（法医学专业论文）dna分析在法医学种属鉴定中的应用研究.pdf

英文缩写 a a f l p a p s b s e c 册 d t t e u s a g d b i c z n n u m 丌s p a g e p b s r a p d a m m o n i t u np e r s u l f a t e b o v i n os p o n g i f o r m e n c e p h a l o p a t h y c y t o c h r o m eb d i t h i o t h r e i t o l e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a y g e n e t i cd a t a b a n k i n t e r n a t i o n a lc o m m i s s i o no n z o o l o g i c a ln o m e n c l a t u r e n u c l e a rs e q u e n c e so f m i t o c h o n d r i a lo r i g i n p o l y a c r y l a m i d eg e l e l e c 血o p h o r e s i s p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e r a n d o ma m p l i f i e d p o l y m o r p h i s m 过硫酸铵 牛海绵状脑病 细胞色素b 二硫苏糖醇 酶联免疫吸附试验 遗传学数据库 国际动物学术语命名委员会 起源于线粒体的核序列 聚丙烯酞胺凝胶电泳 磷酸盐缓冲液 随机引物扩增片段长度 多态性 r f l p s n p s s c p s t r s t e m e d t p 5 3 其主要任务是鉴定法医学生物性检材的种属来源，确定检材是否来自人 体，必要时还需要确定检材来自何种动物。种属鉴定采用的方法主要有三 类，即形态学方法、血清学方法和d n a 技术检测方法。与蛋白质相比，d n a 分子相对稳定、特异，所以d n a 分析方法有助于对微量、降解和腐败检材 的鉴定。利用d n a 分析进行种属鉴定是目前法医学研究的热点。目的本 课题旨在研究1 7 个新的s t r 基因座和肿瘤抑制基因t p 5 3 第八内含子的种 属特异性；建立m t d n a 细胞色素b ( c y t6 ) 基因p c r r f l p 分析以及复合 扩增m t d n a - - h vi 、 i i i 和c y tb 片段进行法医学种属鉴定的方法。研究 上述方法在种属鉴定中的价值和可行性。方法以人和十七种常见动物为 研究对象，提取d n a 定量后。( 1 ) 分别扩增1 7 个s t r 基因座和t p 5 3 第八 内含子，聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染检测，分析各基因座和t p 5 3 第八内 含子的种属特异性。( 2 ) 扩增c y tb 基因，根据扩增产物的有无初步区分 部分动物，对于有扩增产物的动物，选择限制性内切酶( a l ui ) 对扩增产 物酶切，分析酶切产物，进行种属鉴定。( 3 ) 复合扩增m t d n h i vi 、h v 和c y tb 片段，p a g e 、银染显色后分析结果。结果( 1 ) d 9 s 1 1 1 8 和d 2 0 s 6 0 4 基因座对各动物d n a 均无扩增产物；d x s i o i 、d y s 3 9 1 和d 2 0 s 1 6 1 基因座 只对猴d n a 有扩增产物；d 2 s 1 7 7 4 基因座对猴和鼠d n a 有扩增产物； d 2 1 s 1 4 0 9 、d x s 6 8 0 9 和d y s 3 9 3 基因座对猴、豚鼠、鼠和蛙d n a 有扩增产 物，对其他动物d n a 无扩增产物或扩增产物在人类等位基因分型区外； d y s 3 9 0 、d x s 6 7 8 9 、d x s 9 8 9 4 、d i s 2 1 4 2 、d i o s 2 3 2 5 、d i s 2 1 3 4 、d 2 0 s 6 0 1 和 d 2 s 2 9 4 4 基因座对多种动物d n a 均有扩增产物，片段多位于人类等位基因 分型区内。( 2 ) t p 5 3 第八内含子对人和猴的d n a 都扩增出一条长度为 4 6 0 b p 的片段；对其他动物虽有扩增产物，但片段长度和人有差异；鸡、 狗的d n a 未见扩增产物。( 3 ) 扩增c y t b 基因在牛、猪、羊、猫、猴、兔、 豚鼠、鼠、鳝及人m t d n a 检出9 8 1b p 扩增产物；对狗m t d n a 有微弱的非 特异性扩增产物：对鸡、蛙、鸭、鱼和马m t d n a 无扩增产物。