（高分子化学与物理专业论文）低聚壳聚糖衍生物生物活性研究.pdf

摘要 壳聚糖及其衍生物因其具有良好的物理化学性质和医药功能，近年来在药 物研究及生物材料领域得到广泛的应用。另一方面，氧自由基包括 0 2 。、o h 、o r 等，是人体正常代谢的产物，在正常情况下，体内氧自由基的 产生和清除是平衡的。人体内少量氧自由基的存在，还可促进细胞增殖，加速细 胞的杀菌、消炎作用，一旦体内氧自由基产生过多或抗氧化体系出现故障，氧自 由基代谢就会失衡，成为引起衰老和许多疾病的重要因素，对有关清除氧自由基 的研究很有意义。低聚壳聚糖被证明具有较高的生物活性，而且其水溶性很强， 但是有关低聚壳聚糖衍生物生物活性的研究尚在起步阶段，本论文试图制备一系 列低聚壳聚糖担载小分子络合物，并研究其生物活性。论文首先对活性氧自由基 及其抗氧化剂的研究进展，以及壳聚糖及其衍生物的物理化学性能、生物活性新 进展进行了综述。 第二，首次将硫脲引入b p r c o “h 2 0 2 体系，建立了b p r 硫脲催化光度法， 以研究羟基自由基的产生与清除作用。对照实验结果表明：改进后的方法稳定性 好、操作简便、测定快速，可作为一种简便筛选抗氧化剂的方法。并采用b p r - 硫脲催化光度法测定水溶性低聚壳聚糖三种希夫碱钴配合物( 即：壳聚糖水杨醛 希夫碱钻配合物c s s a l c o 、壳聚糖香草醛希夫碱钴配合物c s v a l c o 、壳聚糖 2 , 4 二羟基苯甲醛希夫碱钴配合物c s d h c o ) 的抗羟基自由基的活性。实验结 果表明：低聚性壳聚糖希夫碱钻配合物对羟基自由基有一定的清除作用，其中， 低聚壳聚糖水杨醛希夫碱钴配合物c s s a l c o 的清除效果最好，清除率达到 9 5 4 。 第三，制备了低聚壳聚糖担载金属卟啉的络合物( m t a p p c s 、m t p p s 4 c s ， m = c u ，z n ，c o ) ，并通过红外光谱、紫外光谱进行了表征。用荧光探针法对 m t a p p c s 、m t p p s 4 一c s 与d n a 的相互作用做了初步分析，结果表明此类化合 物与d n a 有较强的相互作用。 采用s r b 染色法研究了低聚壳聚糖担载金属卟 啉的络合物( m t a p p c s 、m t p p s 4 一c s ，m = c u ，z n ，c o ) 对人体肝癌细胞7 4 0 2 的 抑制作用，结果表明，此类复配物对肝癌细胞的生长有良好的抑制作用，低聚壳 聚糖担载金属玎卜啉络合物的l g o 值在l o 一3 0 。u g m l 范围内，可作为抗癌药物前体， 做进一步的研究。 第四，以低聚壳聚糖为药物载体，与抗癌药物5 一氟尿嘧啶进行物理吸附得 到低聚壳聚糖5 一氟尿嘧啶复合物，利用红外光谱对其进行了表征。通过s r b 染色法研究了其对人体肝癌细胞7 4 0 2 的抑制作用，实验结果表明，c s ( 5 f u ) ( 5 ：1 ) 、c s ( 5 一f u ) ( 1 0 ：1 ) 有较好的抑制癌细胞生长的活性，i c 5 0 值为：3 1 6p 。g m l 、 5 8 8 g m l ，而c s ( 5 一f u ) ( 5 0 ：1 ) 的i c 5 0 值 1 0 0 1 t g m l ，已不具备抑制活性。 壳聚糖的引入，增强了药物与机体的生物相容性，有望利用高分子载体对小分子 的吸附作用降低药物毒性和副作用，引导药物直接到达病灶。 关键词：低聚壳聚糖，金属卟啉，5 氟尿嘧啶，s r b 染色法，活性氧自由基 b p r 硫脲催化光度法，抗氧化剂。 a b s t r a c t b a s e do nt h e i re x c e l l e n tp h y s i c a lc h e m i s t r yp r o p e r t i e s a n dp h a r m a c e u t i c a l f u n c t i o n ，c h i t o s a na n dt h e i rd e r i v a t i v e sh a v eb e e na p p l i e di nt h ep h a r m a c e u t i c a lf i e l d a n db i o l o g i c a lm a t e r i a l s i nt h i st h e s i s ，w eh a dp r e p a r e das e r i o u so fl o wm o l e c u l a r w e i g h tc h i t o s a ns u p p o r t e dm e t a lc o m p l e x e sa n ds t u d yt h e i rb i o a c t i v i t y f i r s t l y , t h e r e h a v er e v i e w sw i t ht w ot o p i c s ：o n ef o c u so nt h ed e v e l o p m e n to fs t u d i e so fa c t i v e o x y g e nf r e er a