（分析化学专业论文）光谱法研究血清白蛋白及壳聚糖与染料的相互作用及分析应用.pdf

摘要 黼簟羞i i 置鼻i i i 葺瞄葺皇i i i i 黼i i l l i i i i i i i i 黼黼皇i i | i i i i 常黼麓i i i i i i i i 嗣i i i i 鞘麓 分予光谱法研究盎清自蛋自及壳蒙糖与染料静 相互作用及分析应用 分新纯学专巫研党生零世星 指导教师扬季冬教授 攘要 荧光分析涟县有灵敏度高、选择性好，试样量少和方法简单等特点已成为一种常见的物 矮定性定量势辑方法。本文研究了蛋自质与多耪染耨豹程整稼蠲爱它 】静巍谱褥廷。势班睾 辫结果阐释了荧光猝灭的类趟，染料与蛋白成的作用力类型。并计算了体系的结合常数、结 食位点数和结台距离等有关参数。实验发现染料与蛋白质作用后，其荧光= 猝灭程度与染料浓 璇堇线佳关系，弦琵可建立分授测定染辩静耩方法；当蔽变蜜验条辞薅蛋自鹱与菜塑染瓣佟 用会导致染料荧光增强，其增强值与蛋白质的浓度呈正比，于是可建立分析测定蛋白质的新 方法。 莛振臻荦l 敬瓣往魄s ) 法楚遥l f 来发震越来熬操作麓霞、瑟壤度裹静努予光谱势拆方法。 目前r r s 法已经广泛用丁：生物，犬分子分析、咒机物和药物分析、痕量无机离子的测定和纳米 离乎的表征等方掰的研究。我们将它应用于糖类物质的分桥，建立了测定壳凝糖的r r s 掰方 法，并研究7 察验静条辞释彰瞬因素。方法雕乎壳聚糖翦安鼯徉箍灏定，缝莱令a 满意，并 髟其它方法比较有更高的灵敏虔和选择性。 1 蛋白质吩嗪类染料体系 在p h7 , 4 瓣t r i s - h c i 缓i 串分震中牛盎涛自蛋l q ( b s a ) 及入盎清鑫蛋自( 1 i s a ) 与酚藏秘红 ( i s ) 、中性红( n r ) 和番红花红( s ”吩嗪类染料发生结合反应。兰种染料均导被了蛋白质的荧光 狞灭，其荧光猝灭值与染料浓度成正比，可以虽白质为探针，铡定某些染料。由实验数据得 到举阕溢度下静瀚态猝灭常数秘静态猝灭结食常数、反癍的热力学参数翱缩合位点数。搬撂 f 6 s t e r 能量转移原理计算出y - 种染料与血清白蛋白2 0 ( 2 时的结合距离。同时研究了在p h 9 5 麴t r i s h c i 缓冲溶液中蛋白质慰p s 荧光的增强作用。根据p s 荧光增强稷度与蛋白质浓度的 线性关系，可爝予蛋白质的禽鬣测定。研究? 牛盘清自蛋融每中性红静三缭荧光兜谱，袋鹱 = 者发生了能最转移，b s a 将部分能虽转移绦n r 。导致b s a 的荧光猝灭。 两南大学硕十学付论文 2 蛋白质一二苯蒸奈基甲烷类豢辩体系 拜；荧光光谱、同步荧光光谱和紫羚吸收光谱法研究了b s a 及h s a 与维多利砸蓝f v b ) 、 维多利砸蓝b ( v b b ) 、维多利弧菔4 r ( v b 4 r ) 镣二苯基萘墓甲烷类染料相互作用及光谱特征。 结聚表明染辩譬溅良质的反应母致了蛋矗质蛉荧光猝灭，萁荧光猝灭篷与v b 、v b b 、v b 4 r 的浓度鼙正比。鲻s t e m - v o l m e r 方程和l i n e w e a v e r - b u r k 取倒数函数处理赏骧数据，得到不同 温度下的动态猝灭常数和静态獬灭结合常数、反应的热力学参数和结合位点数。根据f 6 s t e r 熊鬣转移原瑾计籍窭了三静染辩与趣涛白蛋白瓣结合距裹。 3 壳聚糖金属离子遥 自质体系 在p h6 5 的b r i t t o n - r o b i n s o n ( b r ) 缓冲溶液中。h s a 、铜离子和壳聚糖反应后形成曼冗 笈仓钫，导致体系辩敖射光强凌鼹簧增强。最大数射峰位予4 7 0h i l l 左右，纛键3 0 5 - 3 4 0 n m 麓右的散射峰强度最为稳定。程0 , 0 1 4 0p 幽l 范围内散射强度与壳聚糖浓魔晕线性关系。方 法灵敏度高，检测限为3 7n g m l 。该方法用r 海虾、蟹等实际样品及胶囊中含量测定，结果 潢露。 4壳聚糖一四碘荧光素体系 在p h4 0 的b r 缓冲溶液中，四碘荧光索与壳聚塘反心嫩成复合物导致拭振瑞利散射光 滋媛度增强，最犬r r s 蜂霞予5 7 5n m 。研究了体系静透宣发疯条蟹及共存貔蔟鳃影薅，援攥 其线性关系建立丁测定壳聚糖的r r s 新方法。线性范围魑o 1 2 ol t g m l ，检出限为1 7 n u m l 。方法简便、快速，重复性好。可用于壳聚糖胶囊的测定。本法与第曼体系中的研究方 法蟋有较叠翦攒遴弱荧光葬灭浚、紫羚分先必发毒更毫戆灵敏覆疑及方法鬟瑗牲好等谨蔗。 