（分析化学专业论文）dna自组装增强信号的生物传感器研究.pdf

丫 - 一 ， 奋 i i ii ir l li r i i i iir l li il 19 0 7 3 2 6 s i g n a le n h a n c e m e n t f o rb i o s e n s o r sb a s e do nd n as e l f - z h u j i n q i n g b s ( n a n c h a n gu n i v e r s i t y ) 2 0 0 8 at h e s i ss u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no ft h e r e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e eo f m a s t e ro fs c i e n c e a n a l y t i c a lc h e m i s t r y i n t h e g r a d u a t es c h o o l o f h u n a nu n i v e r s i t y s u p e r v i s o r p r o f e s s o ry a n gx i a o h a i p r o f e s s o r ，an gk e m i n m a y , 2 0 1 1 a 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其它个人或 集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 糨j 鸯 日期：2 , 0 1 1 年r 月之j 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密n 。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：爿乙：赴：函 导师繇移阮圾 千3 必 日期：。加f 年1 7 月弓日 日期如c ( 年、j 一霸日 硕士学位论文 a b s t r a c t d n ah a sa t t r a c t e di n c r e a s i n ga t t e n t i o nb e c a u s eo ff a c i l es y n t h e s i s ，e a s ym o d i f i c a t i o n , s t a b l ep r o p e r t i e sa n di t ss p e c i f i cw a t s o n - c r i c k - b a s e dd u p l e x i na d d i t i o n ，d n ah a sp l e n t yo f s e l f - a s s e m b l e ds 伽j 舭，g o o db i o c o m p a t i b l ea n dv a r i e t yo fc h a r a c t e r i z a t i o n m e t h o d s r e c e n t l y , t h es e n s i t i v i t y a n d s e l e c t i v i t y h a v e b e e n i m p r o v e db yc o m b i n i n g d n a s e l f - a s s e m b l e ds t n 】c n l r ea n dv a r i e t yo ft r a d i t i o n a lb i o a n a l y s i st e c h n o l o g y b a s e do nd n a s e l f - a s s e m b l e ds t r u c t u 】汜a n d g o l dn a n o p a r t i c l e s ，i nt h i st h e s i s ，t h r e e k i n d so fs i g n a l a m p l i f i c a t i o na p p r o a c h e sf o rd e t e c t i o no fd n a a n ds m a l lm o l e c u l e sw e r ed e m o n s t r a t e d ， r e s p e c i t i v e