（急诊医学专业论文）环孢素a联合地塞米松对百草枯中毒大鼠肺间质纤维化的治疗作用.pdf

徐州医学院硕士学位论文 j c y c - l k 卜 t d e x e c m h y p i o d m o d m d a p i f p q s o d t g f - p l 吣 缩略词表 a b b r e v i a t i o n 英文全称 h i 曲一d o s ec y c l o s p o r i n eaa s s o c i a t e dw i t h d e x a m e t h a s o n e l o w - d o s ec y c l o s p o r i n eaa s s o c i a t e dw i t h d e x a m e t h a s o n e d e x a m e t h a s o n e e x t r a c e l l u l a rm a t r i x h y d r o x y p r o l i n e i n t e g r a t e do p t i c a ld e n s i t y m o d e l m a l o n d i a l d e h y d e p u l m o n a r yi n t e r s t i t i a lf i b r o s i s p a r a q u a t s u p e r o x i d ed i s m u t a s e t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r - 1 3 1 w e tw e i g h t d r yw e i g h tr a t i o 中文全称 大剂量环孢素a 联合地塞 米松 小剂量环孢素a 联合地塞 米松 地塞米松 细胞外基质 羟脯氨酸 积分光密度 模型 丙二醛 肺间质纤维化 百草枯 超氧化物歧化酶 转化生长因子1 3l 湿干比 哪8舢0洲058帅8ii啪y 、 【 徐州医学院硕士学位论文 联合地塞米松对百草枯中毒大鼠肺间质纤维 化的治疗作用 中文摘要 过观察大鼠病理形态改变，测量肺组织w d ，检测肺组中织转化生长 p 1 ) 和羟脯氨酸( h y p ) 的表达，超氧化物歧化酶( s o d ) 的活性及 丙二醛( m d a ) 的含量，研究环孢素a 联合地塞米松对实验性百草枯( p q ) 中毒 所致大鼠肺间质纤维化( p i f ) 的治疗作用及其机制。 方法将8 0 只s d 大鼠随机分为：模型组( m o d 组) ，地塞米松治疗组( d e x 组) ，小剂量环孢素a 联合地塞米松治疗组( c y e l 组) 和大剂量环孢素a 联合地 塞米松治疗组( c y e h 组) ；三个治疗组根据给药疗程不同分为3 d 、7 d 和1 4 d 三个 亚组，每组8 只。采用腹腔注射2 0 百草枯溶液( 1 8 m g k g ) 制备急性p q 中毒p i f 模型。染毒后2 h ，d e x 组经腹腔注射地塞米松( 5 m g k g ) ；c y e - l 组经腹腔注射环 孢素a ( 5 m g k g ) + 地塞米松( 5 m g k g ) ；c y c - h 组经腹腔注射环孢素a ( 2 0 m g k g ) + 地塞米松( s m g k g ) ，每2 4 h 重复一次，根据疗程分别注射3 次、7 次和1 4 次； m o d 组经腹腔注射等容积生理盐水。实验过程中观察大鼠一般状态，2 2 d 后处死大 鼠取肺组织，行h e 染色和m a s s o n 染色观察肺组织病理变化，测量肺组织w d ， 检测肺组织中m d a 含量、s o d 活性，检测h y p 和t g f d l 表达情况。 结果1 h e 染色和m a s s o n 染色显示模型组第2 2 d 出现明显的p i f ；d e x 组、 c y c l 组及c y c h 组p i f 较m o d 组减轻；c y c h 组p i f 减轻更为明显，优于d e x 组和c y c l 组；7 d 和1 4 d 疗程组p i f 的改善好于3 d 疗程组。 2 与m o d 组相比，d e x 组、c y c l 组和c y c h 组肺组织h y p 的表达显著降 低，差异有统计学意义( 尸 o 0 5 ) ；c y c h 组肺组织h y p 的表达又较c y c l 组和 d e x 组显著降低，差异有统计学意义( 尸 o 0 5 ) ；7 d 和1 4 d 疗程组肺组织h y p 的表达较3 d 疗程组显著降低，差异有统计学意义( 尸 0 0 1 ) 。 2 徐州医学院硕士学位论文 d e x 组、c y c l 组和c y c h 组肺组织w d 均降低，差异 0 5 ) ，c y c h 组下降幅度最大，显著低于d e x 组和c y c l 计学意义；7 d 疗程组大鼠肺组织w d 又较3 d 和1 4 d 疗程 组明显下降，差异有统计学意义( 氏0 0 5 ) 。 4 与m o d 组相比，d e x 组、c y c l 组和c y c h 组肺组织s o d 活性显著升高， 差异有统计学意义( p o 0 1 ) ；c y c h 组肺组织s o d 活性又较d e x 组和c y c l 组 显著升高，7 d 疗程组又较3 d 和1 4 d 疗程组有所增高，差异均有统计学意义 ( 氏0 0 5 ) 。 