱基对( 千碱基) 羧苄青霉素 水解酪蛋白 十六烷基三甲基溴化胺 2 ，4 一二氯苯氧乙酸 脱氧核苷酸 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 i s o p r o p y 卜卜t h i o b - d g a l a c t o s i d e 异丙基硫代b d - 半乳糖苷 k a n a m y ci n n a p h t h a l e n e a c e t i ca c i d m u r a s h i g e & s k o o gm e d i u m p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p h o s p h i n o t h r i c i n p r o l i n e r i f a 皿p i c i n s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s t r e p t o m y ci n t r i sh y d r o c h l o r i d e u b i q u i t i n 卡那霉素 奈乙酸 m s 培养基 聚合酶链式反应 草丁膦 脯氨酸 利福平 十二烷基磺酸钠 链霉素 三羟甲基氨基甲烷 玉米泛素基因启动 逆转录p c r 内蒙古农业大学研究生学位论文独创声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的 地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 括为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名：壁醚堕! 日 期：三塑：乏：笸 导师指导研究生学位论文的承诺 本人承诺：我的研究生丝磊整。盥 ：所呈交的学位论文是在 我指导下独立开展研究工作及取得的研究结果，属于我现任岗位职务 工作的结果，并严格按照国家及学校有关学术道德规范的规定要求而 获得的研究结果。如果违反，我必须接受按国家及学校有关规定的处 罚处理并承担相应导师连带责任。 指导教师签名：幺塑丝 日 期：丝2 ：兰：6 内蒙古农业大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解内蒙古农业大学有关保护知识产权的规定，即：研 究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属内蒙古农业大学。本 人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为内蒙 古农业大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为内蒙古农业 大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电 子文档，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部 分内容( 保密内容除外) ，采用影印、缩印或其他手段保存论文。 论文作者签名：虚蠢整望 指导教师签名：垒丝 日 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 1 前言 1 1 燃料乙醇的研究现状 随着资源短缺、环境污染和能源危机的加剧，近年来，将生物资源转化为可发酵的 多糖或者单糖，进一步发酵生产乙醇等能源物质或者其它化学产品成为研究的热点。 燃料乙醇可用作车用替代燃料，在汽油中添加1 0 - 1 5 的乙醇即可使汽油燃烧得更完全， 同时减少c o 。的排放量，降低污染。目前燃料乙醇主要有两种生产方法：化学合成法和 生物发酵法。化学合成法是以乙烯为原料加水合成，乙烯不可再生，且合成的乙醇杂质 含量较高，生物发酵法则是以玉米、大豆，谷物等物质为原料，经水解作用转化为糖 类物质，再经微生物发酵将糖转化为乙醇。