d i c a la n da n t i o x i d a n t a n o t h e ri sa b o u tp h a r m a c e u t i c a lf u n c t i o na n d b i o l o g i c a la c t i v i t i e so fc h i t o s a na n dt h e i rd e r i v a t i v e s s e c o n d l y , an e ws y s t e mc 0 2 + - h 2 0 2 一b r o m o p y r o g a l l o lr e d ( b p r ) w i t ht h ec a t a l y s t o ft h i o u r e af o ri n v e s t i g a t i n gh y d r o x y lf r e er a d i c a l ( + o h ) i sd e v e l o p e df r o mt h e t r a d i t i o n a la s s a ys y s t e m t h es y s t e mp r o d u c e sc a t a l y t i c a l l yh y d r o x y lf r e er a d i c a lb y t h i o u r e a a c c o r d i n gt ot h ei n t e r a c t i o no fh y d r o x y lf r e er a d i c a la n db r o m o p y r o g a l l o l r e d ，t h ea m o u n to fh y d r o x y lf r e er a d i c a lp r o d u c e di nt h es y s t e mc a l lb ei n d i r e c t l y a s s a y e dt h r o u g ha b s o r b a n c ec h a n g ea tw a v e l e n g t ho f5 5 3 5a mi ns p e c t r o p h o t o m e t e r c o m p a r e dt ot h er e s u l t ，t h em e t h o dp r o v e dt ob er a p i d ，s i m p l ea n ds t a b l e i tc a nb e u s e dt os e l e c ta n t i o x i d a n t s t h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t i e so fs c h i f fb a s ec o b a l tc o m p l e x e so fl o wm o l e c u l a r w e i g h tc h i t o s a n ( c s ) w e r ea s s a y e db yt h ec a t a l y t i co x i d a t i o nr e a c t i o nw i t hb p ra n d t h i o u r e a t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tc ss c h i f fb a s ec o b a l tc o m p l e x e sc a l ls c a v e n g e h y d r o x y lf r e er a d i c a l ( 0 均，a n dc ss a l i c y l a l d e h y d es c h i f fb a s ec o b a l tc o m p l e xi s s u p e r i o rt oo t h e r s t h i r d l y , l o w m o l e c u l a rw e i g h tc h i t o s a n ( c s ) s u p p o r t e dm e t a l l o p o r p h y r i n c o m p l e x e s ( m t a p p c s 、m t p p s 4 一c s ，m = c u ，z n ，c o ) w e r ep r e p a r e d t h e s e c o m p l e x e sw e r ec h a r a c t e r i z e db yi c pa n du v v i sa n a l y s i s t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n m t a p p c sa n dm t p p s 4 c sw i t hd n aw a si n v e s t i g a t e db yf l u o r e s c e n tp r o b e t e c h n i q u