5 与m o d 组相比，d e x 组、c y c - l 组和c y c h 组肺组织中m d a 含量显著降 低，差异有统计学意义( 氏o 0 5 ) ；c y c h 组肺组织m d a 含量明显低于d e x 组和 c y c l 组，差异有统计学意义( 氏0 0 1 ) ；7 d 疗程组肺组织中m d a 的含量又较 3 d 和1 4 d 疗程组明显降低，差异有统计学意义( p o 0 5 ) 。 6 与m o d 组相比，d e x 组、c y c l 组和c y c - h 组肺组织t g f p l 的表达显著 降低，差异有统计学意义( 尸 0 0 5 ) ；c y c h 组肺组织t g f - d l 的表达又较c y c - l 组和d e x 组显著降低，差异有统计学意义( 火o 0 5 ) ；7 d 和1 4 d 疗程组肺组织t g f p l 的表达较3 d 疗程组显著降低，差异有统计学意义( 砌0 1 ) 结论1 地塞米松或环孢素a 联合地塞米松均可减轻百草枯中毒引起的大鼠 p i f ，大剂量环孢素a 联合地塞米松疗效优于小剂量环孢素a 联合地塞米松和单纯 地塞米松的疗效，7 d 疗程的治疗效果要好于3 d 和1 4 d 疗程。 2 地塞米松或环孢素a 联合地塞米松治疗减轻p i f 的可能机制：增加肺组 织清除氧自由基能力、降低脂质过氧化水平；抑制t g f p l 的表达。 关键词百草枯中毒；肺间质纤维化；环孢素a ；地塞米松；转化生长因子 bl ：羟脯氨酸 徐州医学院硕士学位论文 t h e r a p e u t i ce f f e c t so fc y c l o s p o r i n ea a s s o c i a t e dw i t h d e x m e t h a s o n eo np a r a q u a t - - i n d u c e dp u l m o n a r yi n t e r s t i t i a l f i b r o s i s a b s t r a c t o b j e c t i v e t oe s t a b l i s hp u l m o n a r yi n t e r s t i t i a lf i b r o s i s ( p i f ) m o d e li n d u c e db y i n t r a p e r i t o n e a li n j e c t i o np a r a q u a ti nr a t s t oi n v e s t i g a t et h et h e r a p e u t i ce f f e c ta n d m e c h a n i s mo fc y c l o s p o r i n eaa s s o c i a t e d 、 r i ld a m e t h a s o n eo nt h ep i fi ne x p e r i m e n t a l m r s m e t h o d s8 0s dr a t sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t o4g r o u p s ：m o d e lg r o u p ( m o d g r o u p ) ，d e xg r o u pt r e a t e dw i t hd e x a m e t h a s o n e ，c y c lg r o u pt r e a t e d 埘t l ll o w - d o s e c y c l o s p o r i n ea a s s o c i a t e d 丽t l ld e x a m e t h a s o n e ，c y c - hg r o u pt r e a t e dw i t hh i 曲- d o s e c y c l o s p o r i n eaa s s o c i a t e dw i t hd e x a m e t h a s o n e t h e ne a c ht h e r a p e u t i cg r o u pw a s r a n d o m l yd i v i d e di n t ot h r e es u b - g r o u p sa g a i na c c o r d i n gt ot r e a t i n gt i m e ( 3 d ，7 da n d 14 d ) t h e p a r a q u a tp o i s o n i n gp u l m o n a r yi n t e r s t i t i a l f i b r o s i sm o d e l w a sm a d eb y i n t r a p e r i t o n e a li n j e c t i o n2 0 p a r a q u a ts o l u t i o n 、析mt h ed o s eo f18 m g k g t w