经a l ui 消化后，牛和猪的扩增产物产生三条带；羊的扩增产物小部分被酶切；猫 的扩增产物原9 8 1b p 片段被完全酶切，获得一条约6 0 0b p 的片段；猴的 扩增产物原9 8 1b p 片段被完全酶切，获得一条约8 0 0b p 的片段；兔的原 9 8 1b p 片段被完全酶切，获得一条约9 0 0b p 的片段；豚鼠原9 8 1b p 片 段未被完全酶切，但获得较多小的片段；鼠的原9 8 1b p 片段被完全酶切， 获得两条约4 0 0b p 和5 5 0b p 的片段；鳝及人的扩增产物无明显变化。( 4 ) 复合扩增m t d n a - - h vi 、h v 和c y tb 片段在人m t d n a 表现为2 7 8 b p 、4 2 5 b p 、 3 5 8 b p 三条带，动物为一条带，在电泳谱中位置与人3 5 8 b p 的条带存在差 异。结论( 1 ) d 9 s i l l 8 和d 2 0 s 6 0 4 基因座种属特异性好；d x s i o i 、d y s 3 9 1 、 d 2 0 s 1 6 1 、d 2 s 1 7 7 4 、d 2 1 s 1 4 0 9 、d x s 6 8 0 9 和d y s 3 9 3 基因座对少数动物有 扩增产物，扩增产物多位于人等位基因分型区外，种属特异性较好，法医 学实践中可用于检材的种属来源分析；d x s 9 8 9 4 、d y s 3 9 0 、d x s 6 7 8 9 、 d i s 2 1 4 2 、d i o s 2 3 2 5 、d i s 2 1 3 4 、d 2 0 s 6 0 1 和d 2 s 2 9 4 4 基因座种属特异性差。 ( 2 ) 扩增c y tb 基因，根据扩增产物的有无可初步鉴定检材的种属来源。 用a 1 ui 酶切扩增产物，如原9 8 1b p 片段被完全酶切，可以认定检材为 非人类来源，而且，根据酶切产物的数量及大小，可进一步分析检材的具 体种属来源。( 3 ) 扩增t p 5 3 第八内含子以及复合扩增m t d n ad - 环h vi 、 h vi i 和c y tb 片段进行种属鉴定，方法简单，灵敏度较高，可应用于法医 2 学实践。 ，关键词：种属鉴定s t r 肿瘤抑制基因p 5 3 细胞色素br f l p 复 合扩增 as t u d s p e c i a l i t y ：f o r e n s i cm e d i c i n e p o s t g r a d u a t e ：w a n gc h u a n gt u t o r ：p r o f z h a n gl i n s p e c i e si d e n t i f i c a t i o np l a y s 趾i m p o r t a n tr o l ei nf o r e n s i cm e d i c i n e ；i t s m a i nt a s ki st oi d e n t i f ys p e c i e so r i g i n so fb i o l o g i c a ls a m p l e s ，t od e t e r m i n e w h e t h e rt h es a m p l e sa f r o mh u m a no ra n i m a la sw e l la st od e t e r m i n et h e s p e c i e ss p e c i f i c i t yw h e ni ti sn e c e s s a r y t h e r ea r et h r e em e t h o d sa p p l i e dt o s p e c i e si d e n t i f i c a t i o n ：m o r p h o l o g i c a lm e t h o d s ，s e r o l o g i c a lm e t h o d sa n dd n a a n a l y s i s c o m p a r i n gw i t hp r o t e i n s ，d n am o l e c u l e sa r ；em o r es t a b l e ，s p e c i f i c ， a n de a s yt oa n a l y s e ；t h e r e f o r e , d n aa n a l y s i si sm o r eh e l p f u lt o i d e n t i f y s a m p l e sw i t i ll o wq u a n t i t yo rb a dq u a l i t y s p e c i e si d e n t i f i c a t i o nu s i n gd n a a n a l y s i si st h eh o tp o i n t i nf o r e n s i cm e d i c i n er e s e a r c h 0 b j e e f i v e st o e v a l u a t et h es p e c i e ss p e c i f i c i t yo f1 7n e ws t rl o c ia n di n t