这种方法生产的乙醇纯度较高，且原料可再 生，因此世界约9 5 以上的乙醇生产都是采用生物发酵法。发酵法生产乙醇的原料按 其被利用的难易程度可分为三大类：糖类、淀粉类和纤维素类，其中糖类可被微生物 直接利用发酵转化为乙醇，淀粉类则必须先经水解作用转化为糖类，再被微生物利用 发酵制得乙醇，以这两类物质为原料的发酵工艺成熟，曾是发酵生产燃料酒精的主要 方式，但目前世界上仍然存在粮食短缺的问题，导致生产成本较高，应用前景不容乐 观，纤维素在这三种原料中最难利用，但它易得且量大，虽然不能被人和动物直接利用， 但可被某些微生物分解利用，有巨大的发展潜力，因此世界各国都投入了大量精力来 研究纤维素生物转化为乙醇的方法，并取得了一定成果，有的科研小组成功构建了一 些可使纤维素类生物资源高效转化为乙醇的基因工程菌。 美国和巴西是世界上燃料乙醇的两个最大生产国，美国主要以谷物为原料生产燃 料乙醇，而巴西则是使用甘蔗。最近，欧洲国家的燃料乙醇消耗量也在逐年增加。我国 近几年也在加大力度发展燃料乙醇，河南、吉林，黑龙江和安徽等省被列为首批推广 乙醇汽油的试点省份，分别建设完成年产万至几万不等的燃料乙醇生产项目悯。 1 2 纤维素酶的研究概况 1 2 1 纤维素酶系组成及催化机制 在化石能源渐趋枯竭，环境压力日益沉 重，需求和油价持续上升，以及世界能源资源 争夺战越演越烈的时代背景下，寻求可再生 清洁能源和能源的多元化已成为世界发展的 必然趋势。面对这种形势，能源科学家们早 己为节能及开辟新能源进行着不懈的努力： 与此同时许多学者们也在着力开发来自自然 界的另一种可再生能源，如太阳能和植物等。 植物体中产量最大、分布最广的为纤维素类。 图1 纤维素分子结构 f i 备l t t i ei i c c u i 簦蜘a o t i i 佗o f l l u l o 辩 2 纤维素酶基因的克隆与植物的转化以及c r e i o x p 系统的研究 木质纤维素资源由于巨量和廉价，多年以来一直被认为是最合适的起始原料啪，利用 廉价的木质纤维素类可再生资源生产化工产品和能源物质，不仅能够节粮代粮，缓解 能源紧缺，同时还可以保护环境，促进全球经济的可持续发展。因此，关于纤维素的研 究在世界各国都得到了很高的重视。纤维素是植物细胞壁的主要成分，也是一种间接 的太阳能m ，是地球上最多的多糖类物质，也是用之不竭的可再生生物能源睁m 。生物 能源是解决能源危机的重要出路，其中燃料乙醇是目前最现实和可以大规模替代化石 能源的一种产品，它已成为世界各国首选的生物能源n 习。由于世界人口的急剧膨胀和 粮食短缺，用粮食生产乙醇的发展将受到限制，为解决这个问题，全世界都将目光集中 在产量大、来源广、可再生的纤维素原料上。纤维素( c e l l u l o s e ) 占全球植物总干重 的3 0 一5 0 n 羽，它是自然界中数量最大的可再生性物质，它的降解是自然界碳素循环的 中心环节n 5 1 。纤维素( c e l l u l o s e ) 是由d - i i 比喃型葡萄糖基经b - 1 ，4 糖苷键联结而成 的直链多糖( 图1 ) ，维素由排列整齐而规则的结晶区和不规则的无定性区组成，其 结晶度由3 0 一8 0 之间不等。纤维素分子易于聚集形成致密结构，大大影响了其被微生 物降解的速度n 纠叼。要利用纤维素作为能源及化学原料，就必须将其转换成可供利用 的形式，如葡萄糖、乙醇等。由于纤维素酶对纤维素的降解几乎不会对环境造成污染， 这一途径己受到越来越多的关注n 力。纤维素的利用与转化对于解决世界能源危机、粮 食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义。自从1 9 0 6 年在蜗牛消化道发现纤维 素酶以来，纤维素的微生物降解问题就得到了国内外学者的很大关注n 帕。纤维素被彻 底分解而又无污染的一条有效途径，就是利用纤维素酶的水解作用。如果能有效地利 用生物转化技术将这些纤维素转化成简单糖，再发酵产生乙醇等能源物质，不仅可以 变废为宝，而且还可以避免由于化石燃料燃烧所带来的环境污染，更重要的是可以缓 解或解决化石能源短缺乃至枯竭所带来的世界性能源危机。