（植物病理学专业论文）黏菌延长因子的序列测定及其分子系统学初步研究.pdf

吉林农业大学硕士学位论文黏菌延长因子的序列测定及其分子系统学初步研究 黏菌延长因子的序列测定及其分子系统学初步研究 摘要 黏菌作为真核生物中的一个特殊类群，在生物界中占有重要地位。因其独特的兼具动 物和真菌某些特征的生活史循环，使其在生物界中的地位一直没有得到统一。同时，黏菌 内部成员的组成也在不断变化。为了建立一个更趋自然的黏菌分类系统，寻找解决传统分 类学上比较困难的问题，本文采用分子生物学技术对黏菌部分分类单元的延长因子进行了 p c r 扩增和序列测定，通过序列分析探讨其分子系统学关系。 本研究对黏菌纲内5 份样品的延长因子进行p c r 扩增和序列测定，并与从g e n e b a n k 上查得的1 0 份黏菌序列进行分子系统学分析。初步推断：团毛菌目和无丝菌目的关系较 近，且在进化上为较高级的类群；刺轴菌目和绒泡菌目与团毛菌目和无丝菌目的关系较远， 为进化上较低级的类群；绒泡菌目和发网菌目关系较近，介于刺轴菌目和团毛菌目之间， 且与团毛菌目和无丝菌目稍远。 本研究对从实验室分离得到的圆头网柄菌( d i c t y s t e l i u ms p h a r e o c e p h a l u m ) 进行延长 因子的序列测定，并与黏茵纲内种群做分子系统学分析。 以上研究在国内属首次，为黏茵起源和演化的研究奠定了基础。但由于材料有限，有 些类群没有涉及到，还有待进一步补充和完善。 关键词：黏菌，延长因子，序列测定，分子系统学 吉林农业大学硕士学位论文 黏茵延长因子的序列测定及其分子系统学初步研究 s t u d i e so nt h ea m p l i f i c a t i o na n dm o l e c u l a rp h y l o g e n e t i ca n a l y s i so f e l o n g a t i o nf a c t o ri a i nm y x o m y c e t e s a b s t r a c t m y x o m y c e t e sa r ei m p o r t a n ta n ds p e c i a lg r o u po fe u k a r y o t e s t h et a x o n o m i cp o s i t i o no f m y x o m y c e t e si nl i v i n gn a t u r ew a ss t i l lc o n t r o v e r s yd u et ot h e i rl i f ec y c l ew h i c hc o n t a i n d i s t i n c t l ys o m ef e a t u r e so fb o t ha n i m a la n df u n g u s m e a w h i l e ，t h ei n n e rm e m b e r so f m y x o m y e e t e sw e r ea l s oc h a n g i n gg r a d u a l l y a i m e dt os e tu pat a x o n o m i cs y s t e mi n c l i n i n gt o n a t u r e ，t h ee l o n g a t i o nf a c t o r1 a ( e f l a ) g e n ef r o mm y x o m y c e t e sh a v eb e e na m p l i f i e db yp e ra n d s e q u e n c e di nt h i sp a p e r s y s t e m a t i cr e l a t i o nh a sb e e nd i s c u s s e db yc o m p a r i n ga n da n a l y z i n gt h es e q u e n c e ， a n df m dm o r ef a v o r a b l ee v i d e n c e st os o l v et h i sp r o p l e mt h a tm y x o m y c e t e ss h o u l db e l o n gt oi sd i f f i c u l tt o d e t e r m i n eu s i n gt h em o r p h o l o g i c a lt a x o n o m i cm e t h o d s ，a n dw a st oe s t a b l i s ht h eb a s et os e tu pat a x r n o n o m i c s y s t e mi n c l i n i n gt on a t u r e e l o n g a t i o nf a c t o r 1ao f5 s a m p l e si n4o r d e r so fm y x o m y c e t e sw e r ea m p l i f i e db yp e ra n d s e q u e n c e da n