（农药学专业论文）交沙霉素发酵工艺研究.pdf

华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 于两姜 交沙霉素是由那波链霉菌交沙霉素变种( s t r e p t o m y c e sn a r b o n e n s i s ，： j o s a m y c e t i c u s ) 产生的一种十六元大环内酯抗生素。交沙霉素不易产生抗药性，能 治疗革兰氏阳性菌和某些革兰氏阴性菌引起的疾病，提高交沙霉素的效价具有非常 重要的意义。 从交沙霉素的摇瓶发酵着手，对培养基和发酵条件进行了优化，并筛选前体，考 察前体加入时间和加入的量对交沙霉素效价的影响。考察了碳源、氮源对交沙霉素 发酵的影响，并通过正交设计实验、爬坡实验和中心组合实验确定了最佳发酵培养 基配方为：淀粉4 ，葡萄糖1 5 3 ，面筋粉2 ，鱼粉2 ，m g s 0 4 0 0 6 ，k 2 h p 0 4 0 1 5 ，c a c 0 3 0 3 ，n a c l 0 1 ，豆油1 。优化后的发酵培养基使交沙霉素产生菌 在摇瓶培养条件下交沙霉素的效价达到5 7 6pg m l ，比优化前提高了7 8 9 。在发酵 条件优化的过程中，分别考察了温度、转速、初始p h 值、摇瓶装液量、接种量、 接种龄对发酵的影响，结果表明：交沙霉素产生菌的最佳培养温度为2 8 ，摇床转 速为18 0 r r a i n ，初始p h 为7 5 ，摇瓶装液量为2 5 m l 1 2 5 m l ，接种量为8 ，最适按 种龄为3 6 h 。经过发酵培养条件优化后，交沙霉素发酵条件得到验证。通过试验证 明添加正丙醇可以增加交沙霉素的效价。采用优化的发酵培养基配方和发酵条件， 并在发酵进行至0 时添加o 4 正丙醇，可提高效价，其摇瓶效价达6 2 5 弘g m l 。 以摇瓶发酵试验为基础，进行了交沙霉素发酵由摇瓶到1 6 l 发酵罐的放大，考察 了交沙霉素产生菌在1 6 l 发酵罐中的代谢特性，包括发酵过程中的p h 、糖代谢、生 物量、效价。确定了在发酵过程中进行间歇补糖实验。发酵周期为1 6 8 h ，从7 2 h 开 始，每隔1 2 h 补糖一次，保持还原糖浓度在1 0 l ，结果表明在1 6 l 发酵罐上的交 沙霉素发酵单位为5 1 8 u g m l 。 关键词：交沙霉素；发酵；培养基；前体 交沙霉素发酵工艺研究 a b s t r a c t j o s a m y c i n i sak i n do f16 - m a c r o l i d ea n t i b i o t i c s p r o d u c e db ys t r e p t o m y c e s n a r b o n e n s i sv a ej o s a m y c e t i c u s i ti sn o te a s yt oi n d u c er e s i s t a n c ea n di tc r r ed i s e a s e st h a t a r ec a u s e db yg r a m - p o s i t i v ea n dg r a m - n e g a t i v eb a c t e r i u m i ti si m p o r t a n tt oi n c r e a s et h e t i t r eo f j o s a m c y i n w eo p t i m i z e dt h ec o m p o n e t so ft h em e d i u ma n dt h ec o n d i t i o no fc u l t u r e ，o b s e r v e d t h ea d d i n gt i m ea n dq u a n t i t yo fp r e c u r s o r se f f e c t so nt h et i t r eo fj o s a m y c i n w et e s t d c a r b o ns o u r c e ，n i t r o g e ns o u r c e ，o r t h o g o n a ld e s i g ne x p e r i m e n t ，s t e e p e s ta s c e n te x p r i m e n t a n dc e n t r a lc o m p o s ee x p r i m e n to nt h ef e r m e n t a t i o no fj o s a m y c i n t h eo p t i m u mm e d i u m w a s ：g l u c o s ew a s1 51 ，c o r ns t a r c hw a s4 ，f i s hm e a lw a s2 ，g l u t e np o w d e rw a s2 ， b e a no i lw a s0 5 ，m g s 0 4w a so 0 6 ，k 2 h p 0 4w a s0 15 ，c a c 0 3w a so 3 ，n a c tw a s 0 1 u n d e rt h ec