纤维素酶的特异性高，反 应条件比较温和，可避免化学转化所导致的环境污染等。因此，在再生能源利用方面 具有很广阔的应用前景。另外，自然界中细菌( 主要有梭菌属( c l o s tr i 改u r n ) 、纤 维单胞菌属( c e ll u l o m o n a s ) 、杆菌a c i ，淞) 、高温单胞菌属( rh e r m o m o n o sp o r a ) 、 瘤胃球菌属( r u m in o c o c c u $ ) 、拟杆菌a c t e r i o d e s ) 、欧文氏菌属( e r w fn i 口) 、醋弧菌属 研c e t o v i b r i o ) 、小双孢菌属( m i c r o b i s p o r a ) 和链霉菌属$ tr ep t o m y c e s ) 等n 町) 、真菌 ( 主要有白绢菌( s e l e r o t i u m r o l 厂s i o 、白腐真菌( p c h r y s o s p o r i u m ) 以及木霉属 ( t r i c h o d e r m a ) 、曲霉属( a s p e r g i l l u s ) 、裂殖菌属( s c h i z o p h y l l u m ) 和青霉属( p e n i c i l l i u m ) 等种属中的一些真菌，其中木霉属是研究最广泛的纤维素酶产生菌嗍) 、某些无脊椎 动物中都有纤维素酶的存在，因此i 纤维素酶的研究还具有普遍的生态意义。 一般用于生产的纤维素酶来自于真菌，比较典型的有木霉属( t r i c h o d e 册口) 、曲霉 属( a s p e r g i l l u s ) 和青霉属( p e n i c i l l i u m ) 1 。纤维素酶是一种糖蛋白，是一类能够降解 纤维素生成葡萄糖的酶的总称，它是一类复杂的复合物，称之为纤维素酶系，根据其中 内蒙古农业大学硕士学位论文 各酶功能的差异，可将其分为以下三大类： ( 1 ) 内切葡聚糖昔酶：来自真菌的简称e g ，来自细菌的简称l c n 又称为c l 酶，这类酶 作用于纤维素内部的非结晶区，随机水解b 一1 ，4 一糖苷键，将长链纤维素分子截短，产 生大量含非还原性末端的小分子纤维素。 ( 2 ) 外切葡聚糖苷酶或纤维二糖酶：来自真菌简称c b h ，来自细菌简称c e x ，叉称为c x 酶，这类酶作用于纤维素线状分子末端，水解l ，4 b d 糖苷键，每次切下1 个纤维二 糖分子。故又称为纤维二糖水解酶。 ( 3 ) 0 葡萄糖苷酶：简称b g 酶，这类酶将纤维二糖和寡糖水解成葡萄塘分子。 目前认为纤维素酶水解纤维素的协同作用为：e g ( c ) 酶随机水解切断无定形区的 纤维素分子链，使结晶纤维素出现更多的纤维素分子端基，为c b h ( c x ) 酶水解纤维素 创造了条件。c b i t 酶与e g 酶再共同作用下获得水解产物纤维二糖，由b g 酶水解成葡萄 糖。因而纤维素酶水解结晶纤维素的过程可以简单表示为：e g c b h - - b g ，如( 图2 ) 所示，说明了纤维素的降解是纤维素酶的3 种成分共同作用的结果。 一 田2 真曹纤堆l 雎幕其作用 f i p ，2 f 吼酬c c t l b a 筻 m 一i n t e r a c t i n g m “ 122 纤维素酶的分子结构和性质 t i l b e u g h 等人嘲对纤维素酶进行研究发现，降解纤维素的纤维素酶是由约5 6k d 球状的催化( 水解) 活力的核心蛋白催化区域( c a t a l y t l c d o m a i n s ，c d ) 、连接区( 1 i n k e r ) 4 纤维素酶基因的克隆与植物的转化以殛c r e i o x p 系统的研究 和投有催化作用但具有纤维素吸附能力的纤维素结合区域( c e l u l o s e b i n d i n g d o m a i n s ，c b d ) 3 部分组成( 图3 ，图4 ) ： ( i ) 催化结构域：呈球形和楔形，包含催化位点和底物结合位点，主要体现酶的 催化活性及对特定水溶性底物的特异性。