荭草素和异荭草素对照品的制备.doc

荭草素和异荭草素对照品的制备作者：赵平 李勇军 何迅 王爱民 王永林【摘要】 目的： 建立荭草素和异荭草素对照品的制备方法。方法: 用萃取、硅胶柱层析、重结晶等方法对荭草水提取物进行分离纯化，通过MS、IR、1HNMR、13CNMR对其分离产物进行结构鉴定。结果: 薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）检测分析，荭草素和异荭草素的纯度分别为98.03%和98.26%。结论: 本方法简便,产品纯度高,该对照品可作为控制荭草及其制剂质量的指标成分。 【关键词】 红蓼； 色谱法，薄层； 色谱法，高压液相； 荭草素； 异荭草素； 对照品 Abstract Objective: To establish a method for preparing the reference substances of orientin and isorientin. Methods: Orientin and isoorientin were isolated and purified from the water-extract of Polygonum orientale by solvent extraction, silica gel column chromatography, and recrystallization. Their structures were determined by spectroscopic methods (MS, 1H- and 13C-NMR).The purity of the products was meaeured with thin-layer chromatography(TLC)and high pressure liguid chromatography(HPLC) Results: TLC and HPLC analysis showed that the purity of orientin and isoorientin was 98.03% and 98.26% respectively. Conclusion: The method developed is simple and effective for producing products with high-purity.The products obtained can be used as index in the quality control of Polygonum orientale and its pharmaceutical preparation. Key words Polygonum orientale; chromatography,thin layer; chromatography,high pressure liquid; orientin; isoorientin; reference substance 荭草为蓼科植物荭蓼(Polygonum orientale L.)的干燥果穂及带叶茎枝，具有清热解毒、祛风除湿、活血消肿的功效，用于治疗风湿性关节炎、冠心病、疝气、疮肿等1。前期的研究已从荭草中分离得到黄酮、木脂素、甾体皂苷等多类成分24。最近对该植物的化学成分和质量研究也证实，以荭草素和异荭草素为主的黄酮苷是其水溶性部位的主要成分5，6。在随后的药理筛选实验中，发现荭草水溶性部位有较好的抗心肌缺血和抗缺氧。这些研究结果表明，以荭草素和异荭草素为主的黄酮苷可能是其主要活性成分。付晓春等7也在最近的研究中证实荭草素对缺血、缺氧心肌具有明显的保护作用。为控制荭草药材及其制剂质量，在荭草提取工艺研究的基础上，对荭草素和异荭草素的对照品制备方法进行了研究，建立了以萃取、硅胶柱层析、重结晶为手段的能大量制备荭草素和异荭草素的对照品的方法，该法分离所得荭草素和异荭草素的纯度分别为98.03%和98.26%8。 1 仪器与试药 Varian INOVA-400核磁共振波谱仪；HPLC-MSD电喷雾质谱仪；岛津高效液相色谱系统，包括LC-10ATvp泵、SPD-10Avp检测器；Rheodyne 7725i手动进样阀（美国Rheodyne公司）；WML色谱工作站（广西威玛龙色谱科技公司）。色谱用硅胶（200300目）及硅胶G预制板由青岛海洋化工厂生产，色谱用聚酰胺由浙江黄岩化工厂生产。乙腈(色谱纯)、甲醇（色谱纯）、磷酸（分析纯），水为重蒸水，其它试剂均为分析纯。实验样品采自贵州省贵阳市鹿冲关，由贵阳医学院药学院生药学教研室龙庆德副教授鉴定为Polygonum orientale L。 2 方法与结果 2.1 药材的提取与分离 取荭草药材15 kg，用10倍量水煎煮3次，每次1 h，滤过，滤液浓缩至15 kg， 加乙醇30 kg，搅拌均匀，静置12 h，抽滤，滤液减压回收乙醇并浓缩至15 kg，用1/2倍量水饱和的正丁醇提取4次，合并正丁醇液，用1/8倍量水洗2次，减压回收正丁醇，得到富集黄酮类化合物浸膏120 g。 2.2 化合物的分离 120 g浸膏用50%乙醇500 ml溶解，加200 g硅胶(200300目)搅拌，自然晾干，研细，过80目筛，备用；取硅胶(200300目) 2 400 g，用水饱和醋酸乙酯湿法装柱；将拌样硅胶上于装好的硅胶柱表面，用水饱和醋酸乙酯冰乙酸 (10 0001) 洗脱，分段收集，各段在硅胶G预制板上点样，用醋酸乙酯-甲酸-水(100.50.5)展开，喷以10%硫酸乙醇试液，加热显色，检查Rf =0.5（荭草素）和Rf =0.3（异荭草素）的2个黄色主斑点部分，分别回收溶剂。