r o n8o f t h et p 5 3 g e n e t oe s t a b l i s ht h em e t h o d so fr f l pa n a l y f i so fm t d n ac y tbg e n ea n d m u l t i p l e xa m p l i f i c a t i o no fm t d n a h vi h v ha n dc y tbr e g i o n s t o e v a l u a t et h ev a l u e sa n df e a s i b i l i t i e so ft h e s em e t h o d si nc o s to fs p e c i e s i d e n t i f i c a t i o no ff o r e n s i cb i o l o g i c a ls a m p l e s m e t h o d s1 7d i f f e r e n tk i n d so f o r d i n a r ya n i i n a l sa n dh u m a nb e i n gw e r es t u d i e di nt h i sr e s e a r c h ；d n a 4 g e n ep c rp r o d u c t s ；t h e nt h er e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e ( a l ui ) w a ss e l e c t e dt o d i g e s tc y tbg e n e , a n dt h ed i g e s t i o np r o d u c t sw e r ea n a l y s e df o r f u r t h e r i d e n t i f i c a t i o n ( 3 ) m t d n a - - h vi ，h vi ia n dc y tbr e g i o n s 、黼m u l t i p l e x a m p l i f i e d t h ep c rp r o d u c t sw e r ea n a l y s e d 、秭t hp a g es i l v e rs t a i n i n g r e s u l t s ( 1 ) n op c rp r o d u c t so f d 9 s 1 1 1 8a n dd 2 0 s 6 0 4l o c iw e r ed e t e c t e d f o ra l l l e e t e da n i n l a l s t h ed x s l 0 1 ，d y s 3 9 1 ，d 2 0 s 1 6 1a n dd 2 s 1 7 7 4 p r i m e r so n l ya m p l i f yt h eh u m a n ，m o u s ea n dm o n k e y sd n a c a v y , m o l l s e a n df r o g sd n ac o u l db ea m p l i e db yd 2 1 s 1 4 0 9 ，d x s 6 8 0 9a n dd y s 3 9 3 p r i m e r s , b u tn o to t h e ra n i m a l s d n a , o rt h ep c rp r o d u c t se l e c t r o p h o r e t i c a l l y m i g r a t e do u t s i d et h eh u m a n sa l l e l i c l a d d e rf r a g m e n t s t h ep r i m e r so f d x s 9 8 9 4 ，d y s 3 9 0 ，d x s 6 7 8 9 ，d i s 2 1 4 2 ，d 1 0 s 2 3 2 5 ，d 1 $ 2 1 3 4 。d 2 0 s 6 0 1 a n dd 2 s 2 9 4 4c a na m p l i f ym o s ta n i m a l s d n a ，t h ep c r p r o d u c t c sl o c a t e da t t h eh u m a n sa l l e l i cl a d d e rf n g m e n t s ( 2 ) t h eh u m a na n dm o n k e y si n o n8o f t h et p 5 3g e n eh a v eo n ea m p l i f i c a t i o nb a n d 讹s i z eo f4 6 0 b pw h i l eo t h e r a l 血n a l sc o u l da m p l i f yd i f f e r e n tk i n d so fb a n d s n oa m p l i c o n sw e r ef o u n di