oh o u r s l a t e r , r a t si nt h ed e xg r o u p ，t h ec y c lg r o u pa n dt h ec y c hg r o u pw e r er e s p e c t i v e l y g i v e nb yi n t r a p e r i t o n e a li n j e c t i o nt h ed e x a m e t h a s o n e ( 5 m g k g ) ，c y c l o s p o r i n ea ( 5 m g k g ) a s s o c i a t e dw i t hd e x a m e t h a s o n e ( 5 m g k g ) a n dc y c l o s p o r i n ea ( 2 0 m g k g ) a s s o c i a t e d w i t hd e x a m e t h a s o n e ( 5 m g k g ) ，r e p e a t e de v e r y2 4h o u r s r a t si nt h em o dg r o u pw e r e g i v e nn o r m a ls a l i n es o l u t i o nw i t l lt h es a m ev o l u m eb yi n t r a p e r i t o n e a li n j e c t i o n t h e c h a n g e so ft h er a t s b e h a v i o r sw e r eo b s e r v e di nt h ec o u r s eo fe x p e r i m e n t a tt h e2 2 t h d a yt h er a t sw e r ek i l l e dt oc o l l e c tt h el u n gt i s s u e ，t h e nt h el u n gt i s s u ew dw a s m e a s u r e d ，t h ec o n t e n to fm d aa n dt h ea c t i v i t yo fs o di nl u n gt i s s u ew e r ed e t e c t e d ， t h ee x p r e s s i o no fh y pa n dt g f - p li nl u n gt i s s u ew a sm e a s u r e d l u n gt i s s u ew a s s t a i n e db yh em e t h o da n dm a s s o nm e t h o d , a n du s e dm i c r o s c o p et oo b s e r v et h e p a t h o l o g y r e s u l t s1 h es t a i n i n ga n dm a s s o ns t a i n i n g ：i nm o d g r o u p ，t h e r ew a so b v i o u s p i fo n2 2 t hd a y ；t h ep i fo fr a t si nd e xg r o u pa n dc y c lg r o u ph a sb e e ns i g n i f i c a n t l y r e l e a s e d ，c o m p a r e d 、) r i t ht h er a t so fm o d e lg r o u p t h ep i fo fr a t si nc y c - hg r o u pw a s b e t t e rt h a nt h a to ft h ed e xg r o u pa n dc y c - lg r o u p ；c o m p a r e dw i t hp i fo fr a t si nt h e3 d 4 g r o u pa n dc y c - lg r o u p ( p o 0 5 ) ；c o m p a r r d 谢t ht h e3 da n d14 dg r o u p ，t h ew di i l l u n gt i s s u eo fr a t si nt h e7 dg r o u pw a ss i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d ( 尸 o 0 5 ) 4 t h el u n gt i s s u ea c t i v i t yo fs o di nt h ed e xg r o u p ，c y c lg r o u pa n dc y c h g r o u pw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to fm o dg r o u p 妒 o o1 ) t h el u n gt i s s u e a c t i v i t yo fs o d i nt h ec y c - hg r o u