l y t h em a i nr e s e a r c h e so f t h i sd i s s e r t a t i o na r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 a ne l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o rf o ra d e n o s i n eb a s e do n “s u p e r s a n d w i c h s i g n a l a m p l i f i c a t i o n ad n a s e l f - a s s e m b l y b a s e d s u p e r s a n d w i c h s t r u c t u r eh a sb e e ne m p l o y e df o ra d e n o s i n e d e t e c t i o n t h ed e t e c t i o nl i m i to ft h em e t h o df o ra d e n o s i n ei s5 0n m t h es t r a t e g yh a s i m p r o v e dt h ed e t e c t i o nl i m i tf o rn e a r l y10t i m e sc o m p a r e dt o “n o n - s u p e r s a n d w i c h m e t h o d i t i sa ne n z y m ef r e e ，l a b e lf r e e ，s i m p l e ，i n e x p e n s i v e ，a n dg o o dg e n e r a l i t yd e t e c t i o nm e t h o d 2 a ne l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o rf o rd n aa m p l i f i e dd e t e c t i o nb a s e do nd e n d r i t i c d n a c a p p e dg o l dn a n o p a r t i c l e s t h r o u g hr e p e a t e d “s a n d w i c h ”f o r m a t ，t w od i f f e r e n tk i n d so fd n a - c a p p e dg o l dp a r t i c l e s h a v e b e e nu s e dt ob u i l dd e n d r i t i c a r c h i t e c t u r e so nt h es u r f a c eo fe l e c t r o d ef o rd n a q u a n t i t a t i v ed e t e c t i o n t h ed e t e c t i o nl i m i ti s0 13p m t h es t r a t e g yh a si m p r o v e dt h ed e t e c t i o n l i m i tf o r n e a r l y 4t i m e sc o m p a r e dt o “g o l dn a n o p a r t i c l e o n l y ”m e t h o d t h ea p p r o a c h p o s s e s s e sh i 曲s e n s i t i v i t y , e x c e l l e n ts e l e c t i v i t y , r e p r o d u c i b l ep r o p e r t i e s ，a n dg o o dg e n e r a l i t y 3 as p rd n as e n s o rb a s e do ng o l dn a n o p a r t i c l e sa n d “s u p e r s a n d w i c h s i g n a l a m p l i f i c a t i o n f i r s t ，t h es p rr e s p o n s es i g n a lw a se n h a n c e db ye l e c t r o n i