（植物病理学专业论文）烟草黑胫病菌、青枯病菌拮抗放线菌的筛选及控病研究.pdf

孺婴 烟草黑胫病菌、青枯病菌拮抗放线菌的 筛选及控病研究 植物病理学专业硕士研究生王岩 指导教师肖崇刚教授易龙副教授 摘要 烟草是我国重要的经济作物之一，近几年来，重庆烟区以烟草黑胫病、青枯 病发病最为严重，造成大量经济损失。在烟草病害的多种防治方法中，生物防治 对烟叶生产的可持续发展具有较好的应用前景。放线菌是生防微生物的重要来源， 在植物病害的生物防治中占有重要地位。本试验从采自我国几大烟区的烟草根围 土壤中分离筛选出对烟草黑胫病、青枯病病原菌有拮抗效果的放线菌，进行温室 控病研究及菌株的鉴定，并进一步探讨其生防控病机理。具体结果如下： 1 、从重庆、贵州、云南、河南、陕西、山东这几个我国主要的烟草生产地区 共采集烟草根围土壤样品5 7 份。在高氏一号培养基上采用平板稀释法分离获得4 1 5 株放线菌。 2 、将分离获得的4 1 5 株放线菌分别采用平板对峙法和平板喷雾法对烟草黑胫 病菌、烟草青枯病菌进行初筛，得到有拮抗活性的菌株1 7 8 株，占分离总数的 4 2 9 。其中对烟草黑胫病菌有拮抗活性的菌株1 3 4 株，占分离总数的3 2 3 。对 烟草青枯病菌有拮抗活性的菌株7 7 株，占分离总数的1 8 6 。而对两种病害均有 拮抗作用的活性菌株为3 3 株，占分离总数的7 9 5 。 3 、对初筛拮抗半径在1 0 m m 以上的烟草黑胫病菌拮抗菌以及初筛拮抗半径 在5 m m 以上的烟草青枯病菌拮抗放线菌菌株进行复筛，测定单个菌株的平板抑 菌效果。对烟草黑胫病菌抑菌带宽在1 5 , - 3 5 m m 拮抗菌共有1 1 株菌株，其中菌 株h l l 3 4 、b x2 - 5 4 抑菌带宽平均值为3 3 3 m m 和3 2 m m ；对烟草青枯病菌的抑 菌圈直径在3 5 - 5 5 m m 的活性菌株有7 株，菌株g a s1 - 9 和y y d3 3 2 抑菌圈直 径均在5 0 m m 以上。 4 、温室盆栽试验结果显示，参试拮抗菌株发酵原液对两种病害均有良好的防 治效果。对烟草黑胫病的防治效果在3 8 1 3 - - 8 8 8 9 ；相对防效5 0 以上的菌株 8 株，占总数的6 1 5 ；防效在8 0 以上的菌株2 株，菌株b x 2 5 4 的防治效果最好， 西南大学硕十学位论文 达8 8 8 9 ；其次为b x l 1 ，防效为8 8 1 3 。拮抗菌对烟草青枯病的防治效果在 3 7 8 9 - - 9 0 0 6 ；防效在6 0 以上的菌株有6 个，占总数的8 5 7 。相对防效最高 的菌株为s x l1 - 7 ，防效9 0 0 6 ；其次为菌株g a s l 9 ，相对防效为8 5 7 2 。 5 、通过形态和培养特征的观察、生理生化的测定对平板抑菌和温室控病筛选 出的1 3 株拮抗菌进行分类鉴定，初步认为1 3 株拮抗菌均为放线菌，其中链霉菌属 ( s t r e p t r o m y c e s ) 6 株，包括白孢类群、绿色类群、黄色类群和粉红孢类群弗氏亚 群；链轮丝菌属( s t r e p t r o v e r t i c i l l i u m ) 3 株；糖单孢菌属( s a c c h a r o m o n o s p o r a ) 1 株；鞘孢囊菌属( e l y t r o s p o r a n g i u m ) 1 株；孢囊放线菌属( a c t i n o s p o r a n g i u m ) 1 株。另外对5 株温室防效较好的菌株更深入的进行了1 6 sr d n a 序列及系统发育分 析，结合其形态学及生理生化特性，确定菌株的分类地位。结果表明：菌株g a s l 9 为娄彻氏链霉菌( s t r e p t r o m y c e sr o c h e i ) ；b x l 1 为变异链霉菌( s t r e p t r o m y c e s v a r i a b i l i s ) ；b x 2 5 4 为吸水链霉菌( s t r e p t r o m y c e sh y g r o s c o p i c u s ) ；s y z 2 6 为放 线细菌( a c t i n o m y c e t a l e sb a c t e r i u m ) ；s x l l 7 与皱褶链霉菌( s t r e p t r o m y c e s p l i c a t u s ) 最相近。 6 、对5 株温室防效较好的菌株进行拮抗代谢产物分析，结果表明，参试菌株 都具有良好的生防潜力。其中s y z 2 6 并i b x l 1 均能产生几丁质酶、纤维素酶、蛋 白酶以及嗜铁素等生防活性物质。 