pw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to fd e xg r o u pa n d c y c - lg r o u p 俨 0 0 5 ) ；c o m p a r e d 、) i r i lt h e3 da n d14 dg r o u p ，t h el u n gt i s s u ea c t i v i t yo f s o di n7 dg r o u ph a sb e e ns i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d 俨 0 0 5 ) 5 t h ec o n t e n to fl u n gt i s s u em d ai nt h ed e xg r o u p c y c - lg r o u pa n dc y c - h g r o u pw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h a to fm o dg r o u p ( p 0 0 5 ) c o m p a r e dw i t l lt h e g r o u p so ft h ed e xg r o u pa n dc y c - lg r o u p ，t h ec o n t e n to fl u n gt i s s u em d a i nc y c h g r o u ph a sb e e ns i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d ；c o m p a r e d 、 r i m3 da n d14 dg r o u p t h ec o n t e n t o fl u n gt i s s u em d ai n7 d a yg r o u ph a sb e e ns i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d 俨 0 0 5 ) 6 。t h ee x p r e s s i o no fl u n gt i s s u et g f p ii nd e xg r o u p ，c y c - lg r o u pa n dc y c - h g r o u pw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h a to fm o dg r o u p c o m p a r e dw i t ht h ed e xg r o u p a n dc y c - lg r o u p ，t h ee x p r e s s i o no fl u n gt i s s u et g f - p li nt h ec y c hg r o u ph a sb e e n s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d ；c o m p a r e d 丽t ht h e3 da n d14 dg r o u p ，t h ee x p r e s s i o no fl u n g t i s s u et g f - p ii nt h e7 dg r o u pw a ss i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d ( 尸 0 01 ) c o n c l u s i o n s1 t h ed e x a m e t h a s o n ea n d c y c l o s p o r i n e aa s s o c i a t e dw i t h d e x a m e t h a s o n eh a v et h e r a p e u t i ce f f e c t so np i fi n d u c e db yp a r a q u a tp o i s o n i n g t h e t h e r a p e u t i ce f f e c t so ft h eh i 曲- d o s ec y c l o s p o r i n ea a s s o c i a t e dw i t hd e x a m e t h a s o n ew a s b e t t e rt h a nt h a to ft h ed e x a m e t h a s o n ea n dt h el o w d o s ec y c l o s p o r i n eaa s s o c i a t e dw i m d e x a m e t h a s o n e t h et h e r a p e u t i ce f f e c t so f7 dt r e a t m e n tt i m ei sb e a e rt h a nt h a to ft h e3 d a n d14 dt r e a t m e n tt i m e ； 5 p e r o x i d ea n di n h i b i t i n gt h ee x