o n d i t o no fo p t i m i z e df e r m e n t a t i o nm e d i u m ，t h et i t r eo f j o s a m y c i nc o u l d r e a c h5 7 6 “g m l i ti n c r e a s d7 8 9 t h a nt h er a t i oo p t i m i z a t i o n i nt h ep r o c e s s e so f o p t i m i z i n gc u l t u r ec o n d i t i o n ，i m p a c to ft e m p e r a t u r e ，t a b l er o t a t i o n a ls p e e d ，p r i m a r yp h ， f l a s kc o l u m n ，i r m o c u l a t i o nt i m ea n di n n o c u l a t i o nc o n t e n to nf e r m e n t a t i o nh a db e e n s t u d i e d t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ew a s2 8 。c ，t a b l er o t a t i o n a ls p e e d w a s18 0 r m i n ，p r i m a r yp hw a s7 5 ，f l a s kc o l u m nw a s2 5 m l 15 0 m l ，i n n o c u l a t i o nt i m e w a s3 6 h ，i n n o c u l a f i o nc o n t e n tw a s8 p r o p a n o lc o u l di n c r e a s et i t r e b yu s i n gt h e o p t i m i z a t i o nm e d i u ma n dc o n d i t i o n , a d d e dn - p r o p a n o lo 4 t o f e r m e n t o rw h e nt h e f e r m e n t a t i o nt i m ec o m e st oo h t h ef i t r eo f j o s a r n y c i nw a s6 2 5pe g m l b a s e do nt h er e s u l t si ns h a k ef l a s k s ，j o s a m y c i nf e r m e n t a t i o nw a ss c a l e du pi na16 l f e r m e n t o r t h em e t a b o l i cc h a r a c t e r i s t i co fs t r e p t o m y c e sn a r b o n e n s i sv a r j o s a m y c e t i c u s i nt h e16 lf e r m e n t o ri n c l u d e dp h ，s u g a rm e t a b l i z a t i o n ，b i o m a s sa n dt i t r e w eu s e dt h e f e d b a t c hf e r m e n t a t i o nw i t hi n t e r m i t t e dc u l t u r e t ok e e ps u g a rc o n c e n t r a t i o no n10 l ， w em a d eu ps u g a re v e r y12 h f e r m e n t a t i o np e r i o dw a s16 8 h t h et i t r eo fj o s a m y c i ni n f e r m e n t a t i o np o tw a s518ug m l k e yw o r d s ：j o s a m y c i n ；f e r m e n t a t i o n ；c u l t u r em e d i u m ；p r e c u r s o r ； 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一n z r _ 作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：做寺鸫时间：硼。7 年s 月j 日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版 和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传 播学位论文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书 学位论文储张砥朴) 导师鼢样矽 签名日期：加o c l 年s 月弋日签名日期：多种年，月，日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 1 前言 交沙霉素( j o s a m y c i n ，j m ) 是一种大环内酯抗生素，于1 9 6 4 年由日本山之内制 药株式会社研制而成( k u n i a k i ，1 9 7 8 ) 。