在几乎全部失去对结晶纤维素的吸附水解能 力的情况下，仍能具有对纤维二糖的水解活性。内切酶的活性位点位于一个开放的裂 口( c l e f t ) 中，它可结合在纤维素链的任何部位并切断纤维素链。外切酶的活性位点 位于一个长环状通道中，它只能从纤维素链的非还原性末端切下纤维二糖。 ( 2 ) 纤维素结合结构域：c b d 在纤维素酶中位于肚链的氨基端( n 末端) 或燕基 端( c 末端) ，通过连接桥与催化结构域相连”。如粪碱纤维单胞菌( c e l l u l o m o n a s e f i m i ) 的c e n a 的吸附区位于n 一末端，而c e x 8 的吸附区位于c 末端。c b d 对酶的 催化活力是非必需的，但它们执行着调节酶对可溶性和非可溶性底物专一性活力的作 用，其主要功能是将酶分子连接到纤维素上。 ( 3 ) 连接桥连接桥作用主要是保持c d 和c b d 之间的距离，存在的重要性尚有 争议，也可能有助于不同酶分子间形成较为稳定的聚集体。连接桥富含脯氨酸( p r o ) 和羟基氨基酸( s e t ，t h r ) ，细菌纤维素酶的连接桥富含脯氢酸、苏氨酸，而真菌纤维 素酶的连接桥富含甘氨酸、丝氪酸和苏氨酸。 图3 # 维素酶3 d 固 f i g33 d m a po f c e l i u l a 5 c 目4 酶的蚪牡丹f 横型【17 f i g4e n z y m e j i k e m 0 1 c c u l m o d e lo f t h e t 日d p o l e 123 产纤维素酶的微生物 自然界中，伴随着亿万年的进化历程，出现了众多能降解纤维素的微生物，包括 真菌、细菌和放线菌。 ( 1 ) 来源于细菌的纤维素酶 细菌主要产生中性纤维素酶和碱性纤维素酶阎。分解纤维素的细菌在纤维素酶作 用下，可将纤维素一直分解到葡萄搪为止一。分三大类群：( 1 ) 厌氧发酵型：芽孢梭菌 属( “o s t r i d i u r u ) 、牛黄瘤胃球菌属( e u m i n o c o c c u 审、白色瘤胃球菌 内蒙古农业大学硕士学位论文 5 ( r u m i n o c o c c u s a l b u s ) 、产琥珀酸拟杆菌( b a ct e r o i d e ss u c c i n o g e n e 0 、产琥珀酸丝 状杆( f i b r o b a c t e r s u c c i n o g e n e s ) 、溶纤维菌( b u t y r i v i b r i of i b r i s o l v e n s ) 、热纤梭 菌( c o s t r i d i u m 拍e r m o c e l u m ) 、解纤维梭菌( c o s t r i d i u m c e l l u l o l y t i c u m ) 等，则能 在厌氧条件下将纤维素分解，草食动物的消化道、尤其是反当动物的瘤胃中，也存在着 相当数量的纤维素分解细菌，( 2 ) 好氧型：粪碱纤维单胞菌( c e l i u o m o n a s f i m l 、纤维 单胞菌属( c e l l u o m o n a 曲、纤维弧茵属( c e l l v i b r i o ) 、发酵单胞菌( z y m o m o n a s ) 、混 合纤维弧菌( c e l l v i b r i m i x t u s ) ：( 3 ) 好氧滑动菌，如噬胞菌( c y t o p h a g a ) 删。 ( 2 ) 来源于真菌的纤维素酶 目前应用于纤维素酶生产、对纤维素作用较强的真菌菌株主要有木霉属 ( 7 h c h o d e r m a ) 、曲霉属( a s p e r g i l l u s ) 、青霉属( p i n i c i l l i u m ) 和枝顶孢霉属 ( a c r e m o n i u m ) 的菌株。