（植物学专业论文）蓝猪耳（torenia+fournieri+lind）花发育及育性的研究.pdf

华南师范大学硕士学位论文答辩合格证明 学位申请人湟查墨向本学位论文答辩委员会提交 题为盔旌夏旌丝与整盘：! 垒生舀盘 的硕士论文， 经答辩委员会审议，本论文答辩合格，特此证明。 学位论文答辩委员会委员( 签名) 主席：圭：金 委员： 墼蕴 矬差 论文指导老师( 签名) ： 一f 年j 月7 e t 摘要 本研究以篮猪耳( t o r e n i a j o u r n i e r il i n d ) 为材料，采用扫描电镜和石 蜡切片方法，观察了蓝猪耳花芽的形态发生和结构发育过程，并对花的育 性进行了初步研究。主要结果如下： 1 从2 0 0 4 年1 1 0 月份分批播种蓝猪耳种子，结果显示，不同月份 播种的植株，从播种到现蕾的时间有所不同。1 月份所播的种子，植株现 蕾所需时间为6 7 d ：8 月份所播的种子，植株现蕾所需时间仅为3 4 d 。 2 ，光周期对蓝猪耳花芽分化有影响，初步实验表明，短日照使植株现 蕾时间推迟。 3 蓝猪耳花具有双子叶植物的4 轮花器官。从器官原基发生至花开 放以前，按形态和细胞学特征，将花的发育分为1 6 个阶段。阶段1 4 为 器官原基发生时期：阶段5 6 细胞加速进行分裂与分化；阶段7 小孢子 母细胞进入减数分裂；阶段1 3 大孢子母细胞开始减数分裂。完成整个1 6 阶段发育约需1 8 d 。 4 采用花粉离体萌发法检测花粉的活力，结果显示，6 和7 月份花粉 活力比较接近，约为6 3 ；8 月份花粉活力降为4 8 ：l l 和1 2 月份花粉 的活力分别为1 4 和1 5 ：说明在自然状态下，气候可能影响花粉活力。 5 从兰花中心大棚采集花粉，分设4 c 、2 5 ( 2 和3 7 。c 3 个温度处理， 每隔2 h 检测花粉的活力，结果表明，3 7 c 下花粉活力下降最快且最先失 去活力，2 5 。c 和46 c 下花粉活力下降较慢。 6 花期内，柱头在丌花第2 d 具有可授性。以开花第l d 的花粉异花 授处于开花第2 d 的柱头，观察到有花粉粒的萌发，结实率达9 7 。异花 授粉能提高蓝猪耳花的结实率。论文对结实率低的原因进行了探讨。 关键词：蓝猪耳：花发育阶段；花粉活力：结实率 a b s t r a c t t h ed i f f e r e n t i a t i o na n d d e v e l o p m e n tp r o c e s s e so f f l o w e rb u di nt o r e n i a f o u r n i e r il i n dw e r ec h a r a c t e r i z e da n ds o m ee x p e r i m e n t sw e r ec o n d u c t e dt o i n v e s t i g a t et h ef l o w e rf e r t i l i t y t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 s e e d sw e r eg e r m i n a t e di nd i f f e r e n tt i m ef r o mj a n u a r yt oo c t o b e r o f2 0 0 4a n dt h ed u r a t i o no fo n s e to f f l o w e r i n gw a so b s e r v e d i tt o o k6 7d a y s f r o ms o w i n gt ot h eo n s e to ft h ef l o w e rw h e nt h es e e d sw e r eg e r m i n a t e di n j a n u a r ya n do n l y3 4d a y sf o rt h o s eg e r m i n a t e di na u g u s t 2 i tw a sf o u n dt h a tt h e f l o w e r i n g t i m ew a s r e g u l a t e db y p h o t o p e r i o d s t h e o n s e to ft h e f l o w e r i n g w a s d e l a y e d w h e n3 0a n d 4 0 - d a y o l dp l a n t sw e r et r a n s f e r r e dt oas h o r t d a yc o n d i t i o n 3 t o r e n i a f o u r n i e r il i n dh a st y p i c a l4w h o r l so f t h ef l o w e ro r g a n s f r o mt h ea p p e a r i n go ft h ep r i m o r d i at ot h et i m eb e f o r