p r e s s i o no ft g f - p li nl u n gt i s s u e k e yw o r d sp a r a q u a tp o i s o n i n g ；p u l m o n a r yi n t e r s t i t i a lf i b r o s i s ；c y c l o s p o r i n ea ； d e x a m e t h a s o n e ；t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r - p l ；h y d r o x y p r o l i n e 6 徐州医学院硕士学位论文 吾鲁士 翮看 百草枯( p a r a q u a t ，p q ) ，化学名1 ，1 - 二甲基- 4 ，4 一联吡啶二氯化物，它是一种有 机杂环类、接触型脱叶剂，为墨绿色液体，2 0 水溶剂，纯品为白色结晶，以阳离 子形式存在，易溶于水，在酸性及中性溶液中稳定，碱性环境易水解破坏。其特 点为喷洒后发挥作用快，接触土壤后迅速失活，土壤中残留少，对野生动物和环 境危害少【l 】，但如使用不当对人畜有较强的毒性，致死率高，在一些欧美发达国家 已严禁生产和应用，在一些发展中国家如亚洲、非洲等国家因其生产技术要求低、 成本少仍然被广泛生产应用 2 1 。我国为农业大国，每年有大量患者中毒死亡【2 】，p q 中毒已经成为我国急诊科常见的急危重症，死亡率极高；通常儿童口服2 0 百草 枯溶液4 5 m l ，成人n n a1 0 - - - 2 0 m l 即可致死【3 】。p q 进入人体可使肺、肾、肝、心 脏、脑和消化道出现损伤，早期患者多死于多脏器功能衰竭，或急性肺损伤、严 重低氧血症【4 】。由于肺泡上皮细胞存在着多胺摄取系统，对p q 有主动摄取和蓄积 的特性，因此p q 在体内分布主要集中在肺，肺中p q 浓度能达到l o 一9 0 倍的血 浆浓度，肺是p q 毒性作用的主要靶器官。p q 蓄积于肺泡的i 型和i i 型细胞，p q 作为一种电子受体，干扰其氧化还原反应，破坏肺泡i 、i i 型上皮细胞，导致炎症 细胞浸润，组织细胞水肿出血，此后逐渐出现广泛肺泡间隔内和肺泡腔内纤维化 病变，胶原堆积，严重破坏正常的肺泡结构，导致气体交换严重障碍，出现顽固 性低氧血症，后期p q 中毒患者多死于p i f 导致的呼吸衰竭【s , 6 1 。 目前，针对p q 中毒尚无特效解毒药和有效的治疗手段，目前世界上p q 中毒 的药物治疗多采用糖皮质激素联合免疫抑制剂的治疗方法，因这两类药物都具有 很强的抗炎作用，可以抑制过强的炎症反应，减少氧自由基的产生，保护受损伤 的肺组织，一定程度上减轻急性肺损伤、抑制百草枯中毒的纤维化，降低百草枯 中毒患者的死亡率和住院时间，因而受到广泛关注【s j 。a g a r w a lr 等在2 0 0 7 年通过 采用m e t a 分析的方法，分析1 9 8 0 2 0 0 8 年的1 2 篇关于应用糖皮质激素联合环磷酰 一【怜 徐州医学院硕士学位论文 胺治疗治疗百草枯中毒的临床随机对照实验的文献，发现免疫抑制剂联合糖皮质 激素能减轻百草枯中毒的肺损伤，降低患者死亡率、缩短住院时间【9 】。由于环磷酰 胺对机体免疫系统具有较强的抑制作用，长期应用可降低人体正常的免疫防御机 能，产生严重的副作用，所以其临床应用受到一定限制【l o l 。环孢素a 是一种低毒 高效的免疫抑制剂，对免疫抑制具有一定的选择性，不显著影响机体的一般防御 能力【l l 】。应用博莱霉素复制的大鼠p i f 模型的研究发现，环孢素a 可通过抑制肺 组织中纤维连接蛋白及血小板衍化生长因子的表达减轻p i f l l 2 1 。我国学者张锡刚等 【1 4 1 通过研究3 8 例环孢素a 联合甲基强的松龙治疗p q 中毒患者发现，应用环孢素 a 联合甲基强的松龙治疗p q 中毒的死亡率为3 4 2 ，较环磷酰胺联合甲基强的松 龙有更好的疗效( 死亡率5 1 2 ) ，且无明显副作用。但是此研究的缺点是，病例 数少，为回顾性病例对照研究，对环孢素a 的具体使用剂量、疗程及机制没有进 一步深入探讨，结论不可靠。 本实验通过建立p q 中毒致大鼠p i f 的模型，观察大鼠肺组织病理变化、测量 肺组织w d 及p i f 特异性指标h p y 来观察疗效；测量氧化抗氧化指标s o d 活性 和m d a 含量及与肺组织纤维化密切相关的细胞因子t g f p l 的表达，研究环孢素 a 联合地塞米松对p i f 的防治效果，探讨其可能机制，希望能为临床应用提供基础 动物实验的理论依据。 8 徐州医学院硕士学位论文 材料与方法 1 实验材料与仪器 1 1 实验动物 健康清洁级s d 大鼠雌雄不限，体重约2 0 0 - 2 5 0 9 ，由徐州医学院动物实验中心 提供，生产许可证号为：s y x k ( 苏) 2 0 0 2 0 0 3 8 ，符合国家健康一级动物标准。大鼠 均给予标准饲料喂养，自由摄食及饮水，独立通风隔离笼具饲养，室温保持在 ( 2 5 士3 ) ，避免噪音干扰，保持环境安静。 