cc o u p l i n gb e t w e e ng o l df i l m a n dg o l dn a n o p a r t i c l e s t h e n ，t h es i g n a lw a sf u r t h e re n h a n c e db y “s u p e r s a n d w i c h f o r m a to f d n a - c a p p e dg o l dn a n o p a r t i c l e s a f t e rt w i c ea m p l i f i c a t i o np r o c e s s e s ，t h ed e t e c t i o nl i m i ti s0 1 p m i th a si m p r o v e d t h ed e t e c t i o nl i m i tf o rn e a r l y10 0t i m e sc o m p a r e dt o “g o l d n a n o p a r t i c l e o n l y ”m e t h o d ，w h i c hi se x p e c t e dt oe x p e n dt oo t h e rt a r g e t sd e t e c t i o n k e yw o r d s ：g o l dn a n o p a r t i c l e s ；d n as e l f - a s s e m b l e ；e l e c t r o c h e m i c a l ；s u r f a c ep l a s m o n r e s 0 n a n c e l i t 一 氐 d n a 自组装增强信号的生物传感器研究 目录 学位论文原创性声明和学位论文版权使用授权书。i 摘要k 一：i i a b s t r a c t i l l 本文所用英文缩略词：v i i 第1 章绪论l 1 1 自组装技术简介1 1 1 1 分子自组装。l 1 1 2d n a 自组装2 1 2 分析检测中常见的几种d n a 自组装结构3 1 2 1 单纯的d n a 自组装结构在分析检测中的应用3 1 2 2d n a 纳米颗粒复合自组装结构在分析检测中的应用8 1 2 3d n a 碳纳米材料复合自组装结构在分析检测中的应用1 0 1 2 4d n a - 阳离子聚合物自组装结构在分析检测中的应用1 1 1 3 本论文拟开展的工作1 2 第2 章d n a 超级“三明治”结构增强信号的电化学生物传感器研究。1 4 2 1 前言1 4 2 2 实验部分1 4 2 2 1 试剂和仪器1 4 2 2 2 溶液的配制1 4 2 2 3 金电极的表面处理与修饰1 6 2 2 4 金电极表面捕获探针修饰密度的测定1 6 2 2 5 超级“三明治 结构的考察1 6 2 2 6 实验条件的选择1 7 2 2 7 腺苷的检测1 7 2 2 8 特异性考察18 2 2 9 再生和稳定性能考察1 8 2 2 o 电化学检测18 2 3 结果与讨论18 2 - 3 1 检测原理18 2 3 2 金电极表面捕获探针修饰密度的测定2 0 2 3 3 超级“三明治”结构形成的验证2 0 i v 食 硕士学位论文 2 3 4 实验条件的优化2 1 2 3 5 灵敏度考察2 3 2 3 6 腺苷检测的特异性2 4 2 3 7 传感器的再生和稳定性2 5 2 4 ，j 、结2 6 第3 章d n a 功能化纳米金颗粒“树枝 状结构增强信号的电化学传感器研究2 7 3 1 前言2 7 3 2 实验部分2 7 3 2 1 主要试剂与仪器2 7 3 2 2 溶液的配制2 7 3 2 3 纳米金颗粒的制备与修饰2 8 3 2 4 金电极的表面处理与修饰2 9 3 2 5 金电极表面s h d n a 修饰密度的测定2 9 3 2 6d n a 的检测2 9 3 2 7 再生性能考察_ 2 9 3 2 - 8 电化学检测2 9 3 - 3 结果与讨论3 0 3 3 。1 实验原理3 0 3 3 2 功能化纳米金颗粒的表征3 0 3 3 3 可行性考察31 3 3 4d n a 的定量检测3 2 3 3 5d n a 检测的特异性3 3 3 3 6 传感器的再生3 4 3 4 小结3 4 第4 章集成纳米金颗粒与d n a 超级“三明治”放大的表面等离子体共振生物传感器的 研究3 5 4 1 前言一3 5 4 2 实验部分3 5 4 2 1 试剂和仪器3 5 4 2 2s p r 仪器3 5 4 2 3 溶液的配制3 5 4 2 4 纳米金颗粒的制备与修饰3 7 4 2 5 传感芯片的制备3 7 4 2 6 传感芯片上修饰密度的考察3 8 4 2 7 超级“三明治”结构考察3 8 v d n a 自组装增强信号的生物传感器研究 4 2 8 可行性考察3 8 4 2 9 灵敏度的考察3 8 4 2 1 0 特异性的考察3 8 4 2 1 l 再生性能的考察。