交沙霉素的抗茵谱与红霉素相似，抗菌活力 比红霉素稍弱。与红霉素相比较而言，交沙霉素的组织浓度较高，胃肠道反应较轻， 不易诱导葡萄球菌产生耐药性，临床应用疗效满意，是一种有广阔的应用范围和较 高的治疗效果的抗生素( 张永信和董人禾，1 9 9 0 ) 。 交沙霉素由那波链霉菌交沙霉素变种( s t r e p t o m y c e sn a r b o n e n s i s v a t j o s a m y c e t i c u s ) 产生那波链霉菌交沙霉素变种是链霉菌属的一种放线菌，代表菌株 为a 2 0 4 p 2 ，分离自日本土样，产生的交沙霉素抑制葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌 等革兰氏阳性菌，对淋菌、痢疾菌、脑膜炎菌等部分革兰氏阴性菌、厌氧菌及支原 状属也有效( 阎逊初，1 9 9 2 ；陈风阁，1 9 9 0 ) 。临床上用于呼吸道感染、支气管炎、 肺炎、副鼻窦炎、中外耳炎、皮肤感染、术后创口感染、泌尿科、五官科、口腔科 感染等。 1 1 交沙霉素的性质和作用机制 1 1 1 交沙霉素的化学结构 交沙霉素的化学结构式如图1 所示： 图1 交沙霉素的化学结构式 f i g u r e l m o l e c u l a rs t r u c t u r eo fj o s a m y c i n 交沙霉素是由一个十六元环内酯，两个糖基( 氨基碳霉糖和红霉糖) 和一个异 丁酸所组成的化合物。交沙霉素的内酯环上有一个共轭双键，所以在2 3 0 - 2 3 2 毫微 米有最大紫外吸收峰。c 5 位上连着两个糖基，其中碱基碳霉糖的存在，使交沙霉素 交沙霉索发酵工艺研究 是弱碱性物质。c 9 位上的羟基可以连接上一个丙酸，将交沙霉素改造成丙酸交沙霉 素。 1 1 2 交沙霉素的理化性质 交沙霉素是无色针状晶体( 苯) ，弱碱性，p k a 7 1 。熔点为1 3 0 1 3 3 。易溶于 甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、醋酸乙脂、醋酸丁脂、二氧六环及酸化水，可溶于丁醇、 乙醚、四氯化碳、苯及甲苯，难溶于水、石油醚、正己烷。其盐酸盐、硫酸盐溶于 水( 王岳和方金瑞，1 9 8 8 ) 。 交沙霉素用硫酸做红霉素试验为红色，加热变暗紫色；用盐酸作碳霉素试验为 红色；间苯三酚盐酸试验为橙黄色。薄层层析板上d r a g e n d o r f f 反应为橙色。三氯 化铁、碱性硝酸银、茚三酮、双缩脲、f e h l i n g 、e l s o n - m o r g a n 及m i l l o n 反应阴性。 交沙霉素紫外光谱，入m a x ( e l 锄1 ) 分别为2 3 2 ( 3 2 0 ) 毫微米( 甲醇) 和2 3 2 ( 3 2 5 ) 毫微米( 0 0 0 1 n 盐酸) 。交沙霉素纸层析结果和薄层层析结果见表l 和表2 ： 表1 交沙霉素纸层析结果 t a b l e lt h er e s u l to fjo s a m y c i nb yf i l t e rp a p e rc h r o m a t o g r a p h y 纸层析液 r f 值 苯：氯仿( 1 ：1 ) 苯：水饱和醋酸乙酯( 9 ：1 ) 苯：丙酮( 9 5 ：5 ) 四氯化碳：氯仿( 1 ：1 ) 0 4 9 0 6 8 0 6 5 o 7 6 表2 交沙霉素薄层层析结果 t a b l e 2t h er e s u l to fj o s a m y c i nb yf o l i u mc h r o m a t o g r a p h y 氧化铝薄层层析r f 值 醋酸乙酯 醋酸乙酯：甲基乙基丙酮：水( 8 0 ：1 8 ：2 ) 硅胶g 正丁醇：醋酸：水( 3 ：1 ：1 ) 0 6 7 0 4 7 0 6 4 1 1 3 交沙霉素的产生菌 那波链霉菌交沙霉素变种( & n a r b o n e n s i sv a t j o s a m y c e t i c u s ) 是交沙霉素的产生 菌，其孢子丝直、柔曲。孢子椭圆形、柱形，表面光滑，在不同培养基平板上的培 养特征见表1 。该菌明胶液化强，有时少量黄褐色素。牛奶凝固并胨化，无色素。 水解淀粉。纤维素上生长少。硝酸盐不还原。不产生类黑色素和酪氨酸酶。利用葡 2 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 萄糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、蔗糖、棉子糖以及半乳糖、麦芽糖、糊精、淀粉、 菊糖、甘油；不利用鼠李糖、肌醇、甘露醇以及乳糖、山梨醇、卫矛醇。 