1 2 实验试剂 大鼠饲料徐州医学院动物房提供 2 0 百草枯浓缩液 山东农药股份有限公司( 批号：2 0 1 0 0 3 1 9 ) 环孢素a n o v a r t i sp h a r m as e h w e i za g ( 批号：0 9 0 1 0 3 ) 地塞米松注射液 山东鲁抗辰欣药业有限公司( 批号：0 9 1 2 0 3 3 0 2 ) 免疫组化试剂盒( p v 6 0 0 1 ) 北京中杉金桥生物技术有限公司( 批号：k 1 0 2 4 1 1 b ) t g f 1 31 的单克隆抗体 北京中杉金桥生物技术有限公司( 批号：f 1 0 3 0 ) d a b 显色剂 北京中杉金桥生物技术有限公司( 批号：z l i 9 0 1 7 ) s o d 试剂盒： 南京建成生物工程研究所生产( 批号：2 0 1 0 0 4 2 6 ) m d a 试剂盒： 南京建成生物工程研究所生产( 批号：2 0 1 0 0 4 1 2 ) h y p 试剂盒：c u s a b i ob i o t e c hc o ，l t d ( 批号：c s b e 0 8 8 3 8 0 1 3 手术器械与消毒用品 工作台，无影灯，鼠板，各种手术器械：手术刀，镊子，眼科剪，l m l 、5 m l 注射 器，无菌手套，口罩，帽子，碘酒等。 1 4 主要仪器 b i o - t a k e l x 8 0 0 酶标仪 s a n i et e c a n 7 2 1 分光光度仪日本 9 徐州医学院硕士学位论文 高速低温离心机( 5 8 0 4 r ) 超低温冰箱h e t o 恒温振荡水浴箱s h a c 电热恒温干燥箱2 0 2 2 石蜡切片机 电子天平 o l y m p u s b x 51 显微图像采集系统 2 实验方法 德国 丹麦 金坛市 上海实验仪器厂 德国l e i c a 公司 上海第二天平仪器厂 日本 2 1 动物分组将8 0 只s d 大鼠随机分为：模型组( m o d 组) ，地塞米松治疗组( d e x 组) ，小剂量环孢素a 联合地塞米松治疗组( c y e l 组) 和大剂量环孢素a 联合地 塞米松治疗组( c y e h 组) ，三个治疗组根据给药疗程不同分为3 d 、7 d 和1 4 d 三个 亚组，每组8 只。 2 2 模型制作和给药方法 2 2 1 模型制作1 2 2 1 将2 0 浓度的p q 溶液，按1 8 m g k g 剂量用生理盐水稀释至 l m l ，注入腹腔。 i l2 2 2 给药剂量和方法【2 3 , 2 4 1 一染毒后2 h ，d e x 组：地塞米松( 5 m g k g ) ：c y e l 组： 环孢素a ( 5 m g k g ) + 地塞米松( 5 m g k g ) ；c y c - h 组：环孢素a ( 2 0 m g k g ) + 地塞 米松( 5 m g k g ) ：上述药物溶于l m l 生理盐水中，腹腔注射，每2 4 h 重复一次，根 据疗程分别注射3 次、7 次和1 4 次；m o d 组腹腔注射等容积生理盐水。 2 3 标本的收取及处理 在第2 2 d 用1 0 水合氯醛( 3 0 0 m g k g ) 腹腔注射麻醉后，将大鼠仰卧、四肢 与头部固定，沿正中线剪开皮肤，钝性分离并暴露腹主动脉，放血处死动物，沿 胸骨正中剪开胸骨，打开胸腔，暴露心脏和肺脏。结扎肺支气管，取左肺叶用1 0 中性福尔马林溶液浸泡固定，制各病理切片；右肺上叶用于测定w d ，右肺下叶 冰冻保存用于测定肺组织h y p 含量。其余肺组织做成匀浆，8 0 保存，用于测量 s o d 活性及m d a 含量。 1 0 徐州医学院硕士学位论文 大鼠，每日进食情况，体型和毛发变化，以及活动状况等。 将固定好的肺组织常规石蜡包埋，连续切片，厚4 1 m a ，切下的薄片放到4 5 1 2 水中烫平( 尽量展平) ，再贴到载玻片上，放4 5 恒温箱中烘干2 h ，防水密封， 进行h e 染色和m a s s o n 染色。 3 2 1h e 染色步骤 将切片浸入二甲苯i ，二甲苯i i ，1 0 0 酒精i 各1 5 m i r a 再浸入1 0 0 酒精i i 、 9 5 酒精，9 0 酒精，8 0 酒精、7 0 酒精各1 0 m i n 后，再浸入流动的自来水中洗 去酒精；将切片浸入苏木素染液中染色2 - 5 m i n ，流动自来水洗2 m i r a0 5 盐酸酒 精溶液分化数s 钟，流动自来水洗l m i m0 5 淡氨水蓝化切片3 0 s ，流动自来水洗 5 m i n ，镜检着色满意后再用蒸馏水清洗；将切片浸入o 5 伊红染液中染色2 m i n ， 用蒸馏水清洗；梯度酒精脱水：7 0 酒精、8 0 酒精、9 0 酒精，9 5 酒精、1 0 0 酒精i 各l m i n ，1 0 0 酒精i i5 m i n ，二甲苯i2 m i n ，二甲苯i i5 r a i n ，二甲苯i i i1 0 m i r a 将已透明的切片滴上树胶，盖上盖玻片固封。 3 2 2m a s s o n 染色步骤 将切片常规脱蜡至蒸馏水；苏木素染2 - 5 m i r a 充分水洗；1 盐酸酒精分化 6 , - , 7 s ，观察玻片上样本泛桃红色为宜，蒸馏水冲洗3 0 s ；丽春红酸性品红液中染 2 4 m i n ，流水冲洗干净3 0 - - - 6 0 s ；以o 2 冰醋酸水溶液浸洗片刻；1 磷钼酸水溶 液分化1 0 1 5 m i n ，镜下观察样本中较远纤维部分褪成淡粉红色为宜；不经水洗， 直接用苯胺蓝液染10 15 m i n ；以0 2 冰醋酸水溶液浸洗片刻；9 5 酒精、10 0 酒 精、二甲苯透明、中性树胶封固。 