（发育生物学专业论文）转录因子couptfii对端粒酶催化亚基htert转录调控的作用及意义.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人 承担。 论文作者签名：至堡 e t期：! ! ! 堡i 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅 和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：王巍导师签名：逊l 盏日期：墨丝丝丝受 生查盔兰兰主鲎垡至塞一一一 转录因子c o u p t f ii 对端粒酶催化亚基 h t e r t 转录调控的作用及意义 摘要 端粒酶通过催化端粒合成，保持端粒长度，从而保证细胞的持续分裂能 力，其活性与细胞永生化、肿瘤发生等过程密切相关。各种生物中端粒酶均 至少由三个单位构成，即r n a 模板t r 、逆转录催化亚单位t e r t 和相关蛋白 t l p 等。人端粒酶逆转录催化亚单位h t e r t 的m r n a 表达水平与端粒酶的活性 有非常明显的一致性，表明h t e r t 的转录调控是端粒酶活性调节中的限速步 骤。h t e r t 的启动子已经被克隆，其主要调节区为结构简单的看家基因类启 动子：无典型的t a t a - b o x 结构，富含g c ，具有多个s d i 结合位点。近年来 已经发现了很多参与h t e r t 转录调节的相关因子，其中对c m y c 的研究最为 充分，s p l 和雌激素也有所涉及。另外，p 5 3 、w t i 、m z f - 2 和m a d 是已知的 对h t e r t 的转录起抑制作用的因子。但是，肿瘤细胞中h t e r t 基因表达的详 细情形仍不明了。为了分离和克隆参与h t e r t 转录调控的转录园子，分析其调 控的分子机制，并鉴定其对h e l a 细胞端粒酶活性的生物学效应，本研究进行了 下列实验： l 、参与端粒酶催化亚基h t e r t 转录调控的转录因子的分离和克隆 提取h o l a 细胞基因组为模板，p e r 扩增合成h t e r t 基因核心启动子6 3 0 片 断，并将其作为诱饵重组到酵母质粒报告基因的上游。h e l a 细胞e d n a 表达文库 转化双重报告酵母菌株，于选择培养条件下筛选出阳性克隆，回收阳性克隆的酵 母质粒，进一步进行b 一半乳糖菅酶活性测定。共有1 8 个酵母克隆能在较短时间 内使底物变蓝，显示出较高的半乳糖苷酶活性。提取其质粒并测序，测序结果在 g e n b a n kb l a s t 进行同源性分析，其中第1 8 号酵母质粒，含有c o u p _ t f i i 全长 e d n a 。 2 、c o u p - t f i i 融合蛋白的原核表达和纯化 构建含c o u p t f i i 全长e d n a 的c 0 u p t f i i p e k - 3 1 8 原核表达重组质粒，将 山东大学博士学位论文 其转化大肠杆菌x l l - b l u e 。i p t g 诱导表达h i s t a gc o u p t f i i 融合蛋白，并经 s d s p a g e 和w e s t e r nb l o t 印迹鉴定。在变性条件下亲和层析纯化c o u p t f i i 融合蛋白，其纯度高于9 8 。纯化的蛋白经透析复性并浓缩至2 0 0 ug m l 。 3 、c o u p t f i i 融合蛋白与h t e r t 基因启动子的相互作用 通过凝胶迁移阻滞实验进一步证实，c o u p t f i i 融合蛋白可以与h t e r t 启动 子一2 0 l + 3 5 区段相结合。随后的f o o t p r i n t 实验表明，c o u p - t f i i 有a 、b 、c 三个结合位点分布在- - 6 6 一2 4 之间：a ： 一6 4t o 一5 3 ( 5 一g 8 礁嘲g g c a 一3 ) ； b ：一5 0t o 一4 2 ( 5 一g c t g c g t c c 一3 ) ：c ：3 8t o 一2 6 ( 5 一t g c g c a c g t g g g a 一3 ) 。其中c 位点包含一个e - b o x 元件。结合位点突变和缺失实验进一步证 实c o u p t f i i 与e - b o x 的结合。最后，通过p u l l - d o w n 下拉实验，分离到了两种 和c o u p t f i i 相互作用的蛋白p 1 和p 2 。经l c e s im s m s 质谱分析，并在n c b i n r 数据库中搜寻，p 1 是神经降压肽受体( n e u r o t e n s i nr e c e p t o r ) 的同源蛋白， p 2 和c h r o m o d o m a i nh e l i c a s ed n ab i n d i n gp r o t e i n3i n t e r a c t i n gp r o t e i n 匹 配度非常高。 四、c o u p - t f i i 在h e l a 细胞中对h t e r t 转录调控的影响 首先构建c o u p - t f i i 正义及反义真核表达质粒s - c o u p - t f i i p c d n a 3 和 a s c o u p t f i i p c d n a 3 。荧光酶报告基因检测表明，异位表达c o u p - t f i i 基因能 够抑制h t e r t 启动子的活性，降低h e l a 细胞中荧光酶的表达水平。而且， h e l a 中共转染c - m y c 可以逆转c o u p t f i i 对h t e r t 启动子活性的抑制。h e l a 细胞转染c o u p t f i i 正反义质粒，g 4 1 8 筛选得到稳定单克隆细胞株。 n o r t h e r nb l o t 表明，h e l a 中异位表达c o u p t f i i 基因，可以抑制h t e r t 的转 录：而且，用反义技术“封闭”c o u p t f i i 的表达，h t e r tm r n a 表达水平有所 提高。t r a p p c re l i s a 提示c o u p t f i i 对h e l a 细胞内源端粒酶活性有抑制作用。 本研究表明，c o u p t f i i 作为一个转录抑制因子，通过与h t e r t 基因启动子 相互作用，和c m y c 竞争结合e b o x 元件，降低人端粒酶催化亚基h t e r t 的转 录并相应抑制h e l a 细胞端粒酶活性。初步揭示了c o u p t f i i 在细胞分化和肿瘤 转化过程中的参与途径和调控机制为开启以端粒酶为靶目标的肿瘤治疗奠定了 基础。 