n c h i c k e na n dd o g sd n a ( 3 ) o n ef r a g m e n tw i t hs i z eo f 9 8 1b pw c r ed e t e c t e d i nc o w , p i g ，s h e e p , c a t , m o n k e y , r a b b i t , e a v y ，m o u s e ，e e la n dh u m a nm t d n a w h e nc y tbg e n ew a sa m p l i f i e d s o m ew e a kn o n - s p e c i f i cp c rp r o d u c t sw e 佗 d e t e c t e di nd o g n op c rp r o d u c t sw e r cd e t e c t e di nc h i c k e n , f r o g , d u c k , f i s h a n dh o r s e a f t e rd i g e s t e d 、丽t ha l ul3f r a g m e n t sw e r ed e t e c t e di np c r p r o d u c t so fc o wa n dp i g , s o m ew e a kf r a g m e n t sw e r ed e t e c t e di ns h e e p ，1 一、_-。-_。_-_-_-i_-，一 f r a g m e n tw i t hs i z eo f6 0 0 b pw a sd e t e c t e di ne a t , 1f r a g m e n tw i t hs i z eo f 8 0 0 b pw a sd e t e c t e di nm o n k e y ，1f r a g m e n tw i t hs i z eo f 9 0 0 b pw a sd e t e c t e di n r a b b i t , 2f r a g m e n t sw i ms i z e so f4 0 0 b pa n d5 5 0 b pw e l - ed e t e c t e di nm o u s e w i t ht h ed i s a p p e a r a n c eo ft h e9 8 1 b pf r a g m e n t m a n ys m a l ls i z ef r a g m e n t s w e r ed e t e c t e di ne a v yw i t h o u tt h ed i s a p p e a r a n c eo ft h e9 8 1 b pf r a g m e n t t h e r e sn oc h a n g ei np c rp r o d u c t so fe e la n dh u m a n sd n aa t t e ra l ui d i g e s t i o n ( 4 ) t h r e ef r a g m e n t sw i t hs i z e so f2 7 8 b p ，3 5 8 b pa n d4 2 5 b pw e r e d e t e c t e di nh u m a nm t d n a ；w h i l eo n l yo n ef r a g m e mw a sd e t e c t e di na n i m a l m t d n aw h e nh vi ，h vi ia n dc y tbr e g i o n sw e t em u l t i p l e xa m p l i f i e d t h e p o s i t i o no ft h eo n l yo n ea n i m a l sb a n di sd i f f e r e n tw i t ht h eh u m a nb a n dw i t h s i z eo f 3 5 8 b p c o n c l u s i o n s ( 1 ) d 9 s 1 1 1 8a n d d 2 0 s 6 0 4w e r c h u m a n - s p e c i f i cl o c i ；d x s l 0 1 ，d y s 3 9 1 ，d 2 0 s 1 6 1 ，d 2 s 1 7 7 4 ，d 2 1 s 1 4 0 9 ， d x s 6 8 0 9 ，d y s 3 9 0a n dd y s 3 9 3c a na m p l i f yd n ao ff e wa n i m a l sa n dm o s t p c rp r o d u c t se l e c t r o p h o r e t i c a l l ym i g r a t e do u t s i d et h eh u m a n sa l l e l i cl a d d e r f r a g m e n t s ，t h e s el