还有镰孢菌属( f u s a r i u m ) 、根霉属( r h i z o p u s ) 和漆斑霉属 ( m y r o t h e c i u m ) 嗜热毛壳菌( c h a e t o m i u mt h e r m o p h y l u m ) 和嗜热子囊菌q m 9 3 8 3 等菌株 口 。木霉属因其纤维素酶产量高，酶系全，而得到了广泛的应用，真菌通常能将纤维 素酶分泌至胞外酶，可用过滤和离心等方法较容易地得到粗酶制品。 1 2 4 纤维素酶的应用 纤维素是一种廉价的可再生资源，广泛存在于自然界。利用纤维素酶水解桔杆、 蔗渣等农业废料，将纤维素水解成葡萄糖，再通过发酵可生产乙醇、丙酮、丁醇等有 机化工原料和燃料，也可以生产饲料、食物和药物等。利用纤维素酶的催化反应代替 高温高压的化学反应，对于实现节粮、代粮、降低成本和革新工艺等具有积极的意义。 纤维素材料是解决人类面临的粮食问题、能源问题和环境问题的最有前景的资源，研 究开发纤维素资源有着深远的意义。纤维素酶的应用，目前已进入了食品、酿造、饲 料、纺织、化工、造纸、医药、石油开采等工业领域。近年来，有关纤维素酶的应用 途径仍在不断开拓，潜力很大。而且随着生物技术的发展，利用基因工程手段构建工 程菌也已成为提高纤维素酶产量和质量的重要途径。通过克隆出菌种的纤维素酶基因， 将其与高效表达基因的启动子和染色体起始位点融合则可高效表达，同时利用基因工 程手段对纤维素酶分子进行改造，也可增加其活性并提高其耐受性。 1 2 5 内质网滞留信号序列的应用 内质网滞留信号( e rr e t e n t i o ns i g n a l ) 是指内质网的结构和功能蛋白( 如蛋 白二硫键异构酶和协助折叠的分子伴侣) 羧基端的一个四肽氨基酸残基： l y s - a s p g l u l e u c o o - ，即k d e l 信号序列。这段序列在高尔基体的膜受有相应的受 体，一旦进入高尔基体就会被高尔基体上的受体结合( 图7 ) ，形成回流小泡被运回 内质网，所以将该序列称为内质网滞留信号。通过在外源基因的c 端添内质网滞留信 6纤维素酶基因的克隆与植物的转化以殛c r e t o x p 承统的研究 号，外源蛋白在表达后就被运回内质网，从而防止外源蛋自在细胞中被酶类降解，提 高外源蛋白的表达量。除了k d e l 这四个氨基酸残基，h i ) e l 、s e k d e l 也具有内质网滞 留的功能嗍。 目7 内质目浩目信 i 作理 f i g7 e rr c l c n t l o ns 1 印w o r k i n gp r i n c i p l c 13 雄性不育基因的研究 131 雄性不育的研究状况 植物雄性不育( m a l es t e r i l i t y ) 是指一种植物在有性繁殖过程中不能产生有功 能的花药、花粉或雄配子或不能产生在一定条件下能够存活的合子的遗传现象( 图5 ) 。 雄性不育既是农作物利用杂种优势、进行轮回选择和群体改皂的重要工具，又是研究 花粉发育、细胞质遗传和核质互作的重要材料。传统的人工去雄或物理、化学杀雄 方法既费工又费时，而且很容易伤害雌蕊，故在作物育种应用中受到很大限制，利用 基因工程的方法建立植物雄性不育株就可以避免上述弊端叫。 圈5 ：正管檀株花药8 ： 育蚌花药 f ig5 a n t h 自ud i mb ： n f b “】。p i l l s 内鼙古农业大学硕士学位论文 7 杂交优势原理是杂交育种技术的理论基础，许多具有抗病、抗逆、高产等优良品 质表现的品种都来源于杂交育种。因此杂交制种作为一种重要的育种手段在农林业 和园艺业中都得到了广泛的应用，而作物雄性不育性是有效利用杂种优势的前提和基 础。在高等植物中普遍存在这种雄性不育现象。早在1 7 6 3 年德国学者( k o l r e u t e r ) 嘲就观察到植物雄性不育现象。据统计洲，己经在植物4 3 个科，1 6 2 个属，3 2 0 个种和2 9 7 个种间杂种中发现了雄性不育现象，并且这个数目还在增加。尽管雄性不育对于植物 的生长发育是一种不正常的性状，但是这种特性对于杂种优势的利用具有十分重要的 意义咖。利用雄性不育系生产杂交种，不仅能节省大量去雄的人工，降低种子成本，而 且可以减少因去雄不净所造成的混杂，提高种子纯度，充分发挥杂种优势的作用。