关键词：放线菌烟草黑胫病菌烟草青枯病菌拮抗 a b s t r a c t s c r e e n i n ga n d b i o c o n t r o le f f e c to fa n t a g o n i s t i c a c t i n o m y c e t e sa g a i n s t p a r a s i t i c aa n d r a l s t o n i as o l a n n a c e a r u m c a n d i d a t e ：w a n gy a n a d v i s o r ：p r o f x i a oc h o n g g a n ga s s c o p r o f y il o n g a b s t r a c t t o b a c c ob l a c ks h a n kc a u s e db yp h y t o p h t h o r a p a r a s i t i c a , t o b a c c ob a c t e r i a lw i l t c a u s e db yr a l s t o n i as o l a n n a c e a r u m ，a r et h ei m p o r t a n td i s e a s e sw i t hs e r i o u sl o s si nt h e t o b a c c oa r e ao fc h o n g q i n g b i o c o n t r o li sa np r o m i s i n gm e a s u r eo fm e t h o d si nt o b a c c o d i s e a s ec o n t r 0 1 a c t i n o m y c e t e si si m p o r t a n ts o u r c ew i t hp o t e n t i a lb i o c o n t r o le f f e c t i n t h i ss t u d y , s c m ea c t i n o m y c e ss t r a i n sw i t ha n t a g o n i s t i cp h y t o p h t h o r a p a r a s i t i c a r a l s t o n i as o l a n n a c e a r u mw e r ei s o l a t e df r o mt o b a c c or m z o s p h e r es o i li nm a i nt o b a c c o a r e a so fc h i n a ，t h ec o n t r o l e f f i c a c y a t g r e e n h o u s ee x p e r i m e n t ，t a x o n o m i c i d e n t i f i c a t i o n ，a n dt h e b i o c o n t r o lm e c h a n i s mb ya n a l y z e d 1 5 7s o i ls a m p l e so ft o b a c c of i e l d sw e r ec o l l e c t e df r o mc h o n g i n g ，g u i z h o u ， y u n n a n ，h e n a n ，s h a n n x ia n ds h a n d o n gp r o v i n c e s ，t h em a i nt o b a c c op l a n t i n ga r e a so f c h i n a at o t a ln u m b e ro f4 1 5i s o l a t e so fa c t i n o m y c e t e sw e r ei s o l a t e d b yd i l u t i o n c u l t u r e do ng a u s e ss y n t h e t i c a g a rp l a t e 2 t h ea uo fa c t i n o m y c e t e si s o l a t e sb yt e s t e dw i t ht h ep h y t o p h t h o r a p a r a s i t i c a b yp a i r i n gc u l t u r eo np l a t em e t h o d ，a