3 3h y p 测定 3 3 1 原理用纯化的抗体包被微孑l 板，制成固相载体，往包被抗h y p 抗体的微孔 中依次加入标本或标准品、生物素化的抗h y p 抗体、h r p 标记的亲和素，经过彻 1 1 徐州医学院硕士学位论文 底洗涤后用底物t m b 显色。t m b 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的 作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的h y p 呈正相关。用酶标仪在 4 5 0 n m 波长下测量吸光度( o d 值) ，计算样品浓度。 3 3 2 具体方法 ( 1 ) 加样分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空f l c l n 样品稀释液1 0 0 u l ， 其余孔分别加标准品或待测样品1 0 0 u l ，注意不要有气泡，轻轻晃动混匀，酶标板 加盖或者覆膜，3 7 反应1 2 0 r a i n 。 ( 2 ) 弃去液体，每孔加入生物素标记抗体工作液l o o f l ，3 7 c 反应6 0 r a i n 。 ( 3 ) 弃去孔内液体，洗板3 次，每次浸泡l - 2 分钟，甩干，每孔加辣根过氧化 物酶标记亲和素工作液1 0 0 1 d ，3 7 。c 反应，6 0 m i n 。 ( 4 ) 甩干，洗板5 次，每次浸泡1 2 分钟，甩干。依序每孔加底物溶液9 0 1 x l ， 3 7 避光显色。 ( 5 ) 依序每孔加终止液5 0 1 , t l ， ( 6 ) 用酶标仪在4 5 0 n m 波长处依序测量各孔的光密度( o d 值) 。加终止液后 1 5 m i n 内测量。 3 4 肺w d 检测 将待测肺组织剔除多余结缔组织，吸水纸拭干表面血液，用电子天平精确称 其重量( 湿重，w ) ，然后放入8 0 。c 电热恒温箱烘烤4 8 h 后，再次称其重量( 干重， d ) ，计算w d 。 3 5s o d 测定 3 5 1 原理通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基( 0 2 一) ， 后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度 计测其吸光度。当被测样品中含有s o d 时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑 制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度 值，通过公式求出被测样品中的s o d 的活力。 3 5 2 具体方法 1 2 徐州医学院硕士学位论文 ( 1 ) 将试剂一、试剂二、试剂三、试剂四与蒸馏水( 对照管) 或样品( 测定管) 用旋涡混匀器充分混匀，置3 7 恒温水浴4 0m i n 。 ( 2 ) 加入显色剂混匀，室温放置1 0 m i n ，于波长5 5 0 n m 处，l c m 光径比色杯， 蒸馏水调零，比色。 ( 3 ) s o d 活性( u m g p r o t ) _ ( 对照管吸光度- $ t j 定管吸光度) ( 对照管吸 光度 5 0 ( 反应液总体积取液量) 组织中蛋白含量 3 6m d a 测定 3 6 1 原理过氧化脂质降解产物中的m d a 可与硫代巴比妥酸( t h i o b a r b i t u r i c a c i d ，i b a ) 缩合，形成红色产物，在5 3 2 n m 处有最大吸收峰。因底物为t b a ， 所以称t b a 法。 3 6 2 具体方法 ( 1 ) 将试剂一与测试样本( 测定管) 或无水乙醇( 标准空白管) 或1 0 n m o l m l 标准品混匀( 摇动几下试管架) 。 ( 2 ) 加入试剂一、试剂二和5 0 冰醋酸( 测定空白管) 旋涡混匀器混匀，试管 口用保鲜膜扎紧，用针头刺一小孔，9 5 水浴( 或用锅开盖煮沸) 4 0 m i n ，取出后 流水冷却，然后3 5 0 0 4 0 0 0r r a i n ，离心1 0m i n ，取上清液，5 3 2 n m 处，l c m 光径， 蒸馏水调零，测各管吸光度值。 ( 3 ) m d a 含量( n m o l m g p r o t ) = 【( 测定管吸光度一测定空白管吸光度) ( 标 准管吸光度一标准空白管吸光度) 】标准品浓度( 1 0 n m o l m 1 ) 组织中蛋白含量 3 7 肺组织t g f 1 3i 表达的检测( 免疫组化p v 法) 免疫组化p v 法，按试剂盒说明书进行。