笑键词：荧光猝灭共振瑞利散射壳聚糖血清白戳白 l l a b s t r a e t s t u d yo nt h ei n t e r a c t i o na n da p p l i c a t i o ni na n a l y t i c a l c h e m i s t r yb e t w e e ns e r u m a l b u m i n so rc h i t o s a na n dd y e s t u f f b ys p e c t r o s c o p y s p e c i a l t y ：a n a l y t i c a lc h e m i s t r y r e s e a r c h ：m o l e c u l a rs p e c t r a la n a l y s i s t u t o r ：p r o f y a n gj i d o n ga u t h o r ：d e n gs h i x i n g a b s t r a c t f l u o r e s c e n c e s p e c t r o p h o t o m e t r y i sac o m l t l o n q u a l i t a t i v e a n dq u a n t i t a t i v e a n a l y t i c a lm e t h o dw i t hh i g hs e n s i t i v i t ya n dg o o ds e l e c t i v i t y , a n du s i n gl i t t l es p e c i m e n a n do p e r a t i o nr a p i da n ds i m p l e w es t o d ys p e c t r a lc h a r a c t e ro fd y e sb a n d 协s e r u l n a l b u m i n sb yf l u o r e s c e n c e q u e n c h i n gm e t h o d w ee x p l a i n e dt h et y p eo ff l u o r e s c e n c e q u e n c h i n ga n dt h et y p eo fe f f e e t i o no fp r o t e i na n dd y e sb ye x p e r i m e n t a ld a t a w ec a l c u l a t e dt h e f e a t u r e sp a r a m e t e ro f t h er e a c t i o ns y s t e ms u c ha sb i n d i n gc o n s t a n t s ，s i t e sa n dd i s t a n c e 。 w ef o u n dt h e i n t e n s i t y f l u o r e s c e n c e q u e n c h i n g i s l i n e a r l yp r o p o r t i o n a l t ot h e c o n c e n w a i o no fd y e sa f t e ri n t e r a c t i o nb e t w e e nt h es e n l ma l b u m i n sa n dd y e s ，t h e na n e wm e t h o df o rd e t e r m i n a t i o no fd y ec o u l db ee s t a b l i s h e d h o w e v e rt h ef l u o r e s c e n c e i n t e n s i t yo fd y ec a nb ee n h a n c e db e c a u s eo ft h ep r o m i nb i d i n gt od y e si nd i f f e r e n tc o n d i t i o n ，a n d t h ee n h a n c e di n t e n s i t yi s l i n e a r l yp r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no fb s a 。t h u san e w m e t h o df o rt h ea n a l y s i so f b s aw a s d e v e l o p e d r e s o n a n c er a y l e i g hs c a t t e r i n g ( r r s ) i sar e c e n td e v e l o p e dm o l e c u l a rs p e c t r a l a n a l y 涮m e t h o dw i t hh i g hs e n s i t i v i t y a tp r e s e n tr r st e c h n i q u eh a sb e e ne x t e n s i v e l y a n ds u c c e s s f u l l ya p p l i e di nv a r i o u sr e s e a r c hf i e l d ss u c ha sb i o m a c r o m o l e c u l a ra n a l y s i s o r g a n i c s u b s t a n c ea n dm e d i c i n e a n a l y s i s ，d e t e r m i n e di n o r g a n i ci o na n dc h a r a c t e r i z e d b a r l o m e f e ri o n 。