n dw i t ht h er a l s t o n i as o l a n n a c e a r u mb yp l a t e s p r a y i n gm e t h o d a n d1 7 8 ( 4 2 9 o ft h ea l li s o l a t e s ) w e r ef o u n dt ob ea n t a g o n i s t i c e f f e c ta g a i n s tt h ep a t h o g e n 1 3 4 ( 3 2 3 o ft h ea l li s o l a t e s ) a g a i n s t 脚t o p h t h o r a p a r a s i t i c a , w h i c hi e w e r e7 7i s o l a t e s ( 18 6 ) a g i a n s tr a l s t o n i as o l a n n a c e a r u ma n d t h e3 3i s o l a t e s ( 7 9 5 ) c a l la n t a g o n i s t i ct h eb o t hp a t h o g e n s 3 f a r t h e rs c r e e n i n gw e r ec a r d e do u tb ye a c hs t r a i nw i t hp l a t ei n h i b i t i o ne f f e c t a g a i n s tp h y t o p h t h o r ap a r a s i t i c ao v e r1 0m mi n h i b i t i o nr a d i u sa n da g a i n s tr a l s t o n i a s o l a n n a c e a r u mo v e r5m mi n h a b i t i o nr a d i u s t h er e s u l t ss h o w e dt h a t1 1s t r a i n sh a d g o o da n t a g o n i s t i ce f f e c t so np b t o p h t h o r ap a r a s i t i c a , a n dt h ei n h i b i t i o nz o n e d i a m e t e r sr a n g e df r o m1 5t o3 5m m ，i nw h i c ht h ei n h i b i t i o nz o n eo fs t r a i nh l l 3 4a n d i i i 西南大学硕十学位论文 b x 2 - 5 - 4w e r e3 3 3m ma n d3 2m m ，r e s p e c t i v e l y 7s t r a i n sw h i c ha g a i n s tr a l s t o n i a s o l a n n a c e a r u mw e r ef o u n dt h ei n h i b i t i o nz o n ed i a m e t e r s r a n g e df r o m3 5t o5 5 m m ，t h e i n h i b i t i o nd i a m e t e r so fs t r a i ng a s l 9a n dy y d 3 3 2w e r eo v e rt h a n5 0 m m 4 t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ez y m o l y s i sl i q u i do fa l lt h ea c t i n o m y c e t e sh a dg o o d b i o c o n t r o le f f e c t s a g a i n s tt h et w od i s e a s e s a tt h eg r e e n h o u s e e x p e r i m e n t s t h e b i o c o n t r o le f f e c ta g a i n s tp 坶t o p h t h o r ap a r a s i t i c ar a n g e df r o m3 8 1 3 t o8 8 8 9 i n w h i c hh a v e8 ( 6 1 5 o ft h ea 1 1s t r a i n s ) s t r a i n sw i