e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tm t a p p c sa n dm t p p s 4 一c sc a nd e s t r o yt h e s t r u c t u r eo fd n a t h ea n t i t u m o ra c t i v i t i e so ft h e s ec o m p l e x e sw e r es t u d i e db ys r b a s s a y i tw a s f o u n dt h a tt h e s ec o m p l e x e ss h o ws t r o n ga n t i t u m o ra c t i v i t i e s f i n a l l y , t h ec ss u p p o f l e d5 - f l u o r o u r a c i lw a sp r e p a r e db yp h y s i c a la d s o r p t i o no f 5 一f l u o r o u r a c i li n t oc s t h ea n t i t u m o ra c t i v i t yo ft h i sp r o d u c tw a se v a l u a t e di nv i t r o b yu s i n gs r ba s s a y t h ea n t i t u m o ra c t i v i t i e sd e c r e a s e dw i t hi n c r e a s i n go ft h er a t i oo f c sa n d5 - f l u o r o u r a c i ! t h er e s u l t ss h o wc s o f u ) ( 5 ：1 ) a n dc s ( 5 一f u ) ( 1 0 ：1 ) h a v e g o o da n t i t u m o ra c t i v i t i e s ，a n di t si ( 2 5 0i s3 1 6i t g m la n d5 8 8 斗g m lr e s p e c t i v e l y i t c a nb ec o n d u d e dt h a tn a t u r a lm a c r o m o l e c u l e d m gc o m p o s i t ec o u l dl e a dd r u g s d i r e c t l yi n t oat u m o ro rt or e l e a s et h et o x i c i t yo fs m a l lm o l e c u l ea n t i t u m o rm e d i c i n ea t t h es a m et i m e c o m p a r e dw i t hc h e m i c a lb i n d i n g ，p h y s i c a la b s o r b i n gi ss i m p l ea n d e f f e c t i v e k e yw o r d s ： c h i t o s a n ，m e t a l l o p o r p h y r i n ，5 一f l u o r o u r a c i l ，s r b ，a c t i v eo x y g e n r a d i c a l ，b p r ，a n t i o x i d a n t 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得西北师范大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示了谢意。 签名：鱼垒匈一曰期：丛2 ：互 关于论文使用授权的说明 本人完全了解西北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以 公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保 存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名： 塑垒自 导师签名： 磊蒸。趔 曰期： 丛。： 西北师范大学硕士学位论文谢云涛第1 负 第一章文献综述 第一节氧自由基及抗氧化剂的研究进展 一、自由基概述 1 自由基的概念 对自由基的研究，已有较长的历史。不同时期，自由基的概念和定义也有 所不同。自由基的概念，是1 8 世纪末化学家们在研究化学时提出来的，只是猜 测一些不稳定集团，如甲基可能存在。到1 9 0 0 年，用银处理氯化三苯甲基制备 六苯乙烷时，偶然发现了三苯甲基自由基，逐渐积累了许多这类实验数据。到 2 0 世纪初，提出自由基具有奇数个电子，应当是顺磁性的，并且利用瞬时自由 基的概念解释了一些化学反应，如聚合反应和链式反应的机理。 2 0 世纪5 0 年代末，发现了电子自旋共振仪器，为自由基的研究提供了一个 非常有力的手段和方法，极大地推进了自由基研究的过程。