推广 雄性不育系杂交种还有利于高度集约化的作用，促进种子生产现代化。雄性不育又是 研究植物发育和形态建成的极好材料，可以结合性状遗传和分子遗传进行研究。园此， 雄性不育的研究不仅具有生产利用价值，而且具有重要的理论意义。植物的生殖过程 是高等植物生活史中的最重要的阶段，植物花发育分子遗传机理的研究已获得重大进 展。目前，人们己获得许多控制花发育的突变体，克隆了许多与花发育有关的基因，构 建了花器官发育的遗传模型。 132 雄性不育的类型 目前普遍将雄性不育划分为3 类，即细胞质不育型、细胞核不育型和质核互作不 育型，即“三型学说1 ；e d w a r d s o n ( 1 9 5 6 ) 将“三型学说”修改为“二型学说 即核不育型和核质互作不育型两类”1 。不论基因组成如何，某些表现型的异常，特别 是花药发育途径和功能的异常均能造成雄性不育。根据表现型划分雄性不育性类型， 可将雄性不育性划分为三个类型：结构性雄性不育、孢子发生性雄性不育、功能性雄 性不育。 3 3b a r n a s e 基因的研究 烹蕊焉裂篙黧蒸 8纤维素酶基因的克隆与植物的转化以及e r e l o x p 系统的研究 性的提高嘲。因此，该基因在农业生产上具有广泛的用途。 绒毡层是花药壁的最内层体细胞，直接与花药药室中的花粉母细胞及以后发育中 的花粉接触，是将饱子体缓织的物质输往雄配子体的最后中转站，对花粉的正常发育 具有十分重要的作用汛嘲。所以说，绒毡层在花粉的发育过程中起着非常关键的作用， 任何影响绒毡层发育的突变，都有可能导致花粉的败育。花药绒毡层组织细胞内 b a r n a s e 基因得到表达，产生永解绒毡层组织细胞内r n a 的核糖核酸水解酶，从嚣阻 碍花药绒毡层的发育，导致雄性不育的产生。另一方面，转基因植物都存在着生物安 全性问题，所以雄性不育对于生物安全方藤起着重要的作用。 1 。3 。4雄性不育基因工程的应用 雄性不育基因工程是新兴的现代农业生物技术之一，为作物育种提供了一个新 的途径。现就其与传统雄性不育系选育方法比较，基因工程的方法可以创造出饪何植 物的雄健不育系。因此，这种方法比起传统雄性不育系的选育方法，很大程度上突破 了自然资源的局限，是选育雄性不育系的一条捷径。而且基因工程的方法获得的雄性 不育系比传统方法周麓短，雄性不育豹枫理清楚，遗传方式更篙单。因此，科研互作者 开始从事人工创造植物雄性不育系的研究工作。m a r i a n i 等引在1 9 9 0 年利用 豫2 9 - b a r n a s e 嵌合基因的转化获褥了转基因不育烟草和漓菜，剃太文等湖利用玉米 花粉启动子z m l 3 和b a r n a s e 基因构建了雄性不育基因，并用基因枪法转化玉米，获得 结实的转基因植株。而且目前转基因植物类的生物安全性问题主要是花粉途径的基因 漂移是否会引发潜在的生态安全，因此，也有入提出培育雄性不育品种的技术方案澜。 植物雄性不育和杂种优势利用已经在农业生产中发挥着巨大的作用，随着植物雄 性不育和杂种优势基础理论和应用方面的深入研究，必将会给人们带来更大的物质财 富。 1 4e r e l o x p 重组系统 基因重组是现代生命科学的重要技术之一，c r e l o x p 位点特异性重组系统是 s t e i n b e r g 等首先在大肠杆菌噬菌体p l 中发现的，由c r e 重组酶和l o x p 德点两部分组成 蛳1 。c r e 重组酶是噬菌体p 1 编码的分子量为3 8 5 k d 的蛋白质，能够识别特异的d n a 序列 ( 1 0 x p ) 并进行特定的剪切拼接。该爨自由较小的n 一末端和较大的c 一末端两个结构域 组成，n 一末端与l o x p 系列的识别有关。c 一末端具有一个“a r g _ _ h i s a r 旷一t y r ”的 四联体结构，是c r e 基因的活性中心，和d n a 的结合及d n a 的切割有关。c r e 酶的特异 识别位点l o x p 位点序列长度为3 4b p ，包括两个1 3 b p 的反向重复序列和8b p 的非对称 闻隔序( 图8 ) 。