3 8 4 3 结果与讨论3 9 4 3 1 检测原理。：小3 9 4 3 2 传感芯片上s h d n a l 修饰密度的测定3 9 4 3 3 超级“三明治结构电泳图4 0 4 3 4 可行性分析4 l 4 3 5d n a 的定量检测一4 2 4 3 6d n a 检测的特异性一4 3 4 3 7 传感器的再生：4 3 4 4 ，j 、结4 4 结论。4 5 参考文献4 6 附录攻读硕士期间发表的学术论文目录：5 3 致谢。5 4 v i ， k 本文所用英文缩略词 - 一l 一_ _ _ - - i _ _ _ _ _ _ _ - - l _ _ - _ _ _ - - _ _ _ - - l - - _ - _ _ _ l _ _ _ _ _ _ _ _ - l 一 缩略词 名称 a d p 腺苷 c c d c c p c e 6 c n p s c n t s c y 5 d s d n a d n a r m m c h 1 0 2 p b s p m n t r n a r u h e x ( i i i ) r o x s d s s p r s s d n a 电荷耦合器件 f 阳离子型共轭聚合物 二氢卟吩 碳纳米颗粒 碳纳米管 花菁染料 双链脱氧核糖核酸 脱氧核糖核酸 荧光素 巯基己醇 单线态氧 磷酸缓冲溶液 聚3 。( 3 t - n ，n ，n 三乙胺基1 。异丙基) 4 甲基2 ，5 一盐酸噻吩 核糖核酸 钌胺 6 羧基x 罗丹明 十二烷基磺酸钠 表面等离子体共振 单链脱氧核糖核酸 t r i s三羟甲基氨基甲烷 v i i 如 硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 自组装技术简介 自组装是一种普遍存在的现象。如许多构成生命体基础的生物大分子( 如核酸分子、 酶、生物膜、脂质体等) 都是通过自组装形成高度组织、信息化和功能化的复杂结构【l j 。 近年来，人们利用自组装技术构建出一系列具有特殊化学和生物功能的新材料，并在分 子器件、传感器件、分子生物学、微电子学、表面材料工程等领域得到了广泛的应用【2 ，3 1 。 1 1 1 分子自组装 分子自组装是指分子与分子之间靠非共价键作用力( 包括库仑力、范德华力、疏水 作用力、堆叠作用力、氢键等) 形成具有一定结构和功能的聚集体的过程。分子自组装 是一种由无序到有序、从简单到复杂、由多组分收敛至单一组分的不断自我修正、自我 完善的过程。并不是所有的分子都能够发生自组装反应，形成分子自组装体系有两个重 要的条件 4 1 ：即自组装的推动力及导向作用。自组装的推动力是指分子间的非共价键力。 自组装的导向作用指的是分子在空间上的互补性，也就是说要使分子自组装发生，就必 须在空间的尺寸上和方向上达到分子重排的要求。 通常形成分子自组装体系分为以下几步：( 1 ) 通过有序的共价键合成结构复杂的、 完整的分子中间体；( 2 ) 由分子中间体通过非共价键的协同作用，形成结构稳定的大分 子聚集体；( 3 ) 由一个或几个分子聚集体作为结构单元，多次重复自组织排列成有序分 子自组装体。体系中的相互作用多呈现加和性与协同性，并具有一定的方向性和选择性。 分子自组装的分类方法多种多样，按照分子自组装组分的不同可将分子自组装分 为：表面活性剂自组装、纳米微米颗粒自组装以及大分子自组装【5 j 。 ( 1 ) 表面活性剂两亲分子在材料表面、在胶体聚集体中或在膜中的排列是高度有 序的。通过设计和改变表面活性剂两亲分子的排列方式，可以得到各种各样高性能的材 料。很多重要的生物化学反应都是发生在通过这种自组装方式产生的囊泡、单层膜或胶 束上【6 1 。 ( 2 ) 自组装纳米微米颗粒，特别是纳米金属颗粒、无机纳米颗粒和半导体纳米颗 粒的自组装。这些颗粒作为单独的实体时已经可以产生量子尺寸效应，当自组装在一起 时所产生的光学、磁学和电学交互作用更加明显，宏观上会使材料的物理化学性质得到 极大的提高。目前，大量的研究工作已将白组装的纳米微米颗粒应用于光学、电学和生 物学领域中，并取得了一系列的成果【7 驯。 ( 3 ) 大分子自组装指高聚物或低聚物分子自发地构筑成具有特殊结构和形状的集 合体的过程。