ef l o w e r i n g ，f l o w e rb u d d i f f e r e n t i a t i o na n d d e v e l o p m e n t h a sb e e nd i v i d e di n t o16 s t a g e sb y c o r r e l a t i n gm o r p h o l o g i c a la n dc y t o l o g i c a lt r a i t so f t h ef l o w e rb u d s d u r i n g s t a g e s 1 4t h ef l o w e rb u du n d e r w e n ti n i t i a t i o no ff l o w e ro r g a np r i m o r d i a ； s t a g e5 6w e r ec h a r a c t e r i z e db y af a s t e rc e l ld i v i s i o na n dd i f f e r e n t i a t i o ni n t h ef l o w e r b u d s s t a g e7w a s d e f i n e da sam e i o s i ss t a g eo f m i c r o s p o r em o t h e r c e l l sa n ds t a g e13a sam e i o s i ss t a g eo f m e g a s p o r o c y t e t h ed u r a t i o no f t h e 1 6s t a g e sw a sa b o u t1 8d a y s 4 p o l l e nv i a b i l i t yw a se v a l u a t e db yp o l l e ng e r m i n a t i o ne x p e r i m e n t t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ep o l l e nv i a b i l i t yw a sa b o u t6 3 i nj u n ea n dj u l y a n dd r o p p e dt o4 8 i na u g u s t i tw a si nn o v e m b e ra n dd e c e m b e rt h a t p o l l e nv i a b i l i t yw a s1 4 a n di5 r e s p e c t i v e l yp o l l e nv i a b i l i t yw a sa f f e c t e d b y t h ec l i m a t ei nt h en a t u r e 5 p o l l e ng r a i n sw e r eh a r v e s t e df r o mt h ep l a n t so fo u t s i d ea n dw e r e 3 i n c u b a t e di n4 、2 5 。c a n d3 7 。c p o l l e nv i a b i l i t yw a sd e t e c t e de v e r y2h o u r s a f t e ri n c u b a t i o ni tw a sf o u n dt h a tt h ev i a b i l i t yd e c l i n e df a s t e ra t3 7 t h a n j ，a fa t4 o r2 5 c 6 t h es t i g m ao ft h ef l o w e rh a dr e c e p t i v i t yo nt h es e c o n dd a ya f t e r b l o o m i n g p o l l e ng e r m i n a t i o nc o u l db eo b s e r v e dw h e n2 - d a y o l ds t i g m a w e r ep o l l i n a t e db y1 - d a y p o l l e nf r o ma n o t h e rf l o w e r a n ds e e d - s e t t i n gr a t i o r e a c h e dt o9 7 t h er e a s o no fl o wr a t i oo f s e e d s e t t i n gi nt o r e n i af o u r n i e r i i ，i n dw a sd i s c u s s e d k e yw o r d s ：t o r e n i af o u r n i e r il i n d ；f l o w e rd e v e l o p m e n t a ls t a g e ；p o l l e n v i a b i l i t y ；s e e d - s e t t i n gr a t i o 4 1 前言 蓝猪耳( t o r e n i a f o u r n i e r i l i n d ) 又名夏墓、虎口子，是玄参科蓝 猪耳强( 翼萼属) 的一年草本植物。