t hr e l a t i v ee f f i c i e n c yo v e r5 0 2 s t r a i n sw i t hr e l a t i v ee f f i c i e n c yo v e r8 0 w e r eb x2 5 4s t r a i na n db x1 - 1s t r a i n w h i c ht h ec o n t r o le f f e c tr e a c ht o8 8 8 9 a n d8 8 1 3 r e s p e c t i v e l y t h eb i o c o n t r o l e f f e c to fa c t i n o m y c e t e sa g a i n s tr a l s t o n i as o l a n n a c e a r u m r a n g e df r o m3 7 8 9 t o9 0 0 6 i nw h i c hh a v e6 ( 8 5 7 o ft h ea l ls t r a i n s ) w i t hr e l a t i v ee f f i c i e n c yo v e r6 0 t h e s t r a i n ss x l l 7h a dt h eb e s tc o n t r o le f f e c to f9 0 0 6 f o l l o w e dt h es t r a i ng a s l 9w i t h t h ec o n t r o le f f e c to f8 5 7 2 5 b a s e do nt h ec h a r a c t e r i s t i c so fm o r p h o l o g ya n dp h y s i o l o g y b i o c h e m i s t r y , p l a t e s c r e e n i n ga n dg r e e n h o u s ee x p e r i m e n t ，1 3a n t a g o n s i s t sw e r ep r i m a r i l yi d e n t i f i e da s a c t i n o m y c e t e s i nw h i c h6s t r a i n sb e l o n gt os t r e p t r o m y c e si n c l u d i n ga l b o s p o r u s ， v i r i d i s ，f l a v u s ，r o s e o s p o r u sf r a d i a e ，a n d3s t r a i n sb e l o n gt os t r e p t r o v e r t i c i l l i u m ，o t h e r 3s t a i n sb e l o n gt o s a c c h a r o m o n o s p o r a ，e l y t r o s p o r a n g i u ma n da c t i n o s p o r a n g i u m r e s p e c t i v e l y f u r t h e r m o r e ，5s t r a i n sh a dg o o db i o c o n t r o le f f e c ta tg r e e n h o u s ew e r e a n a l y z e dw i t hm o r p h o l o g y , p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lp r o p e r t i e s ，1 6 sr d n a p h y l o g e n e t i ct r e e ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eg a s l 9w a si d e n t i f i e da s 7 印f 加，吵c 邸r o c h e i ， b x l 1w a s s t r e p t r o m y c e s v a r i a b i l i s ，b x 2 5 4w a s s 打e p t r o m y c e sh y g r o s c o p i c u s ，s y z 2 - 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2 0 ，严重时出现大面积绝产现象【2 】o 烟草黑胫病的病原为寄生疫霉烟草致病变种( p h y t o p h t h o r ap a r a s i t i c a v a t n i c o t i a n a e ( b r e d ad eh a r m ) t u c k e r ) 属鞭毛菌亚门( m a s t i g o m y c o t i n a ) ，卵菌纲( o o m y c e t e s ) ，霜霉目 ( p e r o n o s p o r a i e s ) ，疫霉属( p h y t o p h t h o r a ) 。