（动物学专业论文）西施舌同工酶分析及消化酶活性的研究.pdf

内容提要以西施舌( c o e l o m a c t r aa n t q u a t as p e n g l e r ) 为研究时象，采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶不连续电泳对福建、江苏西施舌亲贝不同组织的同工酶表达进行生化遗传分析，并对福建鹾施舌幼体发_ 疔过程中同工酶的变化进行研究，以探求西施舌同工酶系统的遗传基础。此外，通过酶学分析方法研究了消化酶及超氧化物歧化酶在两海区西施舌亲贝组织器官中的分布及活性差异。通过本文的研究，希望可以为更加深入地进行西施舌的发育生物学、遗传学以及幼体发育变态过程中的营养生理学研究提供有价值的参数，同时也为国家“8 6 3 ”计划西施舌的大规模人工育苗中优质亲贝培育、生殖调控技术及病害预防等问题提供一定的理论依据。研究结果表明：不同性质的同工酶在西旋舌亲贝不同组织器官中的分布与其功能密切相关：两海区西施舌亲贝同工酶谱既有较大的一致性，同时也存在差异，但差异不显著：d 形幼虫后期和壳顶幼虫早期为西施舌幼体同工酶基因被激活的关键时期。晶杆是西施舌对淀粉和蛋白质的主要消化场所，而肠道和胃则是纤维素酶和脂肪酶的主要生成器官；福建西施舌亲贝胃、肠、晶杆的s o d 活性均远高于江苏西施舌亲贝，说明进行西施舌的大规模人工育苗应选用福建西施舌亲贝较好。关键词：西施舌同工酶消化酶组织特异性遗传变异a b s t r a c tt h eo b j e c t i v eo ft h i ss t u d yw a sc o e l o m a c t r aa n t i q u a t a 1 s o z y m e si nd i f f e r e n tt i s s u e so fc o e t o m a e t r aa n t i q u a t ai nf u j i a na n dj i a n g s uw e r es t u d i e db yv e r t i c a lp o l y a c r y l a m i d eg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i st e c h n i q u e ，a n dc h a n g e so fi s o z y m e sd u r i n gt h eo n t o g e n e f i cp e r i o d so fc o e l o m a c t r aa n t i q u a t ai nf u j i a nw e r ea l s oa n a l y z e d i nt h i ss e n s e ，g e n o t y p i em i l i e uo fi s o z y m e sw e r es t u d i e d b e s i d e s d i t i e r e n c eo fd i s t r i b u t i o na n da c t i v i t i e so fd i g e s t i v ee n z y m e sa n ds o di nd i f f e r e n td i g e s t i v eo r g a n so fc o e l o m a c t r aa n t i q u a t aw e r ec o m p a r e db ye n z y m o l o g ya n a l y s i sm e t h o d w eh o p et h a tt h er e s u l t sc o u l do f f e rr e a s o n sf o rs t u d i e so fb i o l o g yo fd e v e l o p m e n t 、g e n e t i c sa n dp h y s i o l o g yo fn u t r i t i o ni nt h eo n t o g e n e t i ep e r i o d so fc o e l o m a c t r aa n l 衄u a t aa n df o rb r e e d i n gp a r e n t sw i t hh i g h q u a l i t y 、r e g u l a t i o no f p r o c r e a t i o na n dp r e v e n t i o no fd a m a g eb yd i s e a s ei n “8 6 3 ”p r o j e c t ：( ( c o s m i c a l l yc u l t i v a t i o no fc o e l o m a c t r aa n t i q u a t a ) t h er e s u l t ss h o w e da sb e l o w ：d i s t r i b u t i o na n da c t i v i t i e so fd i f f e r e n ti s o z y m e si nd i l y e r e n tt i s s u e sw e r ed i f i e r e n t i a la n dr e l