o c ih a v eg o o ds p e c i f i c i t ya n dc a nb eu s e dt oa n a l y s es p e c i e s o r i g i n i nf o r e n s i cp r a c t i c e d x s 9 8 9 4 ，d x s 6 7 8 9 ，d i s 2 1 4 2 ，d 1 0 s 2 3 2 5 ， d i s 2 1 3 4 ，d 2 0 s 6 0 1a n dd 2 s 2 9 4 4h a v el o w e rs p e c i e ss p e c i f i c i t y t h es p e c i e s o r i g i no f t h es a m p l e ss h o u l db ed e t e r m i n e db e f o r eu s i n gt h e s el o c i ( 2 ) s p e c i e s o r i g i mc o u l db ep r e l i m i n a r i l ya n a l y s e db yd e t e c t i n gt h ef r a g m e n ts i z eo f 9 8 1 b pa f t e ra m p l i f i c a t i o no fc y tbg e n e o n ec o u l dd e t e r m i n et h eb i o l o g i c a l s a m p l ei sn o tf r o mh u m a no n c et h ef r a g m e n tw i t i ls i z eo f9 8 1 b pd i s a p p e a r e d a f t e ra l uid i g e s t i o n t h es p e c i f i co r i g i no ft h eb i o l o g i c a ls a m p l ec o u l db e d e t e r m i n e db ya n a l y z i n gt h en u m b e ra n dt h es i z eo f t h ed i g e s t i o np r o d u c t s ( 3 ) t h em e t h o d so fs p e c i e si d e n t i f i c a t i o nw i t ha n a l y s i si n t r o n8o ft h et p 5 3g e n e a n dm u l t i p l e xa m p l i f i c a t i o no fm t d n a - - h vi h vi ia n dc y tbr e g i o n sa l e s i m p l ea n ds e n s i t i v e i tc o u l db eu s e di nf o m a s i cm e d i c i n e 6 k e y w o r d s ：s p e c i e si d e n t i f i c a t i o n ，s h o r t t a n d e mr e p e a t s ，u u t i o r s u p p r e s s o rg e n ep 5 3 ，c y t o c h r o m e b ，r e s t r i c t i o nf r a g m e n t s l e n g t h p o l y m o r p h i s m ，m u l t i p l e xa m p l i f i c a t i o n 7 ， d n a 分析在法医学种属鉴定中的应用研究 前言 法医学种属鉴定就是要在法医学实践中鉴定生物检材的种属来源，确 定检材来自人体或者动物，必要时还需要确定何种动物。种属鉴定的检材 主要是各种体液、分泌液、排泄物，各种组织器官及其碎块，毛发、指甲、 骨骼和牙等。种属鉴定方法多样，各有特点，主要包括形态学方法、血清 学方法和d n a 技术检测方法。 形态学方法最早用于种属鉴定，如根据红细胞有无细胞核，可以区分 人类与鸟类，应用较多的是根据比较人类与其他动物的毛发、骨骼在大体 形态和显微镜下结构的差异，达到种属鉴定的目的。血清学方法是种属鉴 定的经典方法，广泛应用于血痕的种属鉴定。经过确证试验后，血痕的种 属试验是血痕鉴定的一个关键步骤，因为动物血中含有某些与人血液遗传 标记类似的物质，如a 及b 抗原，若不进行种属鉴定，直接检测血痕的a b o 血型，可能误将动物血判断为人血，造成错误认定。即使采用d n a 分析进 行个人识别检验，仍必须确定血痕足人血后才能做d n a 分型检测。血清学 方法是根据人体蛋白与动物蛋白间理化性质差异，通过检测检材中是否含 有种属特异性蛋白质来达到种属鉴定的目的，包括：沉淀反应，抗人血红 蛋白胶体金试验，间接酶联免疫吸附试验，凝集反应，等电聚焦，高效液 相色谱技术及纤维蛋白溶解实验等，其中环状沉淀反应方法简便，是目前 常规检验方法之一。 