当时就更明确地提出 自由基的定义：一个分子或分子的一部分，它的化学键经过修饰之后一个未成对 电子留在这个体系。在大量化学反应中出现的有机自由基，如甲基自由基、三苯 甲基自由基等是很符合这一定义的。但还有很多具有顺磁性的物质，如氧气，虽 具有两个未成对电子，但未经过化学修饰，也就不属于自由基，因而定义为顺磁 性物质。大量过渡金属离子也具有一个到多个未成对电子，不属于自由基，因而 定义为顺磁性的过渡金属离子。直到1 8 世纪7 0 年代，对自由基的定义仍保持着 这一含义，即“均裂产生的包含一个未成对电子的分子或原子团称为自由基”， 其中仍包含化学反应和一个未成对电子两重意思。 8 0 年代，一些研究者对自由基的定义进行了扩展，提出“任何能够独立存 在的，包含一个或多个未成对电子的原子或原子团都称为自由基”。比前一个定 义包含的面大了很多，前面所说的具有两个未成对电子的三重态氧和具有多个未 成对电子的过渡金属离子，都属于自由基的范畴。现倾向于这样的定义：“任何 包含一个未成对电子的原子或原予团，均称之为自由基”【1 l o 自由基( 包括o2 。、h o 、r o 等) 是引起衰老和人类许多疾病的重要因素， 例如癌症、多发性硬化症、帕金森疾病、自身免疫疾病、局部缺血、贫血症、老 年痴呆病、慢性肺炎等都与自由基有关【2 , 3 1 。近年来，国内外对自由基及其清除剂 第2 页第一章文献综述 的研究十分活跃，氧自由基生物学已成为一门新兴的学科，目前的研究主要集中 于氧自由基的物理化学性质、自由基的产生、反应及清除的机理，天然药物或食 物中的某些成分对氧自由基的清除效果，以及天然的抗氧化剂的筛选等方面【4 1 。 现在人们也越来越认识到清除体内过剩自由基的重要性，因此寻找能够清除活性 氧自由基并具有治疗作用的抗氧化剂具有十分重要的意义。 2 自由基的性质及其产生 2 1 自由基的性质 从自由基的定义可知，自由基有三个明显的特点，一是反应性强，二是具 有顺磁性，三是寿命短。 自由基的基本特征是具有一个未成对电子，具有强烈的配对倾向，所以大 多数自由基都很活泼，反应性极强，容易反应生成稳定分子，这是自由基的一个 非常重要的性质。自由基也很容易与其它分子或自由基反应生成新的自由基，由 此引发连锁反应。自由基清除剂的作用就是阻止连锁反应的引发或抓住已引发出 来的自由基从而切断连锁反应。 自由基的化学性质可归纳以下几点【1 】： ( 1 ) 抽氢反应 这是一个非常普遍的自由基反应，自由基从反应物中抽取一个氢，形成新 的自由基。r - + a - h 斗r h + a 典型例子有：c h 3 十c 1 2 + c h c l 3 十c l c l + c 2 h 6 + h c i + c 2 h 5 ( 2 ) 自由基化合反应 两个自由基互相结合自我湮灭的反应 r +r + r r ( 3 ) 歧化反应 两个自由基反应，一个被氧化，一个被还原。 2 - c h 3 一c h 2 + c h z = c h 2 + c h 3 一c h 3 ( 4 ) 加和反应 r + a c 每c b 卜a c e b i r c 1 + a c - e b a c 。- c 一b r re l ( 5 ) 芳环取代 a r h + c 6 h 5 _ ar c 6 h 5 + h 。 西北师范大学硕士学位论文 谢云涛第3 页 a r h c 6 h s a r + c 6 h 6 ( 6 ) 链式反应 c l ，+ 2 c 卜 c l + h r 卜h c l + h h + c l _ 厂卜h c l + c 卜 h + h h ， c l + c 1 c l ， h + c l h c l 2 2 氧自由基的产生 据文献报道人体内总自由基中约9 5 以上属于氧自由基，因此，氧自由基 对人体有着特殊的意义【5 】，现将常见的氧自由基列于表1 - 1 。 表1 - 1 常见的氧自由基 氧自由基的来源主要有两个方面，一方面是由紫外线和宇宙射线的照射、 电离辐射、以及某些药物、农药、食物添加剂、酒精、吸烟或高压氧中毒等，这 些称外源性自由基；二是机体在代谢过程中产生自由基，即内源性自由基。内源 性自由基的产生途径【6 】： 红细胞内的氧合血红蛋a 可自发转变为高铁血红蛋白从而铁供出电子给 生成o 。 细胞内有的酶促反应以0 2 为受氢体h 2 0 2 可以与0 2 在f e z + 或c u + 存在 下反立生成h o o 第4 页 第一章文献综述 微粒体混合功能氧化酶催化药物等非营养性物质羟化时，有黄素蛋白及 细胞色素p 4 5 0 及0 2 参加，反应中有0 2 生成。 体内的醌类化合物，如辅酶c 的代谢产物可在氧化还原中生成半醌自由 基，后者将单电子交给0 2 生成0 2 - o 吞噬细胞的“呼吸爆发”在补体、c a 2 十白三烯或内毒素等的刺激下。吞噬 细胞的氧摄取量增加，其胞膜下n a d p h 氧化酶活性增高，将0 2 还原为o 。、 黄嘌呤氧化酶增多，黄嘌呤氧化酶( x a n t h i n eo x i d a s ex 们的前身是黄嘌呤 脱氢酶，存在于毛细血管内皮细胞内，正常人只有1 0 的x o 的形式存在，9 0 为x o ( 黄嘌呤脱氢酶) 。