株高约2 0 3 0 c m ，叶片对生呈卵 形，先端尖，全株茎叶无毛。唇形花由旗瓣一枚，翼瓣两枚，龙骨瓣 一枚构成。花期4 至9 月，花色有白，粉红，浅监，深蓝等。它原产 于印度支那半岛，主要分布在亚洲、非洲的热带和亚热带地区，喜欢 温暖湿润的气候，不耐寒，适宜作为夏季花坛和地被植物，是一种重 要的观花植物。由于蓝猪耳生长周期短、容易再生、种子小数量多、 适合热带气候且具备特殊的裸露胚囊，可作为花器官发育和授粉受精 研究的模式植物( t e t s u y a 等，1 9 9 8 ) 。蓝猪耳不仅在园艺生产实践中占 有重要的地位，而且还具有很高的科研价值。 1 1 蓝猪耳遗传转化研究进展 应用基因工程技术定向改良花卉品质和性状，是当今花卉育种地 重要途径。目前花卉基因工程研究主要包括花色基因工程、花香基因 工程、花型基因工程、花期基因工程、株型基因工程等( 李静和车代 弟，2 0 0 4 ) 。通过基因操作已经获得了具有优良性状的转基因花卉，如 丌砖红色花的蓝猪耳( o u d 等，1 9 9 5 ) 、抗病毒的唐菖蒲( k a m o ，1 9 9 7 ) 、 抗黑斑病的月季( m a r c h a n t 等，1 9 9 8 ) 等等。目莳蓝猪耳再生及遗传 转化系统在国外的一些实验室已经比较完善。通过遗传转化已经进行 了蓝猪耳花期延长、花色改良及抗除草剂等方面的分子育种尝试。 a i d a 等( 1 9 9 8 ) 将乙烯合成关键酶a c c 氧化酶f 义和反义基因分别 转入蓝猪耳都得到了花期延长的转基因植株。在花色和花型改良方 面，a i d a 等( 2 0 0 0 ；2 0 0 1 ) 利用f 、反义基因引入可以使植物的内源 基因失活，从而导致花色代谢发生变化的原理，将c h s 和d f r 基因 以正义和反义的方式转入蓝猪耳植株中，出现了花朵表现出不同花型 的转基因植株。f u k u s a k i 等( 2 0 0 4 ) 将c h sm r n a 的编码区和3 端 的非翻译区分别作为r n a i 的靶位点，成功的诱导了基因的沉默，使 原来的蓝色花分别转变为白色和浅色的花。 1 2 蓝猪耳在植物授粉受精研究中的作用 由于蓝猪耳再生容易且在胚囊发育的四核期，胚囊从胚珠的珠孔 端伸出，形成了一个裸露的胚囊。在胚囊发育成熟时，助细胞、卵细 胞核大部分中央细胞均暴露在胚珠组织之； t - ( h i g a s h i y a m a ，2 0 0 2 ) ，所 以是研究被子植物细胞分化、胚囊发育和受精过程的极好的模式植 物。袁明等( 2 0 0 2 ) 通过对蓝猪耳活体胚囊的研究，发现中央细胞和 初生胚乳细胞中的微丝骨架在细胞核迁移时发生了显著的变化。授粉 前，微丝在中央细胞的周质位置呈现短束状随机分布，丌花2 d 后它 们组装成截然不同的微丝网络，在这个阶段，次生核( 两个极核形成) 位于中央细胞位置并与短束状的微丝列阵相联系。在授粉发生后不 久，分布在珠孔端的微丝发生片断化，此时次生核与卵细胞相邻。受 精后初生胚乳细胞核从卵细胞处移开，在初生胚乳细胞中微丝又重组 形成清晰的网络结构。房克风等( 2 0 0 3 ) 对蓝猪耳胚胎发生过程中细 胞表面三种凝集素凝集素( 伴豆刀凝集素，麦芽凝集素和大豆凝集素) 受体动态分布进行了研究。姚成义和赵洁( 2 0 0 4 ) 研究了钙和硼对蓝 猪耳花粉萌发和花粉管生长的影响。结果表明，c a 2 1 主要影响花粉萌 发速度和花粉管生长速度；硼明显影响花粉萌发频率及花粉管形态。 国外利用蓝猪耳为材料进行的授粉受精机理的研究也比较多。 t e t s u y a 等( 1 9 9 8 ) 研究蓝猪耳花粉管和胚囊离体受精的过程，发现活 细胞的丝状器在花粉管的伸长起着准确的指导作用，助细胞可以控制 花粉管的生长方向，花粉管只选择完整的、未受精的胚囊，而不会选 择胚珠经过热处理或助细胞遭到破坏的那些胚囊，说明花粉管受离体 活助细胞丝状器的特异吸引。通过蓝猪耳花粉和胚囊离体技术的改 进，t e t s u y a 等( 2 0 0 0 ) 详细观察了蓝猪耳花粉管进入胚囊的受精过程， 当花粉管到达目的胚囊后，就进入到珠孔端，在两个助细胞之间挤出 一条通道，然后花粉管顶端破裂，开始爆发式的喷出内涵物，喷出的 9 内涵物随后快速流入胚囊。花粉管物质的释放马上促使一个助细胞破 裂，而另一个助细胞可以存活几天，在花粉管释放的起始时，助细胞 保持完整，当完全释放后，该助细胞也马上降解以将雄配子转移到雌 配子处。w a l l w o r k 和s e d g l e y ( 2 0 0 0 ) 利用共聚焦显微镜对蓝猪耳的 授粉受精过程进行研究，发现受精过程在1 2 1 6 h 内连续进行，精细 胞和卵细胞的高频率融合主要发生在1 4 h 的时段。精细胞穿过降解的 助细胞要花几个小时，而精细胞和各自雌配子的融合同时进行。