现场检材常受环境因素，如日晒、雨淋、酶解、细菌污染等影响，蛋 白质被破坏，常不能用血清学方法鉴定种属。与蛋白质相比，d n a 分子相 g 对稳定、特异、易于判断结果，因此，近年来运用d n a 技术进行种属鉴定 的研究及应用迅速发展。较早用于种属鉴定的是a l u 序列，检测方法有斑 点杂交和p c r 扩增两种。由于a l u 序列为人及灵长类动物共有，不具有人 类特异性，检测出a l u 序列，只能表明检材来自灵长类动物。 人类基因组计划已测出整个人类基因组序列，基因数据库中有很多动 物的基因组序列，并且动物的种类在不断增加，通过计算机对检材某一段 序列和基因数据库序列比较，根据两者序列同源性大小，判断它们在种属 上接近的程度，最终达到种属鉴定的目的。 总的说来，形态学方法较粗略，受检测者主观因素影响较大，可检测 的检材种类较少，主要为毛发、骨骼等；血清学方法应用最广泛，研究最 彻底，同时也存在检材的可检测时限较短，对检材要求较高，抗血清的特 异性不高等不足；d n a 技术发展迅速，具有特异性好，可检测腐败、其他 方法无法检验的检材。 本研究以各种分子生物学方法为基础，以人和十六种常见动物为研究 对象，研究了1 7 个新的s t r 基因座和肿瘤抑制基因t p 5 3 内含子8 的种属 特异性；建立m t d n ac y tb 基因p c r - r f l p 分析以及复合扩增m t d n a - - h v i 、h 、，i i 和c y tb 片段进行法医学种属鉴定的方法。从核基因组d n a 和线 粒体基因组d n a 两个方向研究d n a 分析在法医学种属鉴定中的价值和可行 性。 9 第一部分 十七个 目前应用于法医检验中的多态性遗传标记主要有s t r 长度多态性、 m t d n a 序列多态性和s n p 等遗传标记“。s t r 基因座在基因组中分布广泛， 其等位基因片段长度多在4 0 0 b p 以下，扩增成功率高，适用于大多数法医 物证检材的检验；s t r 基因座等位基因容易准确分型，多个s t r 基因座同时 使用，可有较高的个人识别和非父排除能力，在法医亲子鉴定和个人识别 中有较大的价值。s t r 分析以高灵敏度、高鉴别能力和杯准化分型等特点 成为目前法医d n a 分析中的主流技术0 1 。 目前应用的s t r 基因座种属特异性不一，而且法医检验工作需要进一 步增加新的s t r 遗传标记，提高检测能力。s t r 基因座等位基因频率分布在 不同人群间有一定的差异，法医学实践中，应选择在本地人群中等位基因 频率分布好，且具有良好种属特异性的s t r 基因座，s t r 基因座的种属特异 性研究与群体频率调查一样重要。 本课题选择了1 7 个s t r 基因座，对其进行种属特异性分析，选择基因 座时参照以下标准：( 1 ) 等位基因长度在3 0 0 b p 以下；( 2 ) 重复单位为四 核苷酸，不含有插入的非重复单位碱基；( 3 ) 等位基因数8 1 2 个：( 4 ) 基因座杂合度0 8 以上，个体识别能力大于0 9 ：( 5 ) 基因频率分布比较平 均；( 6 ) p c r 扩增稳定，突变率低。1 。 抑癌基因t p 5 3 编码的p 5 3 蛋白有抑癌作用；突变型t p 5 3 及其编码的蛋 白有促癌作用，现己发现人类肿瘤约5 0 以上含有突变型 1 0 阴影基因定位于1 7 号染色体的短臂( 1 7 p 1 3 i ) ，全长约2 0 k b ，共有1 1 个外 显子和1 0 个内含子，此基因有5 个进化上的保守区“1 。最近发现招钌内含 子8 作为分子标记用于种属鉴定有一定的特异性和分辨力嘲，它在不同动 物问扩增的片段长度的差异使得区分不同种属动物成为可能。本文对1 7 个新的s t r 基因座和职钌内含子8 的种属特异性进行了初步研究，探讨了它 们在法医学种属鉴定中的价值。 1 材料和方法 1 1 材料 1 1 1 样本 牛、猪、羊、狗、鸡、鸭、鱼、兔，鳝、蛙的肌肉组织，市售，猴、 豚鼠、鼠肌肉组织、猫颊粘膜试子取自四川大学实验动物中心，肌肉组织 浸泡于7 0 乙醇，4 冰箱保存；人类血液样本为本教研室已有样本，e d t a 抗凝，2 0 保存。 1 1 2 试剂 t a q 酶( 华美，国产) ；d n t p ( p r o m e g a ，国产) ；p r o t e a s ek ( p h a r m a c i a ， 瑞典) ：丙烯酰胺( 分析纯，国产) ；甲叉双丙烯酰胺( f l u k a ，瑞士) ； t r i s ( p h a r m a e i a ，瑞典) ；硼酸( 分析纯，国产) ；e d t a ( 分析纯，国产) ； i o o b p d n al a d d e r ( 天为时代，国产) ；其余试剂均为国产分析纯。 本研究中的1 7 对s t r 引物由上海申能博采生物技术有限公司合成， t p 5 3 内含子8 引物由上海生物芯片有限公司合成( 见表l 1 ) 。 