（蔬菜学专业论文）番茄抗坏血酸生物合成与代谢途径中相关酶基因的克隆与调控.pdf

番茄抗坏血酸生物合成与代谢途径中 相关酶基因的克隆与调控 中文摘要 抗坏血酸即维生素c ，在生物体中具有重要的代谢功能和抗氧化作用。抗坏 血酸是保证人类健康所必需的营养物质，人类自身已经丧失了合成能力，必须从 食物中摄取，而植物为人类提供了主要的抗坏血酸来源。抗坏血酸还与植物细胞 的分裂、伸长和植株生长有关。抗坏血酸及其代谢相关酶类在清除活性氧方面的 作用使得抗坏血酸在植物抵抗环境胁迫中也起着重要作用。通过调控植物抗坏血 酸生物合成与代谢相关酶基因的表达，可以提高抗坏血酸的含量，改变某些代谢 酶类的活性，从而增加植物产品的营养价值，增强植物对逆境的抗性。 番茄是一种世界上广为栽培的高营养、高价值的蔬菜作物，然而，目前番茄 抗坏血酸生物合成与代谢途径中大部分基因都没有克隆到，对其进行转基因调控 的报道几乎没有。因此，本研究以番茄这一重要的蔬菜作物为材料，鉴定和克隆 抗坏血酸生物合成和代谢相关酶基因，通过基因工程调控番茄抗坏血酸的代谢， 分析转基因番茄的植株生长、生理生化及抗氧化逆境的特性等，以期获得具有应 用价值的抗坏血酸含量增加的番茄材料。本研究获得的主要结果如下： 1 克隆了番茄抗坏血酸生物合成途径中上游的g d p d 甘露糖焦磷酸化酶 ( g m p ) 基因的全长c d n a ，其g e n b a n k 登录号为a y 6 0 5 6 6 8 ，测序结果表 明该c d n a 全长1 5 3 5b p ，包含一个长为1 0 8 6b p 的完整开放读码框，编码 3 6 1 个氨基酸，氨基酸序列比对结果显示番茄g m p 与其他植物g m p 的同源 性较高。根据g e n b a n k 中已公布的番茄抗坏血酸生物合成途径中最后一步合 成酶l 半乳糖酸1 。4 内酯脱氢酶( g l d h ) 的全长e d n a 序列，克隆了番茄 g l d h 基因，该基因编码区长1 7 6 7b p ，编码5 8 8 个氨基酸。根据已报道的 序列克隆了番茄抗坏血酸代谢途径中促进抗坏血酸再生的单脱氢抗坏血酸还 原酶( m d h a r l ) 基因的全长c d n a ，该基因编码4 3 3 个氨基酸。利用r a c e 技术克隆了2 个促进抗坏血酸再生的另一关键酶脱氢抗坏血酸还原酶 ( d h a r ) 基因的全长e d n a ，其g e n b a n k 登录号分别为a y 9 7 1 8 7 3 和 a y 9 7 1 8 7 4 ，d h a r l 的c d n a 全长9 9 1b p ，编码2 1 0 个氨基酸，d h a r 2 的c d n a 全长1 0 2 4b p ，编码2 6 8 个氨基酸，分析表明d h a r l 属于胞质类型，而d h a r 2 属于质体类型。利用r a c e 技术克隆了一个新的番茄胞质抗坏血酸过氧化物 酶( a p x ) 基因，其g e n b a n k 登录号为a y 9 7 4 8 0 5 ，该基因的c d n a 全长1 1 6 9 5 b p ，其编码区编码2 5 0 个氨基酸。克隆了番茄抗坏血酸氧化酶( a o ) 基因的 全长c d n a ，其g e n b a n k 登录号为a y 9 7 1 8 7 6 ，该c d n a 全长1 9 8 4b p ，其编 码区编码5 7 8 个氨基酸。 2 利用7 6 个番茄渗入系( i n t r o g r e s s i o nl i n e s ，i l s ) 将1 4 个涉及到番茄抗坏血酸 生物合成与代谢的基因定位在9 条染色体上，大部分基因都显示单拷贝信号。 3 对g m p 和c a p x 2 基因在番茄不同组织的表达进行了n o r t h e r n 杂交分析，结 果表明这两个基因在番茄根、茎、叶、花、果实等各种组织器官中呈组成型 表达，但不同组织的表达水平有差异。利用番茄表达数据库( t o m a t o e x p r e s s i o nd a t a b a s e ，t e d ) 分析了番茄抗坏血酸生物合成与代谢相关基因的 数字表达谱。 4 构建了g l d h 、d h a r l 、m d h a r l 等3 个基因的正义( 超量) 表达载体及 r n a i 抑制表达载体共6 个，并利用农杆菌介导的遗传转化方法将它们导入 常规番茄品种中蔬5 号及品系a i o i 与f r 中。 5 获得卡那霉素抗性转化植株8 2 棵，p c r 检测和s o u t h e r nb l o t 结果表明，外源 基因已整合到番茄基因组中，其拷贝数1 5 个不等。 6 部分正义转基因植株的n o r t h e r nb l o t 结果表明，多数转基因植株靶基因的表 达量比对照明显增加。 7 对g l d h 基因的转基因植株的酶活性及抗坏血酸含量测定结果表明：不论基 因型是a 1 0 1 还是f r ，正义转基因植株的g l d h 活性都比对照显著增高，最 高的转基因株系g l d h 活性是对照的3 6 倍；多数正义转基因植株叶片和果 实的抗坏血酸含量都比对照显著增加，最高的转基因株系叶片和果实的抗坏 血酸含量分别比对照增加了5 8 和4 7 ；对于r n a i 转基因株系来说，它们 的g l d h 活性都比对照低，相应地，叶片和果实的抗坏血酸含量比对照减少， 最低的转基因株系g l d h 活性比对照降低了5 4 ，叶片和果实的抗坏血酸 含量分别比对照减少了2 0 和2 7 。 8 对d h a r l 基因的转基因植株的酶活性及抗坏血酸含量测定结果表明：所有 正义转基因植株的d h a r 活性都比对照显著增高，最高的转基因株系d h a r 活性是对照的5 2 倍；正义转基因植株叶片和果实的抗坏血酸含量都比对照 显著增加，最高的转基因株系叶片和果实的抗坏血酸含量分别比对照增加了 5 8 和5 7 ；对于r m 虻转基因株系来说，它们的d h a r 活性以及叶片和果 实的抗坏血酸含量与对照的差异都不显著。 