另外 他们还观察了授粉受精过程中胚囊结构和卵细胞、助细胞细胞壁结构 的变化。h i g a s h i y a m a ( 2 0 0 2 ) 对蓝猪耳授粉受精过程中助细胞在花粉管 进入过程中的功能进行研究，也得出助细胞是双受精过程中花粉管生 长方向的导引者和接受者的结论。 1 3 本研究的目的意义 随着经济的发展，社会的进步，人们对花卉的需求量闩益增大， 对花卉的特异品质要求越来越高。因此有关开花及花器官发育的研究 也变得尤为重要。目前丌花研究主要以拟南芥( l e v y 和d e a n ，1 9 9 8 ； k o o r n n e e f 等，1 9 9 8 ) 和金鱼草( a m a y a 等，1 9 9 9 ) 等温带花卉为模式 进行。蓝猪耳是一种重要的热带、亚热带观花植物，生长期短，花期 长，而且花朵繁茂，因此不仅在热带的花卉栽培中起着重要的作用； 而且还适合作为热带开花植物花发育研究的模式植物。此外由于其具 备特殊的裸露胚囊( t e t s u y a 等，1 9 9 8 ) ，又适合进行植物授粉受精过程 的研究。因此对蓝猪耳进行系统全面而深入的研究具有重要的理论和 实践意义。 我们在实践中发现，蓝猪耳自然结实率低，试管苗丌花后基本不 结实。本研究旨在划分蓝猪耳花器官发育阶段并研究花的育性，为进 一步了解和提高结实率、为花发育的分子生物学研究奠定基础。 1 0 2 材料与方法 2 1 实验材料 蓝猪耳( t o r e n i a f o u r n i e r il i n d ) 种子由宾金华教授提供，将华南 师范大学生命科学院兰花中心种植的深蓝色花的植株单株收种获得。 材料分别培养在本实验室光照培养室和华南师范大学兰花中心大棚。 2 1 1 室内种植 种子播种在含有培养土( 购自广东省顺德市翠筠有限公司) 的小 花盆中，培养室光周期1 6 h 光照8 h 黑暗，湿度7 0 8 0 ，温度2 3 ( 2 1 ，光照强度6 0 t m o l m 五s 一。播种2 周内每天浇水1 次；2 周 后。把幼苗单株移栽至含有混合土( 蛭石+ 培养土) 的花盆中，放在兰 花中心大棚继续种植，每3 7 d 浇水1 次，2 周施肥1 次。实验从2 0 0 4 年1 1 2 月份进行。 2 1 2 室外种植 实验从2 0 0 4 年3 1 0 月份进行。将种子直接播种在花盆中，幼 苗的移栽方法、浇水及施肥时间与室内种植相同。 2 1 3 温度的记录与整理 在华南师师范大学生命科学学院兰花中心大棚培养的蓝猪耳植 株旁，悬挂上海华辰医用仪表有限公司生产的高低温度计，每隔一天 记录下当天的同最高温度及最低温度等相关气象数据。本实验从2 0 0 4 年6 1 2 月。 2 2 实验方法 2 2 1 石蜡切片的制作与观察 参考郑国铝( 1 9 7 9 ) 的方法。石蜡切片在华南农业大学吴鸿教授 实验室完成。培养在光照培养室中的蓝猪耳出现花芽之前，每隔1 2 h 连续取样，将所取材料立即投入卡诺氏固定液中，进行抽气。然后于 常温下固定1 2 4 8 h 。经9 5 ，8 5 ，7 0 各级乙醇脱水，每级停留 3 0 m i n ，最后在7 0 的乙醇中，4o c 保存。 保存在7 0 乙醇中的材料，经系列乙醇脱水后制成石蜡切片， 切片厚度6 8 1 x m ，供形态学和细胞学观察，在l e i c ad m l b6 0 光学 显微镜下观察照帽。主要方法步骤如下： 保存于7 0 乙醇中的花蕾 经8 5 9 5 ，1 0 0 各级乙醇过渡，各1 5 h 0 二甲苯透明2 h + 浸蜡，包埋，切片，脱蜡，染色，封片镜检，摄影 2 2 2 花芽发育的扫描电镜观察 在华南农业大学电镜室进行。将蓝猪耳的花芽用戊二醛、锇酸 双固定，经乙醇逐级脱水，l 缶界点干燥和喷金后，用x l 3 0 e s e m 型 扫描电镜观察并照相。主要方法步骤如下： 取样斗4 戊二醛固定啼0 1 m o l l 磷酸缓冲液冲洗三次， 每次1 0 m i n - 1 锇酸固定，4 c 下保存1 0 5 1 2 0 m i n - 磷酸 缓冲液冲洗三次，每次l o m i n 乙醇梯度洗脱5 0 乙醇，1 0 m i n 7 0 乙醇，1 0 m i n 8 0 乙醇，1 0 r a i n 斗9 0 乙醇，1 0 m i n 斗 1 0 0 乙醇，1 0 m i n 1 0 0 乙醇，1 0 m i n 乙酸异戊醣冲 洗两次，每次1 5 m i n 斗临界点干燥斗装台斗上机观察， 拍照。 2 2 3 光周期对现蕾的影响 将蓝猪耳种子播种在光照培养室，光周期为1 6 h 光照8 h 黑暗，湿 度7 0 8 0 ，温度2 3 c l ，光照强度6 0 p m o l m 。2 s - 。分别于播 种后的第3 0 、4 0 、5 0 d 把一部分幼苗移至光周期为8 h 光照1 6 h 黑暗的 短r 条件下，记录现蕾时间。 2 2 4 花粉萌发率的测定 采用离体花粉萌发方法( 参考胡适宜。1 9 9 3 ；r o d r i g u e z r i a n o 和 d a f i r t ，2 0 0 0 ) ，在开花第1 d 用毛笔沾少许花粉抖在含有5 蔗糖+ 1 琼 脂+ o 0 1 硼酸的培养基上进行培养。