i ) 2 0 s 6 0 4 d y $ 3 9 1 d 2 0 s 1 6 1 d 2 s 1 7 7 4 d 2 1 s 1 4 0 9 d x 8 6 8 0 9 d y s 3 9 0 d y $ 3 9 3 d x s 9 8 9 4 d x s 6 7 8 9 d i s 2 1 4 2 d 1 0 s 2 3 2 5 d i s 2 1 3 4 d 2 0 8 6 0 1 d 2 s 2 9 4 4 i n t r o n8o ft p 5 3 f ：5 一t 6 a g t g a a t t r r r c t a t a a t o c c 一3 r ：5 一从g c a a t c t c t 1 t t 1 t r r a c a c a - 3 f ：5 啊a t t c a t t c a a t c a t a c a c c c a 一3 r ：5 - g a t t c l t r g t g g t c , c t c t g - 3 f ：5 一e c c c t t c a a c t l b t c a g c 一3 r ：5 一t c c t t c c a c t g g t a t c t t g 一3 p ：s _ c 弧c k 撇暾c a c m m c 3 l r ：5 - c a a g 6 g a a c t a g c a c g a c a t 一3 f ：5 g g a g g g g a a t a c t t t g 一3 r ：5 一眦c i c r g a , s , t a t c c c t a t 一3 f ：5 - a g a g c c c a t g g a g c t a t c 订一3 r ：5 叫c t c a g r r c a a g g a a 础a - 3 f ：5 - t a t a 丌仃 c c a t l t 兀五o c 一3 r ：5 一t g a c a g t 从m t g 从c a c a t l 优一3 f ：5 _ g t g g t c t t c t c t t g t g t c a a t a c 一3 r ：5 一a a c t c 从g t c c a a a a a a t g a c - g - 3 p ：5 1 g c 皖n k n 矾吼镐t g 矾静3 r ：5 一 ”- r c l t r c o c t 嘣从o c 一3 f ：5 兀g g t a r r a a t 枞c c c t c t i t f - 3 r ：5 叫了 g a g g g c a g 从c c a a t a g g 一3 7 f ：5 a g c c c a g 从c a a t c t g t g a c 一3 r ：5 - t g c t c t a a a g t g a t t g t g a a g c 一3 f ：5 c t c a c g a g 从g c c t 册3 r ：5 1 弋晦c 嗡隅峨c k 筑蝴一3 1 f ：5 - a , a c , c a c a g t c c a c a c t c c t 一3 r ：5 一a g c t c 巾：c 了c 口f c c a a g a a g 一3 f ：5 6 g t a o c a g a g c a a c a o 盯r g 一3 r ：5 一 t a 从g g a a a t c c c 0 c t a c c 一3 f ：5 - t c t g t c t t a g a t g g a t g a a t g g 一3 r ：5 稍a 1 a t g g a a a g a t l 一3 f ：5 一从g g g t g g t l 口* a g t a g a 一3 r ：5 一a c c m a 觚a g t g t t a g a c - 3 1 1 3 仪器 p e 一9 6 0 0 扩增仪( p e 公司，美国) ； 增仪( b i o r a d 公司，美国) ；高速离心机 ( b i o r a d 公司，美国) ；d y y 一1 1 1 2 8 6 型电 漩涡振荡器( 浙江乐清仪器厂) ；可调 纯水体系( m i l l i p u r e ，法国) ；去离子水体系( e a s y p u r e r f ，美国) ；恒温 水浴箱( 国产) ；摇床( 国产) ；u v - 2 6 0 紫外分光光度计( 岛津，日本) 。 1 2 方法 1 2 1d n a 提取及定量 酚氯仿法提取d n a ( 具体步骤见附录1 ) ，紫外分光光度计检测d n a 的质与量( 具体步骤见附录2 ) 。 1 2 2p c r 扩增 以人d n a 为阳性对照，灭菌去离子水为阴性对照。p c r 反应体系：总 体积3 7 5i i1 ，含d n a 模板2 一1 0n g ，0 2 m m o l ld n t p2 4 | il ，f o x p c r b u f f e r 缓冲液( 无m g c l 2 ) 3 l il ，2 5 m m o l lm g c l 2l 。4 pl ，l o p m o l pl 每种引物1pl ，5 u i li t a q 聚合酶0 3 ul 。