表3 那波链霉菌交沙霉素变种的培养特征 t a b l e 3t h ec u l t i v a t e dc h a r a e t e ro fs n a r b o n e n s i sv a t j o s a m y e e t i e u s 1 1 4 交沙霉素的作用机制 大环内酯类抗生素与细菌细胞核糖体5 0 s 亚单位的2 3 s 核糖体( 2 3 s r r n a ) 上的特 殊靶位及这种核糖体的蛋白质结合，使核糖体在m r n a 上的位移受阻，影响细菌蛋 白质合成。最近研究认为，所有大环内酯类抗生素能与核糖体5 0 s 亚单位的l 2 7 和 l 2 2 蛋白质结合，在肽链延长阶段能促进肽酰基r r n a 从核糖体解离，从而抑制细 菌蛋白质合成( 肖永红，2 0 0 4 ) 。 2 0 0 0 年n i s s e n 等( n i s s e ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 通过高分辨x 衍射测定了h a l o a r c u l a m a r i s m o r t u i ( 一种古细菌) 中的5 0 s 核糖体亚单位的晶体结构，同时测定a 、p 位 点结合了底物类似物的核糖体亚单位的结构，证明只有2 3 sr n a 的v 结构域存在 肽转移酶结合位点，认为a 2 4 5 1 位点可能与催化有关。s c h t i n z e n 等对d e i n o c o c c u s r a d i o d u r a n s ( d e i r a 菌) 中的5 0 s 核糖体亚单位及其与红霉素、克拉霉素、罗红霉 素复合物晶体结构的研究进一步表明( s c h t i n z e ne ta 1 ，2 0 0 1 ) ，这几种大环内酯类抗 生素均位于肽转移酶中心肽释放通道的入口处，并且与2 3 sr n a 的v 结构域相连。 s c h t m z e n 与合作者建立了一个较为理想的键合模型( 图2 ) ，在此模型中，德糖胺糖2 羟基通过三个氢键与a 2 0 5 8 、a 2 0 5 9 位点结合，内酯环的6 羟基或6 甲氧基、1 1 - 羟基和1 2 羟基各自键合a 2 0 6 2 、u 2 6 0 9 、u 2 6 0 9 位点，1 4 元环的大环内酯类抗生素 依赖此结合位点阻断肽释放通道。 交沙霉素发酵工艺研究 图2 大环内酯与肽转移酶核苷的键合模型 f i 9 2 t h e b i n d i n gm o d e lo fm a c r o l i d et op e p t i d et r a n s f e r a s en u c l e o s i d e ( 摘自郑忠辉，石和鹏，金洁大环内酯类抗生素的发展与展望药学进展，2 0 0 5 ， 2 9 ：1 7 ) 细菌核糖体在1 4 或1 5 元大环内酯存在时仍然有能力合成短肽，而在碳霉素等1 6 元大环内酯存在时，核糖体合成肽链的能力被完全抑制。这是因为1 6 元大环内酯 在c 5 位上有双糖侧链，而1 4 或1 5 元大环内酯为单糖侧链所致( 王建强，2 0 0 6 ) 。 1 2 交沙霉素的应用 1 2 1 交沙霉素的抗菌活性 1 9 7 5 年，l a r r y 等对交沙霉素的体外活性与红霉素进行了比较研究( l a r r ye ta 1 ， 1 9 7 6 ) ，结果表明交沙霉素抗菌谱与红霉素相似。同年，e r i c 等进行了交沙霉素对革 兰氏阳性需氧菌和厌氧菌体外活性的研究( e r i ce ta 1 ，1 9 7 6 ) ，r i c h a r d 等采用琼脂 稀释法研究了临床分离的1 4 5 种厌氧菌和9 6 种革兰氏阳性需氧菌在体外对交沙霉素 的敏感性( r i c h a r de ta 1 ，1 9 7 6 ) ，结果表明，9 5 的需氧菌对1 5 6ug m l 甚至更低 浓度的交沙霉素敏感，且其最低抑制中浓度均不大于0 3 9 1 tg m l ；在体外，小于3 1 2 ug m l 浓度的交沙霉素对1 0 0 的厌氧菌均有活性。 交沙霉素与青霉素、链霉素、四环素、氯霉素无交叉耐药性，是非诱导耐药性 的抗生素，且在金葡萄球菌中不诱导耐药性。但是与红霉素、碳霉素交叉耐药，口 服给药，对小鼠的葡萄球菌或肺炎双球菌均有显著的保护作用。交沙霉素对革兰氏 阳性细菌及部分阴性细菌包括金黄葡萄球菌、溶血性链球菌、淋球菌、百日咳杆菌、 支原体、衣原体等有很高的活性。交沙霉素对部分病原菌的最低抑制浓度见表4 。 4 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 表4 交沙霉素对部分病原菌的最低抑制浓度 t a b l e 4t h em i n i m a li n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o no fj o s a m y c i nt os o m ep a t h o g e n y 病原菌最低抑制浓度( 微克毫升) 藤黄八叠球菌p c i l0 0 1 金黄葡萄球菌2 0 9 p 枯草杆菌6 6 3 3 大肠杆菌o 1 2 肺炎克氏菌p c i 6 0 2 伤寒沙门氏菌h 9 0 1 w 化脓性链球菌s s 4 5 8 分支杆菌6 0 7 肺炎双球菌i 型 1 2 2 交沙霉素的临床应用 交沙霉素于1 9 6 4 年由日本山之内制药株式会社研制而成，自诞生以来，它就在 世界范围内广泛应用于临床了。