烟草黑胫病菌在固体培养基上产生菌丝旺盛， 菌丝粗细不均，无隔膜，有分枝，宽8 5 ( 5 1 1 ) j f l m 。菌丝膨大体有或无，其上有若干条放 射状菌丝。孢囊梗简单合轴分枝或不规则分枝。孢子囊卵圆形至近圆形，孢子囊具乳突，通 常1 个，少数2 个，乳突半球形，大多明显，孢子囊顶生，常不对称，具脱落性，孢囊柄短 【2 t 5 1 。 烟草黑胫病多发生于成株期，少数苗床期发生，以侵染茎基部和根为主。幼苗发病，多 数先在根、茎部近地面处发生黑色斑，病部向上下扩展，延及全部茎、叶及主根。受病茎基 部细缢，引起“猝倒”症状。但与猝倒病不同的是，黑胫病部分或全部根系腐烂变黑，而烟 草猝倒病一般在发病中、初期，根系不变色腐烂。在高温多雨时，病苗全部腐烂，表面产生 白色绵毛状霉，并迅速蔓延到附近的苗上，造成烟苗成片烂死。如果天气干燥，则病苗干枯 呈黑褐色。幼苗受病轻微时，症状不明显。烟苗移植大田后，遇到高温多湿环境，极易发病。 多数先在根茎交接近地面处开始发黑，并向上扩展。黑胫病在成株期发病，亦先在茎基部出 现黑斑，病斑迅速向四周上下及髓部扩展，可达3 0 4 0 c m 高，使水分运输受阻，叶片自下而 上依次变黄萎垂，悬挂在茎上，终致全株枯萎。病菌从抹权时的伤口侵入，也可形成茎斑。 两南大学硕十学位论文 这些茎斑可同时向上、下和茎周围扩展，严重时引起枯死或腰折。拔起病株，可见病株根部 变黑，部分侧根、须根腐烂。一般情况下，在叶片上较少造成危害，但若生长季节多雨，雨 点飞溅，也会将土表或茎基病斑上的孢子传播到下部叶片上，引起叶片侵染，使中下部叶片 常产生圆形黑褐色的大块病斑，似沸水烫状，形如膏药，农民称之为“黑膏药”，病斑无明显 边缘，有水渍状淡绿相间轮纹，病斑可很快扩展到茎部，引起“腰烂”。此病虽有各种症状， 但共同的特点是，发病株的叶片都是自下而上逐渐发黄下垂萎蔫，发病初期，过夜后能恢复。 4 - - 一5 d 后全部叶片萎凋，最后全株枯死。病株因根大部分腐烂，故很容易拔起。纵割被害的 茎部，除皮层变黑外，髓部亦变成黑褐色，且干枯瘪缩呈碟片状，片与片之间生有稀疏的白 霉。如遇多雨潮湿的天气时，在病组织外表也生有白霉 7 1 。 1 2 烟草青枯病的发生、病原及症状特点 烟草青枯病( t o b a c c ob a c t e r i a lw i l t ) 俗称“烟瘟”、“半边疯”，是危害烟草最重的一种细 菌性病窖【8 】o 最显著的症状是枯萎，一旦发病即可造成全株死亡，对烟草的产量和质量影向 极大，是烟草上一大毁灭性病害，特别在苗期，此病常致幼苗成片枯死，造成大量缺苗【9 1 。 该病广泛分布于全世界的热带、亚热带和一些温暖的地区。在中国，烟草青枯病是长江以南 烟区普遍发生的主要病害之一。对烟草的产量和质量影响极大，成为不少地区烟草生产发展 的制约因素【8 , 1 0 j 。 烟草青枯病原菌为劳尔氏菌属的假单胞杆菌( r a l s t o n i as o l a n n a c e a r u m ( e e s m i t h ) c o m b n o v ) 1 1 】。菌体短杆状，两端钝圆，无芽孢，无荚膜，大小2 9 2 , u m x o 5 0 跏m ，单极鞭1 3 根，偶尔两极生，好气性，革兰氏阴性【8 】。在肉汁蛋白胨培养基上菌落为小圆形，表面润 滑有光泽，初为乳白色，后变为褐色。病菌生长的温度范围为1 8 - - 3 7 ，最适温度3 0 - 3 5 ， 致死温度为5 2 1 0 m i n ；p h 值4 - 8 ，最适为6 6 。烟草青枯病菌在病残体中可以存活7 个月， 在土壤或堆肥中可存活2 - - - 3 年以上，有的竟达8 - - 2 5 年，但在干燥的条件下很快就死亡，在 种子表面的病菌两天后即可全部死亡。青枯病寄主范围很广，可侵染茄、豆、风仙花等4 4 个科的数百种植物。除烟草外，对花生、辣椒、番茄、茄子及马铃薯等为害最重，但不侵染 禾本科及麻类植物【1 2 】。 烟草青枯病是一种典型的维管束病害，危害期多出现在旺长期或旺长期后，根、茎、叶 各部均可受害。