各基因座p c r 反应条件见表l 一2 。 1 2 4 等位基因分型标准物的制备 用各s t r 基因座引物分别扩增该基因座各个等位基因的凝胶浸泡液， 混合等位基因的p c r 产物，制成各基因座等位基因分型标准物嗍。 1 2 5t p 5 3 内含子8 扩增系统灵敏度检测 用酚氯仿法提取d n a 后，人样本分别定量出4 0 n g 、2 0 n g 、l o n g 、5 n g 、 2 5 n g 、i 2 5 n g 、0 6 2 5 n g 、3 1 2 5 p g 、1 5 6 2 5 p gd n a ，扩增t p 5 3 内含子8 ， 观察最小可检出d n a 量。 2 结果 2 11 7 个s t r 基因座的检测结果 将提取的1 4 种常见动物d n a 进行1 7 个s t r 基因座的检测，结果上述 动物d n a 在d 9 s i l l 8 和d 2 0 s 6 0 4 基因座均无p c r 产物( 图1 一i 、1 - - 2 ) ； d x s i o i 、d y s 3 9 1 、d 2 0 s 1 6 1 基因座只对猴d n a 有p c r 产物，d y s 3 9 1 和d 2 0 s 1 6 1 基因座对猴d n a 的p c r 产物在人类等位基因分型区内( 图1 3 、1 4 ) ； d 2 s 1 7 7 4 基因座对猴、鼠d n a 有p c r 产物，产物在人类等位基因分型区内 ( 图1 - - 5 ) ；d 2 1 s 1 4 0 9 基因座对猴、豚鼠、鼠d n a 有扩增产物，对鼠d n a 的扩增产物在人类等位基因分型区内( 图l 一6 ) ；d x s 6 8 0 9 基因座对羊、猴、 豚鼠、鼠、蛙d n a 有扩增产物，对豚鼠、鼠、蛙d n a 的扩增产物在人类等 位基因分型区内( 图i - - 7 ) ；d y s 3 9 3 基因座对羊、猫、猴、豚鼠、鼠、蛙 d n a 有扩增产物，对鼠、蛙d n a 的扩增产物在人类等位基因分型区内( 图1 - - 8 ) ：d y s 3 9 0 、d x s 6 7 8 9 、d x s 9 8 9 4 、d i s 2 1 4 2 、d i o s 2 3 2 5 、d i s 2 1 3 4 、d 2 0 s 6 0 1 。 和d 2 s 2 9 4 4 基因座对多种动物d n a 有扩增产物( 图l 一9 、l 1 0 、l 一1 i 、 l - - 1 2 、i 1 3 、1 1 4 、i 1 5 、1 1 6 ) ，片段多位于人类等位基因分型区 内( 表l - - 3 ) 。 图1 1人和1 4 种动物在d 9 s 111 8 基因座的电泳分析图l ：1 0 0b p 分子量标 准：m ：人类等位基因分型标准物：阳：人类d n a 的p c r s t r 分型结果作为阳性对照： 阴：阴性对照：上方：阴极：下方：阳极 图1 2 人和1 4 种动物在d 2 惦4 基因座的电泳分析图l ：1 0 0b p 分子量标 准：n ：人类等位基因分型标准物：阳：人类d n a 的p c i l s t r 分型结果作为阳性对照； 阴：阴性对照；上方：阴极；下方：阳极 图卜一3 人和1 4 种动物在d x s l 0 1 基因座的电泳分析图l ：1 0 0b p 分子量标准：m ： 人类等位基因分型标准物：m 1 ：女性l ；i t 2 ：女性2 ；f i ：男性l ；f 2 ：男性2 ；阳：人类 d n a 的p c r - s t r 分型结果作为阳性对照；阴：阴性对照；上方：阴极；下方：阳极 图1 4 人和1 4 种动物在d 2 0 s 1 6 1 基因座的电泳分析图l ：1 0 0b p 分子量标 准：m ：人类等位基因分型标准物：阳：人类d n a 的p c r - s t r 分型结果作为阳性对照： 阴：阴性对照：上方：阴极；下方：阳极 1 7 图1 5 人和1 4 种动物在d 2 s 1 7 7 4 基因座的电泳分析图l ：1 0 0b p 分子量标 准：m ：人类等位基因分型标准物：阳：人类d n a 的p c r - s t e 分毽结果作为阳性对照； 阴：阴性对照；上方：阴极；下方：阳极 图1 6 人和1 4 种动物在d 2 1 s 1 4 0 9 基因座的电泳分析图l ：1 0 0b p 分子量标 准：m ：人类等位基因分型标准物：阳：人类d n a 的p c r - s t r 分型结果作为阳性对照 阴：阴性对照；上方：阴极；下方：阳援 图1 7 人和1 4 种动物在0 ) ( $ 6 8 0 9 基因鏖的电泳分析图l ：1 0 0b p 分子量标 准：m 1 ：女性l ；舷：女性2 ；f i ：男性1 ；f 2 ：男性2 ；阴：阴性对照；上方：阴极； 下方：阳极 图1 8 人和1 4 种动物在d y s 3 9 3 基因座的电溶分析图l ：1 0 0b p 分子量标准： m 1 ：女性l ；1 1 2 ：女性2 ；f 1 ：男性l ；f 2 ：男性2 ；阴：阴性对照；上方：阴极；下方： 阳极 1 9 图l 一9 人和1 4 种动物在d y $ 3 9 0 基因座的电泳分析图l