缺血时由于a t p 减少，膜泵功能失灵，c a 2 + 依赖蛋白水 解酶，使x d 大量转变为x o 缺血时a t p 不能用来释放能量，而且还依次降解 为a d p 、a m p 和次黄嘌呤，结果黄嘌呤大量堆积。再灌注时，大量的分子氧随 血液进入缺血组织，此时大量增加的黄嘌呤氧化酶在催化次黄嘌呤转变为黄嘌 呤，进而黄嘌呤转变为尿酸的两步反应中，都同时以分子氧为电子接受体，从而 产生大量的0 2 。和h 2 0 2 ，后者再在金属离子参与下形成h o o 因此，再灌注时 组织内0 2 。等氧自由基大量增加。 儿茶酚胺的增加。交感一肾上腺髓质系统是肌体在应激时的重要调节系 统。在各种应激情况下，此系统分泌大量的儿茶酚胺，儿茶酚胺一方面具有重要 的代偿调节作用，但另一方面过多的儿茶酚胺特别是它的氧化产物。往往又成为 对机体有害的产物。实验表明，大量的异丙肾上腺素、去甲肾上腺素、肾上腺素 均能损伤细胞。儿茶酚胺的氧化产物会损伤心肌。儿茶酚胺氧化能产生具有毒性 的氧自由基。肾上腺素代谢产生肾上腺素红的过程中有0 2 。的产生。 磷脂一花生四烯酸途径。胞浆c a 2 + 激活烯脂酶a 2 使膜磷脂降解，释放花 生四烯酸( a a ) ，a a 在环氧化酶的作用下依次生成p c e 2 、p c h 2 、p c i 2 等，同时 伴有自由基的产生；在5 - 脂加氧酶的作用下，生成白三烯等，在1 2 脂加氧酶作 用下生成2 - h e t e 。 3 氧自由基对机体的损伤1 7 】 氧自由基对细胞和组织的损伤是其致病的基础，由于人体是由各种不同功 能的细胞组成，因而自由基对不同细胞的损伤可导致表面看起来毫无关系的疾 病，如：自由基摧毁细胞膜，导致细胞膜发生变性，使得细胞不能从外部吸收营 养，也排不出细胞内的代谢产物，并丧失了对细胞和病毒的抵御能力。自由基攻 击正在复制中的基因，造成基凼突变，诱发癌症发生。 西北师范大学硕士学位论文 谢云涛第5 页 3 1 超氧阴离子自由基o 。 o 二不仅具有重要的生物功能，还与多种疾病有密切关系，同时它还是生 物体生成的第一个自由基，是所有自由基的前身。因此具有深刻重要意义。o 。有 多种反应性，它即可以作为还原剂，又可以作为氧化剂，还可以作为碱，亲核物 和配体参与反应。氨基酸是构成蛋白质的基本单元，在重要的氨基酸中，除半胱 氨酸，组氨酸，胳氨酸，苯丙氨酸外，o 玉与大多数氨基酸几乎不反应，由于 o 。在非质子性溶剂中溶解性更好，生物膜是疏水性的，因此在这种环境中产 生的0 2 。极具危害性。0 2 。的损伤效应主要是使核酸断裂，多糖解聚，不饱和 脂肪酸过氧化，造成损伤等等。0 2 。不是格外活性的物种，0 2 。的毒性小，但 是存在寿命长。 3 2 羟基自由基 羟基自由基是化学性质最活泼的活性氧物种，其反应特点是无专一性，反 应性极强，在机体内一旦形成可立即通过提取氢，加成或电子转移等方式与生物 体内所有物质，如糖，蛋白质，d n a ，碱基，磷脂和有机酸等发生反应，而且 反应速率快，极具破坏性，能造成多种生物分子，细胞和组织的氧化损伤。 f 1 1 损伤蛋白质，使蛋白质的转换增加。羟基自由基对蛋白质的进攻，主要 是通过从蛋白质多肽链的饱和碳原予上提取氢或氧化蛋白质的巯基而进行。其次 级反应的结果使多肽链问发生交联，形成桥键或交错键，引起蛋白质( 或酶) 的 结构改变，其生物活性受损或丧失，还可使蛋白质大分子混乱聚合成酸且呈代谢 惰性，在细胞内聚集并排挤正常成分，引起细胞退行性变化。 ( 2 ) 损害d n a 导致细胞突变。羟基自由基既能从d n a 的戊糖部位提取氢 形成戊糖自由基，碱基自由基或戊糖自由基均可发生次级反应，造成d n a 碱基 降解或缺失，氢键破坏或主链断裂，从而改变核苷酸结构或排列，破坏其携带的 遗传信息，引起细胞突变。 ( 攻击未饱和脂肪酸，引起脂质过氧化对于重要生物结构之一的生物膜， 包括细胞膜或亚细胞膜( 内膜系统) 。羟基自由基主要进攻部位是膜组分磷脂中 的未饱和脂肪酸，引发一系列自由基链式反应，生成多种脂质过氧化物。生物膜 脂质过氧化的后果是使膜的结构和功能改变，如未饱和脂肪酸减少，磷脂组成发 生变化，膜流动性降低，通透性增加，膜上蛋白质或酶损伤失活及脂质过氧化作 用的有毒产物对细胞与亚细胞膜的毒性效应等等。最终造成整个细胞结构与功能 的损伤。 第6 页第一章文献综述 3 3 脂质过氧化物( l p o ) l p o 指脂类中的不饱和脂肪酸与自由基发生的过氧化过程生成烷氧自由 基，过氧自由基，有机氢过氧物和激态羰基等产物的总称。脂质过氧化会损坏线 粒体膜结构，破坏线粒体呼吸和氧化磷酸化，增加膜的通透性，使膜离子转用机 制紊乱，造成细胞损伤。 3 4n o 自由基 它的某些作用机理虽未搞清，但发现n o 自由基具有多方面的重要作用。 n o 是内皮细胞松弛因子。能够松弛血管平滑肌，防止血小板凝聚，是神经传导 的逆信使，在学习和记忆过程中发挥重要作用。研究表明细胞，特别是吞噬细胞 在吞噬异物或受到刺激时，不但产生活性氧自由基，同时还释放大量n o 自由基 来杀伤入侵的微生物和肿瘤细胞。n o 自由基也可损伤正常细胞，在心肌和脑组 织缺血再灌注损伤中起着重要作用。 4 氧自由基与人体健康的关系 自由基是人体正常的代谢产物，正常情况下人体内自由基是处于不断产生 与清除的动态平衡中。