置于2 5 ，7 0 湿度的人工气 候箱中。2 4 h 后进行镜检，以花粉管萌发长度超过花粉粒直径为标准 计算萌发率，并进行花粉活性检验。在显微镜下观察1 2 个视野的花粉 萌发率，求其平均值。 2 2 5 温度对花粉寿命的影响 大棚种植的蓝猪耳，丌花第l d 收集1 0 0 朵花的花粉，设置3 个培 养温度：4o c ，2 5 c 和3 7 ( 2 ，每隔2 h 取一定量的花粉，采用2 2 4 的花 粉萌发方法来测定花粉的萌发率，连续1 2 h 内检测这三个温度对蓝猪 耳花粉寿命的影响。 2 2 6 花粉量的测定 采用血球计数器法( 马之胜1 9 9 2 ) 。取充分成熟、饱满、未开裂 的花药，放入冲洗干净的青霉素小瓶中。置于干燥器内，于3 0 c 培养 箱中加速开裂。待花粉充分散出后，滴入l 六偏磷酸钠溶液，定容 至5 m l ，加盖振荡，使花粉呈悬浮状态，然后吸取数滴悬浮于血球计 数板上( 每大方格0 1 m m 3 ) ，在显微镜下计花粉数量，重复1 2 次，取 平均值。并数出所取的花药数量从而推算出每一花药中的平均花粉 粒数。 2 2 ，7 柱头可授性的检测 用m t t 法( r o d r i g u e z r i a n o 和d a f i n ，2 0 0 0 ) 检测。具体方法是： 每天9 ：0 0 - - 1 2 ：0 0 ，采下开花前、第1 d 、第2 d 和第3 d 的花，将柱 头浸入凹面载玻片中含有m t t 反应液的凹面处，同时用火加热杀死的 柱头作对照。干燥后在显微镜下观察柱头的颜色，若柱头变为黑色表 示具有可授性，若无变化则表示为无可授性。 2 2 8 繁育系统的检测 为了检测蓝猪耳植株的繁育系统和自花授粉及异花授粉的结实效 果，在光照培养室内，对所研究的蓝猪耳植株的花期内设立如下几个 处理进行人工授粉试验：( 1 ) 自然对照：不作任何处理，挂牌直至结 实：( 2 ) 花开之前套袋，直至花凋谢；( 3 ) 花丌之前套袋，花开之后， 以第l d 的花粉人工白花授粉，套袋；( 4 ) 歼花第1 d 的花粉人工异花 授丌花第1 d 的柱头；( 5 ) 玎花第1 d 的花粉人工异花授开花第2 d 的柱 头：( 6 ) 丌花第l d 的花粉人工异花授丌花第3 d 的柱头；检测和统计 各处理的结实率。 2 2 9 结实率的统计 对生长在兰花中心大棚的蓝猪耳，定期收种，统计各个植株的结 实率；同时对光照培养室中的蓝猪耳花的六种处理进行结实率的统计， 计算各处理的结实率。 结实率= 结实花朵开花花朵1 0 0 1 4 3 结果与分析 3 1 蓝猪耳的生长发育 3 。i 1 播种时间对现蕾的影响 从1 月2 9 日开始至l o 月2 3 同，分别播种蓝猪耳，共分9 批。由 表1 可知，l 3 批从播种到现蕾所需时阃差别不明显，为6 3 6 7 d ；4 9 批播种的，花芽分化显示出较大的时间差异，达2 8 d 。可见现蕾时间 是由f | 长和温度共同作用来调节的，只平均温度升高、日照时间增加 对进入花芽分化可能有促进作用。 表1 不同时间播种对蓝猪耳现蕾时间的影响 注：1 3 批播种于光照培养室两周后，单株移植到华南师范大学兰花中心： 4 9 批宣接播种丁兰花中心。 3 1 2 光周期对现蕾时闻的影响 植株在播种后的1 5 d 分盆移栽，之后，在光照培养室生长的1 5 d ( 3 0 d 龄) ，2 5 d ( 4 0 d 龄) ，3 5 d ( 5 0 d 龄) 进行短r 照处理。由表2 可知， 不同时期进行短同照处理，对蓝猪耳现蕾时间有明显的影响。一直生 长在长同条件下的植株现蕾最早，只需6 5 d ；从播种后的第3 0 d 进行 1 5 短只处理，现蕾所需对闽有些延长，需6 9 d ，第4 0 d 短r 处理现蕾最 晚。需7 6 d ，而第5 0 d 进行短只处理，则作用不明显，花芽分化所需 时间与对照只差2 d ，需6 7 d 。我们初步的实验结果表明，蓝猪耳在氏 日条件下现蕾时间早：而短f 1 处理则延长花芽分化所需时问。表l 结 果也暗示，随着只长的增加，能缩短现蕾所需时问。5 0 d 龄植株再进 行短开处理则不起作用。光周期对花芽分化的影响还需进一步的实验 证明。 表2 不同时期进行短曰处理现蕾所需时间 注：1 、2 、3 分别表示从播种后第3 0 d 、第4 0 d 、第5 0 d 进行短日处理，每个 处理n = 6 。 3 1 3 幼苗的生长 将第l 、第2 、第7 批播种的植株生长动态进行比较，每隔l o d 测量植株的高度。结果( 图1 ) 表明，第1 、第2 批的植株动态相似， 都里s 形生长变化，第l 批( 1 月2 9 同播种) 、第2 批( 2 月2 9 日播 种) 植株的最大平均高度分别为3 2 c m 和3 4 c m ，分别需1 3 0 d 和1 1 0 d ； 第7 批与第l 、第2 批的生长状况显示出很大的不同。第7 批( 8 月 1 9f i 播种) 最大平均高度只有约l o c m ，只有正常条件下生长高度的 2 8 6 ，1 2 月植株出现凋谢。