i nt h et h e s i sw es t u d ya s s a yo fc a r b o h y d r a t es u b s t a n c e s 弼蛀lt h i s t e c h n i q u e 。a1 1 e wr r sm e t h o do fd e t e r m i n a t i o no fc h i t o s a nw a se s t a b l i s h e d a tt h es a m e t i m e ，w es t u d yt h ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n sa n di n f l u e n c e df a c t o r s t h em e t h o d w a sa p p l i e dt o d e t e r m i n a t er e a ls a m p l e so fc h i t o s a nw i t hs a t i s f i e dr e s u l t s 。i th a sh i g h e rs e n s i t i v i t ya n dg o o d e l e c d v i t yt h a no t h e rd e t e r m i n a t e dm e t h o d s n 佗r e s e a r c hc o n t e n t s 躺f o l l o w s ： l 董| 两南夫学硕七学位论文 燃皇皇皇曼目鼍i i i i i i i i i l l l l i i i l l l l l l s 1 s e r u ma l b u m i n - p h e n a z i n ed y es y s t e m b o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) o rh u m a ns e r u ma l b u m i n ( h s a ) b i n dt op h e n a z i n e d y es u c ha sp h e n o s a f r a n i n e ，n e u t r a lr e da n ds a f r a n i n et i nt h et r i s - h c ib u f f e rs o l u t i o n 越p h7 4 啊豫r e c a t i o nl e a dt of l u o r e s c e n c eq u e n c h i n go fs e r a l na l b u m i n t h er e l a t i v e v a l u e so f f l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gi sl i n e a r l yp r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no f d y e s ，i t c 黼b eu s e df o rd e t e r m i n a t i o no fd y e sw i t ht h ep r o t e i nf o rr e a c t i o np r o b e t h e f l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gd a t aa ld i f f e r e n tt e m p e r a t u r ew e r ea n a l y z e da c c o r d i n gt o s t e r n - v o l m e re q u a t i o na n dl i n e w e a v e r - b u r kd o u b l er e c i p r o c a le q u a t i o n t h ed y n a m i c q u e n c h i n gc o n s t a n t s ，t h eb i n d i n gc o n s t a n t so fs t a t i cq u e n c h i n go ft h er e a c t i o n , t h e b i n d i n gs i t e sn u m b e ra n dt h eb a s i ct h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r so ft h eb i n d i n gp r o c e s s w e r eo b t a i n e d 聃豫b i n d i n gd i s t a n c eb e t w e e nd y ea n ds e r u ma l b u m i n s 砒2 0 w a s o b t a i n e da c