人体内存在少量的氧自由基，不但对人体不构成威胁，而 且可以促进细胞增殖，刺激白细胞和吞噬细胞杀灭细菌，消除炎症，分解毒物。 但如果人体内氧自由基的数量过多，就会破坏细胞结构，引起脂质过氧化，干扰 人体的正常代谢活动，它直接作用与核酸，导致碱基的修饰和d n a 链的断裂， 引起疾病，加速人体衰老进程【4 】。 4 1 氧自由基与人体衰老的关系 人类机体的衰老是一个极为复杂的过程。正常生理情况下，机体内产生的 少量自由基可被体内抗氧化酶或抗氧化剂迅速清除，通常不会产生细胞损伤作 用。这些抗氧化酶类包括超氧化物歧化酶( s o b ) 、谷胱甘肽过氧化物fg s w p x ) 、 过氧化氢酶( c a t ) 以及谷胱甘肽还原酶( g s h r ) ，抗氧化剂类包括维生素a 、维 生素e 、维生素c 、硒、谷胱甘肽、半胱胺、类胡萝h 素等。但随着年龄的增长， 抗氧化酶活性不断降低或摄入的抗氧化剂不足，体内产生的过量氧自由基不能被 及时清除，这样就使自由基的产生与清除失去了平衡。过剩的自由基可迅速与机 体内的核酸、蛋白质、氨基酸、腊质等发生反应，生成氧化物或过氧化物，破坏 了生物膜的精细结构，造成细胞代谢和功能形态的改变，从而引起细胞衰老和死 亡。脂质过氧化物( l p o ) 还可使结缔组织中的胶原蛋白产生交联而收缩，使皮肤 出现皱纹，并形成脂褐素沉积在内脏器官和皮肤上，加速了细胞以及整个机体的 西北师范大学硕士学位论文 谢云涛第7 页 衰老进程。因此，自由基导致的脂质过氧化、细胞破裂和退行性病变是衰老的主 要原因i 。 由自由基引起的机体衰老的主要机制可概括为以下3 个方面1 9 】： ( 1 ) 生命大分子的交联聚合和脂褐素的累积自由基作用于脂质发生过氧化反 应，其最终产物丙二醛( m d a ) 等会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合， 该现象是人体衰老的一个基本因素。丙二醛与蛋白质等生命大分子的交联聚合所 形成的产物脂褐素在细胞内堆积，就会使人体皮肤失去弹性，出现老人斑，记忆 力下降，视力减退等衰老现象。 ( 2 ) 器官组织细胞的破坏与减少氧自由基引起的脂质过氧化会造成细胞膜与 细胞器膜的破坏，另外氧自由基作用于核酸会引起基因突变，改变遗传信息传递， 导致蛋白质与酶的合成错误，也造成器官组织细胞的老化和死亡。 ( 3 ) 免疫功能的降低自由基作用于免疫系统，引起老年人细胞免疫与体液免 疫功能减弱，引起自身免疫性疾病，也是造成人体衰老的重要原因。 4 2 氧自由基与疾病的关系。 氧自由基几乎和人类的大部分常见疾病都有关系。近年发现与活性氧自由 基有关的疾病有6 0 种以上。在神经系统，早老性痴呆症，震颤麻痹，癫痫等疾 病都有氧自由基的参与；在消化系统，胃炎、消化性溃疡、胃癌、溃疡性结肠炎、 肝硬化、原发性肝癌、急性胰腺炎、胆石病等；在泌尿系统，原发性肾小球疾病、 慢性肾小球肾炎、肾病综合症、急、慢性肾功能不全、慢性前列腺炎等；在代谢 内分泌系统，糖尿病、肝豆状核变性、类风湿关节炎、红斑狼疮等；在呼吸系统， 上呼吸道感染、支气管哮喘、呼吸衰竭、肺水肿、肺炎【1 0 l 等；在外科系统，肺癌、 食管癌、胸部创伤等；在免疫反应的炎症中，巨噬细胞呼吸爆发释放大量氧自 由基【1 】。还有皮肤上的色斑形成，角质层增生、粗糙等衰老现象的发生无不与自 由基、脂质过氧化有着密切关系| 8 j 。 活性氧在生物体内可以造成d n a 多种形式的损伤：单键断裂、双键断裂、 链内交联、链间交联、碱基修饰、腺嘌呤丢失等。这些损伤引起d n a 结构的改 变和功能的抑制或变化，从而使d n a 中遗传信息的稳定性受到不同程度的破坏， 具有诱发肿瘤的潜在威胁【l ”。癌症的发生及发展分为致癌、促癌和癌的形成和发 展3 个阶段，每一阶段均有自由基的产生和参与【1 j 。大部分的致癌物如苯、苯并 芘、亚硝基化合物等，都是由较惰性的物质经生物转化成能与细胞成分反应的高 活性物质，其转化的过程常常会产生一些自由基中问物，在有氧的条件下，进一 第8 页 第一章文献综述 步形成反应活性很强的羟基自由基和单线态氧，从而对细胞成分引起损伤，诱发 癌症。 自由基与人类的心血管疾病也密切相关。心力衰竭、冠状动脉粥样硬化性 心脏病、心肌病、原发性高血压、病毒性心肌炎、血栓的形成、心肌缺血再灌注 损伤等的发病过程中氧自由基起着重要作用；如缺血再灌注损伤就是由于在缺血 的条件下，组织细胞内的黄嘌呤脱氢酶被转化为黄嘌呤氧化酶，同时细胞内的 a t p 被分解为黄嘌呤氧化酶的作用底物次黄嘌呤，当血液再灌注时，氧分子重 新进入组织，与组织中积累的次黄嘌呤发生反应，生成活性氧自由基( 0 2 - 、h 2 0 2 和h o ) 。这些活性较强的氧自由基进攻细胞成分，造成细胞脂质膜的过氧化 和线粒体损伤。而脂质的过氧化是产生动脉硬化的重要原因。使用维生素e 、谷 胱甘肽、维生素c 等清除剂对脂质过氧化有保护作用。自由基参与的蛋白质氧 化还原反应，会使组织蛋白受损害而引发动脉粥样硬化等疾病。 二、自由基的检测方法 由于活性氧具有较高的反应活性，它们可以与许多不同的化合物发生化学 反应，由此产生各种不同的反应生成物，根据这些反应生成物或者反应物的变化 程度可以进行定量或者定性分析。