dc o n d u c tm o l e c u l a rs y s t e m a t o l o g ya n a l y s i sw i t hn i n em y x o m y c e t e ss e q u e n c e sr e f e rt ot h e g e n e b a n k t h er e s u l t si m p l i e dt h a tt h et r i c h i a l e sh a sc l o s e rr e l a t i o n s h i pw i t hl i c e a l e s ，a n dt h e ya 他t h e r e l a t i v eh i g h l ye v o l u t i o n a lg r o u p s ；e c h i n o s t e l i a l e sa n dp h y s a r a l e sa l ef a rf r o mt r i c h i a l e sa n dl i c e a l e si n p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p ，t h e ya r et h el o w e re v o l u t i o n a lg r o u p s ；p h y s a r a l e sa r ec l o s e rt os t e m o n i t i a l e si n p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p ，b e t w e e nt h ee e h i n o s t e l i a l e sa n dt r i c h i a l e s ，a n dr e l a t i v ef a rf r o mt r i c h i a l e sa n d l i c e a l e s e l o n g a t i o nf a c t o riao fd i c l y o s t e l i u ms p h a r e o c e p h a l u mo b t a i n e df r o mi s o l a t i n gs a m p l e s w a ss e q u e n c e d ，a n dm o l e c u l a rs y s t e m a t i c sw e r ea n a l y z e dw i t ht h em y x o m y c e t e s t h em o l e c u l a rs y s t e m a t i c so fm y x o m y e e t e sw a st h ef i r s ts t u d i e d t h er e s u l to b t a i n e dm a y p r o v e di m p o r t a n tm o l e c u l a rb i o l o g i c a le v i d e n c e sf o rt h es t u d i e so nt h eo r i g i na n de v o l u t i o no f t h es l i m em o l d s b u ts o m e g r o p e sw e r ee x c l u d e d ，f u r t h e rr e s e a r c h e sw e r en e e d e d k e yw o r d s ：m y x o m y c e t e s ，e l o n g a t i o nf a c t o r1 a ( e f l a ) ，s e q u e n c e ，s y s t e m a t i c s i i - 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽 我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过 的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了 谢意。 学位论文作者签名： 训骰劾 榔期：沁年嘭日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交 论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存、汇编学位论文。同意吉林农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文 的全部或部分内容。( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 别磁名未1 般 ，n 乙窍| 3 1 日 l 签字脚沁矿年莎月少日 秒 吉林农业大学硕士学位论文 黏茵延长因子的序列测定及其分子系统学初步研究 前言 黏菌因其独特的生活循环史，在生物界中占有重要的地位。其营养阶段以多核的、无 细胞壁的、可移动的原质团形式存在，能够摄食有机物；生殖阶段，它能产生孢子，孢子 着生于膜质的孢子器中。