发病初期，先是病侧有一、二张叶片软化萎垂，但仍为青色，故称“青枯病”。 发病的中前期，烟株一直表现一侧叶片枯萎，另一侧叶片似乎生长正常，这种半边枯萎的症 状可作为与其他根茎类病害的重要区别。若将茎部横切，可见发病一侧的维管束呈黄褐色至 黑褐色。若纵剖病茎，则见维管束的黑色病斑为长条状，但外表仍为暗黄色。发病后期，病 株全部叶片萎蔫，髓部呈蜂窝状或全部腐烂，形成中空，但多限于烟株茎基部，可与髓部全 部中空的烟草空茎病相区别。若将病茎横切，用力挤压切口，可见黄白色的乳状黏液自导管 处渗出，即细菌溢脓。此外，茎上的黑色条斑和叶片上的黑黄色网状病斑是烟草青枯病最重 2 第一章文献综述 要的症状特征【邵1 。 1 3 烟草青枯病和烟草黑胫病的防治概况 1 3 1 选用抗( 耐) 病品种 烟草青枯病和黑胫病是典型的土传病害，药剂防治效果不是十分明显，种植抗病品种则是 防治烟草土传病害的经济有效措施。目前生产上，针对烟草黑胫病引进的抗病品种有n c 8 2 、 k 3 2 6 、g 2 8 、g 8 0 、g 1 4 0 、n c 8 9 和k 3 4 6 等，除此之外中烟9 0 、中烟9 2 0 3 、中烟1 4 、云烟8 5 等 也较抗黑胫病【1 3 】。烤烟品种中，岩烟9 7 、硒9 4 等也对烟草青枯病具有较妞的抗病性【1 4 1 ，匡传 富【1 5 】也报道过t 1 4 4 8 a 、贵烟、c v 0 9 1 、大晒烟、香烟和k 3 2 6 对烟草青枯病有较强的抗性。 在利用抗病品种时必须了解，现有品种对这两种病害都不是免疫的，在接种体数量大的 时候，仍会严重发病，如n c 8 2 、g 2 8 等在连作病地上发病株率也可以超过3 0 ，故只有在 与轮作等防治措施的相结合，这些抗病品种才能更好发挥其防病保产作用【1 3 】。 1 3 2 加强栽培管理措施 轮作：由于烟草青枯病和黑胫病的病原菌不寄生禾本科作物，因此与禾本科作物轮作3 年 以上，要防止与茄科作物轮作、间作。 铲除烟根、茎及其他病株残体，是一项有效的栽培防病措施，包括移栽时剔除病苗，田间 彻底清除病残体，当田间发现病株，应及时拔除带出田外作适当处理，不得随手乱扔，以减少 初侵染来源。平整土地，高垅栽培，易于排灌，防止积水又可防止前期干旱。另外适时早栽可 以使烟株易感病阶段与高温多雨的流行气候错开，具有一定的防病避病作用【1 6 l 。 1 3 3 药剂防治 对于烟草青枯病目前还没有防效很好的药剂，所以药剂只能作为辅助防治，以推迟青枯病 发病高峰期、减轻发病程度为目的。始病期施用2 3 波美度的石硫合剂，防效可达6 2 8 7 5 0 。也可用2 0 0 - 4 0 0 单位的农用链霉素，或9 0 乙霜青1 0 0 0 倍液灌根，或用灭菌净6 0 0 - - 一8 0 0 倍液，在烟苗移栽时结合浇定根水施一次药，大培土时再施一次。2 5 青枯净可湿性粉剂5 0 0 倍液的防治效果也较好，平均防治效果为6 0 6 5 。另夕b i l l 化0 1 8 ( 叶枯宁) 、爱克菌素、d t 等药剂对青枯病也有一定的防效【1 4 1 。 根据烟草黑胫病菌主要分布在土表0 5 c m 处，且主要在茎基部和根系上发生侵染，及现 蕾前为感病阶段等特点，防治烟草黑胫病的主要施药时间是：在移栽后3 - 6 周，视天气情况， 或在连作烟田中感病品种的发病初始期，确定施药时间；施药方法是向茎基部及其土表浇灌， 实施局部保护，此法同整株喷雾法相比，可减少用药量，降低防治成本，又能充分发挥药剂 的防病保产作用，提高防治效果。常用药剂：2 5 甲霜灵可湿性粉剂，5 8 甲霜灵锰锌可湿 性粉剂，6 4 杀毒矾及4 0 7 , 磷铝( 霜疫净) 可湿性粉剂，9 5 敌克松原粉等【1 7 1 。 3 西南大学硕十学位论文 1 3 4 生物防治 目前国内对烟草黑胫病和青枯病的生物防治大致分为植物源的生物防治，诱导抗性防治 和微生物源生物防治这三方面。 邓正平【1 8 】等选择山苍子，大蒜和黄岑3 种植物性药物，研制防治烟草青枯病的植物性药 剂，并进行了田间防效试验。h a r r i s o n ”】的研究表明，在烟草根部接种青枯病菌的死菌能诱 发植物体的抗性，这些经诱导的植株对于致病性青枯病菌有强烈的抑菌作用。赵蕾等【2 0 】报道 壳聚糖除了能抑制烟草黑胫病菌外，也能诱导烟草系统抗病性。杨献营【2 1 1 也报道了通过诱导 抗病来抑制烟草黑胫病。 董春等【2 2 】从烟草、番茄、胡萝卜、芒果、柑橘等作物根和根部土壤中分离并筛选得到5 个 对青枯菌具有较强抑菌作用的细菌菌株，初步鉴定为芽孢杆菌，通过网室盆栽试验和病地小区 试验，结果表明，拮抗细菌对烟草青枯病具有一定的防治作用。