6 9 对m d h a r l 基因的转基因植株的酶活性及抗坏血酸含量测定结果表明：多数 正义转基因植株的m d h a r 活性比对照显著增高，最高的转基因植株 m d h a r 活性是对照的3 4 倍；多数正义转基因植株叶片抗坏血酸含量比对 照显著增加，最高的转基因植株叶片抗坏血酸含量比对照增加了2 1 。 1 0 对部分转基因植株后代的抗氧化逆境特性进行了初步观察，结果表明超量表 达d h a r l 基因的转基因植株后代的耐盐性和对除草剂百草枯的抗性有一定 程度的提高。 关键词：番茄( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u mm i l l ) ；抗坏血酸；生物合成与代谢；基 因克隆；基因定位；基因表达；遗传转化；基因调控 7 c l o n i n ga n dr e g u l a t i o no fg e n e si n v o l v e di nt o m a t o i s c o r b i ca c i db i o s y n t h e s i sa n dm e t a b o l i s m a s c o t dd i o s y n t h e s i sa n dd o l i s m a b s t r a c t l - a s c o r b i ca c i d ( a s a ) ，a l s on a m e dv i t a m i nc ，h a sam u l t i t u d eo ff u n c t i o n si n o r g a n i s m s a s ai sa ne s s e n t i a lc o m p o n e n to fh u m a nn u t r i t i o n ，b u th u m a n sl a c kt h e a b i l i t yt os y n t h e s i z ea s a a sar e s u l to fam u t a t i o ni nt h el a s te n z y m er e q u i r e df o ra s a b i o s y n t h e s i s a s a , t h e r e f o r e ，m u s tb ea c q u i r e dr e g u l a r l yf r o md i e t a r ys o u r c e s ， p r i m a r i l yf r o mp l a n t sr i c hi n 舭a s a i si n v o l v e di nt h ep r o c e s so fc e l ld i v i s i o n ，c e l l e x p a n s i o na n dp l a n tg r o w t h a s aa l s op l a y sa ni m p o r t a n tr o l ea sa na n t i o x i d a n ta n d p r o t e c t st h ep l a n td u r i n go x i d a t i v ed a m a g eb ys c a v e n g i n gf r e er a d i c a l sa n dr e a c t i v e o x y g e ns p e c i e st h a ta r eg e n e r a t e dd u r i n gp h o t o s y n t h e s i s ，o x i d a t i v em e t a b o l i s ma n d v a r i o u ss t r e s s e s b yr e g u l a t i n gt h ee x p r e s s i o no fg e n e si n v o l v e di np l a n ta s c o r b i ca c i d b i o s y n t h e s i sa n dm e t a b o l i s m ，i ti sp o s s i b l et oi n c r e a s et h ea s ac o n t e n t so fp l a n t s ， t h u si m p r o v et h en u t r i t i v ev a l u e so fp l a n tf o o d sa n dt h er e s i s t a n c et oe n v i r o n m e n t a l s t r e s s e s t o m a t oi saw o r l d w i d ev e g e t a b l ew i mh i g hn u t r i t i v ev a l u e s h o w e v e r , m o s t g e n e si n v o l v e di nt o m a t oa s c o r b i ca c i db i o s y n t h e s i sa n dm e t a b o l i s mh a v en o tb e e n c l o n e da n dt h e r ea r en e a r l yn or e p o r t sa b o u tt h eg e n er e g u l a t i o n t h e r e f o r e ，t h i ss t u d y a i m st oc l o n ea n dr e g u l a t et h ee x p r e s s i o no fg e n e si n v o l v e di nt o m a t oa s a b i o s y n t h e s i sa n dm e t a b o l i s