正因为黏菌这种兼具真菌和动物某些特征的生活史，使其在生物 界中的分类地位一直没有得到统一【1 1 。在早期的两界系统时代( 1 8 3 3 ) ，l i n k 将其与真菌 一起归入植物界，称黏菌( m y x o m y c e t e s ) 。d eb a r y ( 1 8 8 4 ) 通过培养和对生活史的研究 比较了黏菌与真菌、细菌的形态学和生物学差异，强调了其动物性，认为起源和演化与后 者无关，将其归入动物界，称为菌虫( m y c e t o z o a ) 1 2 。近代，按流行的以进化程度和营 养生活方式不同划分为五界系统动物界、植物界、菌物界、原生生物界、原核生物界， 黏菌被划归菌物界，但是人们仍然感到这并不是一个十分理想的“归宿”。所以在生物八界 系统中又将其归到了原生动物界( a a r r ，1 9 9 2 ；h a w k s w o r t h ，1 9 9 1 ) 。不仅如此，黏菌内部 成员的组成也在不段的变化，通常所说的黏菌主要指黏菌纲( m y x o m y c e t e s ) 所包含的类 群。后来人们又把集孢菌( a c r a s i o m y c e t e s ) 、原柄菌( p i o t o s t e l i o m y e e t e s ) 、根肿菌 ( p l a s m o d i o p h o r o m y e e t e s ) 和网黏菌( l a b y r i n t h u l o m y c e t e s ) 归入黏菌，这使得黏菌的含义 更加模糊- t t 。 黏菌纲( m y x o m y c e t e s ) 内部各类群间的系统发育关系是黏菌学者一直研究的目标。 1 8 7 3 年，r o s t a t i n s k i 建立了第一个现代的黏菌分类系统，此后，1 9 2 2 年m a c b r i d e 、1 9 2 5 年l i s t e r 、1 9 4 4 年h a g e l a t e i n ，在其基础上出版了几部黏菌专著，建立了几个系统，但这 些系统均仅在属级单元上进行了调整，在整个体系骨架上则维持了r o s t a f i n s k i 的原意。 近年来被普遍认可的m a r t i n 和a l e x o p o u l o s 系统是对前人工作的综合总结，对属级单元做 了目前被认为是较合理的安排，但从中仍可看到r o s t a f m s k i 的思想。这种发展历史表明 黏菌的分类系统基本上是稳定的，只是由于在系统发育上的认识分歧，不可避免地要对一 些分类单元进行某些调型。 近年来，随着科学技术的不断进步，生物生化特性、遗传特点、血清学反应、酶学、 分子生物学以及生物信息学等新的分类依据不断地被引入生物分类当中，黏菌的分类技 术也不可避免地得到充实和完善，在超微结构、个体发育、化学分类、生态学，以及数 值分类学等方面都进行了探讨。近几年各国学者也展开了对黏菌的分子生物学研究，但 都是集中在个别种上。刘淑艳( 2 0 0 0 ) 针对发网菌科( s t e m o n i t a c e a e ) 和无丝菌目( l i c e a l e s ) 的黏菌进行了分子系统学的研究，并初步探讨了黏菌的归属问题，认为将黏菌这个多系 类群看成一个整体是黏菌归属问题悬而未决的主要原因1 3 1 。张亚波( 2 0 0 6 ) 通过对绒泡菌 科和团毛菌目1 8 s r d n a 的序列测定和分析，探讨了白柄菌属( d i a c h e a ) 归属问题，绒泡 菌科( p h y s a r a c e a e ) 和团毛菌目( t r i c h t a l e s ) 内几个属分子系统学关系。认为白柄菌属 吉林农业大学硕士学位论文黏菌延长因子的序列测定及其分子系统学初步研究 应归为绒泡菌目较合理，在团毛菌目内半网菌属为相对原始的类群，团网菌属和团毛菌 属为相对高级的类群，变毛菌属介于而者之f 司t 4 1 。 本文是在前人研究的基础上，通过对黏菌部分类群延长因子的p c r 扩增及序列测定 分析，试图从分子生物学角度来探讨黏菌的系统学关系。 吉林农业大学硕士学位论文黏菌延长因子的序列测定及其分子系统学初步研究 第一章文献综述 1 黏菌在生物界的地位及其内部演化 1 1 黏菌在生物界地位的演化过程 中国唐朝的陈藏器所著的本草拾遗中记录的“鬼屎”被认为是关于黏菌的最早记 载【5 】。但因为它描述的过于简单，无法进行科学验证，只可能是某种黏菌的原质团，接近 现代命名的煤绒菌的原质团或幼子实体阶段【6 】。俄国人p z n c k e w ( 1 6 5 4 ) 对粉瘤菌( l y e o g a l a e p i d e n d n u m ) 的描述成为有关黏菌最早的文献记载1 2 j 。而瑞典人l i n n a e u s ( 1 7 5 3 ) 的 s p e c i e sp a n t a r u m 被国际植物学会确定为黏菌命名的起点。他描述了黏菌的6 个种， 认为黏菌属于膜菌类【2 j 。 p e r s o o n ( 1 8 0 1 ) 在他的( ( s y n o p s i sm e t h o d i c af u n g o r u m ) ) 中将黏菌置于菌物当中， 设一纲裸果菌纲一目皮生果菌目，两科t r i c h o s p e r m i 和g y m n o s p e r m i 。