王雅平等【2 3 】用分离自丝瓜土 壤的枯草芽孢杆菌t g 2 6 浸根处理防治烟草青枯病，苗期防效可达1 0 0 ，田间试验防效为 7 9 6 ，并有明显的增产效应。罗宽等【冽用拮抗的p s e u d o m o n a ss p p 在温室防治烟草青枯病， 防效较好，但未应用于大田。尹华群等【2 5 1 从烟草茎内分离得到的内生细菌0 0 1 、0 0 9 矛l 1 0 1 1 共3 个菌株对烟草青枯病均有良好的防治效果，其中菌株0 0 1 为枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) ， 菌株0 0 9 和菌株0 1 1 为短芽孢杆菌( 且b r e v i s ) ，经田间防效初步测定，这3 株菌株的平均防效 分别达到8 2 5 、1 0 0 和8 4 5 。 b r o a d b e n t 等【2 6 】研究表明，烟草黑胫病菌的拮抗细菌有假单胞杆菌( p s e u d o m o n a ss p p ) 和 芽孢杆菌( b a c i l l u ss p p ) ，它主要通过产生抗菌素而使烟草黑胫病菌菌丝溶解；e n g l i s h 等【2 7 j 进一步在田间土壤中加入拮抗细菌进行实验，发现它能显著降低烟草黑胫病菌的侵染机会，从 而减少发病率。王远山【冽等利用离体拮抗试验和烟草幼苗生物测定法，研究假单胞菌p l 9 菌株 对烟草黑胫病病原菌的拮抗作用，该菌株对烟草黑胫病菌菌丝体有很强的抑制作用，并且可以 完全抑制烟草黑胫病菌游动孢子对烟草幼苗的侵染，其液体培养物浓缩过滤液也有相同的抑制 作用。方敦煌等【2 9 1 研究表明，从重病田健株采集的根际土样中分离根际细菌7 5 3 株，室内平皿 对峙筛选到拮抗烟草黑胫病的菌株9 8 株，占分离菌株的1 2 7 。温室测定发现有2 0 个菌株防治 效果达4 0 0 以上，超过药剂对照的有4 个菌株，防治效果分别为7 5 7 、7 8 6 、7 8 6 和7 9 3 。 其中大部分菌株对烟草有不同程度的促生作用。 2 放线菌在植物病害生物防治上的应用 放线菌( a c t i n o m y c e t e s ) 属于原核生物，广泛分布于自然界，从c o h n ( 1 8 7 2 ) 发现放线 菌至今，已经报道了6 9 个属1 6 8 7 个种【州。除少数厌氧或兼性厌氧的寄生类群外，大多数是 好气性的腐生菌。放线菌种类繁多，代谢功能各异，是一类有着广泛实际用途的微生物资源。 与古老的细菌学和真菌学相比，放线菌学还是一门较年轻的学科，这是因为从世界上的第一 株放线菌被发现起至今，才不过有百余年的时间【3 1 3 2 1 ，但由于放线菌所特有的重要意义和巨 4 第一章文献综述 大的经济价值，从二十世纪二十年代起，该学科获得了长足的发展，在该学科领域内，拮抗 放线菌的研究占有重要的地位，因此，拮抗放线菌一直是研究者关注的焦点【3 1 , 3 3 3 5 】。 2 1 放线菌的生防作用 2 1 1 抗生菌的直接利用 用放线菌制成的活细胞制剂，具有无毒、无残留、不伤害非靶标微生物、与环境兼容性 好、防病持效期长等优点。世界上已广泛应用的一种放线菌的活体制剂m y c o s t o p 【3 6 】，主要用 来防治一些常见的土传病原菌，如腐霉菌( p y t h u ms p p ) ，镰刀菌( f u s a r i u ms p p ) ，疫霉菌 ( p h y t o p h t h o r as p p ) 和丝核菌( r h i z o c t o n i as p p ) 等。它还可用于控制温室中的观赏植物和蔬菜上 的一些常见病害。在我国，由细黄链霉菌( s t r e p t o m y c e sm i c r o f l a v u s ) 制成的“5 4 0 6 ”抗生菌推 广的面积最大。它在生长过程中能分泌数种不同的抗生素，抑制多种植物病原菌的生长，并 能分泌激素促使植物细胞的分裂和伸长【3 7 1 。 2 1 2 抗生素的利用 抗生素是微生物产生的、在低浓度下对其它微生物的生长有抑制或杀灭作用的一类非酶 类化学物质。放线菌是抗生素等一系列生物活性物质的重要生产者。目前世界药物市场上6 7 的抗生素产品来自微生物，其 2 3 又是放线菌产生的p 引。我国农用抗生素的研究开始于2 0 世纪5 0 年代，是随医用抗生素之后发展起来的，其中一些品种已达到世界先进水平。在我国 现有登记注册的抗生素品种有2 3 种，产品1 7 0 个，生产厂家达2 5 3 家，年制剂产量达8 万多吨【3 9 】。 其中正式登记的杀菌剂品种有井冈霉素、农抗1 2 0 和多抗霉素等9 种，临时登记的杀菌剂品种 有中生菌素、宁南霉素等4 种。