关键词：酵母单杂交：c o u p t f i i ；h t e r t ；端粒酶：转录调控 出奎盔堂堡主兰垡鎏耋 e f f e c t so fn u c l e a r t r a n s c r i p t i o nf a c t o r c o u p - t f i io nt h e r e g u l a t i o no f h t e r t t r a n s c r i p t i o n a b s t r a c t t h ea c t i v a t i o no f t e l o m e r a s e ，t h er i b o n u c l e o p r o t e i nr e s p o n s i b l ef o rm a i n t a i n i n g t h ee n d so f c h r o m o s o m e s ，h a sb e e ni m p l i c a t e da st h ec r i t i c a ls t e pi nc e l l u l a ri m m o r - t a l i z a t i o na n dt u m o r i g e n e s i s t h er i b o n u e l e o p m t e i ne n z y m ec o n s i s t so ft h r e em a j o r s u b u n i t sc o n t r i b u t i n gt oi t sa c t i v i t i e s ：t h et e m p l a t er n a t r ，p r o t e i ns u b u n i tf o rr e - v e r s et r a n s c r i p t i o nc a t a l y s i st e r ta n dt h et e l o m e r a s er e l a t i o n e dp r o t e i nt l er e - c e n t l y , am a r k e dc o r r e l a t i o nb e t w e e ne x p r e s s i o no fh t e r tm r n a a n dp r e s e n c eo f t e l o m e r a s ea c t i v i t yh a sb e e n d o c u m e n t e d ，s u g g e s t i n gt h a tt h eo v e r a l lr e g u l a t i o no f t e - l o m e r a s ea c t i v i t yi sa c h i e v e d ，a tl e a s ti np a r t ，t h r o u g hr a t el i m i t i n gm e c h a n i s m sg o v e m i n g t h ee x p r e s s i o no f h t e r t g e n e t h ep r o m o t e ro f h t e r th a sb e e ni s o l a t e da n d c h a r a c t e r i z e db ys e v e r a lg r o u p s ，a n ds h o w ss o m eb a s i cf e a t h e r s ：t a t a 1 e s s ，g c r i c h a n dp o l y s p lb i n d i n g s i t s s i m p l ys i m i l a rw i t ht h eh o u s e k e e p i n gg e n e s c o n s e q u e n f l y , s e v e r a lt r a n s c r i p t i o nr e g u l a t o r sh a v eb e e ni d e n t i f i e da n dm e a n w h i l ec m y c ， a sat r a n s a c t i v a t o ro f h t e r t ，r e c e i v e dt h em o s t w i d e l ys t u d y , t h o u g hr o l e sf o rs p l e s t r o g e nh a v ea l s ob e e ns u g g e s t e d w h i l et u m o r s u p p r e s s i n gg e n e sp 5 3a n dw t lp r e s e n tn e g a t i v er o l e si nh t e r t e x p r e s s i o n ，i n c l u d i n go t h e rn e g a t i v er e g u l a t o r s ：m z f 2 a n dm a d t h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo f t h e r e g u l a t i o no f h t e r tt r a n s c r i p t i o nh a sb e e n r a r e l y e l u c i d a t e d t oc l o n ea n d i d e n t i f y t h e p r o t e i n s i n v o l v e di n r e g u l a t i n g t h e t r a n s c r i p t i o no fh t e r t a n ds t u d yt h er o l eo ft h eg e n e si nb o t hh t e r t t r a n s c r i p t i o n a n dt e l o m e r a s ea c t i v i t y ，t h ef o l l o w i n g e x p e r i m e n t sw e r ec a r r i e dt h r o u g h ： 1 t h ec l o n ea n di d e n t i f i c a t i o no f t h et r a n s c r i p t i o nf a c t o r si n v o l v e di nr e g u l a t i n gt h e t r a n s c r i p t i o no f h t e r t a6 3 0b pf r a g m e n tr e p r e s e n t i n gt h e - 5 8 5t o + 3 5 u p s t r e a mo fh t e r tg e n ew a s a m p l i f i e df r o mt h eg e n o m ed n ao fh e l ac e l l sb yp e r ，u s i n gt h e p r i m e r sp 1a n dp 