ma n de x p e c t st oo b t a i nt o m a t om a t e r i a l sw i t hh i g hc o n t e n t o fa s a b yt r a n s g e n i ct e c h n i q u e s t h em a i nr e s u l t s w e r ea sf o l l o w s ： 1 t h e f u l l - l e n g t he d n ao fg d p d m a n n o s ep y r o p h o s p h o r y l a s e ( g m p ，e c 2 7 7 2 2 ) ，w h i c hc a t a l y z e st h ef o r m a t i o no fg d p - d - m a n n o s e ，w a sc l o n e db y r a c e p c ra n dt h e s e q u e n c e d a t ah a v eb e e ns u b m i t t e dt ot h e d d b j e m b i d g e n b a n kd a t a b b s c su n d e ra c c e s s i o nn u m b e ra y 6 0 5 6 6 8 t h e f u l l l e n g t ho fg m pe d n a i s1 5 3 5b pa n dc o n t a i n sac o m p l e t eo p e nr e a d i n gf r a m e ( o r f ) o f1 0 8 6b p ，w h i c he n c o d i n g3 6 1a m i n oa c i d s ( 缸) h o m o l o g ya n a l y s i so f t o m a t og m ps h o w e dh i g hh o m o l o g yw i t hg m pf r o mo t h e rp l a n t s t h ef u l l l e n g t h e d n ao fl - g a l a c t o n o - 1 ，4 一l a c t o n ed e h y d r o g e n a s e ( g l d h ，e c1 3 2 3 ) ，w h i c hi s t h el a s tk e ye n z y m eo fp l a n ta s c o r b i ca c i db i o s y n t h e s i s ，w a sc l o n e db yr t - p c r b a s e do nt h ep u b f i s h e ds e q u e n c e ( a b 0 8 0 6 9 0 ) t h ec o m p l e t eo r fo fg l d h 8 e d n ae n c o d e d5 8 8a a t h ef u l l - l e n g t he d n ao fm o n o d e h y d r o a s c o r b a t er e d u c t a s e ( m d h a r l ，e c1 6 5 4 ) ，w h i c hi sak e ye n z y m eo fr e c y c l i n g 呲w a s c l o n e db y r t - p c rb a s e do nt h ep u b f f s h e ds e q u e n c e ( 1 , 4 1 3 4 5 ) t h ec o m p l e t eo r fo f m d h a r le d n ae n c o d e d4 3 3a n t w of u l l l e n g t he d n ao fd e h y d r o a s c o r b a t e r e d u c t a s e ( d h a r ，e c1 8 5 1 ) ，w h i c hi sa l s oak e ye n z y m eo fr e c y c l i n ga a ，w a s c l o n e db yr a c e p c ra n dt h es e q u e n c ed a t ah a v eb e e ns u b m i t t e dt ot h e d d b j e m b l g e n b a n kd a t a b a s e su n d e ra c c e s s i o nn u m b e ra y 9 7 1 8 7 3a n d a y 9 7 1 8 7 4 d h a r le d n ai s9 9 1b pi nl e n g t ha n dc o n t a i n sao r f e n c o d i n g2 1 0 a a , w h i l ed h a r 2e d n ai s1 0 2 4b pi nl e n g t ha n dc o n t a i n sao r fe n c o d i n g2 6 8 a n b i o i n f o r m a t i ca n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt o m a t od h a r lm a yb eac y t o s o l i c i s o z y m ea n dd h a r 2m a yb eap l a s t i d i ci s o z y m e an e wt o m a t oc y t o s o l i c a s c o r b a t ep e r o x i d a s e ( a p x ；e c1 1 1 1 1 1 ) g e n ew a