交沙霉素在国内的应用仅处于起步阶段，但是它独 特的优点和优秀的临床效果已越来越受人们的关注和重视。临床用于呼吸道感染、 支气管炎、肺炎、副鼻窦炎、中外耳炎、皮肤感染、术后创口感染、泌尿科、五官 科、口腔科感染等。 在口腔疾病的治疗中，交沙霉素显示了很强的优势( 孙大麟，1 9 9 4 ) 。厌氧茵是 口腔感染性疾病常见的病原体，目前临床上一些常用的抗生素对其感染的治疗都不 甚理想。浙江医科大学附属二院口腔科用交沙霉素和其他9 种常用抗生素对临床分 离的1 3 5 株厌氧菌进行药敏试验( 朱仲珍等，1 9 9 1 ) ，抑菌效果和临床实验研究结果 表明：交沙霉素对口腔常见的急性感染疾病有良好的临床疗效，其有效率可达 9 0 3 ，且均未出现不良反应，且交沙霉素对引起口腔疾病的常见病原体产黑素类杆 菌的抑菌作用明显强于其他9 种临床常用的抗生素，因此，交沙霉素更适用于治疗 口腔感染性疾病。 在毛细支气管炎的治疗中，交沙霉素显示了特殊的优势。交沙霉素具有减少气 道粘膜的粘液分泌，增加纤毛运动，加快排痰速度等作用，有助于毛细支气管炎咳 喘的缓解和气道炎症的消退。因此，交沙霉素治疗毛细支气管炎，能改善咳嗽、喘 憋等症状，促进肺部喘呜音的消失。治疗儿童毛细支气管炎除使用传统的常规治疗 方法以外，加用交沙霉素可获得更好的疗效，同时可调节患儿失调的免疫状态，治 疗总有效率可达到9 5 ( 汪灏和帅春，2 0 0 6 ) 。 5 脯咖如m煳帆 交沙霉索发酵工艺研究 交沙霉素与红霉素比较，具有更好的效果。临床治疗各种细菌感染3 4 例研究发 现，4 3 株表皮葡萄球菌( 表葡菌) 和金黄色葡萄球菌( 金葡菌) 对交沙霉素和红霉素敏感 率分别为8 1 和5 4 。交沙霉素对2 6 株厌氧葡萄球菌( 消化球菌) 、消化链球菌和2 8 株类杆菌的m i c 5 0 分别为o 5 和2 m g l 。交沙霉素对3 4 例口腔、五官及皮肤的感染 全部有效，其中显效( 痊愈) 占8 8 。3 1 例获细菌3 3 株，细菌转阴率为9 7 。治疗中 仅3 例出现头晕和轻度消化道反应( 张永信，1 9 9 0 ) 。 k a s a h a r a 等以f 3 4 4 小白鼠为试验对象，进行了交沙霉素的慢性毒性研究 ( k a s a h a r ae ta 1 ，2 0 0 2 ) ，评估交沙霉素的服用量应该在每天1 0 m g k g 体重以下。 1 2 3交沙霉素的化学改造 交沙霉素难溶于水，味苦，在体内易酶解而打开内酯环或脱去酰基失活，但是 通过对它的结构进行化学改造可以克服这些缺点，目前开发了乙酰交沙霉素和丙酸 交沙霉素( 村上恭子，1 9 7 3 ) 两种产品。在国内仅有丙酸交沙霉素( 交沙咪) 投入 生产和临床应用。交沙咪是将交沙霉素直接用丙酰氯在低温条件下使9 - o h 丙酰化 而成( 图3 ) 。从图3 中可看出丙酸交沙霉素主要是把交沙霉素内酯环上的羟基酯化， 变成了一个丙酸酯( 宋学勤，1 9 9 7 ) 。这一改造使它的性质显著改观，既增加了对酸 的稳定性，不受胃酸的影响，又提高了在血液中的浓度，同时还降低了毒性。这主 要是因为羟基酯化阻止了内酯环的打开，同时增加了整个分子的亲酯性，使之更容 易被吸收，也容易穿透细菌的细胞膜而发挥抗菌作用，而且这种改造消除了原有交 沙霉素的苦味，使之更容易被儿童服用。婴幼儿毛细支气管炎中的应用效果研究表 明( 汪灏和帅春，2 0 0 6 ) ，治疗毛细支气管炎除使用传统的常规治疗方法以外，加用 交沙咪有较好的药物依从性和较少的胃肠道反应与红霉素相比较，更适合低幼儿 童服用，能轻松解决儿童服药困难问题。 图3 丙酸交沙霉素化学合成途径 f i g 3t h ec h e m o s y n t h e s i sp r o c e s so f j o s a m y d np r o p i o n a t e 6 乒髅 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 1 3 交沙霉素的生物合成途径 微生物代谢产物的全合成一直以来都受到科学家的关注，自从1 9 7 2 年 w o o d w a r d 及e s h e m m o r 两公司完成了v b l 2 的合成，人们对大环内酯类抗生素的 合成更加关注。1 9 7 5 年，m a s a m u n e 等首先完成了酒霉素的全合成( m a s a m u n ec ta 1 ， 1 9 7 5 ) ，同年，c o r e y 等完成了红霉素b 的合成( c o r e y c ta 1 ，1 9 7 5 ) ，1 9 8 0 年t a t s u t a 等完成十六元环大环内酯交沙霉素的全合成( t a t s u t a o ta 1 ，1 9 8 0 ) ，以d 。葡萄糖对称 碳源，塑造c 1 c 1 0 ，与c 1 1 1 5 两片断偶联后，经2 次糖苷化，最后脱去保护基， 具体过程见图4 。 