这种安排被认为 是黏菌分类系统的雏形1 7 1 。f r i e s ( 1 8 2 9 ) 鉴于一些黏菌的子实体与马勃相象，而将黏菌 置于膜菌目中，同时他也首次提出了黏菌营养体原质团的发育，他的这些论文被作为 现代系统菌物学的开端【2 】。1 8 6 6 年l i n k 认为黏菌是菌，而使用了m y c o m y c e t e s ( 黏菌) 一词，并将黏菌与膜黏菌分开。d eb a r y 通过大量实验证实并讲述了黏菌的形态、生活史， 详尽描述了两种子实体的发育方式后，强调了其动物性，称之为“菌虫 ( m y c e t o z o a ) 2 j o d eb a r y 的学生r o s t a f i n s k i ( 1 8 7 3 ) 建立了第一个黏菌分类系统。并首次强调了微观特 征在黏菌分类中的作用。但他的分类中并不包括当时已经发现的网柄菌和网黏菌，甚至也 不包括a l b e r t i n i 和s c h w e i n i t z ( 1 8 0 5 ) 发现的、现在一般置于黏菌中的鹅绒菌i z j 。d eb a r y ( 1 8 8 4 ) 首次将黏菌作为一个独立的门，但它把当时发现的具有黏菌普通名的全部成员放 置其下。包括集胞菌、根肿菌，鹅绒菌在真黏菌下，网柄菌归集胞创引。 在现代黏菌学的历史上，人们开始强调黏茵的动物学特性。z o p f ( 1 8 8 5 ) 将菌虫( 黏 菌) 分为鞭毛原生动物门和黏菌门，黏菌门中等列了集胞菌、黏菌和鹅绒菌3 个纲，而根 肿菌和网黏菌在m o n a d i n e a e 门中。这表明他认为真黏菌中不包括集胞菌、鹅绒菌和根肿 菌、网黏菌，前两者与真黏菌关系较近。m a s s e e ( 1 8 9 2 ) 遵循了r o s t a f i n s k i 的分类思想， 以孢子的有无及其相关结构作为分类的基本标准，将腹黏菌分为4 目8 个亚目。s c h r o e t e r ( 1 8 9 7 ) 将“黏菌 分为集胞菌亚纲、寄生黏菌亚纲( 即根肿菌) 和腹黏菌亚纲( 即真黏 菌) ，后者分l l 纲。鹅绒菌为腹黏菌中第一纲【8 】。这与z o p f 的观点不同，他认为集胞菌 和根肿菌与真黏菌关系密切，且鹅绒菌属于黏菌。此后l i s t e r 父女在1 8 9 4 、1 9 1 1 、1 9 2 5 出了三版关于黏菌的世界性专著am o n o g r a p ho ft h em y c e t o z o a ) ，他们仍然沿袭了 r o s t a f i n s k i 的分类观点，以透射光下孢子的颜色、石灰质和孢丝的有无作为分类依据。 吉林农业大学硕士学位论文黏茵延长因子的序列测定及其分子系统学初步研究 他把鹅绒菌( 即外生孢子黏菌) 包括在黏菌中，并作为一个亚纲与内生孢子并列在黏菌纲 下【羽。 m a r t i n ( 1 9 6 0 ) 根据a l e x o p o u l o s ( 1 9 6 0 ) 的研究结果：刺轴目的原质团与其它黏菌的明 显不同，为原始型，而建立了刺轴菌目( e c h i n o s t e l i a l e s ) 。它的建立具有十分重要的意 义，因为它不仅首次将实验室的研究引入黏菌系统分类中，更重要的是首次把成熟的子实 体形态之外的性状用于黏菌分类。值得提的是d eb a r y 早在1 8 8 4 年就指出发网菌的子 实体发育与其它腹黏菌不同，但这些研究在当时并未受到重视，直到1 9 6 9 年a l e x o p o u l o s 等才发现它们在黏菌分类上的重要意义 9 1 。r o s s ( 1 9 5 7 、1 9 7 3 ) 两次强调了发网菌目子实 体发育方式与其它膜黏菌不同，并据此将发网菌从膜黏菌亚纲中移出，建立了发网菌亚纲 1 1 0 - 1 2 1 ，这一方案得到了a l e x o p o u l o s1 1 3 1 、m a r t i n 、a l e x o p o u l o s 【1 4 】、s t e p h e n s e n 、s t e m p e n 1 1 5 1 、山本幸宪【1 6 】的广泛认同，并沿用到今。o l i v e 和s t o i a n o v i t c h ( 1 9 6 0 ) 发现了原柄 菌，这给“黏菌”添加了新成员，但也给分类带来了新问题。0 1 i v e ( 1 9 7 0 ) 建立了黏菌 纲，下设有远柄菌亚纲、网柄菌亚纲、集胞菌亚纲和腹黏菌亚纲，根肿菌作为与黏菌具有 不确定关系的类群附在最后。1 9 7 5 年他重新进行了黏菌及其相关类群的分类，采用裸菌 门来包括它们，其下设黏菌、根肿菌和网黏菌三个亚门，黏菌门下设黏茵纲和集胞菌纲， 黏菌纲又分为原柄菌、网柄菌和腹黏菌3 个亚纲1 1 7 - i $ 1 。a l e x o p o u l o s 和l i m s ( 1 9 7 9 ) 使 用裸菌门来包括黏菌及其相关类群，原柄菌被升格为纲，与黏菌纲共同组成原质团裸菌亚 门，鹅绒菌在黏菌纲内；另一亚门是集胞裸菌亚门，包括集胞菌和网柄菌。