sc l o n e db yr a c e p c ra n d t h es e q u e n c ed a t ah a v eb e e ns u b m i t t e dt ot h ed d b j e m b l g e n b a n kd a t a b a s e s u n d e ra c c e s s i o nn u m b e ra y 9 7 4 8 0 5 t h ef u l l - l e n g t he d n ai s1 1 6 9b pi nl e n g t h a n dc o n t a i n sao r f e n c o d i n g2 5 0a n t h ef u l l - l e n g t he d n ao fa s c o r b a t eo x i d a s e ( a o ；e c1 1 0 3 3 ) w a sc l o n e db yr a c e - p c ra n dt h es e q u e n c ed a t ah a v eb e e n s u b m i t t e dt ot h ed d b j e m b u g e n b a n kd a t a b a s e su n d e ra c c e s s i o nn u m b e r a y 9 7 1 8 7 6 a oe d n ai s1 9 8 4b pi nl e n g t ha n dc o n t a i n sao r f e n c o d i n g5 7 8a n 2 u s i n g7 6t o m a t oi n t r o g r e s s i o nl i n e s ( i b ) ，e a c hc o n t a i n i n gas i n g l eh o m o z y g o u s r f l p - d e f i n e dc h r o m o s o m es e g m e n tf r o mt h eg r e e n - f r u i t e ds p e c i e sl y c o p e r s i c o n p e n n e l l i i ，1 4g e n e si n v o l v e di na s c o r b i ca c i db i o s y n t h e s i sa n dm e t a b o l i s mw o r e m a p p e dt o1 5l o c iw h i c hw e r eo n9c h r o m o s o m e sa n dm o s to ft h ep r o b e sr e v e a l e d as i n g l ec o p ys i g n a l 3 n o r t h e r nb l o t a n a l y s i s s h o w e dt h a tg m pa n dc a p x 2w e r ec o n s t i t u t i v e l y e x p r e s s e di nr o o t s ，s t e m s ，l e a v e s ，f l o w e r sa n df r u i t s o ft o m a t o ，w h e r e a st h e e x p r e s s i o nl e v e l sw e r ed i f f e r e n t t h ed i 【g i t a le x p r e s s i o np r o f i l e so ft h eg e n e s i n v o l v e di na s c o r b i c a c i db i o s y n t h e s i sa n dm e t a b o l i s mw e r ea n a l y z e d ，u s i n g t o m a t oe x p r e s s i o nd a t a b a s e ( t e d ) 4 s i xp l a n te x p r e s s i o nv e c t o r sw e r ec o n s t r u c t e d ，w h i c hc o n s i s to ft h es e n s ea n d r n a io fg l d h , d h a r la n dm d h a r ie d n as e q u e n c e t r a n s g e n i cp l a n t sw e r e o b t a i n e du s i n gt h ea g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n 5 at o t a lo f8 2p u t a t i v et r a n s g e n i ct o m a t op l a n t sw e r eo b t a i n e d t h ep c ra n d s o u t h e r nb l o ta n a l y s i so ft h ep u t a t i v et r a n s g e n i cp l a n t ss h o w e dt h a tt h et - d n a 9 w a s i n t e g r a t e di n t ot h et o m a t og e n o m e ，w i t hd i f f e r e n tc o p yn u m b e r 6 n o r t h e r nb l o tr e s u l t sf r o ms o m es e n s e t r a n s g e n i cp l a n t si n d i c a t e dt h a tm o s to ft h e t a r g e tg