a t i v et ot h e i rf u n c t i o n s 1 、h ei s o z y m ez y m o g r a m so ft h et w op o p u l a t i o n sw e r ee i t h e rc o h e r e n to rd i f f e r e n t ，b u tt h ed i f f e r e n c ew a sn o tr e m a r k a b l e t h et u r n i n gp e r i o d st h a ti s o z y m eg e n e so fy o u n gc o e l o m a c t r aa n t i q u a t aw e r ea c t i v a t e dw e r el a t ei nv e l i g e r - s t a g ea n de a r l yi nu m b o s t a g e c r y s t a l l i n es t y l ew a sm a i no r g a ni nd i g e s t i n ga m y l u m sa n dp r o t e i n s ，a n di n t e s t i n e sm a ds t o m a c hw e r em a i no r g a ni nd i g e s t i n gf i b r i na n df a t a c t i v i t i e so fs o di ns t o m a c h 、i n t e s t i n e sa n dc r y s t a l l i n es t y l ei nc o e l o m a c l r aa n t i q u a t ai nf u j i a nw e r em u c hs t r o n g e rt h a nw h i c hi nc o e l o m a c t r aa n t i q u a t ai nj i a n g s u ，w h i c hs h o w e dt h a tt e m p o r a r yc a h i v a t i o no fc o e l o m a c t r aa n t i q u a t ap a r e n t si nf u ji a nw a se a s i e rt h a nt h a to fc o e l o m a c t r aa n t i q u a t ap a r e n t si nj i a n g s u ，s ow es h o u l dc h o o s ec o e l o m a e t r aa n t i q u a t ap a r e n t si nf u j i a nf o rc o s m i c a l l ya r t i f i c i a lc u l t i v a t i o n ，k e yw o r d s ：c o e l o m a c t r aa n t i q u a t a ，i s o z y m e ，d i g e s t i v ee n z y m e ，t i s s u es p e c i f i c i t y , g e n e t i cv a r i a t i o n i i致谢本文是在导师高如承副教授的悉心拍导下完成的。三年采，导师在我的学习和生活中给予我莫大的关心与帮助，特别是他严谨的治学态度和严寺律己、宽于待人的为人之道更使我受益匪浅。谨此之际，我衷心感谢导师多年末的关心与帮助，今后我会更加努力工诈以报答师恩。在研究工作结束之时我要特别感谢长乐市漳港海蚌场为我提供了反好的实验设备与昧境? 要感谢福建师范大学生物工程学院庄惠如教授，黄谚谚老师在研究过程中的指导及解答相关疑难问题? 要感谢骆轩同学、刘文彪同学、，罗彩林同学和黄振彬同学在研究过程中的帮助。最后，对三年采所有关心、支持和帮助过我的老师、同学和朋友致以衷心的感谢。王静2 57 47 2 0l 刖蟊1 1 概述西施舌( 图版i ) ( c o e l o m a c t r aa n i q u a 妇s p e n g l e r ，1 8 0 2 ) ，俗名“海蚌”，属于软体动物门( m o l l u s c a ) 、瓣鳃纲( l a l n e l l i b r a n c h i a ) 、帘蛤目( v o n o r o i d a ) 、蛤蜊科( m a c t r i d a e ) 、蛤蜊属( m a c t r a ) ，栖息在浅海沙滩内，属广温性种类，分布于太平洋西部、印度支那半岛、日本和中国沿海。据说，世界上有2 个国家出产的西施舌最为著名。一个是意大利，另一个就是中国。而在中国，只有福建省闽江口长乐梅花穿山行以南至文武沙一带，资源量最大，而且产品质量最优，被誉称为“闽江蚌”。因其肉质细嫩、味道鲜美，营养丰富，现已成为福建特优海珍贝类。据分析，西施舌肉中含有大量的蛋白质和脂肪及多种维生素等营养物质。对西施舌的蛋白质进行分析，得知里面含有十六种氨基酸，其中谷氨酸的含量很多，所以西施舌肉昧十分鲜美。同时，西施舌的十六种氨基酸中，有苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和异亮氨酸等六种是人体不能合成，而必须直接从食品当中获得的氨基酸，即：必需氨基酸。