他们的裸菌门 不包括网黏菌，根肿菌也放在了鞭毛菌门中。而在1 9 9 6 年h l e x o p o u l o s 等f i 刎在 i n t r o d u c t o r ym y c o l o g y ) ) 第四版中将黏菌、网柄菌、集胞菌、根肿菌和网黏菌分列为 5 个门，并置于原生动物界下。这更充分体现出这些类群之间的复杂关系。 在著名的( ( a i n s w o r t h b i s b y sd i c t i o n a r yo ff u n g i ) ) 第七版中把黏菌归为真 菌界下一个门，下面包括7 个纲，即：原柄菌纲、鹅绒菌纲、网柄菌纲、集胞菌纲、黏菌 纲、根肿菌纲和网黏菌纲1 2 0 l 。在第八版( 1 9 9 5 ) 中，则将黏菌归于原生动物界，并把集 胞菌、网柄菌和网黏菌升格为门，与黏菌门( 包括原柄菌纲和黏菌纲) 并列，同时将鹅绒 菌移入原柄菌纲中降为科。黏菌纲下直接分六目：刺轴菌目、拟刺轴菌目、无丝菌目、团 网菌目、绒泡菌目和发网菌目。而在第九版( 2 0 0 1 ) 中则将网黏菌作为单独一门，集胞菌、 网柄菌、黏菌、根肿菌作为四个彼此独立的门在原生动物界。黏菌门只包括鹅绒菌纲、黏 菌纲和原柄菌纲【2 1 1 。 1 2 黏菌内部成员的演化 通常说的黏菌，在分类上指的是黏菌纲：鹅绒菌亚纲、腹黏菌亚纲和发网菌亚纲包含 的种类。它们有一定的、基本相同的特征，形成了一个自然类群。l i n k ( 1 s 8 3 ) 所称 m y x o m y c e t e s ( 剩i 菌) 的种类和d eb a r y ( 1 8 5 8 ) 称m y c e t o z o a ( 菌虫) 的种类都是指这自然类 吉林农业大学硕士学位论文黏茵延长因子的序列测定及其分子系统学初步研究 群。但是后来在黏菌的队伍中又加入了一些带有“黏”字的成员，如集胞菌又称细胞黏菌、 根肿菌则常称为内寄生黏菌和网黏菌，亦即水生黏菌，这就使黏菌的概念变得模糊不清了 l q 。z o p f ( 1 8 8 5 ) 将菌虫( 即黏菌) 划分为鞭毛原生动物门和真菌虫门，鞭毛原生动物门 包括了根肿菌目及一些现在认为与黏菌或真菌无关的类群，真菌虫门包括孢堆柄纲( 即集 胞菌纲 、内生孢子纲( 即腹粘菌) 和外生孢子纲( 即鹅绒菌) 。紧接着，s c h r o e t e r ( 1 8 8 5 - 1 8 8 6 ， 1 8 8 9 ) 就把黏菌的内容扩展为：集胞菌、腹黏菌和根肿菌。此后，j a h n ( 1 9 2 8 ) 在e n g l e r 和p r a n t l 的( ( d i en a t u r l i e h e np t l a n z e n f a n ) ) 的第二版中又加入了水生黏菌。m a c b r i d e ( 1 9 2 2 ) 认为粘 菌纲分为寄生黏菌亚纲、外生孢子黏菌亚纲和腹黏菌亚纲三个亚纲。但另外一些黏菌学家 有不同看法，l i s t e r ( 1 9 2 5 ) 菌虫专著第三版【8 1 ，m a c b r i d e 和m a r t i n ( 1 9 3 4 ) 【2 2 】以及m a r t 洫【1 1 】和 a l e x o p o u l o s ( 1 9 6 9 ) j 的黏菌专著都始终是一致的，只包括外生孢子类的鹅绒菌和内生孢子 类的腹黏菌( 含发网菌) ，而不包括其它类群。 6 0 年代以后o l i v e 单独地( 1 9 6 2 ，1 9 6 4 ，1 9 6 7 ) 以及他和s t o i a n o v i t c h 合作( 1 9 6 0 ，1 9 6 6 a , 1 9 6 6 b ，1 9 7 1 a , 1 9 7 1 b ) 陆续发现了菌虫的一些新成员，建立了若干新属、科和一个新目，1 9 7 0 年他修订了菌虫纲的分类，将原柄菌、网柄菌、集胞菌和黏菌各作为亚纲放入到菌虫纲 ( m y e e t o z o a ) 中，隶属于原生界( p r o t i s t a ) ，原生动物门( p r o t o z o a ) ，肉足鞭毛亚纲 ( s a r c o m a s t i g o p h o r a ) ，肉足总纲( s a r c o d i n a ) 。o l i v e ( 1 9 7 5 ) 【i 训出版了菌虫( ( t h em y c e t o z a n s ) ) 专著，他以原柄目为基础设立了原柄亚纲，把鹅绒菌归入原柄目，他在原生生物界下设立 了菌虫亚门。菌虫纲由原柄亚纲、腹黏亚纲、网柄亚纲和集胞亚纲组成。相反，a i n s w o r t h ( 1 9 7 1 ) 却在真菌辞典第六版中把o l i v e 的原柄目改作原柄菌目，归入了腹黏菌亚纲，他 的黏菌门包括集胞菌纲、水生黏菌纲、黏菌纲和根肿菌纲，由他主编的mf u n g i ) ) ( 1 9 7 3 ) 4 卷论文集也沿用了这一观点，在黏菌门下分集胞菌纲和黏菌纲，前者又分为原柄菌亚纲、 集胞菌亚纲和网柄菌亚纲k 引。 