e n ee x p r e s s e dg r e a t e rt h a nt h ec o n t r 0 1 7 m e a s u r e m e n t so fe n z y m ea c t i v i t i e sa n da s ac o n t e n t so ft r a n s g e n i c p l a n t s r e g e n e r a t e df r o mg l d he x p r e s s i o nv e c t o r sw e r ep e r f o r m e da n dt h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h eg l d ha c t i v i t i e so fs e n s et r a n s g e n i cp l a n t sw e r eh i g h e rt h a nt h e c o n t r o la n dt h eh i g h e s tt r a n s g e n i cl i n ei n c r e a s e du pt 03 6 f o l d 皿ea s ac o n t e n t s o fm o s ts e n s et r a n s g e n i cl i n e sw e r eh i g h e rt h a nt h ec o n t r o la n dt h eh i g h e s t t r a n s g e n i cl i n ei n c r e a s e d5 8 i nl e a v e sa n d4 7 i nf r u i t s 勋eg l d ha c t i v i t i e s a n da s ac o n t e n t so fr n a it r a n s g e n i cl i n e sw e r el o w e rt h a nt h ec o n t r 0 1 f o rt h e l o w e s tt r a n s g e n i cl i n e ，t h eg l d ha c t i v i t yd e c r e a s e d5 4 ，a n dt h ea s ac o n t e n t d e c r e a s e d2 0 i nl e a v e s2 7 i nf r u i t s 8 m e a s u r e m e n tr e s u l t so fe n z y m ea c t i v i t i e sa n da s ac o n t e n t so ft r a n s g e n i cp l a n t s r e g e n e r a t e df r o md h a r le x p r e s s i o nv e c t o r si n d i c a t e dt h a tt h ed h a ra c t i v i t i e so f a l lo fs e n s et r a n s g e n i cp l a n t sw e r eh i g h e rt h a nt h ec o n t r o la n dt h eh i g h e s t t r a n s g e n i cl i n ei n c r e a s e du pt o5 2 f o l d t 1 l e 舢ac o n t e n t so fs e n s et r a n s g e n i c l i n e sw e r eh i g h e rt h a nt h ec o n t r o la n dt h eh i g h e s tt r a n s g e n i cl i n ei n c r e a s e d5 8 i n l e a v e sa n d5 7 i nf r u i t s t h ed h a ra c t i v i t i e sa n da s ac o n t e n t so frn _ 赴 t r a n s g e n i cl i n e sh a dn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sw i t ht h ec o n t r 0 1 9 m e a s u r e m e n tr e s u l t so fe n z y m ea c t i v i t i e sa n da s ac o n t e n t so ft r a n s g e n i cp l a n t s r e g e n e r a t e df r o mm d h a r le x p r e s s i o nv e c t o r si n d i c a t e dt h a tt h em d h a r a c t i v i t i e so fm o s ts e n s et r a n s g e n i cp l a n t sw e r eh i g h e rt h a nt h ec o n t r o la n dt h e h i g h e s tt r a n s g e n i cl i n ei n c r e a s e du pt o3 4 一f o l d t h el e a fa s a c o n t e n t so fm o s t s e n s et r a n s g e n i cl i n e sw e r eh i g h e rt h a nt h ec o n t r o la n dt h eh i g h e s tt r a n s g e n i cl i n e i n c r e a s e d2 1 1 0 t h er e s i s t a n c e