c o r d i n gt ot h et h e o r yo ff 6 s t e rsn o nr a d i a t i o ne n e r g yt r a n s f e rm e c h a n i s m h o w e v e rw es t u d yt h ef l u o r e s c e n c ee n h a n c e m e n to fp h e n o s a f r a n i n ei nt r i s - h c lb u f f e r s o l u t i o na tp h9 5 t h er e l a t i v ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fp h e n o s a f r a n i n ei sl i n e a r l y p r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no fb o v i n es e r u ma l b u m i n s i tc o u l db eu s e df o r d e t e r m i n a t i o no fb o v i n es e r u ma l b u m i n s 。w es t u d yt h et h r e e - d i m e n s i o n a lf l u o r e s c e n c e s p e c t r ao fn e u t a lr e db i n dt os e r u ma l b u m i n i td i s p l a yt h e r ea r ee n e r g yt r a n s f e ri n s y s t e m b o v i n es e r u ma l b u m i nt r a n s f e rp a r t i se n e r g yt o n e u t r a lr e d t h i sc a u s e d f l u o r e s c e n c eq u e n c h i n go f b o v i n es c n u na l b u m i n ， 2 s e r u ma l b u m i n - b i s p h e n y l n a p h t h y l m e t h a n ed y e ss y s t e m 1 1 圮b i n d i n gf e a t u r eo fb i s p h e n y l n a p h t h y l m e t h a n ed y e st ob o v i n e8 e n l i l la l b u m i n s o rh u m a ns e l 雠a l b u m i n s 、w 舔s t u d i e db yf l u o r e s c e n c e q u e n c h i n gs p e c t r a , t h e s y n c h r o n o u s f l u o r e s c e n c e s p e c t r u m a n du l t r a v i o l e t s p e c t r u m t h e r e a c t i o no f b i s p h e n y l n a p h t h y l m e t h a n ed y ea n ds e r u ma l b u m i n sc a u s e sf l u o r e s c e n c eq u e n c h i n go f s c m ma l b u m i n s t h er e l a t i v ef l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gi sl i n e a r l yp r o p o r t i o n a lt ot h e c o n c e n t r a t i o no fv b ，v b b ，v b 4 r t h ef l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gd a t aw e r ea n a l y z e d a c c o r d i n gt os t e m v o l m e re q u a t i o na n dl i n e w e a v e r - b u r kd o u b l er e c i p r o c a le q u a t i o n t h ed y n a m i cq u e n c h i n gc o n s t a n t s ，t h eb i n d i n gc o n s t a n t so fs t a t i cq u e n c h i n go ft h e r e a c t i o n , t h eb i n d i n gs i t e sn u m b e ra n dt h eb a s i ct