目前，已知人体必需氨基酸有八种，而西施舌所含的人体必需氨基酸多达六种，因此西施舌的营养价值很高，常被人们作为筵席佳肴。同时，西施舌也可作为滋阴降火，治疗肺病、糖尿病、肝热、耳呜等疾病的补品。但是长期以来，由于只捕不养，又有电拖网，酷渔滥捕，造成天然海区西施舌产量急剧下降，产品供不应求。在这种西施舌天然资源严重衰退的情况下，大力发展西施舌的人工养殖就显得尤为重要。为了保护和发展这种名贵海珍品资源，许多学者对西施舌生殖腺的发育和生态习性进行了仔细的观察研究。从五十年代开始，进行了人工催产、孵化和育苗实验，六十年代开始设立增殖场，八十年代福建省制定了资源保护条例，取得了初步成果，但进展不大。为此，九十年代农业部水产司再立了一个重点科研课题西施舌生活条件及增养殖技术研究。迄今为止，国外有关西施舌的报道很少。在国内，主要是西施舌的生物学观察及其人工育苗的研究。齐秋贞等系统地研究了西施舌自受精卵至幼虫、稚贝与幼苗整个生活史中各个发育阶段的形态变化及区别特征“1以及西施舌幼虫至幼贝器官的发生与形成的细微、渐变的全过程。1 ；刘德经等对西施舌的繁殖生物学”1 、诱导产卵“3 、人工育苗及稚贝培育技术晦7 3 1等进行了研究，并初步研究了西施舌胚胎发育生物学零点温度和有效积温。“”及西施舌幼贝的摄食与生长“川；高如承等“”研究了盐度对西施舌幼虫和贝苗生长发育的影响；饶小珍掣“1 对西施舌的核型进行了分析：陈寅山等“”研究了西施舌血清和肌肉提取液的凝集性能；陈素文等研究了氯化钾对西麓舌眼点幼虫变态的诱导效果”“及西施舌稚贝的附着基质“。目前，西施舌的大规模人工育苗已经成为国家“8 6 3 计划”重点研究课题，目标就是建立西施舌养殖苗种集约化全人工培育关键技术及相关辅助技术，实现西施舌的大规模人工育苗。其主要研究内容有：优质亲贝培育与生殖调控技术；西施舌幼体高效、规模化培育技术；西施舌幼体不同发育阶段的营养研究：西施舌稚、幼贝中间培育关键技术等等。l - 2同工酶技术原理及其应用现状1 2 1 同工酶技术概述1 9 5 7 年，h u n t e r 和m a r k e z 将蛋白质淀粉凝胶电泳技术与组织化学染色技术结合起来，创立了蛋白质( 同工酶) 电泳酶谱分析方法”。1 9 5 9年，m a r k e t 和m o l e t 用此法发现了乳酸脱氢酶具有多神形式“，从而产生了同工酶( i s o z y m e ) 的概念：同工酶是存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织，甚至同一组织或同一细胞中，催化同一种化学反应，但酶分子结构有所不同的一组酶。“，由染色体上不同的基因位点或同一位点的等位基因编码。“。从电泳酶谱的角度来讲，就是在凝胶上所看到的一组酶带，这是由于其结构中氨基酸序列或组成有差异，致使同工酶电泳时其迁移率也产生差异。1 9 6 6 年，h a r r i s 、h u b b y 和l e w o n t i n 等采用同工酶凝胶电泳技术对果蝇和人类遗传变异进行了深入的研究。2 23 。2 ”。1 9 6 9 年，p r a k a s h 等“”人从广义的“同工酶”概念中提出了一个新的概念：把同一基因位点的不同等位基因所编码的一种酶的不同形式日q 作“等位基因酶”( a 1 l o z y m e ) ，从此电泳酶谱就有了更准确的遗传学意义。酶作为基因编码的表达产物，根据中心法则，酶蛋白质中多肽链上的氨基酸顺序( 通过r n a ) 反映了d n a 链上碱基对的顺序，其变化( 异) 能很好地代表d n a 分子的变化( 异) ，表明等位基因和基因位点变化( 异)的存在。也就是说，电泳酶谱方法把宏观的遗传现象关联到微观的分子水平，从基因产物认识、研究基因的存在及表达，由生化表现型反映基因型，将基因、酶、性状与结构、功能、调控关系连在一起，因此，等位基因酶是遗传的生化指标或标记。同工酶几乎存在于所有生物中，根据同工酶的来源和结构的不同，从遗传学的角度可以将它分为四类：l _ 单基因决定的同工酶；2 多基因决定的同工酶：3 复等位基因决定的同工酶：4 修饰同工酶或次生同工酶。迄今为止，被详细研究的同工酶已经有几百种，具体运用于植物、动物、微生物、农业及医学等方面的已经有上百种之多，可以说，现在同工酶的研究已经成为细胞分化和形态遗传学的分子学基础中的重要内容。1 2 ，1 1 分离同工酶常用的屯泳技术同工酶的分离方法有电泳法、层析法、酶学法和免疫学法等，其中以电泳法应用最为普遍。因为酶的各种等位形式( 等位基因酶) 主要由他们的所带电荷差异，其次是它们具有不同的分子大小和性状显示出来，而电泳技术是分辨这种差异的极好的手段睇，2 “。我们知道，从等位基因酶特性的意义上看，酶谱是结构基因的产物，而调节基因贝0 是作为结构基因位点的开关。从结构基因所控制的产物产生与否，可以间接地觉察到这种调节活动。在某些生物，胚胎或幼体的结构基因产物仅仅在个体发育的某个关键时期产生，然后停止产生，而代之以成体的结构基因产物。成体的结构基因一旦打开，其产物将在其一生中连续不断地产生。在某些病理条件或恶劣的外部环境下结构基因产物也可能会减少，但是不会改变其电泳迁移率，因为这一变化是量的变化而不是质的变化，个体的某种基因产物的迁移率也不会随季节而改变。