此外我们还观察到，3 、4 、5 、6 、7 月 所播种的植株，最大平均高度都超过3 0 c m 而8 、9 、1 0 月所播种的 植株，1 l 、1 2 月份的低温影响正常生长以致于有些没到开花和结实 时，植株已经强谢。 6 4 5 0 4 0 0 3 5 0 ，i 3 0 0 型2 5 0 旭2 0 0 1 5 0 1 0 0 5 0 0 + 镣1 批 昌昌导88 是星蓦墨兰垦星 时间( d ) 图1 播种时间对植株生长的影响 3 1 4 植株的分枝与现蕾 参考b o r c h e r t 和s l a d e ( 1 9 8 1 ) 植物枝系确定的植物学法。蓝猪耳由 枝系的下部或里层向上部和外部推进，下部或罩层的第一小枝为第一 级，第一级上出现分枝时即为第二级，第二级上出现分枝时即为第三 级，依次类推( 图2 ) 。 图2 蓝猪耳枝系的确定( 参考b o r c h e r t 和s l a d e 1 9 8 1 ) 注：由r 向上的1 2 表示一级挫、：级枝等 由表3 可知，第1 批播种的植株出现二级分枝与三级分枝的时间 阳j 隔是1 7 d ，三级分枝与花芽出现同时发生，出现三级分技后1 5 d 开 始露出花瓣；第2 批植株二级到三级分枝之间的时1 1 日j 是1 1 d ，三级分 枝后1 6 d 露出花瓣。批次之间分枝时间的不同可能与季节变化有关。 蓝猪耳植株的分枝与花芽分化及_ ) 1 ：花的这种对应关系，为我们确定花 芽的出现时间提供了方便。 表3 植株的分枝与花芽分化时间 3 2 蓝猪耳的花发育 3 2 1 花器官的发生和发育 通过扫描电镜和石蜡切片技术，对蓝猪耳花发育的外部形态和内 部结构进行详细观察，结果表明，蓝猪耳花3 朵一束，包被于苞片内 ( 图版ia 、b 、c ) ，苞片原基在发育中顶端逐渐愈合，最终封闭，花 原基在苞片内发育成熟。下面就分阶段来描述蓝猪耳花发育过程和特 点。 阶段l ：萼片原基的发生阶段。蓝猪耳的花器官发育过程中5 个 花萼原基最早发生，未分化的花原基呈球形突起( 图版ic ) ，接着在 花原基侧面产生5 个突起，它们发育成5 个萼片原基。从位露上看，5 个萼片原基以轮状的方式发生在发生时阃上稍有差别( 图舨ic ) 。 但很快即发育为大小近一致的轮状排列的萼片原基( 图版1d ，图版 i ia ) 。萼片原基发生后，花原基顶端即出球形变成扁平状( 图版i ia ) 。 阶段2 ：花瓣原基的发生阶段。花瓣原基出现于萼片原基的内侧 基部，从萼片原基出现至花瓣原基的产生通常经历较长的时间。萼片 原基出现后，原基通过顶端生长和边缘生长，导致向t 延伸和面积不 断扩大。逐渐地引起萼片顶端逐渐合拢( 图版i ib ) 。当萼片发育至顶端 相遇时，其包裹的生长点依然呈扁平扩展状( 图版if ) ，由多层分裂旺 盛的细胞组成。随着萼片进一步分化，在萼片叶腋处位于生长点的表 面开始形成突起，此即为花瓣原基( 图版l lc ) 。在扫描电镜下观察到， 5 个萼片原基发育到一定程度，在其内侧、相糊的位簧，5 个花瓣原基 先后发生( 图版l ld ) ，但很快即发育为大小相近的轮状排列的花瓣原 基( 图版i l g ) 。 阶段3 ：雄蕊原基的发生。雄蕊原基的发生通常在花瓣原基出现后 不久，花瓣原基出现突起的同时，在花瓣原基内侧生长点表面上又发 生突起( 图版h e ) ，此为雄蕊原基。雄蕊原基发育速度快。大小很快 超过花瓣原基的高度( 图版i if 、g ) 。 阶段4 ：心皮原基的发生。当雄蕊原基高度大于花瓣原基时，在雄 蕊原基内侧，生长点细胞进行频繁分裂，形成近环状突起，其生长锥 顶部形成凹陷( 图版i i f ) ，呈浅浅锅状( 图版i i g ) ，此即为雌蕊原基。 以后，环状突起逐渐向上伸长呈筒状，基部不断膨大，上部伸长愈合， 产生了最早的心皮原基。 阶段5 ：随着萼片原基、花瓣原基、雄蕊原基、心皮原基的相继发 生，由萼片包裹着的花器官进行快速的生长，尤其是心皮原基和雄蕊 原基的生长最为迅速，当雄蕊和花瓣发育到几乎在同一高度时，雄蕊 呈现典型的两叶型，胎座原基出现，心皮开始愈合( 图版i l i a ) 。 阶段6 ：快速生长的5 枚萼片的顶部已紧密愈合，花瓣的高度又超 过雄蕊和雌蕊，花瓣开始向中心方向伸展，雄蕊戡现花药与花丝的分 化，花药体积小，花丝较粗且长。心皮基本愈合，仅顶端分离( 图版i i h ) ，中轴骆座明显可见( 圈版i i l b ) 。 阶段7 ：愈合的萼片继续伸长，花瓣继续向中心方向生长，逐渐包 围雌雄蕊，其高度超过雄蕊、雌蕊。每一花药的两个花粉囊可以明显 1 9 区分。雄蕊的花药表皮以内的组织进行旺盛的细胞分裂。花药壁的四 层结构：表皮、药室内壁、中层和绒毡层可以分辨，花粉囊中的胼胝 质沉积在小孢子母细胞的周围，小孢子母细胞开始进行减数分裂。雌 蕊也快速生长，花柱明显可见( 图版i i i c ) 。 阶段8 ：萼片包着的花瓣、雄蕊和雌蕊都进行快速的生长与分化； 与雄蕊相比，雌蕊的细胞分化更为明显，雌蕊在进行细胞分化的同时， 快速生长，其生长速度明显快于雄蕊，高度已超过雄蕊。同时子房进 行快速的发育，胎座上已出现了胚珠原基( 图版 i i d ，图版e ) 。 