临时登记的杀虫、杀螨剂品种有浏阳霉素、华光霉素和阿维菌 素，除草剂品种有双丙氨磷。取得了巨大的社会效益、经济效益和生态效益【删。 随着发酵技术的发展和抗生素生产条件的日益完善，农用抗生素制剂的种类也不断增多。 许多科学家对抗生素在植物病害生物防治中的作用做了大量的研究，如韩国的i ( i m 等【4 1 】从黎 巴嫩链霉菌( 鼬b a n i ) 中分离出抗生素a s l a 。这种抗生素对番茄灰霉病( b o t r y t i sc i n e r e a ) 、黄 瓜叶霉病( c l a d o s p o r i u mc u c u m e r i n u m ) 、瓜类炭疽病( c o l l e t o t r i c h u ml a g e n a r i u m ) 和辣椒疫病 僻c 印s f c f ) 等温室常见病害有很好的控制效果。b y u n g 等【4 2 】从玫瑰放线菌似c 砌d 小口幽r 口 r o s e o l a ) 的培养液中分离提取出抗生素d a 2 b ，对辣椒疫霉和立枯丝核菌僻s o l a n i ) 有明显的 抑制作用，主要是抑制菌丝的生长。d a 2 b 对酵母，如酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 和革 兰氏阳性细菌有很好的抑制效果。陈琦冈等【4 3 】从云南省滇西北采集的土壤样品中分离得到一 株抑制白粉病菌的放线菌y i m 3 0 9 9 7 ，其抑菌机理主要是以产生的抗菌素抑制病菌。 2 1 3 酶及其代谢物的利用 放线菌的生长比一般细菌和真菌慢，常在天然有机物分解的后期起重要作用，这些特殊 5 西南大学硕士学位论文 的生态习性反映了它们的酶活性和代谢产物的作用【州。放线菌的代谢产物除了抗生素外，还 有酶、有机酸、甾体化合物、维生素、核苷酸以及酶抑制剂等。放线菌的其它代谢产物对防 治病害、促进作物的生长、提高作物产量等方面也起着重要的作用，正越来越多地被人们开 发和应用m 4 “7 】。 2 1 4 促进植物生长 b e n s o n 4 8 于1 9 9 3 年报道植物根际的链霉菌具有固氮作用，可与植物形成共生关系，促 进植物的生长。近年来，我国也开展了弗兰克氏菌共生固氮放线菌的研究，该菌能够诱导大 范围的放线菌根瘤植物产生根瘤，并促进植物对f e 等元素的吸收。 2 2 放线菌的生防机理 放线菌可以通过对病菌的直接抑制作用或通过增强植物抗病性作用发挥生防效果。对病 菌的直接作用有抗生作用、竞争作用和重寄生作用，这些作用都能够抑制病菌生长，有些生 防菌甚至能够抑制病菌致病因子的产生，从而降低病菌的致病力；放线菌也能够激发植物提 高抗病性，增加抗菌物质的合成，并以此抑制病原菌的生长、繁殖，达到减轻病害的目的【州。 2 2 1 抗生作用 放线菌产生抗生素抑制病菌的现象为抗生作用。抗生素的作用机理主要是：( 1 ) 抑制微 生物细胞代谢的某些环节或代谢中的某些酶系统。微生物重要代谢环节被抑制，生长发育出 现障碍，甚至死亡。( 2 ) 广谱抗生素的抗菌机制：某些抗生素能抑制微生物共同的代谢途径， 如蛋白质和核酸的合成，则可抑制许多不同种类微生物的生长。( 3 ) 除了干扰代谢作用外， 有时也可影响病原菌的形态结构【4 9 1 。 放线菌是产生抗生素种类最多的一类微生物，人们从放线菌中分离的抗生素已达4 0 0 0 余 种【5 p 5 z l 。有些抗生素，已广泛应用于工业、农业和医学领域。如我国研制开发的井冈霉素、 多效霉素和农用链霉素等生物农药已经在农业生产中普遍使用【5 3 1 ，取得了巨大的经济效益和 生态效益。赵蕾等【5 4 1 分离到一株链霉菌s t 1 ，它所产生的抗生素对蔬菜灰霉病菌等具有良好 的防治效果。 2 2 2 竞争作用 生防放线菌能够利用自身的生长优势与病菌展开竞争作用，这种竞争作用可以进一步抑 制病原菌对植物的侵染。竞争主要包括：( 1 ) 空间竞争：有些放线菌能在植物根围迅速定殖， 占领根表位置，因此病菌无法在根表定殖，也就不能对植物致病。( 2 ) 营养竞争：铁离子( f e 3 + ) 利用度是土壤环境对微生物生长的一个限制因子，链霉菌能够分泌嗜铁素( s i d e r o p h o r e ) 鳌 合铁离子，限制了病原微生物对铁离子的需求，从而达到抑制病原菌的目的m 。另外，对土 壤中碳源的竞争也属于营养竞争。芬兰的k e 血r a 以灰绿链霉菌 g r i s e o v i d i s ) 的孢子和菌丝制 6 第一章文献综述 成生物$ 1 j 3 l j m y c o s t o p ，该制剂施用方法主要是种子处理、土壤喷洒或灌药等，施药后放线菌 活菌体能够在