荭草素部分的残留物用100 ml甲醇超声溶解过滤，滤出的沉淀物用适量50%乙醇加热回流溶解放置，结晶完全后，滤出结晶，再以适量甲醇加热回流溶解，加入等体积醋酸乙酯混匀，放置结晶，得荭草素的黄色粉末1.26 g；异荭草素部分的残留物用100 ml甲醇超声溶解过滤，滤出的沉淀物用适量甲醇加热回流溶解放置，结晶完全后，滤出结晶，再以适量甲醇加热回流溶解，放置重结晶，得黄色颗粒结晶2.47 g。 2.3 结构确定 2.3.1 荭草素 淡黄色粉末，盐酸镁粉反应阳性，mp 256258 。UV（MeOH） max：210、256.5、269、348 nm；IR(KBr)max：3 516，3 380（OH），2 897、1 655（C=O），1 610、1 576、1 551、1 511（Ar）cm-1；ESIMS m/z：447.1 (M-H-1)；1H-NMR（DMSO-d6）：13.18 (1H, s, 5-OH), 10.83 (1H, 7-OH), 10.05 (1H, 4-OH), 9.07(1H, 3-OH), 7.54 (1H, dd, J = 8.4, 2.0 Hz, 6-H), 7.49 (1H, d, J = 2.0 Hz, 2-H), 6.88 (1H, d, J = 8.4 Hz, 5-H), 6.66 (1H, s, 3-H), 6.28 (1H, s, 6-H), 4.69 (1H, d, J = 10 Hz, 糖的端基氢)；13C-NMR （DMSO-d6） ：182.0 (C-4), 164.1 (C-2), 162.5 (C-7), 160.4 (C-5), 156.0 (C-9), 149.6 (C-4), 145.8 (C-3), 122.0 (C-1), 119.4 (C-6), 115.7 (C-5), 114.1 (C-2), 104.5 (C-8), 104.0 (C-10), 102.4 (C-3), 98.1 (C-6), 82.0 (C-5), 78.8 (C-3), 73.4 (C-1), 70.8 (C-2), 70.7 (C-4), 61.6 (C-6)。以上数据与文献报道荭草素基本一致，从荭草中分离得到的此成分可确定为荭草素（orientin）9,10。 结构式见图1。 2.3.2 异荭草素 黄色颗粒结晶，盐酸镁粉反应阳性，mp 230232 。UV （MeOH）max：213、257、270.5、350 nm；IR(KBr)max：3 4503 200（OH），1 652（C=O），1 623、1 579、1 517、1 453（Ar） cm-1；ESIMS m/z：447 (M-H-1)；1H-NMR（DMSO-d6）：13.56 (1H, s, 5-OH),10.65 (1H, brs, 7-OH), 9.95 (1H, brs, 4-OH), 9.47(1H, brs, 3-OH), 7.41 (1H, dd, J = 8.4, 2.0 Hz, 6-H), 7.38 (1H, d, J = 2.0 Hz, 2-H), 6.88 (1H, d, J = 8.4 Hz, 5-H), 6.67 (1H, s, 3-H), 6.47 (1H, s, 8-H), 4.57 (1H, d, J = 10 Hz糖的端基氢)；13C-NMR（DMSO-d6）：182.0 (C-4), 163.7 (C-2), 163.3 (C-7),160.8 (C-5),156.3 (C-9), 149.8 (C-4), 145.8 (C-3), 121.5 (C-1), 119.1 (C-6), 116.1 (C-5), 113.4 (C-2), 108.9 (C-6), 103.5 (C-10), 102.9 (C-3), 93.6 (C-8), 81.7 (C-5), 79.0 (C-3), 73.1 (C-1), 70.7 (C-2), 70.2 (C-4), 61.6 (C-6) 。以上数据与文献报道异荭草素基本一致，可确定为异荭草素（isoorientin）11,12。结构式见图2。 2.4 纯度检测 2.4.1 杂质检查 按中国药典2005年版二部附录V B薄层色谱法试验。取荭草素、异荭草素分别加甲醇制成1 g/ml样品溶液，分别条带状点于聚酰胺薄膜或硅胶G薄层板上，点样量10 l、20 l；展开剂：聚酰胺薄膜用（1）甲醇-水-冰醋酸（411）；（2）甲醇；（3）醋酸。硅胶G薄层板用：（1）醋酸乙酯-甲酸-水(100.50.5)；（2）氯仿-甲醇-甲酸(820.5)。显色剂：聚酰胺薄膜2%的AlCl3乙醇液，硅胶G薄层板2%的FeCl3乙醇液。色谱识别：聚酰胺薄膜置日光下检视或紫外光灯（365 nm）下检视，硅胶G薄层板置日光下检视。结果：在2种薄层板上经5个展开系统多种显色方式检识均呈单一斑点，色谱中不显杂质斑点，结果见图3、图4。 2.4.2 峰面积归一化法纯度检查 Hypersil C18(5m，200 mm5.0 mm)色谱柱；甲醇-0.1%磷酸溶液（2674）为流动相，流速：1 ml/min，温度：35 ，紫外检测器；荭草素、异荭草素分别加甲醇制成0.5 g/L样品溶液，进样量20 l。在该色谱条件下，记录色谱图的时间为样品峰出峰时间的2倍，荭草素和异荭草素样品按表1所列检测波长得到色谱图，采用