主要分为天然聚合物高分子的自组装和合成大分子的自组装。近年来，科 d n a 自组装增强信号的生物传感器研究 学界对合成大分子的自组装行为的研究工作越来越多，已在树枝状大分子、液晶高分子、 嵌段共聚物、能形成兀键或氢键的聚合物以及带相反电荷体系的组装方面取得了显著的 进展【1o 1 1 1 。1 1 1 2d n a 自组装 目前，应用于分子自组装的材料主要有：无机材料【1 2 】、有机分子1 3 1 及生物聚合物 1 1 4 - 1 6 。d n a 分子由于具有以下特点成为备受关注的生物自组装材料：( 1 ) 由于碱基间 的特异性结合使d n a 分子自组装具有可预测性；( 2 ) d n a 分子自组装的各种纳米结构 易于表征；( 3 ) d n a 分子本身容易合成与修饰、性质稳定；( 4 ) 交替使用灵活的单链 和刚性的双链可以组装成多种构型；( 5 ) d n a 自组装材料生物相容性好l l 7 1 。 最简单的d n a 自组装模型在几乎所有的生物体内都存在，即d n a 双螺旋结构。 d n a 自组装的驱动力是非共价键相互作用力，主要有：氢键、碱基堆积、静电作用力、 疏水作用力，严格的来说遵循碱基互补配对的原则。为了组装成更加复杂的自组装结构， 可以把模型扩展成两维空间结构。1 9 8 2 年s e e m 觚【1 5 】首先提出可以利用d n a 构建二维 空间结构的设想，如图1 1 所示。由四条单链d n a ( s s d n a ) 组装成的二维的有四个“手 臂”的复合结构，每个“手臂”设计了一个粘性末端而且两两互补，所以该结构可以通 过粘性末端间的连接组装成无限大的二维网络结构。 图1 1d n a 自组二维空间结构模型 1 7 1 m a o 等【l8 】组装了一个平行四边形的结构，并对该结构进行表征，证实该结构中间有 个菱形的孔洞。之后，该小组还构建了三角形自组装结构【1 9 1 。f u 等【2 0 1 开发出d n a 双链 交叉结构( d n ad o u b l e c r o s s o v e r ，d x ) ，两条单链通过与其它的单链同时杂交，从而组 装成两股互相平行的双螺旋结构，如图1 2 b 所示。y a n 等【2 l 】综合以上两种自组装构型的 设计方法，发明了一种4 4 的自组装结构，或称十字构型。该结构形状如四臂结，在 每一臂上增加了一条专有链，与一条公用的中心链形成一个交叉点。如果进一步在各臂 上伸出粘性末端，则能够形成一张方形网格，见图1 2 c 。除了以上提到两维平面结构， d n a 还可以组装成三维空间结构口2 】( 如图1 2 d 所示) 。r o t h e m u n d 2 3 1 首次提出“d n a 折纸 的概念，这是一种与传统d n a 自组装完全不同的新方法，是d n a 自组装领域 的一个重大突破。“d n a 折纸技术的原理如1 2 e 左图所示，该方法采用“一锅煮”的 策略，设计多条短的d n a 单链( 称为订书机链) ，把它们和一条长的d n a 单链( 称为 2 硕士学位论文 脚手架链) 混合，使脚手架链和短链共同折叠出所设计的二维结构。r o t h e m u n d 小组基 于“d n a 折纸 的概念，构建了一系列更加复杂的自组装结构，如1 2 e 中的五角星和 笑脸。 r 图1 2 经典的自组装结构【1 7 1 构建d n a 自组装结构通常需要以下几步【1 7 1 ：( 1 ) 结构建模。基于d n a 双螺旋结 构相关知识，结合物理学和几何学中已有的模型进行设计。该步骤关键在于确保每个 d n a 片段在最后的自组装结构中都处于最稳定的状态。( 2 ) 序列的设计。该步骤要遵 循的一个基本的原则是：在分叉点处不要设计互补序列。序列的设计可以用一些软件来 完成，如s e q u i n ，t i a m a t 及u n i q u i m e r 。( 3 ) d n a 自组装结构的形成。首先合成所需 的d n a 序列，然后将所有的d n a 序列按照一定的比例混合在一起，溶解在含有镁离 子的中性杂交缓冲液中，之后进行加热变性，最后缓慢降温使所有d n a 序列按照预先 设计好的模型进行自组装。 d n a 自组装结构常用的表征方法主要有：变性凝胶电泳口4 1 ，费格斯实验【2 5 】，羟基 自动足迹印记法【2 6 1 ，原子力显微镜口7 1 、扫描隧道显微镜和电镜口羽，及荧光显微镜 2 9 1 。 随着d n a 自组装技术的发展，自组装的图形越来越复杂，其表征技术表现出跨平台、 多仪器，多领域多学科交叉的特点。 