h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r so ft h e b i n d i n gp r o c e s sw e r eo b t a i n e d t h eb i n d i n gd i s t a n c eb e t w e e nd y ea n ds e r u ma l b u m i n s a b s t r a c t w a so b t a i n e da c c o r d i n gt ot h et h e o r yo ff 6 s t e rsl i o nr a d i a t i o ne n e r g yt r a n s f e r m e c h a n i s m 3 c h i t o s a n - m e t a li o n - s e r u ma l b u m i ns y s t e m 下h et e r n a r yc o m p l e xs y s t e mw a sp r o d u c e df r o mt h et h r e ec o m p o s e so fh u m a n s e r u ma l b u m i n ，c o p p e ri o na n de h i t o s a nr e a c t i o n i nb r i t t o n - r o b i n s o n r ) b u f f e r s o l u t i o na tp h6 5 i tr e s u l t si nas i g n i f i c a n te n h a n c e m e n to fr e s o n a n c er a y l e i g h s c a t t e r i n g ( r r s ) i n t e n s i t ya n dt h em a x i m u m r r sp e a ki sa t4 7 0l 姐b u tt h er e s o n a n c e r a y l e i 垂s c a t t e r i n g ( r g s ) i n t e n s i t y 曩l3 0 5 3 4 0n n la r es t a b l e 弛ee n h a n c e dr r s i n t e n s i t y ( a r t s ) a t3 1 8n mi sp r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no f c h i t o s a ni nt h er a n g eo f 0 0 1 4 0l a g m l 硼1 em e t h o de x h i b i t sh i g hs e n s i t i v i t i e sa n dt h ed e t e c t i o nl i m i ti s 3 7 n g m lf o rc h i t o s a n + 曩臻m e t h o da r ea p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fp r a c t i c a ls a m p l e s 谢t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s 4 c h i t o s a n - t e t r a i o d o f l u o r e s c e i ns y s t e m t e t r a i o d o f l u o r e s c e i na n dc h i t o s a nf o r mc o m p o u n di nb r i t t o n - r o b i n s o n ( b r ) b u f f e rs o l u t i o na tp h4 0 i tr e s u l t si nag r e a te n h a n c e m e n to fr e s o n a n c er a y l e i g h s c a t t e r i n gi n t e n s i t y n l em a x i m u m r r sp e a ki sa t5 7 5n m o p t i m u mc o n d i t i o n so ft h e r e a c t i o na n dt h ei n f l u e n c eo ff o r e i g ns u b s t a n c e sh a v e b e e ni n v e s t i g a t e d i tw a sf o u n dt h a t t h er r si n t e n s i t i e sw c l i np r o p o r t i o n 静t h ec o n c e n t r a t i o n so f c h i t o s a n 采p e a k5 7 6n mi nt h er a n g e o f0 1 2 0 “g m l t h ed e t e c t i o nl i m i t sw a s1 7n g m l ar a p i d s i m p l ea n ds e n s i t i v er r s m e t h o df o rt h ea n a l y s i so fc h i t o s a nw a gd e v e l o p e d t i l i sm e t h o dw a sa p p l i e dt ot h e d e t e r m i n a t i o no fc h i t o s a ni nc a p s u l ew i 氆s a t i s f a c t o r yr e s u l t s 。