a l e x o p o u l o s 和m i m s ( 1 9 7 9 ) 【z j 在( ( i n t r o d u c t o r ym y c o l o g y ) ) 中，把不同时期加入黏 菌行列的异型类群统称裸菌，列为- - f q 裸菌门( g y m n o m y c o t a ) ，下设2 个亚门：集胞裸 菌亚门( a c r a s i o g y m n o m y c o t i n a ) 含集胞菌纲( a c r a s i o m y c e t e s ) 和原质体裸菌亚门 ( p l a s m o d i o g y m n o m y c o t i n a ) 含原柄菌纲和黏菌纲。而在1 9 9 6 年a l e x o p o u l o s 等刁在 ( ( i n t r o d u c t o r ym y c o l o g y ) ) 第四版中将黏菌、网柄菌、集胞菌、根肿菌和网黏菌分列为5 个门，并置于原生动物界下。这也清楚的反映了现今的共识，即这五类类群是异型的。 h a m k s w o r t h ( 1 9 8 3 ) 比u j 在著名的( ( a i n s w o r t ha n db i s b y sd i c t i o n a r yo f t h ef u n g i ) ) 第七版 中，在门下直接分为7 个纲：原柄菌纲、鹅绒菌纲、网柄菌纲、集胞菌纲、黏菌纲、根肿 菌纲、网黏菌纲。这种分类方法充分反应了这一大类群多元异型的特点，回避了某些有联 系又不易处理的部分，这与w h i t t a k e r 的处理方法有相同之处。在第八版( 1 9 9 5 ) 中，则 将黏菌归于原生动物界，并把集胞菌、网柄菌和网黏菌升格为门，与黏菌门( 包括原柄菌 纲和黏菌纲) 并列，同时将鹅绒菌移入原柄菌纲中降为科。黏菌纲下直接分六目：刺轴菌 吉林农业大学硕士学位论文黏菌延长因子的序列测定及其分子系统学初步研究 目、拟刺轴菌目、无丝菌目、团网菌目、绒泡菌目和发网菌目。而在第九版( 2 0 0 1 ) 中则 将网黏菌作为单独- - 1 7 在c h r o m i s t a 界，集胞菌、网柄菌、黏菌、根肿菌作为四个彼此独 立的门在原生动物界。黏菌纲只包括鹅绒菌纲、黏菌纲和原柄菌纲。后两版中的黏菌只包 括原质团黏菌i i j 。 我国黏菌学的奠基人之一周宗璜【2 4 】提出了一个与a l e x o p o u l o s 的方案相似，但在反映 类群间自然系统关系上却截然不同的方案，即在裸菌门下直接分3 个纲：原柄菌纲、集胞 菌纲和黏菌纲，把根肿菌和网黏菌排除在黏菌之外。这一系统不同于1 9 6 9 年w h i t t a k e 产刈 的五界系统中把黏菌列为一个单纲门，把集胞菌、网黏菌、根肿菌也单列一门的作法，处 理得较为简捷，显然是遵循了形态、结构、生活史等由简单到复杂的路线来反映类群的关 系。这个方案体现了中国人的智慧，也更易被我国学者所接受，如1 9 8 6 年周与良【2 6 】主编 的真菌学就采用了这一系统。 2 黏菌分子系统学研究概况 黏菌作为一个特殊的类群，从发现时就对其分类地位存在较大分歧。这主要是因为黏 菌独特的生活史导致的。其营养生长阶段是独立生活的、多核非细胞结构的、仅有表面质 膜而无细胞壁的、能变形移动和摄食有机物的一团原生质，称为原生质团，这与原生动物 相似；从营养生长阶段转入繁殖阶段时，原生质团转变为一个或一群非细胞结构的子实体， 子实体的表面或内部产生孢子，与真菌相似。黏菌内部各类群之间的系统学关系也因为黏 菌不易人工培养，野外采集有限等原因，造成某些种属在分类上有分歧。传统的形态学分 类观点难以解决这些问题。随着生物学、细胞学，特别是分子生物学技术的发展，为探索 解决生物的系统演化提供了新的途径。黏菌的研究方法也得到了充实和完善，在起微结构、 个体发育、化学分类、生态学、分子系统学等方面都进行了探讨研究。目前，国外对黏菌 小亚基的分子生物学研究很广泛，但对其延长因子的研究相对较少。本实验针对黏菌延长 因子进行研究，这在国内尚属首次。 2 1 国外研究概况 o t s u l ( a 等人【2 7 】( 1 9 8 3 ) 用m a x a m g i l b e r t 的化学测序方法测定了多头绒泡菌 ( p o l y c e p h a l u m ) 的5 8 s 和2 6 sr r n a 基因，以及二者之间的转录间区的全部序列。至此 绒泡菌属成为第二个完整确定大亚基r r n a 基因的真核生物。这也是成为黏菌分子系统学 研究的开端。m c c a r r o l l 等【2 8 】( 1 9 8 3 ) 测定了盘基网柄菌( d i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u m ) 小亚 基r r n a ( s m a l ls u b u n i t r r n a ) 的全部序列。并将其与其它真核生物及原核生物的小亚基 r r n a 序列作比较，通过同源性比较分析，结果表明盘基网柄菌是真核生物中最早从真核 生物主体分化出来的类群。o z a k i 等【2 9 】( 1 9 8 4 ) 将盘基网柄菌的5 8 s r r n a 基因序列与酿 酒酵母，x e n o p u sl a e v i s 和多头绒泡菌的5 8 s r r n a 基因进行比较，结果全序列同源性分 吉林农业大学硕士学位论文黏菌延长因子的序列测定及其分子系统学初步研究 别为6 0 ，5 9 和5 1 ，这也进一步说明了真核生物的5 s s r r n a 基因是从大肠杆菌的 2 3 s r r n a 的5 末端演化而来的说法。