步骤：石蜡切片，常规脱蜡；p b s ( p h7 4 ) 冲洗，3 m i n 3 次，抗原热修复；3 过氧化氢孵育1 0r a i n ，以消除内源 性过氧化物酶活性；p b s 冲洗，3 m i n x3 次；滴加一抗( 兔抗鼠t g f 1 31 抗体， 浓度1 ：5 0 ) 4 c 过夜；p b s 冲洗，3 m i n x 3 次；滴加山羊抗兔i g g 二抗，3 7 c 孵 育3 0 m i n ；p b s 冲洗，3 m i n x 3 次；d a b 显色，自来水充分冲洗：苏木素复染l m i n ， 自来水冲洗；盐酸、酒精分化1 s ，水冲；碳酸锂3 0 6 0 s 水冲；乙醇梯度脱水二甲 1 3 苯透明中性树胶封片。 个1 0 x 4 0 倍镜视野观察 算各组肺组织的t g f p 核染成棕黄色) 。 4 统计学处理 实验数据采用统计 差齐性检验、采用多因 统计学意义。 徐州医学院硕士学位论文 结果 1 大鼠一般状态 实验过程中发现p q 染毒后各组大鼠出现精神萎靡，活动减少，进食量下降， 呼吸急促，步态不稳，眼鼻分泌物增加，略带血性，中毒症状明显。7 2 h 后，各 组大鼠一般情况逐渐恢复，但l 周后，m o d 组大鼠逐渐出现呼吸困难，且进食困 难，严重消瘦，体重明显下降，毛黄不光滑且竖立，脱毛；而d e x 组、c y c l 组 和c y c h 组的一般情况进一步改善，大鼠皮毛较光滑、身体强壮、饮食较好，呼 吸较平稳，其中c y c h 组一般状态最好，7 d 疗程组的一般状态相对好于3 d 疗程 组、3 d 疗程组又好于1 4 d 疗程组。 2 肺组织病理形态的变化 m o d 组h e 染色可见肺泡壁显著增厚、毛细血管腔闭塞、肺泡结构紊乱，可 见大量成纤维细胞增生；m a s s o n 染色见胶原纤维明显增多，呈束状或片状沉积。 与m o d 组比较，d e x 组、c y c - l 组及c y c - h 组p i f 的程度明显减轻，其中c y c h 组p i f 最轻，7 d 和1 4 d 疗程组p i f 轻于3 d 疗程组。( 见图1 、图2 ) 。 3 肺组织h y p 表达检测结果( 见表l 、图4 ) 与m o d 组比较，d e x 组、c y c l 组和c y c h 组肺组织h y p 含量显著减少， c y c h 组又较d e x 组和c y c - l 组减少，差异都有统计学意义( 尸 0 0 5 ) 。7 d 和1 4 d 疗程组肺组织h y p 表达较3 d 疗程组显著减少，差异有统计学意义0 0 5 ) ，7 d 和1 4 d 疗程组比较肺组织h y p 表达差异无统计学意义。 4 肺组织w d 测量结果( 见表2 、图5 ) 与m o d 组相比，各d e x 组、c y c l 组和c y c h 组大鼠肺组织w d 均降低，差 异均有统计学意义( 尸 o 0 5 ) ；c y c - h 组下降幅度最大，显著低于d e x 组和c y c - l 组( p o 0 5 ) 。7 d 疗程组大鼠肺组织w d 较3 d 和1 4 d 疗程组显著下降，差异有统 计学意义( 尸 o 0 5 ) 。 徐州医学院硕士学位论文 5 肺组织s 0 1 ) 活性检测结果( 表3 、图6 ) 与m o d 组比较，d e x 治疗的7 d 和1 4 d 亚组、以及c y c l 和c y c - h 组肺组织 的s o d 活性显著增加；c y c h 组又较d e x 组和c y c l 组显著增加，差异有统计学 意义( 氏o 0 5 ) 。7 d 疗程组肺组织的s o d 活性显著高于3 d 和1 4 d 疗程组，差异 有统计学意义( p 0 0 5 ) 。 6 肺组织m d a 含量检测结果( 见表4 、图7 ) 与m o d 组比较，d e x 组、c y c l 组和c y c h 组肺组织m d a 含量显著降低， c y c h 组又较d e x 组和c y c l 组降低，差异有统计学意义( p o 0 5 ) 。7 d 疗程组肺 组织m d a 含量显著低于3 d 和1 4 d 疗程组，差异有统计学意义俨 o 0 5 ) 。 7 大鼠肺组织t g f - 9l 表达检测结果( 见表5 、图3 、图8 ) 与m o d 组比较，d e x 组、c y c - l 组和c y c - h 组肺组织t g f - bi 表达显著减少， c y c h 组又较d e x 组和c y c - l 组减少，差异有统计学意义( 氏o 0 5 ) 。7 d 和1 4 d 疗程组肺组织t g f bi 表达较3 d 疗程组显著减少，差异有统计学意义( p 0 0 5 ) ， 7 d 和1 4 d 疗程组比较肺组织t g f p l 表达差异无统计学意义( p o 0 5 ) 。 1 6 徐州医学院硕士学位论文 讨论 p q 中毒患者死亡率高，早期重症患者多死于严重的多脏器功能衰竭，或急性 肺损伤、严重低氧血症1 4 1 。由于肺泡上皮细胞对p q 有主动摄取和蓄积的特性， p q 蓄积于肺泡的i 型和i i 型细胞，干扰其氧化还原反应，破坏肺泡i 、i i 型上皮 细胞，导致炎症细胞浸润，组织细胞水肿出血，此后逐渐出现广泛肺泡间隔内和 肺泡腔内纤维化病变，胶原堆积，严重破坏正常的肺泡结构，导致气体交换严重 障碍，出现顽固性低氧血症，后期p q 中毒患者多死于p i f 导致的呼吸衰竭及其合 并症【5 ，们。目前认为p q 中毒患者的治疗主要着眼于减轻p i f ，糖皮质激素联合环 磷