1 2 分析检测中常见的几种d n a 自组装结构 d n a 自组装技术除了用来构建各种复杂的纳米结构之外，还广泛应用于分析检测 中。本节介绍几种常见的d n a 自组装结构及其在分析检测中的应用。 1 2 1 单纯f l t j d n a 自组装结构在分析检测中的应用 d n a 自组装增强信号的生物传感器研究 ( 1 ) d n a 自组装四面体结构 在生物分子的识别与检测中，表面反应中捕获探针与目标物的结合率往往比在均相 反应中的结合率要低 3 0 , 3 1 】。已有报道通过调控捕获探针的密度与构型、表面的尺寸与构 造等方法【3 刁来提高结合率。p e i 掣3 3 1 利用d n ae 组装三维结构增强了捕获探针与目标物 的结合率，如图1 3 所示。首先，基于d n a 自组装的原理设计了一种三角锥形的四面体 结构( 将如图1 3 所示的四条d n a 链混合加热后迅速降至4 ，2m i n 内即可形成该结构) ， 并用电泳的方法证明该结构的形成。其中，该结构的三个顶点含有巯基，可以通过a u s 键固定在金基底上，另一个顶点的延伸序列作为捕获探针。该结构在金膜表面的组装过 程用石英晶体微天平、荧光及声学的方法进行了表征。与普通的s s d n a 作为捕获探针的 方法相比，该方法的检测限约为1p m ，降低了2 5 0 倍，特异性增强。这主要是因为：该 结构力学性质稳定、刚性强；在表面排列规则有序、方向一致，而普通的单链捕获探针 容易“躺在”表面上或相互缠绕；四面体底座使捕获探针距离表面比较远( 约6n l t l ，普 通的捕获探针距离表面约1n m ) ，更容易与目标物结合。此外，该结构不需要使用巯基 己醇( m c h ) 封闭，抗蛋白吸附能力强，可用于实际样品中的检测；生物相容性好，可 以用来构建光学、电学、力学及声学传感器；通用性好，可以通过改变序列设计对多种 目标物实现检测。 zzz + f f 8 f l e 8 l _ 。j 鼍， 图1 3 基于d n a 自组装四面体的生物传感器【3 3 】 ( 2 ) d n a “折纸 技术 利用d n a “折纸”技术，将一条d n a 长链和多条短链混合加热后，就会自组装 成人们想要的图案。k e 等【3 4 】利用d n a “折纸 技术构建探针阵列，实现了对r n a 的检 测，如图1 4 所示。首先，基于d n a “折纸 技术构建一个探针阵列，将该阵列溶解在 水溶液中与目标d n a 杂交；然后，固定在云母基底上，利用原子力显微镜测定探针杂交 前后刚性的变化研究纳米尺度上位置依赖的杂交反应，同时也可以用来检测砒妊。该方 法不需要标记，灵敏度高、特异性好。 4 “ ，、嗜 ， 碍 硕士学位论文 q 一一 。0 逾 2 2 监 一_ 1 7 “ 歹一 向固栌 笛x 幽 图1 4 基于d n a 自组装构建的水溶性探针阵列检测r n a 杂交【3 4 】 ( 3 ) d n a 分子机器 基于d n a 自组装构建了d n a 分子机器【3 5 】：首先，基于d n a 自组装的原理构建一个 稳定的自组装结构；然后，加入目标物引发链置换反应或者改变其所处环境的条件( 如 p h 值或某种离子的浓度) ，该结构就会被激活。y u r k e 等【3 6 1 提出了d n a 纳米镊子的概念， 成功构建了一个以d n a 为“开关”的d n a 分子机器，如图1 5 所示。 a b 图1 5 基于d n a 自组装构建的纳米镊子【3 6 1 5 t。l。土 d n a 自组装增强信号的生物传感器研究 两条单链( b 和c ) 的一端区域分别与第三条单链( a ) 的各一半序列杂交，组成纳 米镊子的两臂；两条单链未配对的部分序列各自悬在臂的末端；此外，连接两臂的部分 通常会留出几个充当铰链作用的碱基以利于纳米镊子的打开和关闭动作。纳米镊子的开 关动作是指其两臂的张开和合拢，而悬在两臂末端的两段单链是纳米镊子产生开关动作 的控制部位，称为“门”链；它与控制该纳米镊子进行开关运动的“锁”链相对应。加 入“锁 链f ，因为f 与“门 链杂交，使纳米镊子两臂合拢( 图1 5b ) ，纳米镊子处于 关闭状态。“锁”链f 除了与“门 链上的碱基完全配对外，还有- d , 段未配对碱基序 列，称为“t o e h o l d ”区域，这是为了方便于“锁”链的去除。