因此，从这一角度来看，电泳方法也是研究同工酶的较佳选择。1 2 1 1 1 淀粉凝胶电泳法这是最古老的电泳方法之，其优点在于便宜、无化学毒性物质，可以迅速筛分不同活性的酶，但其分辨率不高“。1 2 1 1 2 聚丙烯酰胺凝胶电泳( p a g e )此法在分离蛋白质和核酸上应用比较广泛。实践中都采用不连续电泳，即通过浓缩胶的收缩效应和分离效应，将同工酶分成一条条狭窄的曲带2 。1 2 l1 3 等电聚焦利用同工酶的等电点不同，在电泳支持物中加入两性电解质载体，因电场的作用，同工酶在p h 梯度凝胶中泳动，当迁移至其等电点的p h 处，则不再泳动，而浓缩成狭窄的曲带渊。这种方法分辨率很高。但该法得到的同工酶常常失活。1 _ 2 1 1 4 双向电泳利用蛋白质或酶样品中不同组分等电点差异，进行第一向分离，然后纵向切割以垂直于第一向的方向进行第二向电泳，从而使不同分子量的蛋白质或酶样品进一步分离。此法分辨率高于各种单向电泳，但同工酶易失活，特别是碱性同工酶的分析，应该采用其它技术方法“。l i2 1 2 同工酶的染色同工酶的染色方法有原染色法、荧光染色法、放射染色法、电子传递染色法和酶连锁染色法等。后三种较为常用，其中以电子传递染色法最为常用。染色的原理。”是利用酶活性的特异性，在染色液中加入底物和酶活性所需的因子，通过酶促反应生成有色物，显示酶带，以便观察和记录结果。1 2 2同工酶技术的研究及应用在生物进化过程中，同工酶是为了适应细胞代谢的多方面要求而形成的，常常越是关键的代谢调控酶或与外界环境密切相关的酶，同工酶就越普遍，分子类型也越多。不同的个体、组织器官、发育阶段与外界环境都可能产生同工酶的差异，因此，同工酶的功能在生理上就表现为对代谢的调节作用。从分子遗传的角度来看，同工酶分子的基因编码、调控与基因活动的差异反映了基因型与表现型的相互关系，而且当一种酶同时受几个基因控制时，会更容易适应环境的变化，因为当一个基因由于突变而无用时，其它基因的存在仍然可以产生类似作用的同工酶，从而有助于机体适应突变的不利后果。b u t h 等啪1 认为，同工酶的研究应包括控制一个同工酶系统的基因数，种内、种问特异性，组织特异性基因表达，发育中表达，翻译后修饰等方面。至今，同工酶已广泛应用于种群遗传多样性、分子进化、种质鉴定及分子系统分类等方面的研究，这些研究在种间杂交及品种改良等生产实践中均有重要意义。近年来，不少国外学者在双壳类动物中也展开了这方面的研究m 1 。1 2 2 1同工酶在动物分类学中的应用传统的形态学方法是大多数动物分类学家采用的主要方法。随着研究的深入，分类学家们逐渐遇到了许多传统方法无法解决的问题，因为很多e物种单单从形态上根本无法进行区分。而同工酶是由等位基因或不同基因位点基因所决定的，其电泳谱带的相似性从一定程度上反映了物种遗传上的相近性。在同一种的范围内，各种群间具有高度的生化相似性，研究表明：单个种群包含很多存在于这个种之中的共同的遗传信息。同种种群间遗传变异的最大贡献来自多态位点上等位基因频率的差异。因此，多态位点的研究很可能会成为种下亚分类的依据。“。q u a r z a u 等。”运用同工酶技术对葡萄牙相近的两个蝉种进行分类学分离，检测了1 9 个同工酶位点，显示了这两个种群间的遗传差异，从而有力地证明了他们是属于两个独立的生物物种。a s t o r g a 等。”对日本海t j a p o m i c u 和智利ts g m m e t r i c u s 这两种蟹的1 5 种同工酶的2 4 个位点进行了分析，发现其中有5 个位点不同，基因相同率为0 7 9 2 ，说明它们在亚种水平上存在区别。王志铮等。4 3 对中国栉孔扇贝和日本栉孔扇贝两个自然种群的6 种同工酶也进行了研究，得到了基本酶谱。对其进行生化遗传分析，共记录了1 8 个座位2 8 个等位基因，并对其差异进行了比较和讨论。两种群各自具有种群内的个体差异，有主特征谱带，可将其作为栉孔扇贝亚种间差异的一种分子标记。刘必谦等姐”利用同工酶技术和r a p d 技术澄清了牡蛎等一些贝类的分类问题。可见，在使用同工酶进行物种分类时，结合r a p d 等现代分子生物学检测方法还可以使分类更确切可靠。由以上分析可以看出，同工酶电泳技术与单纯的形态学分类相比，可以大大提高分类的准确性。因为物种种间乃至种内的区别，从本质上说就是基因的差别，表型只表示其外在的、表面性的特征，而同工酶是由于基因的不同表达而形成的一组功能相似的蛋白质，对同工酶进行分析可以更直接地揭示不同物种内在的差别，以及进化上的相关性。因此，同工酶技术弥补了传统方法在种下亚分类方面的缺陷，并且能成功地区分形态上十6分接近的近缘种；同时还能精确地阐明种以下各类群间、种间甚至属间的遗传分化程度，从而使分类的科学性和准确性大大提高。1 2 2 2同工酶在发育遗传学研究中的应用同工酶作为基因表达的直接或间接产物，直接参与生物体的各种代谢途径，它们的丰富程度直接影响生物体的机能和对环境的适应能力。许多学者的研究发现：个体发育期间同工酶表达中出现的酶带数和活性变化是与形态和生理变化相伴发生的，与细胞组织器官分化相关。那些突然变化的同工酶很可能反映了特定形态结构和生理功能的出现，这种变化在胚胎发育时期表现极为显著。“。胚胎发育早期的蛋白质合成完全是利用卵子发生过程中从母体得来的m r n a ，所以胚胎早期发育过程中的重要蛋白质( 包括同工酶) 基本是由母体m r n a 指导合成并保持恒定或缓慢下降。”