t j o h a n s e n 等【3 0 1 人，他们于1 9 8 8 年测定了多头绒 泡菌1 9 s r r n a 的全部序列( 1 9 6 4 b p ) ，同时将该序列与2 8 个不同的真核生物序列进行了 比较，结果表明多头绒泡菌的分化比盘基网柄菌的出现要早，且其相似性值也表明这个种 的亲缘关系较远。 j o h a n s e n 【3 1 】( 1 9 9 2 b ) 中测定了黄钙皮菌( d i r i d i s ) 大亚基r r n a 基因的的序列。通 过序列分析他估计了黄钙皮菌和多头绒泡菌分化的年代约为4 旺5 0 亿年前，而且认为二 者是原生物界中的原始类群。2 0 0 1 年h t a k a n o 等1 3 2 1 对多头绒泡菌的原质团中线粒体d n a 测定了全序列，该线粒体d n a 是具有6 2 8 6 2 b p 的环状分子。2 0 0 3 年m a r t i n 掣3 3 j 把根据 基因文库中的多头绒泡菌的序列和他们自己测得的序列进行比较，设计了四种引物用于扩 增r d n a 的i t s 区段和亮皮菌属( l a m p r id e r m a ) 黏菌的5 8 s 基因片段。u m ak r i s h n a n 等( 2 0 0 7 ) 剐对绒泡菌等7 种黏菌的线粒体小亚基r r n a 进行测定，并建立了r n a 编辑 机制方面的模型。研究发现呈现在多头绒泡菌线粒体内的特异形式的r n a 编码也同样呈 现在其它六种黏菌的亚组r r n a 的线粒体里。虽然它们的r n a 编辑特征和绒泡菌相似， 但在体内的插入点各有不同，这与主要r r n a 的次级结构有关。研究还表明r n a 的编辑 位点在黏菌进化阶段已经不止一次被构建。 b a l d a u f 等【3 5 】( 1 9 9 7 ) 通过对蛋白质合成延长因子1 a ( e f 1 a ) 的氨基酸序列和核苷 酸序列的分析，认为菌虫( m y c e t o z o a ) 包括真黏菌或原质团黏菌、细胞状黏菌和原柄菌 是一个单系类群，且多头绒泡菌与盘基网柄菌之间的关系比他们与原柄菌的关系更近。腹 黏菌和网柄菌具有非常近的亲缘关系。通过系统发育分析方法的结果表明：菌虫这个单系 群处于多细胞真核生物中，菌虫与动物、真菌之间的关系比其与植物之间的关系更近。 f i o r e d o r m o 等( 2 0 0 5 ) 3 6 】进行了对5 个目7 个科的黏菌延长因子( e f i - a ) 和部分小亚基 r r n a 的序列进行p c r 扩增和序列测定后，认为黏菌由三个类群组成，最基础的为刺轴 菌目( e c h i n o s t e l i a l e s ) ，不着色或轻微着色的孢子：第二个类群由无丝菌目( l i c e a l e s ) 和 团毛菌目( t r i c h i a l e s ) 组成，存在有清晰且着色的孢子；第三个类群由绒泡菌目( p h y s a r a l e s ) 和发网菌目( s t e m o n i t a l e s ) 组成，它们均为黑色孢子。 2 2 国内研究概况 国内通过分子生物学手段对黏菌进行研究起步较晚，并且主要集中在吉林农业大学菌 物研究所。刘淑艳、李玉【3 7 】( 2 0 0 0 ) 用r a p d 方法对粉瘤茵属内3 个种2 2 份样品的扩增 图谱进行聚类分析显示：3 个种在系统进行中存在明显的变异，且小粉瘤菌在亲缘关系上 与大粉瘤菌稍近，而与粉瘤菌稍远。此结果在另一方面也从分子水平上证明了形态学上的 分类的正确性，即实验所用的粉瘤菌属的3 个种为3 个独立的种，同时3 个种内各样品之 间即有相同又有不同。刘淑艳p j ( 2 0 0 0 ) 通过对几种黏菌主要科目典型种的1 9 s r d n a 的 吉林农业大学硕士学位论文黏菌延长因子的序列测定及其分子系统学初步研究 序列进行比较，探讨了发网菌科内4 属、无丝菌目5 个属以及黏菌纲内4 个目的分子系统 学关系。 刘淑艳、李玉【3 8 1 ( 2 0 0 3 ) 首次用一对引物( s m n u r l 0 i n s 6 ) 扩得大粉瘤菌小亚基 r d n a 长片段( 1 4 0 0 1 5 0 0 b p ) 。同时将之与多头绒泡菌的相应序列进行了比较，其同源性 为5 8 1 6 。同年，又对黑发菌( c o m a t r i c h an i g r a ) 核糖体d n a 小亚基片段进行了序列测 定，同时将其与多头绒泡菌的相应序列进行了比较，其同源性为6 6 。这一结果补了国 内外对黏茵小亚基研究的空白，也为进一步研究黏菌的系统演化开辟了一条新的途径。刘 淑艳、李玉【3 9 】( 2 0 0 4 ) 首次用p c r 法扩得长尖团毛菌t r c h ad e c i p i e n s 小亚基r d n a 片段 取得成功，引物为s m n u r l 0 1 和n s 6 ，片段长度约为1 4 0 0 b p 。这一成果为团毛菌序列测 定奠定了基础，也填补了国内对团毛菌分子系统学的研究的空白，为进一步研究团毛菌的 系统演化创造了条件。