重新打开纳米镊子则是 硕士学位论文 子内结合力大于分子间结合力，两种信号分子以发夹形式存在，标记在两端的芘分子由 于相互远离而处于单倍体状态，荧光发射波长范围是3 7 5 一一3 9 8i l l l l | 加入目标d n a ，由 于目标d n a 与h 1 部分互补从而将h 1 的发夹结构打开，释放出能够与h 2 杂交的序列， h 2 的发夹结构打开的同时又会释放出能够与h 1 杂交的序列。如此反复，能形成如图 1 7 所示的d n a 自组装长链，此时芘分子由于距离拉近形成二聚体，其荧光发射光谱移 到4 8 5n l n 处。通过测定芘分子的荧光发射光谱的出峰位置与荧光强度实现对目标d n a 分子的检测。此外，由于芘分子的荧光寿命比实际样品的背景荧光寿命长1 0 倍，所以 该方法可检测实际样品中的d n a 。 图1 7 基于触发式d n a 自组装检测实际样品中的d n a t 弼1 ( 5 ) 超级“三明治 自组装结构 目前，“三明治”杂交模式是d n a 检测的主要方法【3 9 舶】。通常将一条与目标d n a 部分互补的序列修饰在表面上作为捕获探针，与目标d n a 另一部分互补的序列一端修饰 荧光染料【4 7 4 9 】或电活性物质【5 0 。5 4 】作为信号探针。该方法具有普遍性，不受序列限制。不 存在目标物时捕获探针和信号探针不杂交，所以背景信号低。但是，传统的“三明治 检测模式中一个目标d n a 分子只对应一个信号分子，灵敏度往往不高。通常引入纳米颗 粒【5 5 缶1 1 、酶 6 2 1 和超分子聚合【6 3 。6 5 】等进行放大。然而，这些方法往往需要耗费较长的时间 和多步反应( 如清洗或放大的步骤) ，以减少非特异性吸附所引起的假阳性信号。x i a l 2 4 等参照“三明治 杂交的模式，设计了一种基于d n a 自组装超级“三明治”结构的新型 的信号放大方法，与普通“三明治”方法相比其检测限降低了3 个数量级，低至o 1p m ， 原理如图1 8 所示。基于相似的原理，z h e n g 等t 6 6 】设计了一种不需要标记信号探针，利用 静电吸附在d n a 链上的钌胺的氧化还原信号，实现了对目标d n a 的检测。 7 孱罾 d n a 自组装增强信号的生物传感器研究 图1 8 基于超级三明治放大的电化学传感器1 2 4 1 2 2d n a 纳米颗粒复合自组装结构在分析检测中的应用 ( 1 ) d n a - 纳米金颗粒复合自组装结构 r o t h b e r g 等【6 7 j 最早提出s s d n a 可以通过静电吸附作用吸附在纳米金颗粒上。由于 s s d n a 柔韧性好，能自由伸展，使带负电的磷酸骨架远离纳米金颗粒，而碱基暴露出来 与纳米金颗粒通过范德华力组装在一起。双链d n a ( d s d n a ) 由于碱基互补配对形成双 螺旋结构，带负电的磷酸基团裸露在外面，与带负电的纳米金颗粒互相排斥，难以组装。 据此实现了d n a 的检测。z h a n g 等 6 8 】基于类似原理实现了可卡因的检测，如图1 9 所示。 当不存在可卡因时，s s d n a 与纳米金颗粒通过a u - n 的相互作用力组装成稳定的结构，保 护纳米金颗粒在高浓度盐溶液中不会发生团聚，溶液依然是红色。而当存在可卡因时， 由于两条s s d n a o 匕够与可卡因特异性结合，使得纳米金颗粒在高浓度盐溶液中发生团 聚，溶液由红色变成蓝色，在5m i n 内可实现对0 1p m 的可卡因可视化检测。 五。每浮妒刍笔 兰s a l t 繁 。圆l 瑶蹬豳k a 嗍- b1 胃“ 图1 9 基于核酸适体与纳米金颗粒聚集变色实现对可卡因的检测【6 8 】 8 戥 k爿?_，彰钦： ， = 。j _ p 、” 礴 妒、 矿 硕士学位论文 巯基修饰的d n a ( s h d n a ) 可以通过a u s 作用自组装到金或银基底上。本研究小 组【6 明基于d n a 与纳米金颗粒的自组装实现了对腺苷的检测，原理如图1 1 0 所示。腺苷的 核酸适体被裂开成探针1 ( d n a l ) 和探针2 ( d n a 2 ) 得到两种d n a 功能化纳米金颗粒。 加入目标物腺苷，这两种颗粒就会发生团聚，从而引起纳米金颗粒粒径的变化，检测限 低至7n m 。该方法只需要一步混合即可实现检测，简便、快速、灵敏度高、特异性好。 = = 粤默。- a 。； 删 a l m w al sj t u r j 誓 幽矿一 一 ，7 弋飞，卞、 、i 、 徵。缭獬 ，彩麓喾彩 耄一? 曳 酶7 镶碜瓣繇絮 薹。麓警墓 糍+ 镦一溉，。