，其后，随着胚胎发育到一定时期，这些同工酶逐渐被新合成的酶分子所代替。m o r g a n 等汹1 分析了哈氏扇蟹6 个发育时期的6 种同工酶，得出了不同发育阶段同工酶谱有着明显的差异。张志峰等。”研究了中国对虾幼体发育阶段8 种同工酶的变化。结果表明：有6 种同工酶均随发育其酶谱表现出明显的差异。李广丽等“们对罗氏沼虾个体发育早期的同工酶研究表明，随着个体逐渐发育成熟，其酶谱表现出明显差异，而且酶谱渐趋复杂。卢建平等“也对罗氏沼虾发育过程中同工酶的变化进行了分析。结果表明，5 种同工酶均有明显的变化，而且随着胚胎的发育，酶活性也随之增加，膜内蚤状幼体初期为胚胎同工酶基因被激活的关键时期，而且e s t 酶谱的变化过程同卵黄的消化过程有关。吴力钊等“2 1 对草鱼早期发育过程中的l d h 、m d h 、g d h 、a d h 、z d h 、e s t进行了研究。发现除了a d h 以外，其余5 种同工酶系统在早期发育过程中均发生了变化，从而将草鱼的同工酶分成了3 大类。一类是管家酶，在未7受精卵及整个早期发育过程中都有活性，且常具有较广泛的分布；一类在未受精卵与早期发育中都没出现，只随特定组织分化而出现，可能与其特殊代谢功能有关；另一类在未受精卵及早期发育中都不出现，只在少数成体组织中出现，分析可能与所分布组织的功能相关。刘艳等。6 1 对3 月龄栉孔扇贝稚贝同工酶进行了生化遗传分析，李太武等“”研究了亲本栉孑l 扇贝野生种群的同工酶。结果发现，3 月龄稚贝已经存在较完善的酶系统，能够完成基本的新陈代谢活动；但与成贝相比，稚贝各酶的位点数和等位基因数都比较少，多样性也较低。即表型相近，但有一定差异，无论在位点表达上还是在等位基因的数量上都表现出同一个趋势，即它们只拥有亲本的部分条带，也即亲代群体的酶谱远丰富于子代个体的。同时，亲代群体的遗传变异指数也高于子代群体的。这也是与其发育阶段、生活环境和新陈代谢水平相适应的。目前，关于双壳类同工酶的组织特异性也有很多研究。李广丽等“”研究了马氏珠母贝8 种组织7 种同工酶的酶谱表型。结果表明，在马氏珠母贝的8 种组织中，已经存在相当丰富和完整的酶系统，它们不仅以同工酶的形式参与代谢和调节，而且在表型、分布和活性上均表现出高度的组织特异性。综上所述，同工酶的谱带变化( 即亚基的出现消失) 与动物胚胎发育过程中有着很多的相关，很可能是内在基因调控机制起着关键的作用。同工酶在各种生物的不同发育阶段往往表现出亚型上的不同及同一亚型含量上的增减，这主要是因为随着生物体的发育，其体内新陈代谢及其所生活的环境都或多或少地发生变化，为了适应这些变化，在长期的进化中生物形成了一种普遍的适应形式，即通过改变体内同工酶的亚型种类及含量来调节各种生化反应，从而维持细胞乃至生物体的生命周期。1 2 2 3 同工酶与基因遗传研究的关系生物在漫长的系统发育历程中，基因也在不断地进化与变异。基因最s初来自一个“祖先基因”，经过突变与积累，或由于突变与自然选择，基因调控发生了改变，亚基的核苷酸序列发生了变异，复制成另一个基因。基因调控使基因或在有利条件下开放，不利时关闭；或必需的基因开放，不必需的基因关闭；或由其他原因引起开放与关闭。关闭的基因停止合成相应的蛋白质，在酶电泳凝胶上由此基因编码的酶带就不出现。不表达的基因开始出现于个别的个体，而后扩大到种群，最后固定在一个种内 4 5 3o运用同工酶进行各种生化遗传分析，主要内容有：被分析的同工酶是几聚体，有几个基因座位编码，单态或多态，有几个等位基因等等“。7 0 年代初，f r i t z 等1 提出，l d h 同工酶表达的调控过程是十分复杂的，主要涉及到l d h 的a 、b 亚基的合成，亚基合成四聚体后，在各四聚体之间还有亚基的交换，a 、b 亚基的降解及各四聚体的降解。此外，同工酶技术还可以用于养殖贝类种群的数量分析：1 种群分类及亲缘关系的判断；2 群体遗传变异及近交程度的检测；3 杂种优势的预测：4 放流苗种对自然种群遗传结构影响程度的估测等等。目前，对牡蛎“侧、皱纹盘鲍、海湾扇贝“”、虾夷扇贝“”等一些主要经济贝类的自然群体和养殖群体的遗传背景也都有一定的研究。刘仁沿等。2 1 对菲律宾蛤仔五个群体的十几种同工酶作了初步分析和研究，结果表明，菲律宾蛤仔的同工酶电泳具有明显的地理群体特异性。如今，同工酶分析技术已广泛应用于分子遗传、种群遗传、系统进化、个体发育、杂交育种、病理生理及环境保护等方面“刚。随着现代分子生物学技术的发展，同工酶的研究也逐渐与现代分子生物学相结合，以便对同工酶表型变化及其内在的基因机制进行进一步的揭示。至今，在生物体中有同工酶存在的机理还不完全清楚，但根据现有的实验资料分析，可以认为生物体为了适应自然选择的需要，基因发生了突变，使机体合成了与原始酶分子不同的突变型酶分子。这些酶分子对底物、抑制剂、活化剂和激素等因素的敏感性不同，有利于机体进行复杂的代谢调节，使机体能更好地适应环境的变化。1 3 动物消化酶及超氧化物歧化酶的研究与应用酶是催化生物化学反应的一类特殊的蛋白质，生物体中的化学反应很少是在没有催化剂的情况下进行的。酶的突出特征是它们的高度催化能力和专一性，而且酶的活性可以被调节，与不同能量形式的转化密切相关。总之，酶在生物体内起着非常独特和关键的作用。消化酶是酶的一种，具有酶的所有特征，主要是消化腺和消化系统分泌的营消化作用的酶类。