c o o m c a c 笏参龇 o 。b t 7 h 辱广晟 一 占 交沙霉素发酵工艺研究 图4 交沙霉素全合成途径 f i g 4t h e f u l lc h e m o s y n t h e s i sp r o c e s so fj o s a m y e i n ( 摘自张致平，微生物药物学，化学工业出版社，2 0 0 3 ：2 4 7 2 4 8 ) 1 4 交沙霉素的定量检测方法 1 4 1微生物检定法 交沙霉素效价的生物检测法主要采用管碟法。管碟法利用抗生素在琼脂培养基 中的扩散作用，将已知浓度的标准溶液和未知浓度的样品在含有敏感性实验菌的琼 脂表面进行扩散，由于对被试菌的抑制作用而产生抑菌圈，抑菌圈的大小和抗生素 的浓度问有一比例。这个方法利用抗生素抑制敏感菌的特点，符合临床使用的实际 情况，因此被国际公认( 张治琰，1 9 8 7 ) 。 日本抗生物质基准解说( 1 9 8 6 年版) 收载的交沙霉素片效价测定使用b a c i l l u s s u l l i l i s a t c c 6 6 3 3 为试验菌( 即我国枯草芽孢杆菌6 3 5 0 1 ) ，培养基i ，p h7 8 8 0 。 在3 5 。3 6 培养约9 h 后，抑菌圈产生明显双圈，因而影响了测定结果的准确性。 黄西萍等选用培养基i i ( 枯草芽孢杆菌，p h 7 8 8 o ；藤黄八叠球菌，p h6 5 6 6 ) ，以 枯草芽孢杆菌和藤黄八叠球菌分别为指示菌，对交沙霉素效价进行测定，可得到清 晰且不易产生双圈的抑菌圈，其结果在统计学上无显著差异( 黄西萍等，1 9 9 3 ) 。梁 好容等对交沙霉素效价测定的实验条件进行了探讨( 梁好容和洪建文，1 9 9 6 ) ，结果 表明交沙霉素效价测定时，影响抑菌圈清晰度的主要因素是培养基成分和氯化钠浓 度，采用含3 氯化钠的i i 号培养基( p h7 8 。8 0 ) ，以磷酸盐缓冲液( p h7 8 ) 为稀 释溶剂，代替卫生部标准( 试行) 规定的i 号培养基及日抗基采用的培养基，进行 交沙霉素微生物效价测定，抑茵圈清晰，边缘光滑，无双圈，能准确测量，改进后 的主要生物检定统计指标优于当时标准检定条件下的结果。赵长敏等对交沙霉素效 价测定的方法进行了改进，结果表明在培养基i 号( p h7 8 8 o ) 中加入0 2 0 3 的 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 葡萄糖时，抑菌圈边缘清晰，菌层生长适中，无菌膜无双圈，便于测量，效果优于 i i 号培养基( p h7 8 8 0 ) 和i i 号培养基( p h7 8 8 0 ) 加入0 2 0 3 的葡萄糖( 赵常 敏等，1 9 9 9 ) 。 1 4 2 高效液相色谱法 高效液相色谱( h p l c ) 法由于其操作简便、精密度高，因此广泛用于检测交沙霉 素的含量。高效液相色谱法检测交沙霉素广泛采用c 1 8 反相柱，交沙霉素霉素在 2 3 0 r i m 处有最大吸收峰，所以检测器采用u v 检测器，常见流动相如表5 所示。 表5l t p c l 法检测交沙霉素的常用流动相 t a b l e 5m o b i l ep h a s ei nh p l c 流动相配比 甲醇：0 0 2 m o l l 磷酸二氢钾缓冲液 水：乙腈 0 0 2 5 m o l l 磷酸二氢钾磷酸缓冲液：甲醇 乙腈：0 1m o l l 醋酸铵溶液 6 5 ：3 5 4 5 ：5 5 4 0 ：6 0 6 0 ：4 0 农以宁采用反相高效液相色谱法( r p h p l c ) ，以b o n d a p a k - c 1 8 ( 1 0 1 tm ，3 9 r a m 3 0 e m ) y 勺固定相，甲醇0 0 2 m o l lk h 2 p 0 4 缓冲液( 6 5 ：3 5 ，p h = 3 3 ) 为流动相，己 烯雌酚为内标，测定了交沙霉索原料和片剂的主成分含量，同时分离出5 种未知成 分( 农以宁，1 9 9 3 ) ，结果表明在0 0 2 0 1 m g m l 范围内，交沙霉素峰面积与浓度 呈线性关系，测试样品的相对标准偏差为o 1 4 0 3 9 ，方法回收率1 0 0 1 0 2 4 。 1 9 9 8 年，r o e t s 等建立了一种等强度液相层析法( r o e t se ta 1 ，1 9 9 8 ) ，以非常稳定 的聚苯乙烯二乙烯多孔树脂p l r p s ( 8 1 tm ，1 0 0 0a 。) 为固相萃取顶柱( 2 5 0 4 6 m mi d ) ，乙腈0 2 m 磷酸缓冲液，p h1 0 0 水( 体积比5 2 ：2 0 ：1 0 0 ) 为流动相，结 果很好的将含有交沙霉素，丙酸交沙霉素，丙酸柱晶白霉素a 4 等8 种交沙霉素 类似物混合物分离开来，且各交沙霉素类似物的浓度线性范围为 o 5 4 ( 1 芦0 9 9 8 8 ) ，相对标准偏差( r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o i l ，r s d ) 为o 5 ( n = 6 ) ， 表明该方法分离测定交沙霉素类似物选择性很好，灵敏度高。 