通常采用的仪器分析方法有，电子自旋共振捕 集法、化学发光法、紫外可见吸收分光光度法、荧光光度法、电极测定法等。 1 电子自旋共振捕集法( e s r ) 自由基上的电子具有自旋特性，其旋转过程会产生一个自旋磁矩。如果自 由基处于一个外磁场中，其电子的自旋磁矩与外磁场平行时，能量最低：而当电 子的自旋磁矩与外磁场反平行时，能量最高。用辐射的方法给处在低能级的电子 一个相当于能级差的能量，使其跃迁至高能级，此过程称为共振。将此共振信号 收集并放大，即可得到e s r 波谱，可用作判定自由基的存在和浓度。因为自由 基的寿命非常短，将一种不饱和的抗磁性物质( 称为自旋捕集剂) 加入到要研究 的反应体系中，生成寿命较长的自旋加合物，即可用自旋共振仪对自由基进行检 测。e s r 作为活性氧的化学反应后的检测方法，可以理解成是一种自由基的标识 反应，即向活性氧生成的反应体系中添加本身带有不对称电子的自由基，这一添 加物与活性氧发生反应后失去不对称电子，从而导致e s r 信号的变化。u t s u m i ”】 等在研究生物机体或者生物膜的构造过程中，使用了硝基木酮自由基作为反应的 添加物，硝基木酮自由基在与0 2 。，h o 或者生物微粒体( m i c r o s o m e ) 等的电 西北师范大学硕士学位论文 谢云涛第9 页 子传输系统发生反应过程中，被还原生成羟胺或者羟氨基，从而失去单自旋电子， 在e s r 测定中体现为信号的减弱。另外，t m p ( 2 ，2 ，6 ，6 - t e t r a m e t h y l 一4 一p i p e r i d o n e ) 类似的哌啶衍生物，在1 0 2 的作用下，可与硝基木酮自由基发生氧化还原反应， 也可应用于1 0 2 的测定。但是，这方法同样存在测定选择性差的问题，除了1 0 2 以外，其他种类的活性氧或者电子供给体同样可以向硝基木酮自由基提供电子， 影响e s r 信号的判断，需要得到进一步改进和完善。 2 化学发光法 化学发光测定法是仪器分析中灵敏度最高的方法之一，已在医学、环境以 及工业分析等许多领域里得到广泛的应用。活性氧的化学发光研究也是活性氧测 定法研究领域中比较活跃的分支之一，特别是针对h 2 0 z 测定，有许多灵敏度高、 选择性好的化学发光体系。近年来，在h 2 0 2 测定方面开发了一系列高灵敏度的 化学发光分析法。除此之外，目前比较成功的活性氧化学发光测定法主要有鲁米 诺法( l u m i n o l l 、光泽精法( 1 u c i g e n i n ) 和c y p r i d i n al u c i f e r i n a n a l o g ( c l a ) 法。氧自 由基在反应过程中，释放能量，产生化学发光，利用高灵敏度发光仪可直接观察。 为了提高观察效果，通常加入鲁米诺( l u m i n 0 1 ) 等作为光增效剂。活性态氧可 使增效剂氧化激发，回到基态时释放特定波长的光，测定其发光强度即可推算自 由基的浓度1 1 3 j 。t a w a 等f 1 4 】对鲁米诺化学发光法与e s r 测定h o 的结果作了比 较，表明化学发光法测定h o 是有效的，他们还研究了抗坏血酸、维生素e 和 s o d 对h o - 的清除作用。 通常，鲁米诺在碱性溶液( p f l - - - - 1 0 左右) 中，首先形成单价阴离子，然后在 催化剂，如酶，“2 + 、c 0 2 + 、n i 2 + 和c u 2 + 等过渡金属离子或者金属络合物的催化 下与溶液中的溶解氧或者过氧化氢发生氧化还原反应，生成激发态的两价阴离子 氨基肽酸盐f a p d ) ，a p d 经非辐射性跃迁回到基态时，放出光子。自从1 9 2 8 年 a l b r e c h t 巧】发现鲁米诺的化学发光现象以来，其化学反应发光机理仍然没有得到 解决。 3 紫外一可见吸收分光光度法 活性氧的分光光度测定，最常用的方法有细胞色素( c y t o c h r o m ec ) 的氧化 法和硝基四氮唑蓝( n i t r ob l u et e t r a z o l i u m ，n b n 还原法1 1 3 】。具有氧化活性的细 胞色素c 被0 2 一- 还原后，形成了在波长5 5 0l l m 处有强吸收的亚铁细胞色素， 可以用于0 。2 的直接测定，在s o d 存在下o 。受到s o d 的催化形成h 2 0 2 和 0 2 ，可用作s o d 的间接定量分析法。但是，还存在着其它还原性物质，如h a d p a 第1 0 页第一章文献综述 和还原性酶的干扰，一般情况下无法直接用于0 2 。的定性分析，需要比较在 s o d 的存在下，是否还有0 2 一与细胞色素c 发生反应的结果，从而判断的生成 与否。细胞色素c 氧化法主要用来测定o h 自由基。其原理是o h 自由基可 以使细胞色素c 从还原型转化为氧化型： o h + c y t c ( i i ) 斗o h 一+ c y t c ( i i i ) 还原型的细胞色素c y t c ( i i ) 呈浅红色，而氧化型的细胞色素c y t c ( 1 1 1 ) 呈浅黄色。 