t 毯sm e t h o da n da b o v e m e t h o di nt h r i ds y s t e ma l m o 糟s e n s i t i v et h a no t h e rm e t h o do ff l u o r e s c e n c eq u e n c h i n ga n d u l w a v i o l a tl i g h ts p e c t r o s c o p y t h er e a c t i o ns y s t e m sa r em o r es t a b l et o o k e y w o r d s ：f l u o r e s e e f l e eq u e n c h i n g , r e s o n a n c er a y l e i g hs i 瞪l l e 娃纛辫e h 秘o s a n ， s e r u ma l b u m i n v 独创性声明 学位论文题目： 左遂鎏盟霾堕盗鱼登自丞杰塞擅生鎏整鲍担亘佳 用及分析应用 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导卜进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 学位论文作者：剐矽妇堪签字日期：。趵口7 r 年纩月厂日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：$ 夥皂 签字日期：加厂年月厂日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址 导师签 签字日 电话 邮编 日 第一章绪论 第一章绪论 1 1 荧光分析法简介 荧光分析法具有灵敏度高、选择性好、信息量丰富、检测限低等特点，广泛 应用于许多领域。荧光法分为直接荧光法和间接荧光法。间接荧光法又包括络合 荧光法、催化荧光法、荧光猝灭法、同步荧光法、荧光与其它技术联用等。 荧光猝灭：广义上是任何可使荧光强度不与荧光物质的浓度呈线性关系的作 用，或任何可使荧光量子产率降低的作用【1 1 。荧光猝灭过程可以分为动态猝灭和静 态猝灭。 荧光猝灭法利用猝灭剂对荧光物质荧光的猝灭作用而建立起对该猝灭剂的测 定方法。一般荧光猝灭法比直接荧光测定法更灵敏，并具有更高的选择性。猝灭 效应的研究还用于生物化学研究中推测蛋白质上结合点的位置和蛋白质的性状。 动态猝灭遵循s t e m - v o l m e r 方程式。静态猝灭f 0 f 与猝灭剂浓度的关系式与 动态猝灭所得到的关系式相似。因此，单独通过测量荧光强度所得到的荧光猝灭 数据，在没有其它信息时，很难判断所发生的猝灭现象是属于动态猝灭还是静态 猝灭。 荧光猝灭法的应用： ( 1 ) 用于分析测定 金属离子f e ( i i i ) 1 2 1 、c r ( v i ) t 3 1 等能猝灭苯类或氨基酸类物质的荧光，根据荧光猝 灭值与金属离子的浓度的相关性建立起金属离子含量测定的方法。此法还应用于 硝酸盐【4 1 、染料【5 1 、药物 6 1 、核酸们、表面活性剂嘲等的含量测定。 ( 2 ) 物质间的相互作用研究 根据荧光猝灭值与药物浓度的关系以及相关公式，用于研究蛋白质与阿霉素 9 1 、水杨酸【1 0 1 、多沙唑嗪 1 1 j 、吡罗昔剧1 2 1 等药物的作用方式，推测药物在蛋白质 上的结合位点数及反应的热力学参数测定等。用于金属离予 1 4 - 1 6 】如铜锌等与蛋白 质的相互作用研究。以及用于非金属离子如碘离子【明与过氧化物的相互作用讨论。 谢孟峡等还将荧光猝灭法用于研究单宁酸【嘲与人血清白蛋白的二级结构变化之间 的关系。之外，该方法还应用于无机酸【1 9 1 、染料 2 0 1 等物质的相互作用研究，以及 药物与d n a 2 1 1 的分析研究。廖见培【2 2 1 等将它用于小分子与d n a 嵌插键合和沟槽 2 两南大学硕十学位论文 键合两；种传用模式研究。此外，它逐用于碜 究虽囊质的构像变化等。 第一嚣绪论 ! ! ! ! ! 鼍曹! | e ! ! ! 自e 目鼎囊舞皇| ! ! ! ! ! 目! s 恻鼎! ! ! ! ! ! ! ! ! s 自! ! ! ! 目目皇自! ! ! ! | 自| 喇i l l l l _ 1 2 共振瑞翻散射及其应用 一、共振瑞利散射技术概论 悫教菇：楚獾一素光线遴j 童奔凌霹燕入瓣走戳终豹程露方囱上鼹溺羁走强靛 现象。 