在消化酶中，又依消化对象的不同而大致可划分为淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶和蛋白酶等几种。动物消化酶活性的高低直接影响着动物对营养物质的吸收利用程度。“，因此，对消化酶活性的研究是了解动物消化生理的重要内容之一，而且对贝类养殖过程中饵料的应用更是具有重要意义。目前，国际上对脊椎动物，特别哺乳动物的消化酶已经研究得比较清楚，无脊椎动物消化酶的研究却比较少，但是，关于水产动物消化酶的研究，国内外很早就有报道了。从种类上来看，以鱼类、甲壳类和棘皮动物等的研究较多。1 3 1 鱼类消化酶的研究目前，对鱼类消化酶的研究主要有以下几个方面：鱼类食性与消化酶的关系“7 1 5 ；季节变化与鱼类消化酶的关系”：鱼类消化酶酶促反应与酶动力学等方面的研究“；天然饵料中的消化酶及外源消化酶在鱼类消化过程中的作用“1 ；鱼类胚后发育阶段消化酶的发生和演变“”以及消化酶在鱼类体内的分布状况的研究“6 1 等等。1 3 2甲壳类消化酶的研究甲壳类消化酶的研究也有以下几个方面：消化酶种类及其性质、活性大小的研究”“；个体发育不同阶段酶活性的变化。”：饵料因素对消化酶活1 0性的影响”“1 等等。1 3 3 棘皮动物消化酶的研究棘皮动物中的海胆一直是用来研究受精和胚胎发育的好材料，因此，关于海胆与其相关的研究也比较多，而且开始得也较早。关于海胆消化酶的研究也是结合其生长发育进行的。如v i c t o r 等“研究了海胆q 一淀粉酶的活性，指出它随着海胆长腕幼体的肠分化过程而出现，并且与0 一l 、3一葡聚糖酶同步增加，这种q 一淀粉酶还兼有麦芽糖酶的作用，同时还证明了海胆幼体阶段的a 一淀粉酶和海胆成体的0 一淀粉酶具有不同的最适p h 值范围，进而判断这两种酶是不同的两种蛋白质。同年，v i c t o r等【”1 还对海胆长腕幼体肠分化阶段b 一1 、3 葡聚糖酶的发生和活性大小进行了探讨和测定。1 3 4 软体动物消化酶的研究关于海洋软体动物消化酶的研究工作，早在本世纪初就有。国外如1 9 0 0 年c o u p i n 从鸟蛤( c a r d i l i as p ) 的晶杆中发现了消化酶。之后便是c o u p i n 、m i t a 、v a nr y n b e r k 、o a k i n 、y o u r e 等人先后从拟心蛤( c a r d i l i a ) 、背角无齿蚌( a n o d o n t aw o o d i e n a ) 、贻贝、扇贝、沙海螂、鲍、挫石鳖( l i s c h n o c h i t c o ns p ) 等种类的某些消化器官中分析出了消化酶”。牡蛎消化酶的研究最多也最为详细，通过对花缘牡蛎( 治抛印) 和食用牡蛎( o s t r e ae d u l i s ) 的消化盲囊进行分析，得知其中的酶类大致分三类：即碳水化合物分解酶、脂肪分解酶和蛋白分解酶。“；甚至针对其消化器官中存在的吞噬细胞( 一种变形细胞) 中的消化酶也进行了研究。但是，所有这些均是一种确定种类的分析，没有进一步对其性质等进行分析。现在，随着水产养殖业的迅速发展，不少学者对不同软体动物的消化酶进行了研究。如刘万顺等”研究了紫贻贝( m y t i l u se d u i i s ) 和短滨螺( l i t t o r j a ab r e v i c a t a ) 的消化酶活性；朱仁华”对花冠小月螺( l u n e j i al ic o r n a t a ) 、单齿螺( m o n o d o n t a a b i o ) 和疣荔枝螺( t h a i sc l a v i g e r a ) 的消化酶性质及应用进行了研究，小玉修嗣等。”对柔鱼( t o d a r o d e s p a c i ，j x -a s ) 的胰凝胶蛋白酶进行了研究。总之，目前对于软体动物消化酶的研究主要集中在两大方面：一是定性地分析某组织器官中某些酶类的存在，以此来阐明与消化生理的关系；二是将消化酶作为工具酶的多方面应用”。综上所述，有关水产动物消化酶的研究已经取得了不少的成绩。通过这些研究，可以优化永产养殖业中的饵料问题，如消化能力的大小、饵料需求及配比、消化酶对饵料的适应等，人工饵料的优化会给水产养殖业开创一个完全崭新的局面，这也是消化酶研究的实践意义所在。当然，目前水产动物消化酶的研究仍有很大的空白，如消化酶的种类分析、分泌、贮存机制，对饵料的适应程度、活性的变化因素等。因此，消化酶的研究前景还是相当广阔的。1 3 5 超氧化物歧化酶的研究及应用在自然条件下，贝类和其他水生生物一样，在其生活环境中存在大量不同种类的病原生物。但在一般情况下，并不是所有的这些病原生物都感染贝类并对其造成危害，这主要是因为贝类具有一套比较完善的防御系统，能够抵御外来病原生物的侵扰，使其免受感染。甲壳动物没有特异性免疫，对进入体内异物最主要的防御方式是血淋巴的吞噬作用”“。在吞噬过程中伴随大量活性物质的产生与释放，其中最主要的是氧自由基。苏建国等“”的研究结果表明：在氧供应不足或吞噬细胞被激活等情况下，产生大量的自由基，其中最主要的是超氧阴离子自由基。而超氧化物歧化酶能特异性地清除超氧阴离子自由基。当超氧阴离子自由基超出体内抗氧化酶的清除能力时，引起脂质过氧化链式反应，导致生物膜及微循环严重损伤，甚至崩溃，自由基及其产物使多糖聚解，不饱和脂肪酸过氧化，蛋白交联。r n a 、d n a 断裂、突变等。