st oo x i d a t i v es t r e s s e so fs o m et r a n s g e n i cp l a n t sw e r ei n v e s t i g a t e d p r e l i m i n a r i l ya n dt h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ed h a r - o v e r e x p r e s s i n gp l a n t s i n c r e a s e ds a l tt o l e r a n c ea n dr e s i s t a n c et op a r a q u a t k e yw o r d s ：t o m a t o ( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u mm i l l ) ；l - a s c o r b i ca c i d ；b i o s y n t h e s i s a n d m e t a b o l i s m ；g e n ec l o n i n g ；b i nm a p p i n g ；g e n ee x p r e s s i o n ；g e n e t i c t r a n s f o r m a t i o n ；g e n er e g u l a t i o n 1 0 缩略词表 缩略符号英文全称中文意义 a b a a f l p a m p a o a p x a s a b l a s t b s a c a m 3 5 s 咖 c d n a c d s c e f d e p c d h a d h a r e b e d t a e s t g a l d h g a l u r g l d h g m e g m p g p i g p p g p x g r g s h 姒 a b s c i s i ca c i d a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m a m p i c i l l i n a s c o r b a t eo x i d a s e a s c o r b a t ep e r o x i d a s e a s c o r b i ca c i d b a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht o o l b o v i n es e r u ma l b u m i n c a u l i f l o w e rm o s a i cv i r u s3 5 s c a t a l a s e c o m p l e m e n t a r yd n a c o d i n gs e q u e n c e c e f o t a x i m e d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d e h y d r o a s c o r b a t e d e h y d r o a s c o r b a t er e d u t a s e e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d e x p r e s s e ds e q u e n c et a g l - g a l a c t o s ed e h y d r o g e n a s e d g a l a c t u r o n i ca c i dr e d u c t a s e l - g a l a c t o n o 一1 ，4 l a c t o n ed e h y d r o g e n a s e g d p m a n n o s e 一3 ，5 - e p i m e r a s e g d p - d m a n n o s ep y r o p h o s p h o r y l a s e g l u c o s e 6 p h o s p h a t ei s o m e r a s e l - g a l a c t o s e 1 - p h o s p h a t ep h o s p h a t a s e g l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e g l u t a t h i o n er e d u c t a s e g l u t a t h i o n e i n d o l e 3 a c e t i ca c i d 脱落酸 扩增片段长度多态性 氨苄青霉素 抗坏血酸氧化酶 抗坏血酸过氧化物酶 抗坏血酸 局部比对基本检索工具 牛血清白蛋白 花椰菜花叶病毒3 5 s 过氧化氢酶 互补d n a 编码序列 头孢霉素 焦碳酸二乙酯 脱氢抗坏血酸 脱氢抗坏血酸还原酶 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 表达序列标签 l 半乳糖脱氢酶 d 半乳糖醛酸还原酶 l 半乳糖1 ，4 内酯脱氢酶 g d p 甘露糖3 ，5 差向 异构酶 g d p d 甘露糖焦磷酸化酶 葡萄糖6 磷酸异构酶 i ，半乳糖1 磷酸磷酸酶 谷胱甘肽过氧化物酶 谷胱甘肽还原酶 谷胱甘肽 吲哚3 乙酸 i l s i n t r o g r e s s i o nl i n e s “ 7 基因渗入系一一 _ - _ _ _ - - l _ _ - 一i i _ _ _ - _ _ - _ _ _ _ - - - - - - - - _ _ _ _ - _ - - _ - _ _ _ l _ _ - _ _ _ _ - _ _ _ - _ - - - - _ - _ _ _ _ - _ - _ i i - - - - l - _ - _ _ _ _ _ _ _ - _ l - - _ _ _ - - _ _ _ - l _ - _ - - 1 l 1 2 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 是如需保密，解密时间2 0 0 7 年7 月1 日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同- 1 作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 碱蚣各智袖彳 蝴：矽年m 则 始智呼靳挠泸髫 签名日期：年月纱日签名日期：。