瑞利散射；是一类入射光与散射光波长相等的光散射1 2 4 ，是敬射粒子远小鼍= 入黪走波长戆一耱嚣淫教瓣 2 5 - 2 6 。它在努拆诧学孛戆波霉包蕹穗瓣分子錾戆溅定 ( 2 7 - 2 9 1 ，分子回转半径、形状及尺寸的测定f 3 0 - 3 、物质含量测定 3 2 - 3 3 1 、离子缔含或 聚合反应过程的动态行为研究 3 4 - 3 6 ，以及其他一些物理化学参数的测定等 3 7 1 。 璇羁羧蹇重液覆广泛毽鼯存在嚣大不建之楚：痿罨瘩平羝秘获乏逸择往。 共振瑞利散射( r e s o n a n c er a y l e i g hs c a t t e r i n g , r r s ) 是指当瑞利散射位于或接 避于分子吸收带时，电子吸收电磁波频率与散射频率相同，电予阏共振而强烈吸 l | 殳党戆麓量劳黟生秀次数瓣，这释蔽浚+ 褥教耪过程髂为共振臻琴l 教秀| 或共振鬻臻 瑞利散射。其散射强度能比单纯的瑞利散射提高几个数量级，并殿不再遵循瑞制 定律。 共振瑞翻敬麓与擎缝翡臻剃教射鞠魄，其有戳下俊煮 3 7 1 ；( 1 ) 鸯受嵩静灵敏发， ( 2 ) 可以使用普通光源，( 3 ) 有更好的选择性，( 4 ) 可为研究分予结构和反应特征 提供更丰富的信息。( 5 ) 可通过离子缔会反应测定痕嫩金属、非金属、有机化食物 鞍瓣作药物分耩磷究。 二、共振瑞利散射技术的殿用和发展 共振瑞利散射始于上缴纪丸十年代树，1 9 9 3 年p a s t e r n a c k 等【3 8 憎次在荧光分 兜光度诗上翻掰营逶悫涿溺教穿| 先研究# 啭类镬：合物谨孩酸分子主黪j 壅堆秘，获 而首次将该技术与化学过程联系起来。 刘绍璞等研究发现，程硒( i v ) 碘化物罗丹明8 f 蚓反应体系中发现了两种 纛缀散射光谱残象，蓄次将其作为一耱光谱现象熬竣研究磊盈鬻予痰量硒的溅定 4 0 l 。后又发现 h g ( s c n ) 4 p 国络阴离子与罗丹明b 或罗丹明6 g 形成离子缔合络含 物后，二级散射与反二级数射光谱有变化，并将其应用于痕量汞的测定p 。 黄承恚笛入将该技术穗子测定玺秘夭分子辫捌l 。粱宏群5 等剽蓠次应用共振散 射技术结合平衡透析法研究了i 与人血清蛋白( h s a ) 或牛血清蛋囱( b s a ) 的结 3 两南大学硕十学付论文 i i i i i i l ll l l l l l 拦s ! ! ! ! ! ! g g 目| | ! ! 黼 念平衡。 共振瑞捌散射技术避苓来在分析他学领域得到快速的发展。剿用染料在蛋翻 质 4 6 - s 3 、核酸5 4 - s o 上进行堆积导致强烈的共振瑞利散射增强信号与生物大分子的 浓度关系进行象犍大分子静含量测定或绦棱分析和孛句象变位研究。利用某些生他 药物l e o - e 3 与染料等反应后的光谱特性与药物浓度的关系对药物进行分析测定。校 据会属离子与熊它物质反应后共振瑞利散射光谱增强进行金属离子【6 4 粕1 的含量测 定。默纳米粒予 6 9 - 7 1 1 为探锋与染辩或药物俸瘸嚣共强光谱壤强恧送行穆矮的含爨 测定。此外，必振瑞利散射技术还用手表面活性裁f 7 2 删、食品安全f 7 8 】，糖类物质 等的分析研究。共振瑞利散射技术在蛋囱质、金属离予、核酸、药物分析方面得 刭? 广泛的瘟耀，共振琏剃数魅技术成为分辑化学镁域中一重要麟零霹缺少戆分 析技术。 l 第一章绪论 1 3 蛋白质及其测定方法 蛋白质是生命的最基本物质，它是生命活动中重要的化学物质，是重要的生 物大分子。蛋白质在体内的含量大，种类繁多，它与病毒、酶、免疫、物质运输、 遗传、生命等都有密切关系，蛋白质参与几乎所有的生命活动过程，如生物体新陈 代谢起催化作用的酶、多种激素、细胞生长分裂的调节因子和细胞表面与内部的 各种受体等等，其主要成分都是蛋白质。蛋白质是生物体赖以生存的生命物质。 人血清白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质，是由5 8 5 个氨基酸残基组成的单肽链蛋 白质，分子量约为6 6 5 0 0 道尔屯页【7 9 1 。有关蛋白质的研究是目前生命科学和化学领 域中一个十分活跃的课题隅o l 。了解掌握这些生物大分子的性质对认识、保护和改 善人类自身的生活有着极其重要的意义。 蛋白质含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基，故在紫外光区( 吸收峰2 8 0r l l n 左右) 有吸收，并且在3 4 0 3 5 0n n l 有荧光发射，三种芳香氨基酸残基相对应的荧 光强度为1 0 0 ：9 ：o 5 ，因此可以用蛋白质的紫外吸收或荧光光谱进行定量分析。 血清白蛋白( s e r u m a l b u m i n , s a ) 在哺乳动物体内起着重要的贮存和运输作用， 它在体液中的含量以及构象的变化可作为人体营养、健康，疾病诊断等的重要指标 8 1 - 8 3 1 。 由于蛋白质分子巨大，结构复杂，对蛋白质的研究进程缓慢，目前对蛋白质 的研究包括对蛋白质的分析测定和蛋白质与其他物质的相互作用机理两个方面。 