1 4 3 分光光度法 分光光度法是一种广泛应用的定量分析方法，也是对物质进行定性分析和结构 9 交沙霉索发酵工艺研究 分析的一种手段。交沙霉素的分子结构中存在共轭双键，在2 0 0 4 0 0 n m 的紫外光区 具有吸收光，所以可通过紫外分光光度法作标准曲线，测定溶液中的交沙霉素的含 量；也可通过交沙霉素与其它物质的显色反应，利用可见分光光度法测定其含量。 近些年，国内有一些分光光度法测定交沙霉素含量的报道。 罗云等在不同p h 介质中交沙霉素溶出度比较实验中，采用紫外分光度法，选择 2 3 1 n m 作为紫外测定波长( 罗云等，1 9 9 7 ) ，实验结果表明，交沙霉素浓度在1 2 0 l ag m l 浓度范围内线性关系良好( 产o 9 9 9 9 ) ，且平均回收率为9 9 7 ，r s d 为o 8 ( n _ 4 ) ，采用该方法测定交沙霉素片的溶出度方便可靠；王浩强等在交沙霉素片体 外溶出度比较的研究中，以蒸馏水为空白测定不同浓度交沙霉素标准液吸收光谱， 确定2 3 2 n m 为紫外测定波长( 王浩强等，2 0 0 0 ) ，实验结果表明，在1 4 - 4 31 tg m l 浓度范围内有良好线性关系( f o 9 9 9 9 ) ，采用该方法测定交沙霉素片的溶出度，方法 方便可靠。 1 5 十六元大环内酯抗生素发酵的研究概况 按化学结构划分，交沙霉素属于大环内酯抗生素。大环内酯抗生素又可以分为 1 4 元和1 6 元大环内酯抗生素两类。交沙霉素属于后者，和交沙霉素同属1 6 元的还 有柱晶白霉素、麦迪霉素和螺旋霉素等。他们都属于天然抗生素产品，由微生物代 谢直接产生，化学结构相似。通过检索交沙霉素发酵的文章可知，目前国内外还没 有其相关的文献资料，所以，只能通过与交沙霉素有相似结构的柱晶白霉素、麦迪 霉素和螺旋霉素比较得知1 6 元大环内酯抗生素发酵的研究概况。 氨基酸对麦迪霉素和螺旋霉素的影响。氨基酸既是一种有机氮源，也可作为一 种生长因子。李怀书分别比较了丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸蛋氨酸对麦迪 霉素生物合成的影响，结果显示蛋氨酸不仅提高了麦迪霉素的发酵单位，而且提高 了a 1 组分的含量。接着又进行了不同产地蛋氨酸和蛋氨酸加入时间及方法对麦迪 霉素生物合成的影响，结果显示含量在9 9 以上的蛋氨酸，无论来自何地，都能提 高麦迪霉素a 1 的含量；在菌体的抗生素生产期以前加入蛋氨酸对提高麦迪霉素a 1 的含量有利，灭菌方法不同对其影响不大( 李怀书，1 9 9 2 ) 。李友荣等在静息细胞系 统的研究表明，不同种类的氨基酸加入到培养基中对螺旋霉素的合成大多有利，但 浓度过高时有抑制作用，甲硫氨酸对螺旋霉素合成的促进作用最大，是因为甲硫氨 酸可以为螺旋霉素的生物合成提供n - 甲基和c 甲基( 李友荣，1 9 8 8 ) 。 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 磷酸镁对螺旋霉素的影响。很多大环内酯类抗生素，如红霉素、螺旋霉素和泰 洛星的合成均被较高浓度的铵离子所抑制，这种抑制作用可以通过在发酵培养基中 添加铵离子的捕捉剂来解除。磷酸镁可以作为铵离子的捕捉剂，有效地限制铵离子 在培养基中的浓度，同时，在微酸性条件下，磷酸镁是一种微溶性的盐，随着发酵 液中溶磷的消耗，磷酸镁可以缓慢地向发酵液中补充溶磷。在摇瓶中研究了磷酸镁 对螺旋霉素发酵的影响，螺旋霉素的发酵效价因在基础培养基中添加磷酸镁而提高， 在0 0 1 o 的范围内，磷酸镁浓度越高，发酵效价越高，但更高的磷酸镁加量对 螺旋霉素发酵的影响不明显，这是因为过高的磷酸镁加量使得培养基中的氨根离子 浓度下降得太低或使发酵液中溶磷浓度过高，对产物的合成产生不良影响( 刘刚， 1 9 9 7 ) 。 前体的影响。经研究发现，小分子二碳、三碳和四碳化合物对大环内酯抗生素 的生物合成有显著影响。在培养基中添加豆油也对抗生素的合成有促进作用。陈长 华等通过加入二碳、三碳和四碳化合物研究他们对螺旋霉素的影响。结果表明，三 碳化合物的加量在0 6 6 8 1 较合适，若再加大剂量，增产幅度反而减少，且分两 次加入比一次加入更有利于螺旋霉素的生物合成。相对提高产量3 7 ，若将0 6 6 8 的三碳化合物分两次加入则可提高产量4 6 。四碳化合物的最佳加入量仍以0 0 8 2 为好。且分两次加入更为优越，可提高产量4 3 ( 陈长华，1 9 9 5 ) 。表明一次加入前 体，发酵液中局部浓度过高影响菌体生长，同时还因细胞的外源前体浓度与内源浓 度相差较大，从而影响利用前体的效率。而分次加入则避免前述两个问题。采用含 豆油培养基进行发酵试验，结果表明，豆油添加量为2 时，发酵效价最高，相对效 价为1 3 0 。加入时间以0 1 2 小时为宜。采用上述含豆油培养基并补加前体正丙醇， 发酵效价比不添加前体提高2 1 。李友荣等研究表明螺旋霉素产生菌在含油培养基 代谢过程中a t p 含量比不加油的培养基低许多，而低含量a t p 有利于螺旋霉素的合 成( 李友荣，1 9 9 0 ) 。豆油耐性突变螺旋霉素产生菌有把豆油分解成短链脂肪酸的能 力，而短链脂肪酸是构成螺旋霉素内酯环的前体。