因此，超氧化物歧化酶( s o d ) 是广泛存在于需氧和耐氧生物体各组织中的一种重要的抗氧化酶，在免疫方面发挥着重要作用。有关海洋双壳类超氧化物歧化酶的研究，国外有少量的工作m 1 。国内主要是对栉孔扇贝。”、毛蚶”“、缢蛏等有这方面的研究，而有关西施舌该方面的研究，国内外均来见报道。2 本文研究目的、内容及意义海洋无脊椎动物是分布较广、种类较多的海洋生物，也是海洋生物资源最重要的组成部分。尤其是海洋软体动物，是海水养殖的主要种类，如牡蛎、扇贝、鲍等。贝类与鱼类相比，运动能力差，医地理隔离和生殖隔离造成的遗传积累以及人工选择和近交导致的遗传漂变，使贝类常常形成一些地方种群，从分子水平研究这些群体的遗传结构，对种的保护很有意义。目前，种质衰退是我国养殖贝类普遍存在的问题9 。我国贝类养殖基本采用工厂化人工苗种生产。大部分茁种是由有限繁育群体产生的，存在着不同程度的近交现象而导致近交衰退；遗传瓶颈和遗传漂变使养殖种类基因库损失大量的遗传变异”；加上大面积高密度养殖超出养殖容量，造成海区水体生态环境恶化，导致养殖群体种质质量下降，而出现生长速度减慢，商品贝体型变小，肉柱得率下降，易发生疾病等现象“”。然而，我国贝类种质资源的研究却十分滞后，与高速发展的养殖业相比，种质资源研究暴露出了更多的问题和差距，主要表现在：大多数养殖贝类遗传背景不清，生物多样性研究十分缺乏，一些主要养殖贝类在分类上尚存争议；主要养殖种类仍然是未经选育的野生种，人工选育良种基本没有等等。近年来，各种污染及海洋贝类本身的退化，更使得贝类养殖前景愈来愈不乐观，因此，探讨贝类对其生活环境中生态因素的适应和调整的遗传机制，为防止病害发生及选育优良品种提供遗传生化指标也是十分必要的。而同工酶作为一种分子标记技术，它与生物体内的生理变化、遗传特性及生长发育又有着明显的关系，是生化生态遗传学研究中最常用的方法。迄今为止，被详细研究的同工酶已有几百种，但在贝类学方面的应用还不很广泛，而对于西施舌则还没有这方面的报道。本文研究了福建与江苏两海区西施舌亲贝八种组织的八种同工酶( 乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、葡萄糖一6 一磷酸脱氢酶、醇脱氢酶、酯酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶以及超氧化物歧化酶) 的表达中出现的酶谱和酶活性的差异，探讨其同工酶系统的遗传基础，并对福建西施舌幼体发育过程中八种同工酶的变化进行了分析，从而为更加深入地进行西旌舌的发育生物学、遗传学以及幼体发育变态过程中的营养生理学研究提供有价值的参数，同时也为国家“8 6 3 ”计划西施舌的大规模人工育苗中优质亲贝培育与生殖调控技术及西施舌幼体不同发育阶段的营养研究等提供一定的理论依据。西施舌( c o e o m a c t r aa n t q u a t a ) 是我国重要的海珍贝类之一。目前，关于它的消化酶性质方面的研究工作还未见报道。本文研究了福建、江苏西施舌亲贝四种消化酶( 淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶和胃蛋白酶) 及超氧化物歧化酶在其组织器官中的分布和活性，以期对西施舌的消化和营养生理及其免疫机制做进一步的了解。营养生理是研究动物的营养需求、开发人工饲料的基础，通过本研究希望可以为西施舌的大规模人工育苗中优质亲贝培育解决一定的饵料及病害预防问题。3 材料与方法3 1西施舌同工酶的研究3 1 1 实验材料来源亲贝的获得：实验所用西施舌亲贝分别购自福建长乐漳港及江苏沿海。规格见表l 、表2 。福建西旅舌发育过程中各期幼虫及稚贝的获得：将西施舌亲贝人工解剖，取其精、卵进行人工授精( 或将西施舌亲贝阴干1 2 小时后进行流水刺激，使其自然排放精、卵) ，取受精卵进行人工培养，获得各期幼虫( 如卞) 。a 担轮幼虫：本文所取西施舌担轮幼虫大部分为后期担轮幼虫( 见图版i i - 1 ) 。此对期胚体下端的胚壳捧托着软体部，仍无法完全包裹软体部，胚壳内侧出现外套腔，随之逐步形成幼虫肌与外套膜。b d 形幼虫：又名面盘幼虫、直线铰合幼虫( 见图版i i 一2 ) 。此时期两壳瓣形成，可包裹整个软体部，两壳背部成直线铰合，壳形似“d ”字，故名“d 形幼虫”。规格见表3 。c 壳顶幼虫：本文所取西施舌壳顶幼虫大部分为后期壳顶幼虫( 见图版i i 一3 ) 。此时期壳顶突出铰合线，壳形略呈三角的卵圆形，出现管状而弯曲的雏形鳃，面盘发达，仍为唯一运动器官。足棒状不能爬行，一对暗灰色的眼点出现于足的基部。规格见表4 。d 稚贝：见图版i i - 4 。此时期面盘逐渐萎缩，浮游能力亦减弱，主要营附着生活。足较粗，呈斧形或棒状，可在基质上匍匐爬行，这是与壳项幼虫后期的主要区别。鳃丝内侧有纤毛作定向划动。规格见表5 。表1福建西施舌亲贝规格t a b l e1s p e c i f i c a t i o no fc o e l o m a c t r a 口甩嘶u a t ai nf u j i a n表2江苏西施舌亲贝规格t a b l e2s p e c i f i c a t i o no fc o e l o m a c t r aa n a q u a t ai nj i a n g s u编壳长( 0 ，1号c m )壳高体重编壳长( o 。