蛋白质的研究方法主要有：( 1 ) 高效液相色谱法 8 4 1 张素艳等对几种蛋白混 合物变性后酶解在溶液中用高效液相色谱法进行了基因序列分析，实现了混合蛋 白的快速准确鉴定。( 2 ) 紫外吸收光谱法该法对蛋白质进行定量分析大多是基于 有机染料与蛋白质的结合作用所产生的显色或褪色反应。而近年来借助染料进行 蛋白质检测的分光光度法发展很快【睁1 0 ，该方法设备简单，敏度高，稳定性好，线 性范围宽，干扰离子少，简便、快速、准确、经济。( 3 ) 荧光光度法蛋白质分 子中的色氨酸( t r p ) 、酪氨酸( t y r ) 和苯丙氨酸( p h e ) 残基能吸收紫外光，并且能 发射荧光。所以蛋白质具有天然荧光。由于t r p 、t y r 和p h e 的r 基团不同，三 者的荧光光谱也不同。其荧光峰位也不同。当和某些染料结合后能引起荧光增强 或猝灭，根据光谱特性与蛋白质浓度关系，可用于测定蛋白质【1 0 2 12 1 l 。除了可用于 两南丈举硕士学何论文 燃兰舅皇曼曼璺嘲攀尝蜷麓篡g 鲁皇曼黛糟筹懋舞墨鼍鼍曼皇蝴_ 燃i l l i l l l l l l i 一_ 。一一 i l l i l i l i i l 鬣岛矮的宠整溅定终。荧毙毙谱法遥弼以鼹来磅究鬃瞧囊分子盼稳蒙变化，研究 琊或t y r 残纂豹徽环壤戳及研究鬣弱瓣变鳇等。荧光法溺窳爨秘矮通鬻貔紫终 吸收光度法灵敏。( 4 ) 色谱洌1 2 2 1 1 ( 5 ) 凝胶色谱法杨昭鹏铎【1 2 4 1 根据蛋白质分 子璧与分子犬奎抟线蕊荚系，溅定了凡转天然状态下瓣蛋鑫震分予蟹。( 6 ) 毽缨 管电泳法l 渤 ；( 7 ) 藏二甑落法蛋自矮静鞭二色谱分为远紫井酝( 1 8 5 - - 2 4 5 n m ) 耨 避紫外区( 2 4 5 - - 3 2 0 n m ) 。魄紫外区怒肷键的吸收峰范围，反映了童链构象。该方 法蠢受窭l 磷究辫戆广泛笑注牡2 6 - 1 3 0 l 。窀楚醺究鞴溶液审虽鑫震褥黎鳇一韩莰逮、麓 肇、准确瓣方浚 1 3 1 - i 蚓。( 8 ) 共振光数射法共撤滟散射技术爨近年来迅速黢袋怒 米的研究小分子物质与礅髓质、核酸簿生物大分予发生作用并形成聚集体的灵敏 瑟凝戆磷巍穷法1 1 3 5 - 1 5 4 | 。该方法不莰傻簇予定璧测是，还技瑙予鬣鑫凄懿构象_ 糨 d n a 测序研究中。共振毙散射技术蠢敏魔鞍荧光分橱法高，辩髓w 在普通荧光分 光光度计上操作进行，方法方便快速。( 9 ) 免疫法f 螂】、化学发光淡 1 5 6 1 、纳米粒予 法1 鞠、等寓予体共振、 ：攀发毙h 5 摹l 簿浚。 有机小分予与生物大分子的结含在缎理、病理和薄理过稷中凝有极其蘸黉的 意义。蛋白质作为一种常见的生物大分予，它与有机小分子的结合一直是研究的嫩 纛。甄究未簧裳孛在魏个方瑟：一是佟甏缒熊赢、糨麓佟焉蠢类墼耱毒橇参分予懿 鳐台形态。二嫩作用豹横型及结合参数的测定。 研究肖机小分子在生物大分子上的聚集形式以及作用机理。缴物大分予与小 努予静鳍余方式及摇美缝合参数等懿测定在瘸毽势撵、螓瘴梭测骧及基蠢突变骞 黼具有重爱意义。有机小分子与蛋囱质的作用类缀主繇包括以下几种：氢键、藏 德华力、静电弓i 力、疏水作用力。然而根据热力学参数与作用力间的关系，w 以确 寇其终爝宠爽麓。 染料怒能够使纤维和其他被着色物殿获得鲜明而牢固的颜色的一类有机化含 物。 蓊囊染辩类毒撬，j 、癸予与生黪大分乎之鬻翡髂趱对舔究囊褥生溪、病瀵蕊蘩 宵积极作用，对研究染料小分子对人类擞活，健康、海性、致病性具有很熏要的 作用。对这类化合物的反应机理和动力学的研究可以为揭示生化威应、降解机壤 秘探索生禽瑰蘩等提供匿簧鹣毒参考徐蕊妁箍慧+ 宅举莰是识举袋域理沧研究魏 项目，同时也怒医学领域热切关注的爨娶课题。 6 第一章绪论 本文研究的是蛋白质与染料小分子的相互作用，研究了它们之间的作用方式， 测定了相关的热力学参数。讨论了它与蛋白质的作用力类型、作用过程及其在分 析上的应用。 7 两南大学硕十学位论文 1 4 壳聚耱及分裁溅宠方法 糖类( s u g a r , s a c c h a r i d e ) 过去称为碳水化合物，现在统称为糖类。广泛分布于嫩 携体内，其俘翅主要毒：生穆体静钱爨来源；在艇物体中转像宠其它物质。 按照组成糖类成分的糖基个数，可将糖类分为单糖、低聚糖和多糖三类。 糖类物质的存在形态：糖不仅以多糖或寡糖( 通常指少于2 0 个糖基组成的糖 链) 等游离形式袁接参与生念过程，露爨皇要以糖缀会甥雏形式( 磐糖链与其窀 生物大分子以共价键相连形成的化合物如糖蛋白、糖敬、糖脂等) 参与许多重臻 的生命活动。一切重要的生命活动过程都有糖的参与，糖链犹如细胞和大分子袭 嚣的皴矮，攘髭缀瞧之闻、缀憝与各耱大分子之秘掇曩终弱鲍售惑。生念现象审 驹切最本质的表现形式，包括物质运输、能量转移及分子之间韵相互作用，都 与糖类物质密不可分。 甲麦素( c h i t i n ) ：又名足丁震、甲党糜等。存在予诲多低等动貔褥蘩是节黢动 物如虾、蟹、琵虫等的外壳中，也存在予低等植物如荫藻类和真菌的细胞壁中。 鼹2 乙酰氨基之脱氧d 葡萄糖经d ( 1 卅) 糖苷键连接的聚合物。甲壳素资源书 赛，每年逢球主麴自然生产爨霉达1 0 l l 噫，是要蠡夔器圭唯一含麓褒子戆霹食魏