螺旋霉素产生茵在适量的豆油浓 度下将豆油分解成短链脂肪酸，促使产生菌合成更多的螺旋霉素。 1 6 实验目的和意义 红霉素应用广泛，但是它对胃酸不稳定，口服吸收少。而交沙霉素因结构上的 修饰，不易被胃酸破坏，使其血药浓度、组织细胞内药物浓度增高。并且交沙霉素 交沙霉素发酵工艺研究 的半衰期延长，使得给药次数减少，相应的肠胃道反应也减少，有利于病人的吸收 和利用。虽然交沙霉素有这些优点，但是在国内的应用仅处于起步阶段，目前尚无 厂家生产原药，国内销售的药品全为日本进口。为满足国内市场用药需要，实现交 沙霉素原料药的国产化，必须致力于交沙霉素原药的研制工作，填补国内生产的空 白。 本实验从优化交沙霉素产生菌的培养基，优化交沙霉素的培养条件，添加前体 增加交沙霉素的效价等方面着手，使交沙霉素产生菌产生高效价的性状得以充分表 达，达到提高发酵水平的目的。最终使交沙霉素产生菌的产素能力向工业化生产的 要求接近，为尽快实现交沙霉素原药的国产化奠定基础。 1 2 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 2 材料与方法 2 1 试验材料 2 1 1 供试菌株 2 1 1 1 生产菌株 交沙霉素产生菌那波链霉菌交沙霉素变种( s t r e p t o m y c e sn a r b o n e n s i s v a t j o s a m y c e t i c u s ) r 2 9 菌株，由武汉天惠生物工程有限公司研究所保藏并提供。 2 1 1 2 生物测定指示菌 生侧指示菌枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 【c m c c ( b ) 6 3 5 0 1 ，由武汉天惠生物 工程有限公司研究所保藏并提供。 2 1 2 培养基 2 1 2 1 斜面培养基 土豆泥，1 0 ；麦片，2 5 ；精氨酸，o 0 2 ；琼脂2 ；消前p h 7 2 7 4 ；土豆 泥的制作过程如下：按照1 0 0 0 m l 斜面培养基的量称取1 0 0 9 土豆，削皮洗净，放入 1 0 0 0 m l 水中煮2 0 分钟，然后搅拌捣碎，做成泥状，待配制斜面培养基时使用。 2 1 2 2 改良高氏培养基 可溶性淀粉，2 o ；硝酸钾，0 1 ；磷酸氢二钾，0 0 5 ：硫酸镁，0 0 5 ；硫 酸亚铁，0 0 0 1 ：氯化钠，0 0 5 ；酵母浸膏，0 2 0 4 ；琼脂，1 8 ；消前p h 7 2 7 4 。 2 。1 2 3 摇瓶种子培养基 葡萄糖，1 0 ：淀粉，1 0 ；黄豆饼粉，1 5 ；硫酸镁，0 0 5 ；酵母粉，0 5 ； 碳酸钙，o 3 ；磷酸氢二钾，0 5 ；消前p h 8 0 。 2 1 2 4 发酵培养基 葡萄糖，2 o ；棉籽饼粉，2 o ；豆油，1 o ；碳酸钙，o 3 ；玉米淀粉，4 0 ； 磷酸氢二钾，o 0 3 ；面筋粉，2 o ；硫酸镁，0 0 5 ；氯化钠，o 0 5 ；消前p h 8 0 。 2 1 2 5 生物测定培养基 上层平板培养基：蛋白胨，1 0 ；酵母粉，o 5 ；葡萄糖，0 1 ；琼脂，2 o ； 消前p h 7 2 7 5 。下层平板培养基：琼脂2 o ；p h 自然。 2 1 3 试剂 2 1 3 1 参考品 1 3 交沙霉素发酵工艺研究 交沙霉素标准品为杭州民生药业生产的交沙霉素糖衣片，片重4 8 2 m g ，交沙霉 素含量为2 0 0 m g 片，交沙霉素占糖衣片的4 1 4 9 。 将交沙霉素糖衣片研磨成均匀的粉末，并用甲醇溶解配制成1 0 0 0l ag m l 的标准 母液，振荡使交沙霉素充分溶解，并过滤除菌除杂质，置于4 c 冰箱中保存备用。 2 1 4 试验仪器 t d l 5 0 8 台式低速离心机上海安亭科学仪器厂 h q l l5 0 b 恒温冷冻摇床中国科学院武汉科学仪器厂 z k 8 2 a 真空干燥箱湖北黄石市医疗器械厂生产 u v - 9 2 0 0 紫外分光光度计上海精密仪器仪表有限公司 高效液相色谱( h p l c )b e c k m a ng o l d e n 5 0 和w a t e r s 发酵罐b i o f l o12 5 0 。l6n e wb r u n s w i c ks c i e n t i f i cc o 2 2 试验方法 2 2 1培养条件 2 2 1 1 斜面菌种培养条件 培养温度2 8 c ，培养时间7 1 0 d 。 2 2 1 2 摇瓶种子培养条件 培养温度2 8 ，装量2 5 m l 15 0 m l ，摇床转速18 0 r m i n ，培养时间3 0 h 。 2 2 1 3 发酵条件 培养温度2 8 ，装量2 5 m l 1 5 0 m l ，摇床转速1 8 0 r r a i n ，培养时间7 d 。 2 2 2 分析方法 2 2 2 1生物效价的测定 指示菌悬液的制备：将已经产生芽孢的指示菌斜面用无菌水洗下，调整到孢子浓 度为1 0 8 个m l ，放入4 c 冰箱中保存，在使用前用7 5 的水浴灭活十分钟，杀灭 营养体，得到均一的指示菌芽孢悬液。 生物测定方法：将生物测定下层平板培养基( 1 2 0 m l