张亚波 4 1 ( 2 0 0 6 ) 通过对绒泡菌科和团毛菌目1 8 s r d n a 的序列测 定和分析，探讨了白柄菌属( d i a c h e a ) 归属问题，绒泡菌科( p h y s a r a c e a e ) 和团毛菌目 ( t r i c h t a l e s ) 内几个属分子系统学关系。认为白柄菌属应归为绒泡菌目较合理，在团毛 菌目内半网菌属为相对原始的类群，团网菌属和团毛菌属为相对高级的类群，变毛菌属介 于而者之，间。 3 延长因子的研究 延长因子是蛋白质合成过程中的辅助因子，参与蛋白质生物合成过程中肽链延伸的 蛋白因子。蛋白质的生物合成是一个十分复杂的生命现象，它是每个有机体储藏在d n a 分子中的遗传信息与蛋白质之间的纽带。蛋白质合成过程分为起始、延伸和终止三个阶 段。每一阶段都有一套独特的蛋白质因子发挥作用。延长因子( e l o n g a t i o nf a c t o r ) ，通 过在核糖体上催化氨基酸链的延伸而推动、控制蛋白质的合成。 3 1 蛋白质合成中延长因子的生理作用 延长因子是由f l i p m a n n 及其同事和a 1 l e n d e r 及其同事于6 0 年代初首先从e c o l i 细胞分离出的。真核生物延长因子可分为e f l 、e f 2 和e f 3 t 4 0 i 。e f l 可分为两种，即e f l a 和e f l1 3 。e f i a 有4 5 5 个氨基酸，相当于原核生物的e f t u ，两者有5 个高于7 0 9 6 的氨基 酸残基同源区。真核细胞中e f i a 为量甚多，仅次于肌动蛋白，占蛋白总量的1 一2 ，高 于e f 21 7 倍、e f l1 37 倍、核糖体1 7 3 5 倍，t r n a 总量1 3 倍。它和肌动蛋白、微管蛋白 ( t u b u l i n ) 相连。参与调节、组装某些细胞骨架的部件，其功能尚不十分了解【4 l j 。 e f l 有多种分子形式，由不等量的e f l a 和e f ib 组成，分子质量由5 0 k d a 到几千k d a 不等。e f l a 高度保守，人、兔e f l a 相同，人、鼠只相差1 个氨基酸。e f l a 有翻译后修饰 现象，有二或三甲基化的赖氨酸：家兔e f l a 3 0 1 位和3 7 4 位谷氨酸经译后修饰成甘油酞基 乙醇胺( g l y c e r y p h o s p h o r y le t h a n o l a m i n e ) ，而任何其他物种已经分析过的e f l a 都不这 吉林农业大学硕士学位论文黏菌延长因子的序列测定及其分子系统学初步研究 么修饰。e f l a 翻译后修饰的意义，即对e f l a 的稳定性和活性有无影响不明。e f 2 只有一 条多肤，相对分子质量9 5 1 1 0 k d a ，相当于原核生物的e f - g 。e f 2 也很保守，人和仓鼠只 有8 个氨基酸不同。e f 2 也有翻译后修饰，其中最为突出的是h i s 7 1 5 被修饰成白喉胺酞， 即2 3 - e a r b o x y a m i d o 一3 一( t r i m e t h y l a m m o n i o ) p r o p y l h i s t i d i n e 。此物被细菌内毒素 a d p - 核糖昔化，则e f 2 不能和核糖体结合，不能水解g t p ，不能促进转位。不能将h i s 7 1 5 巧修饰成白喉胺酞的突变体仍能生活。但h i s 7 1 5 突变为a s p 、l y s 或a r g 的，都无活性。 g l y 7 1 7 突变为a r 9 7 1 7 ，则白喉胺酞不能被a d p 核糖苷化。e f 2 被磷酸化也失去活性，脱 去磷酸则又恢复活性。所以白喉胺酞的化和磷酸化对e f 2 的活性起调节作用。各种酵母和 某些真菌都有e f 3 ，原核生物和绿藻却没有e f 3 是一条1 2 5 d k a 的多肽。只有酵母核糖体 需要有e f 3 才能翻译，用哺乳动物核糖体来测试酵母延伸因子的功能，e f 3 是用不着的。 交换核糖体大、小亚基实验表明酵母4 0 s 需要有e f 3 。哺乳动物4 0 s 和酵母4 0 s 的差别在 哪里还不清楚1 4 0 。 植物延伸因子e f l 有4 个亚基，分别为e f 一1 a 、e f l1 3 、e f 一11 3 和e f iy ，1 9 9 5 年4 月i u b m b 委员会将其重新命名为e f l a 、e f l b a 、e f l bb 和e e f l by 【4 2 】。植物蛋白质合 成延伸过程中，e f l a 首先与g t p 结合，然后与氨酞基一t r n a 结合形成三元复合物，该三元 复合物进入核糖体的氨酞位( a 位) 。这时e f a l 同时与氨酞基- t r n a 、g t p 和核糖体发生作 用。一旦进入a 位后，g t p 立即水解成g d p ，e f a i g d p 这个二元复合物就与氨酞基一t r n a 解离而释放出来【4 z 州】。e e f l b 将e f l a g d p 转换成e f l a g t p ，已知e f l b a 和e f i b1 3 具有