阶段9 ：愈合的5 枚萼片没有以同样的生长速度伸长，萼片的长 度不一，花萼出现了弯曲；花瓣已完全包住雌雄蕊。雄蕊的花药中的 小孢子母细胞处于减数分裂前期i 。雌蕊的胎座中已发育出维管束， 花柱已弯曲，胚珠正进行分化( 图版i i i e ) 。 阶段1 0 ：花萼继续生长，花冠紧紧地包着分化的雄蕊和雌蕊，雄 蕊的小孢子母细胞处于减数分裂来期i ( 图版i v a ) ，分裂形成的两个 细胞核，共存于同一细胞质中，不形成细胞蕤，无二分体时期，属同 时型；雌蕊的子房也进行快速的发育，在子房壁内出现了空隙( 图版 i i i f ) 。 阶段1 1 ：从花的大小看，此阶段其直径和高度均比上一阶段明显 增加；雄蕊的花药壁的中层受到挤压，已有部分溶解，绒毡层达到充 分发育，具多核。小孢子母细胞处于减数分裂来期i i ( 图版i v b ) ：包 围小孢子母细胞的胼胝质已有部分溶解。雌蕊的胚珠中出现孢原细胞， 柱头明显( 图版i i i g ) 。 阶段1 2 ：花萼的生长减缓，花瓣继续伸长，其长度向花萼接近， 雄蕊花药壁的中层完全溶解。柱头出现明显的分叉，胚珠有些弯曲倾 向( 图版i i i h ) ，出现次生造孢细胞( 图版f ) 。 阶段1 3 ：雌蕊的柱头与花柱连接处变细，胚珠的大孢子母细胞正 进行减数分裂；雄蕊生长更为迅速，其高度稍超过雌蕊，雄蕊花药壁 的绒毡层紧围绕内壁，核已消失。胼胝质已完全溶解，形成四面体型 2 0 的四分体( 图版i i i i ，图版i v c ) 。 阶段1 4 ：花冠的顶端接近萼片，雄蕊明显高于雌蕊；花药壁的绒 毡层已有部分溶解，花药中有单个的形状不规则的小孢子。胚珠的珠 被已形成( 图版i i l j ) 。 阶段1 5 ：雌蕊的高度再次超过雄蕊，雄蕊花粉囊的两室相通，花 药壁的绒毡层已完全溶解，仅剩下表皮和药室内壁。小孢子的细胞质 发生液泡化，形成一个中央大液泡，细胞质成一薄层，贴着细胞壁。 核从中央被挤到细胞一侧，进入单核靠边期。雌蕊的花柱道明显可见。 胚珠中出现珠孔( 图版g 。图版i u k ) 。 阶段1 6 ：萼片仍紧包着花冠，此时花冠开始着色。花粉囊中的小 孢子发育为成熟的花粉粒，花粉粒中出现了营养核和生殖核( 图版 d ) ，与营养核相比，生殖核较小。花药壁已开裂：胚囊清晰可见( 图 版h ) 。 3 2 2 花器官发育的时间进程 对生长在光照培养室不同发育时期的植株挂牌、取样并进行石蜡 切片观察统计，每个时期统计5 朵花。表4 列出了蓝猪耳花器官发育 的时问进程。蓝猪耳花芽1 6 个阶段的发育需要1 8 1 9 d 。原基发生约 需5 d ：减数分裂持续约l i d 。但具体到各个阶段所需时间又有很大的 差异：从阶段1 2 、1 3 所需最短的1 2 h 至阶段1 6 所需最长的6 6 h 不等。 表4 蓝猪耳花发育的时间进程 3 2 3 对应于花器官发育的花蕾大小变化 出图3 可知，阶段7 花芽长度2 6 r a m ，小孢子母细胞开始进行减 数分裂；大孢子母细胞进行减数分裂相对较晚，开始于阶段1 3 ，此时 花芽长度为8 4 m m ，对应于小孢子母细胞减数分裂己完成；阶段1 6 时，花芽长度为1 2 5 r a m ，花粉粒中有营养核和生殖核，而胚珠中才出 现胚囊。 图3 花芽长度与花发育阶段关系图 由图4 可知，小孢子母细胞开始进行第一次减数分裂，花芽的长 度为2 6 4 6 m m ：第二次减数分裂，花芽长度为4 6 6 4 m m ；第二次分 裂产生四面体型的四分体时花芽长度为6 4 1 0 3 m m ：单核花粉粒经过 有丝分裂产生营养核和生殖核，进入双核花粉粒时期，花芽长度为 1 2 2 1 o m m 。花芽长度与小孢子母细胞的这种对应关系为我们判断 小孢子的发育进程提供了方便。 ti n t挖 tu鼙 工l m 啪 tl 9 4 2 o 8 6 昌v 蜊半 ti 8 t，t6王0 4 2 o l23456 雄蕊发育 图4 花芽长度与雄蕊发育进程 注：横坐标1 6 分别表示孢原细胞时期、第一次减数分裂、第二次减数分 裂、单核花粉粒、单核靠边期和取核花粉粒。 由图5 可知，胎座上出现胚珠原基时，花芽的长度为3 4 m m ；胚 珠继续发育，大孢子母细胞开始减数分裂时，花芽的长度为8 5 r a m ； 花芽长度达1 2 2 m m 时胚囊已形成。花芽长度与雌蕊发育的关系为判 断雌蕊发育提供了方便。 l 1 1 萤 v 蜊 出 di i i l2345 6 雌蕊发育 图5 ，花芽大小与雌蕊的发育进程的关系 注：横坐标1 6 分别表示胚珠原基出现、孢原细胞时期、次生造孢细胞时 期、减数分裂开始、出现珠孔和出现胚囊。 工卜l|i 一 k 地 加 8 6 4 2 0 目】赵蟮 3 3 蓝猪耳的育性 3 3 1 花粉的活力 蓝猪耳雄蕊的每个花药的花粉粒数为7 6 6 5 2 3 8 0 。由所测得的数 据可以看出，各个花药中的花粉量变化较大。花粉的离体培养是检验 花粉活性的一军申快速有效方法，其中，培养基的配方及筛选是关键。 本研究利用新鲜花粉对不同浓度的蔗糖培养基进行了筛选( 参考d a f n i ， 1 9 9 2 ) 。由表5 可知，蔗糖浓度为5 时，萌发率最高，达6 7 5 ，而其 他的蔗糖浓度萌发率均低于6 7 5 。