矽厂z 月乙9 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页褪目录之问 l _ 一 l 刖茜 1 1 课题的提出 抗坏血酸( a s c o r b i ca c i d ，a s a ) 即维生素c ( v c ) ，在生物体中具有重要 的代谢功能和抗氧化作用。抗坏血酸是人类和动物维持生长、繁殖和保证健康所 必需的营养物质。抗坏血酸在胶原质的形成上扮演很重要的角色，而胶原质对于 人体的组织细胞、牙龈、血管、骨骼、牙齿的发育和修复是一种重要的物质。抗 坏血酸能帮助人体内铁的吸收；降低血液中的胆固醇；预防病毒和细菌的感染， 增强机体的免疫系统功能；防止亚硝基胺( 致癌物质) 的形成；减少静脉中血栓 的发生；使蛋白质细胞互相牢聚，从而能延长寿命。抗坏血酸缺乏会导致坏血病。 植物上，抗坏血酸与植物的抗逆性呈正相关，增加植物细胞内的抗坏血酸的含量， 能增强植物耐炎热、寒冷和盐碱环境等逆境的能力。抗坏血酸还与植物细胞的分 裂、伸长和植株生长有关。植物、微生物和大多数动物体内可自行合成维生素c ， 但是人类自身已经丧失了合成能力，必须从食物中摄取，而新鲜蔬菜和水果是抗 坏血酸最好的来源。 尽管抗坏血酸具有重要的功能，但到目前为止，人们对其生物合成的认识仍 不完全。早在1 9 3 3 年就已鉴定出抗坏血酸的分子结构，但对其生物合成途径的 发现则较晚。动物、微生物和植物中，抗坏血酸生物合成途径是不尽相同的。动 物和微生物中抗坏血酸生物合成途径揭示的较早，并成功的应用于生物发酵生产 抗坏血酸。1 9 5 4 年，i s h e r w o o d 提出植物中存在类似于动物的抗坏血酸代谢途径， 但没有找到转化的中间产物而未得到验证。2 0 世纪9 0 年代中期。重新引起人们 对植物抗坏血酸生物合成途径高度重视的起因来自于c o n k l i n 和l a s t 的突破性研 究工作，他们从拟南芥突变体中分离到抗坏血酸缺陷型。1 9 9 8 年，w h e e l e r 等根 据自己的研究工作，结合已有的知识积累，提出了植物抗坏血酸生物合成的甘露 糖l 半乳糖途径。以后，a g i u s 等( 2 0 0 3 ) 、w o l u c k a 等( 2 0 0 3 ) 、l o r c n c e 等( 2 0 0 4 ) 相继证实和提出了植物抗坏血酸生物合成的半乳糖醛酸途径、古洛糖途径及肌醇 途径。 植物抗坏血酸生物合成途径的发现具有极为重要的理论研究意义和实际应 用价值，意味着我们可以通过基因工程手段调控植物抗坏血酸合成和代谢，从而 增加其产品的营养品质，增强植物本身对逆境的抗性。但利用基因工程调控植物 抗坏血酸的生物合成依赖于对其代谢途径中相关酶编码基因的克隆和鉴定工作。 尽管对植物的抗坏血酸生物合成途径有了一定的认识，一些代谢相关的酶编码基 因陆续被克隆到，但对其进行调控的研究报道还不是很多。 不同的植物种类、不同的植物组织，含有不同的抗坏血酸浓度。叶片抗坏血 酸含量通常在2 5 a m o l g ，有些高山植物中的含量可在l o 倍以上，繁殖器官和 分生组织抗坏血酸含量也很高，果实是富含抗坏血酸的。但我们对造成这种差异 的原因，或控制的机理知之甚少。如果我们能有目的地控制不同组织和器官的抗 坏血酸代谢，将有利于增加植物产品的营养价值，同时增强植物本身的逆境抗性。 因此，本课题以番茄这一重要的蔬菜作物为材料，鉴定和克隆抗坏血酸相关 酶基因，通过基因工程调控番茄抗坏血酸的代谢，分析转基因番茄的植株生长、 抗氧化逆境的特性等。随着这些问题的解决，必将大大地促进有关植物抗坏血酸 代谢理论和实践的发展。 1 2 抗坏血酸在植物体内的生理功能 抗坏血酸是一种普遍存在于植物组织的高丰度小分子抗氧化物质，所有绿色 植物都能合成抗坏血酸，可以为人类提供丰富而方便的维生素c 源。抗坏血酸也 是植物体自身代谢过程中必不可少的物质，在植物的抗氧化作用、光合作用以及 生长发育等方面具有非常重要的生理功能。 1 2 1 抗坏血酸在植物抗氧化系统中的作用 植物在正常代谢过程中不可避免地会产生活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ， r o s ) ，一定浓度的r o s 是植物正常的生理过程中必需的，但r o s 生成过多会 造成细胞损伤，引起植物未成熟衰老和死亡。r o s 是指化学性质活跃的含氧原 子或原予团，包括超氧阴离子自由基、过氧化氢( h 2 0 2 ) 、单线态氧、羟自由基、 烷过氧化自由基、脂过氧化自由基等。r o s 可以破坏脂类、核酸和蛋白质，造 成氧逆境损伤，导致正常的生理过程遭到破坏( w a n g e ta 1 ，2 0 0 3 ) 。干旱、高温、 冷害、涝害等各种逆境会引起植物体内r o s 大量上升，造成r o s 伤害。抗坏血 酸可以直接清除植物体内包括单线态氧、超氧阴离子及羟自由基在内的活性氧 ( p a d h ，1 9 9 0 ) 等。其次，抗坏血酸能维持另一重要抗氧化剂维生素e 的还原态， 并通过抗坏血酸谷胱甘肽循环( a s a - g s hc y c l e ) 清除h 2 0 2 ( a s a d a ，1 9 9 2 ) ，从 而保护植物