重组反应是在d n a 的两个l o x p 位点闯进行，整个过程没有d n a 的合成 和丢失。c r e l o x p 系统进入细胞后根据l o x p 位点的方向性和分布，可以使转基因中 内曩古农业大学硕士学位论文 9 设定的d n a 片段从基因组中高效地切除、或产生倒位、或整合到另外的位置上。如果 两个识别位点方向相反，中间的d n a 片段会发生倒位；两个识别位点方向相同则中间 的d n a 片段会被切除；如果两个识别位点分别位于两个d n a 分子上，则会发生整合反应 ( 圈9 ) 。c r e 重组酶与l o x p 位点的d n a 片断形成复合物后，可以提供足够的能量引发 之后的d n a 重组过程，因此该系统不需要细胞或者生物体提供其他的辅助因子；也可 以发生于无细胞系统之中；重组反应的底物形式多样，无论是源于动物、植物或微生 物的d n a ，还是线性、开环或超螺旋的d n a 均适用，且l o x p 位点是一段较短的d n a 序列，因此非常容易合成，c r e 重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子之下，从 而使这种重组酶在生物体不同的细胞、组织、器官，以及不同的发育阶段或不同的生 理条件下产生，进而发挥作用，这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一点“”。 田8o x p 位点的序列 f i gbt n ：o f l o x p n 依赖于两个l o x p 位点的方向 1 0 纤维素酶基因的克隆与植物的转化以及c r e l o x p 系统的研究 1 4 1c r e lo x p 重组系统的应用 标记基因在转基因的研究中是一个用于区别转化细胞和非转化细胞的必不可少 的重要因素，它的使用大大加快了转基因技术的发展，但由于广泛使用的标记基因是 一些抗生素基因，比如卡那霉素( n p t i i ) 、氨苄青霉素基因( a m p ) 等，它们的商业 化是公众普遍关注的问题。如n p ti i 基因使用就使许多科学家研究和探讨其对人体及 其它生物的影响或危害，虽然目前尚无确切的证据表明转基因食品会对人体产生不利 的影响，但是由于生产转基因食品所用的植物原料中含有利用现代生物技术手段导入 的外源基因，而目前对转基因植物中外源基因的插入位点仍无法准确控制，对外源基 因与宿主植物基因组之间可能存在的各种复杂的相互作用以及由此产生的各种非预 期效应对人类健康的影响了解甚少，因此转基因食品的安全性问题受到普遍关注嘲3 ， 人们担心食用了转基因的动物或植物后是否会引起肠道内致病细菌获得这些抗生素 基因而改变人体治疗时使用抗生素的效果。另外有报道，抗除草剂基因有可能会通过 花粉转入同科或近缘的杂草基因组中，这些不确定因素对植物改良的发展有很强的制 约作用嘲。解决这些问题的最根本途径，就是去除转基因植物中的选择标记基因。因 此，去除标记已成为国际上植物基因工程领域的一个趋势。利用c r e l o x p 系统可以 将转基因植物中的标记基因选择性地切除。这种方法是在标记基因两侧分别插人 l o x p 位点，利用c r e 基因的表达产物将转基因植物中位于l o x p 位点之间的标记基因 选择性地切除。g l e a v e 等璐帕采用这一策略成功地将转基因烟草中卡那霉素抗性( n p t ) 基因选择性地切除，从7 7 3 株转基因烟草中获得了1 9 株不含标记基因的转基因植 株。 目前，该系统已成为分子生物学研究的有力工具，c r e l o x p 系统广泛应用于各种 动植物基因的敲除、基因打靶、个体发育和基因调控、基因治疗等领域。c r e l o x p 系统的应用使人们定向定点地对基因或染色体进行操作成为可能。由此发展起来的定 点整合与选择标记基因的去除技术是基因工程中的两项颇有发展前途的新策略。 1 5 本论文研究的目的与意义 纤维素酶具有巨大的应用潜力，在众多领域有着十分广阔的应用前景，因此国内 外对纤维素酶的研究颇为广泛。