1f 0 0 3( o 1c m )g )号c m )壳高( o 。1c mj体重( o 0 3g )6 97 36 g7 46 86 46 57 67 85 45 z5 36 25 45 25 45 85 95 8 3 24 2 3 85 4 8 26 4 3 25 6 3 94 8 5 35 1 2 66 2 3 l6 5 0 66 47 25 86 36 25 96 76 46 。65 o5 84 94 84 55 25 45 05 。34 8 5 65 8 2 54 1 2 34 6 7 34 2 5 64 5 2 l5 2 3 84 6 1 54 8 2 51 08 06 27 9 3 62 07 25 45 4 6 31 6n 把坞m坫埔埔碍123456789表3d 形幼虫规格t a b l e3s p e c i f i c a t i o no f v e l i g e r - - s t a g el a r v a e表4 壳顶幼虫规格t a b l e4s p e c i f i c a t i o no f u m b o - - s t a g el a r v a e0 2 2 00 1 8 00 1 6 00 1 7 00 1 6 00 1 6 50 1 8 50 1 7 50 1 8 50 1 7 00 1 7 00 1 5 00 1 5 00 1 7 00 1 6 50 1 6 00 1 6 00 1 7 50 1 6 00 1 6 00 ，1 7 50 1 7 50 1 7 00 1 6 50 ，1 7 50 1 5 00 1 6 50 1 4 50 1 5 00 1 6 00 1 6 00 1 5 00 1 5 00 1 6 50 1 4 00 1 5 01 00 1 4 0o 1 2 02 0o ，1 2 00 i i 01 7儿地nm 坫埔”均表5西施舌稚贝规格t a b l e5s p e c i f i c a t i o no fj u v e n i l ec l a mrc o e l o m a c t r a 积蜘u a t a3 1 2 样品制备测量西旖舌亲贝壳长、壳高，并称重。将西施舌亲贝进行活体解剖，取8 种组织( 水管、鳃、闭壳肌、外套膜、斧足、唇瓣、肝脏、心脏) 及性腺( 精巢、卵巢) 。人工受精后，取发育期的担轮幼虫、d 形幼虫、壳顶幼虫及稚贝，测壳长、壳高。取上述8 种组织、性腺、各期幼虫及稚贝，按1 ：2 ( w v ) 比例加入0 0 1 m 磷酸缓冲液( p h7 4 ) ，用玻璃匀浆器置冰浴中匀浆。匀浆液在4 下以1 2 0 0 0 r m i n 离心3 0 m i n ( 肝脏离心2 次) 。取上清液立即进行电泳或于一2 0 冰箱中保存备用。3 1 3电泳、染色采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板不连续电泳，点样后于4 冰箱中进行电泳。电泳所用浓缩胶为3 6 ，分离胶为8 2 。浓缩胶的凝胶缓冲液为t r i s i h c ( p h6 7 ) ：分离胶的凝胶缓冲液为t r i s h c l ( p h8 9 ) ；电极缓冲液为t r i s - - g y ( p h8 3 ) 。电泳时，先用8 0 v 稳压，当样品进入分离胶接口时改用2 0 0 v 稳压，电泳约4 小时左右。电泳时每样品的加样量为3 0 儿，每一种酶重复电泳3 4 次，耿重复性好、酶带清晰的酶谱进行分析。凝胶取出后，在特定的酶染色液中恒温染色瞎帅5 “岵栅“，染色后的凝胶用双蒸水漂洗2 次，用7 醋酸固定。3 1 4 结果记录与分析3 1 _ 4 1 凝胶处理固定后的胶片先拍照，再计算相对迁移率( r f = d l ，d 为酶带迁移距离；1 为指示剂迁移距离) ，然后制成干片并拍照。注：测量迁移率时，在电泳结束后要先在指示刑移动的位置( 前沿) 作一标记( 通常是插一根短铜丝) ，然后用游标卡尺测量( 以酶带的中部位置为准) 3 1 4 2 酶谱记录参考胡能书等嘞1 的方法( 稍有改动) ，对较为复杂的同工酶酶谱绘制酶谱示意图。图中一示酶带色深( 活性强) ；口示酶带色稍浅；! = _ 示酶带色极浅；f - 5 示扩散带。本文一般只对酶带_ 和p - n 进行酶谱分析，而酶带z j _ 和；2 7 3 视电泳结果一般不参与酶谱分析。3 i 4 3 基因座位判读与等位基因确定本文以已报道的酶蛋白亚基构成为依据，参照熊全沫( 1 9 9 2 ) 鱼类同工酶谱分析。3 圳的方法进行酶谱分析。基因座位的命名用该同工酶英文名称缩写字母的小写( 字头大写) 表示，用阿拉伯数字表示座位序号，把最近阳极的位点标为“一1 ”，次近阳极的位点标为“一2 ”，以此类推。1 9根据酶带迁移率确定支配基因座位的等位基因数，按迁移率大小用英文字母大写命名等位基因，如支配l d h 一1 座位的3 个等位基因分别命名为a 、b 、c 。3 1 4 4 遗传学计算计算多态位点百分数( p ) ：p = ( k n ) 1 0 0 ，其中k 为多态位点的数目，r l 为所测定酶位点的总数。多态座位的判断按n e i 氏( 1 9 7 5 ) ：绝大多数等位基因的频率小于或等于0 9 9 ，即居群中某位点有2 个以上等位基因时，不常见等位基因出现的频率之和在o o l 以上时，即为多态位点，。否则即为单态的。计算酶谱相似