在o h 体系中加入细胞色素c y t a i i ) ，在一定温度下培育一段时间，然后用分 光光度计测定一定波长下的吸光度，与空白对照，即可确定体系中o h 的量。 n b t 在0 。的作用下，还原生成不溶于水、蓝色的二甲替( d i f o r m a z a n ) ，它的 最大吸收波长5 6 0n r n ，吸光系数达1 0 ，0 0 0 以上，测定灵敏度相当高。 徐向荣等【1 6 1 利用f e n t o n 反应产生的羟自由基与二甲亚砜反应，生成甲基亚 磺酸，再与坚牢蓝b b 盐反应生成偶氮砜，比色法测定其含量可间接测定o h 的生成量。并用此方法对抗氧化剂药物硫脲和抗坏血酸对羟自由基进行测定，发 现有明显的量效关系。刘骏m 建立了一种以结晶紫作显色剂，在p h = 4 0 条件下， 用分光光度法测定f e n t o n 反应所产生的羟自由基与结晶紫作用后在5 8 0l l m 处的 吸光度变化，以间接测定羟自由基的生产量。方光荣等【1 8 】研究了上述结晶紫 一f e n t o n 反应体系对天然中药银杏叶清除羟自由基的作用，实验证实该法稳定而 有效。其他测试方法还有甲苯胺蓝光度法【1 9 】、甲基紫光度法 2 0 1 、罗丹明b 显色 法1 2 1 】、b p r ( 溴邻苯三酚红) 催化光度法【2 2 培。 4 荧光光度法 与化学发光一样，荧光分光光光度法也是灵敏度高，操作简便的分析方法 之一。利用自身具有荧光的物质作为探针与氧自由基反应，反应前后其荧光强度 的变化能间接反映出清除氧自由基的效率。吴南等【2 3 】利用苯基荧光酮 ( p h e n y l f l u o r o n e ，简称苯芴酮) 与f e n t o n 试剂作用，测定f e n t o n 反应所产生的 羟自由基，反应后苯基荧光酮荧光大大降低，其最大激发波长和发射波长分别为 5 0 0 n m 和4 2 0 n m ，基于其反应前后的荧光变化，即可间接地测定羟自由基的产 生量。同时通过清除率实验反证了该方法的可靠性，利用顺磁共振法测定苯基荧 光酮加入前后的波谱变化来进一步证实该方法的正确性。弱荧光物质苯甲酸可以 和o h 反应生成强荧光产物。据此原理可以测定抗氧化剂对h o 的清除。 实验结果表明：此荧光法与分光光度法测定结果相比无显著性差异。赫春香等 2 5 , 2 6 】研究了荧光动力学分析法检测超氧自由基抑制剂抗氧活性的方法。在 西北师范大学硕士学位论文谢云涛第l l 页 t r i s h c i 缓冲溶液中( p h = 8 2 0 ) ，邻苯三酚自氧化产生超氧自由基和有荧光效率 的自氧化产物。在4 3 3 0 n m 激发波长和4 9 4 5n m 发射波长条件下，该自氧化产 物时间扫描曲线的斜率与超氧自由基抑制剂的浓度有相关性。结果表明该方法测 定灵敏度优于u v 法，而与单扫描极谱法( s s p ) 相当，但比s s p 法操作简单、 准确度好。并利用荧光动力学分析法研究了5 种酮类化合物对0 2 。和h o 清除 作用5 种酮类化合物使0 2 和h o 的产生速率明显降低。g e r a l dl n e w t o n 等 口”以芳环有机化合物作为探针，检测其与h o 反应后的羟基化产物的荧光值， 发现此方法对h o 有较高的选择性。 5 电极测定法 利用选择性电极法测定活性氧的报道相对比较多，比较成功的例子是利用 过渡金属镍一卟啉的高分子膜微电极测定单一细胞中的n o 1 3 】，n o 的检测限达 1 0 。2 0m o l ，并且选择性也相当不错。还有一类比较成功的研究是h 2 0 2 电极法测 定，采用电沉积的方法，把聚毗咯( p o l y p y r r o l e ) h r p 覆盖在玻碳电极表面，作为 h 2 0 2 的传感器，这种复合电极的可使用酸度范围在p h5 1 - 9 0 ，非常适合于生 物样品的分析。从现有的报道来看，活性氧电极大多是建立在酶催化的基础上， 在测定过程中，往往出现酶不断脱离作为其支持体的高分子膜，容易导致电极寿 命缩短和测定结果不稳定的问题。酶固定方法是电极法今后发展的方向之一。 三、氧自由基清除剂 自由基清除剂是指能清除自由基或能阻断自由基参与的氧化反应的物质。 自由基清除剂可分为酶类清除剂和非酶类清除剂两大类【嚣】。酶类清除剂一般为抗 氧化酶， 酶类清除剂一般为抗氧化酶，主要有超氧化物歧化酶( s o d l 、过氧化 氢酶( c a t ) 和谷胱甘肽过氧化酶( g s h p x ) 。非酶类自由基清除剂一般是一些抗 氧化剂，如天然药物类、维生素类、活性元素类、天然活性成份类和还原型谷胱 甘肽( g s h ) 等。 1 酶类自由基清除剂【4 】 1 1 超氧化物歧化酶( s o d ) s o d 存在于几乎所有靠氧呼吸的生物体内，包括细菌、真菌、高等植物、 高等动物和人体中均存在s o d os o d 是一类含金属的酶。按其所含金属辅基不 同可分为含铜锌s o d ( c u ，z n s o d l 、含锰s o d ( m n s o d ) 和含铁 s o d ( f e s o d ) 。s o d 对氧自由基有强烈清除作用，特别对于0 2 。，s o d 可将 其催化歧化而生成h 2 0 2 和0 2 ，故s