国外开展研究进行得较早些也深入些，迄今为止，在 少数发达国家拥有纤维素酶生产及应用技术并实现产业化，造成市场垄断。国内对纤 维素酶的研究，虽然目前已进行了二些不同的研究开发工作，但迄今为止，作为一种 工业酶制剂在我国尚属空白。我国未能很好解决影响纤维素酶规模生产的难题。国内 每年的农作物秸秆、纤维素废料等利用率很低，阻碍了循环经济的发展。另外近年来 转基因植物的发展十分迅速，随着越来越多的转基因植物被商业化应用，转基因植物 食品的安全性问题也受到了普遍关注。 旦塞直至些查兰塑主兰竺鲎兰! ! 本论文在绿色木霉菌里克隆出来纤维素酶系基囡进行表达，为构建能够高效水解 纤维索生产燃料乙醇的基因工程菌奠定基础。在生物安全性问题方面，通过在转基困 植物的外源基因两侧插入两个l o x p 位点，利用组织特异性启动子对c i - e 基因的表达部 位进行调控，可以在不影响转基因植物抗虫、抗除草剂等原有性状的情况下，将转基 因植物食用部位的外源基因选择性地切除。这是解决转基因植物安全性问题的有效途 径之一。 151 研究内容与技术路线 ( 一) 在化石能源渐趋枯竭，环境压力日益沉重的时代背景下，寻求可再生清洁能 源已成为世界发展的必然趋势。而植物作为用之不竭的可再生生物能源利用纤维素 酶使大量纤维索资源转变成人类生活所需要的物质，解决世界能源危机、粮食短缺、 环境污染等问题具有十分重要的意义。 ( 二) 杂种优势是生物界的一种普遍现象，利用杂种优势大幅度提高产量是2 0 世纪作物育种的一个重大突破。异花授粉作物玉米、常异花授粉作物高粱等杂种优势 的生产应用己成为一种重要的育种途径。但是，有些植物虽然杂种优势极为显著，可 是由于它们花器较小人工去雄操作太费时、费工，而且所得种子也较少，故难以在 生产上应用。本论文利用基因工程的方法获得雄性不育植株，克服常规育种的局限性， 对克服常规育种所带来的不便提供了重要依据。 ( 三) 生物安全问题是随着现代生物技术特别是重组d n a 技术或基因工程的发展 而逐渐成为全球社会关注的话题。本论文利用c r e l o x p 系统同雄性不育基因构建表 达载体，删除标记基因( 抗除草剂基因) 对于目前的生物安全性具有重要意义。 ( 四) 本试验的基本技术路线如下： ：兰。- 。i t 豳圈 1 2 纤维素酶基因的克隆筠植物的转化以及c r e l o x p 系统的研究 2 材料和方法 2 1 植物和真菌材料 烟草和剪股颖种子由本实验室提供，绿色术霉( t r i c h o d e r m av i r i d e ) 3 2 7 7 4 真菌 由中科院微生物所锌瑾老师提供。 2 2 剪股颖和烟草豹再生体系 剪股颖再生体系： 愈伤组织的配方：m s + 2 ，4 - d5 m g l 继代培养基配方：m s + 2 ，43 m g l + 脯氨酸0 2 5 m g + 落蛋白0 2 5 m g l 分化培养基：m s + 6 b a2 m g l + t d z0 2 m g l + 脯氨酸0 2 5 m g l 生根培养基：潞 2 3 质粒和菌株 大肠杆菌( 6 娩舱r 泐妇剃f ) d h 5a 和根癌农杆菌( 以砒施r 如掰t u m e f a c i e n s ) l b a 4 4 0 4 ( r if ，s t r ) 由北京大学生命科学学院蛋白质工程与植物基因工程国家重点实验室保存：质粒 删e a s yv e c t o r 购自p r o m e g a 公司。 2 4 酶和试剂 限带l 胜内切酶购自p r o m e g a 和t a k a r a 公司，t a q 酶购自上海s s l 谵o n 公司及天为时代公司， 莨跳连接酶购自t a k a r a 公司；t r i z o l 购啻i n v i t r o g e n e 公司，e 购自g i b c x r b r l 公司 和b i ol a b 公司；d n a 回收试剂盒购融博麦德生物公司；抗生素、植物激素及i p t g 、x - 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