所以蓝猪耳花粉粒的离体萌发选用 的培养基为o o l 硼酸+ 1 琼脂+ 5 蔗糖。 表5 蔗糖对花粉萌发的影响 由图6 可知，6 、7 月份兰花中心大棚平均最高温度分别为3 0 1 、 3 0 6 平均最低温度约2 5 7 、2 4 9 ，这两个月份花粉活力比较接 近，分别为6 3 5 、6 2 o ；8 月份虽平均最低温度为2 5 1 ，但平均 最高温度为3 3 4 ，花粉活力降为4 8 1 ：1 l 、1 2 月份平均最低温度 分别为1 7 7 、1 3 8 ，其花粉的活力分别降到1 4 3 、1 5 6 。可见， 温度影响花粉活力，温度过高或过低都能影响花粉的活性。 c 魁 娟 1 5 1 0 0 6 + 缚旬 最低 温度 t 萌发 塞 91 0 1 11 2 月份 8 0 7 0 5 0 爸 ：4 0 篓 l 辖 3 。 - 2 0 1 0 0 图6 2 0 0 4 年6 1 2 月每胃每旬的气温变化与花粉活力的关系图 3 3 2 温度对花粉寿命的影响 为了检验温度对蓝猪耳花粉寿命的影响，分设4 。0 、2 5 0 和3 7 c 保存采集的花粉，t 2 h 内每隔2 h 以花粉的离体萌发法来检测花粉的活 力。出图7 可知，3 7 。0 下花粉活力下降最快旦最先失去活力，1 2 h 后 花粉活力降为0 ：2 5 c 和4 c 下花粉活力下降较慢，1 2 h 后，两种温度 下花粉的活力分别为7 8 、5 9 。在不同的温度下，花粉的寿命是不 同的，高温下花粉较快失去活力。 8 00 0 7 00 0 6 00 0 美5 00 0 9 8 褂4 00 0 9 8 划 培3 00 0 2 0 0 0 1 00 0 00 0 024 681 01 2 时问( h ) 图7 花粉在不同温度下的萌发率 3 3 3 花药绒毡层的发育 为了了解结实率低的原因是否与花药发育有关，我们观察了花药 壁结构的变化。对蓝猪耳花药壁的观察表明，小孢子母细胞二分体时 期( 阶段1 0 ) 绒毡层还处于发育时期( 图版v a ) ，阶段1 3 绒毡层核 消失( 图版v b ) ；小孢予至单核花粉粒( 阶段1 4 ) ，绒毡层己解体， 绒毡层细胞没有发生畸形或异常增厚。到单核花粉粒时期胼胝质壁 已完全溶解( 图版v c ) 。 3 3 4 柱头可授性 蓝猪耳花开花前花瓣紧紧包着柱头，柱头里弯曲状，可授性为0 ， 开花第l d 的柱头可授性较微弱，接近0 。丌花第2 d 的柱头可授性为 1 0 0 ，到第3 d 时，花基本凋谢，柱头的可授性又约为0 ( 表6 ) 。 表6 柱头可授性的m t t 检测结果 注：指托头不具可授性。+ 指丰= ：头具可授性+ 指枰头具微弱可授性。 对柱头进行扫描电镜的观察发现，蓝猪耳桂头表皮细胞有稠密拥 挤的毛茸，传粉时可粘获花粉粒；柱头表面干燥，花柱为开放形，具 花柱道( 图版vd ) 。花粉粒萌发形成花粉管后，花粉管可能沿花柱道 表面向下生长直至子房到达胚珠。 3 。3 5 开花期间花药和柱头的形态变化 对开花期间柱头和花药的初步观察表明，第1 d 的花，花药已微微 丌裂，花粉粒成熟，柱头的两片仍紧紧闭合；第2 d 的花，花粉囊中的 花药所剩无几，而此时桂头的两片已张开：第3 d 的花，整个花已凋谢， 花药枯萎，柱头也枯萎：可见花粉囊的打开与柱头张丌不同步( 图版 a i ) 。 3 3 6 植株结实率观察 对兰花中心大棚栽种的蓝猪耳分株挂牌，随机对播种的第l 3 批1 6 株植株单株收种进行结实率统计( 表7 ) 表明，不同的植株结实 率有很大的差异，最高的可达5 0 以上，占总植株1 2 5 ，在2 0 4 0 之间的植株占5 6 3 ，有1 2 5 植株的结实率为0 。 表7 分株挂牌植株的结实率 注：表中每株取花数n = 7 5 9 5 对2 0 0 4 年5 1 0 月期间兰花中心的蓝猪耳结实率的统计( 图8 ) 可知，不同月份植株的结实率有很大的波动；5 月份结实率最高，达 2 8 5 2 ：6 、7 月份结实率分别为3 6 和4 0 ，8 、9 、1 0 月份结实率只有 2 0 左右。 6 0 5 0 未4 0 i 3 0 冀2 0 1 0 o j j 份 图8 不同月份植株的结实率( n = 7 8 1 2 3 ) 为了对蓝猪耳育性进步开展研究，我们对光照培养室的蓝猪耳 植株分株挂牌进行几种不同的处理。从表8 可知，套袋处理结实率最 低，只有1 6 ；处于自然状态下，结实率稍高于套袋情况；人工传粉 对结实率有影响：以开花第1 d 的花粉分别进行授自花的柱头、授开花 第l d 异花的拄头和授开花第3 d 异花的柱头，结实率比较接近。分别 为3 5 和3 9 ；以开花第l d 的花粉异花授第2 d 的柱头，结实率最高， 达9 7 ，在电镜下可见萌发的花粉粒( 图版v e ) 。 表8 不同处理的结实率比较 注；a ，b ，c ，d ，e 和f 分别表示自然状态，套袋，第1 d 的花白花授粉 异花授粉，第1 d 花粉异花授第2 d 的枉头，第1 d 花粉异花授第3 d 的枉头。 2 9 i 。i，。-。 4 讨论 4 。l 光周期对蓝猪耳花芽分化的影响 花芽