瀛、豁 ：，芸彩j 隧h 7 _ l ； 几 虬 肌 d n al5 - l l 釉c j j r 埔a c ct g gt ；ga g ta t - y d n a3矿棚s r f t _ ；a cg g g g aa c , g1 1 - 3 i d n a ，摹一h 岛c r t - r r g 州d 一_ 帅峰r 哪k a d e n i n e 图1 1 0 基于d n a 与纳米金颗粒自组装对腺苷的检测p j ( 2 ) d n a 纳米银颗粒复合自组装结构 基于类似的原理，l i 等【7 0 1 基于d n a 自组装的原理制备了聚集型银纳米颗粒，超高 灵敏地检测了目标d n a ，如图1 1 l 所示。 a 攀绷_ 矿。蛩善。_ ” 翰粼玉幽章删磷搿嚣嚣一磁菇滋落酱 图1 1 1 基于银纳米颗粒自组装聚集放大的超灵敏的d n a 电化学检测f 7 0 1 9 上 蓄二 雠 一 * h p _ 衡 一 僦 | | | ；| 一 幽 d n a 自组装增强信号的生物传感器研究 首先，修饰两种银纳米颗粒：c o n j u g a t e l 用a 1 5 与d - 船v 混合修饰，c o n j u g a t e 2 用t 1 5 修饰。然后，将两种颗粒混合得到聚集型银纳米颗粒。最后，通过三明治杂交的原理实 现了对多条序列的同时检测。值得一提的是，该方法先在溶液中组装出较大的颗粒，再 用来检测，检测限低至5a m ，比直接用银纳米颗粒检测的方法降低了3 个数量级。 1 2 3d n a 碳纳米材料复合自组装结构在分析检测中的应用 目前，碳纳米材料如碳纳米管( c a r b o nn a n o t u b e s ，c n t s ) 7 h ，石墨烯( g r a p h e n e ) 【7 2 1 ，碳纳米颗粒( c a r b o nn a n o p a r t i c l e s c n p s ) 7 3 】等，由于比表面积大，能加快电子传 递，生物相容性好，毒性低等优点备受关注。本节主要介绍d n a 与这三种碳纳米材料的 自组装在分析检测中的应用 由于c n t s 的氧化产物中含有大量的羧基、羟基和环氧键等活性基团，既提高了c n t s 水溶性又能增加其反应活性。s s d n a 能与c n t s 通过碱基与侧壁疏水作用和冗冗键堆积作 用使s s d n a 能稳定地吸附在c n t s 的表面，这不仅使c n t s 稳定的分散在水溶液中，同时 修饰在管壁上的s s d n a 还保持其生物活性 7 4 1 ；但是，由于d s d n a 中的碱基相互配对，因 此不能与c n t s 进行自组装。石墨烯和c n p s 也具有同样的特性。 z h u 掣7 5 】基于单壁碳纳米管( s w n t s ) 与s s d n a 间的自组装实现了对单线态氧( 1 0 2 ) 形成与否的调控，其原理如图1 1 2 所示。 a p 4 a m w - p h 舶o w l o l t t z o rl 磊n ：g a 丌璩瑚t t 稍婚晦 图1 1 2 基于s w n t s 和s s d n a 自组装调控单线态氧的生成【7 5 】 标记了二氢卟吩( c e 6 ) 的核酸适体可通过兀一7 c 键堆积作用组装在s w n t s 上。此时， s w n t s 能有效的猝灭c e 6 的荧光，在光照条件下，不能形成1 0 2 。当存在目标物时，s s d n a 与目标物结合，可从s w n t s 上脱离下来。此时可在光照条件下形成单线态氧，并用于光 动力学治疗。该方法简便、快速、通用性好。 h e 等1 7 6 j 利用s s d n a 与石墨烯的自组装实现了对多条d n a 序列的同时检测，如图 1 1 3 所示。三种信号探针分别标记荧光素( f l u o r e s c e i n ，f a m ) ，花菁染料( c y a n i n e5 ， c y 5 ) 及6 羧基一x 罗丹明( 6 一c a r b o x y l x r h o d a m i n e ，r o x ) ，并通过兀一兀键堆积作用组 装在石墨烯上，此时，三种染料的荧光被石墨烯高效猝灭。当存在目标物时，相应的信 号探针就会脱离石墨烯表面，所标记的荧光染料信号增强。从而，实现对多目标物的快 速、灵敏的检测。因为石墨烯对荧光染料的高猝灭效率有效提高了检测的灵敏度，检测 1 0 年 硕士学位论文 限为0 1n m ，比使用普通分子信标的方法降低了一个数量级。 徽graphene o x i d e 詈p 6 v i 一 孥尹仔b 曙n 争 ? 5 ；5 - f a m c a g a g g c a g l - a a c c a - 3 。 p 6 ：5 。一c y 5 c c c