2 出奎盔兰坚圭兰售连兰 t h ea m p l i f i e df r a g m e n tw a ss u b c l o n e di n t ot h ey e a s tr e p o r t e rp l a s m i d sa n dh e l a e d n al i b r a r yw a st r a n s f o r m e dt od u a lr e p o r t e rs t r a i n t h et r a n s f o r m a n t sw e r es e l e c t e do ns y n t h e t i cm i n u sd r o p o u tm e d i u m t h ep o s i t i v ec l o n e sw e r er e s c u e da n db - & a la c t i v i t yw a sm e a s u r e d t o t a l1 8p o s i t i v ec l o n e sh a v eh i g hb - o a la c t i v i t ya n d t h e ni n d i v i d u a l l yt r a n s f o r m e di n t o 五c o l ix l l 一b l u ec e l l s p l a s m i d sw c i ei s o l a t e dr e - s p e c t i v e l yf r o m h o s tc e l l sa n ds u b j e c t e dt od n a s e q u e n c i n g ，f r o mw h i c h ，t h e n o 1 8 c l o n er e v e a l e dt oc o n t a i nf 叫jc o u p t f i ic d n as e q u e n c e s ( b l a s t e di nc t e n b a n ka t n c b i ) 2 t h ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o na n d p u r i f i c a t i o no f c o u p t f i if u s i o np r o t e i n t h ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nr e c ：( ) m b i n a n tp l a s m i dw a sc o n s t r u c t e db yc l o n i n go f c o u p - t f i ic d n ai n t od o w n s t r e a mo fa6 x h i s - t a go fp e k - 318v e c t o ra n du s e dt o i n t oec o l ix l l - b l u e a r e ru s i n gi p t gt oi n d u c ee x p r e s s i o no fc o u p - t f i if u s i o n p r o t e i n ，s d s p a g ea n dw e s t e r n b l o tw e r ep u tu pt oa n a l y s i so f e x p r e s s i o np r o d u c t s o fc o u p t f i ii ne c o l ix l l - b l u e 。t h e nt h ec o u p t f l if u s i o np r o t e i n sw e r ep u r l f l e dt ot h ef i n e n e s sr a t i ou p9 8 b yn i - n t a a g a r o s ea f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yu n d e r d e n a t u r i n gc o n d i t i o n p r o t e i n sw e r e r e f o l d e db y d i a l y s i sa n df i n a l l yc o n c e n t r a t e dw i t l l p e g 4 0 0 0t o2 0 0 p g m 1 3 。t h ei n t e r a c t i o no fc o u p t f i if u s i o np r o t e i n sw i mh t e r t p r o m o t e r t of u r t h e r p r o b e t h ei n t e r a c t i o no fc o u p t f l l w i t h l t e f h p r o m o t e r , e m s a w a s p e r f o r m e da n dw e h a v et h ec o n c l u s i o nt h a tc o u p - t f i ic o u l db i n dt o 2 0 1t o + 3 5 f r a g m e n to f h t e r t p r o m o t e r i nt h ef o l l o w i n gf o o t p r i n ta s s a y , l h 1 冶ep r o t e c t e da r e a s s e p a r a t e l yn a m e da ，ba n dc ，d i s t r i b u t i n gw i t h i n 一2 4t o 一6 6r e g i o n ：a ：6 4t o 一5 3 ( 5 礤震甏黼k 论c a 3 ) ，b ：5 0t o - 4 2 ( 5 - g c t g c g t c c 一3 ) a n dc ：一3 8t o 2 6 ( 5 。t g c g i | | 瀚黧冀瓣gg a 3 ) i nc ：3 8 2 6r e g i o n ，t h e r e i sa ne b o xm o t i f ( 5 - c a c g t g - 3 、) w ef u r t h e rc o n f i r m e dt h a tc o u p - t f i is p e c i f i c a l l yb o u n dt ot h e e b o xm o t i fo fh t e r t p r o m o t e rb ye m s a su s i n g aw i l d - t y p eo l i g o n u c l e o t i d e p r o b e ( v e t ) c o r r e s p o n d i n gt h ee b o xr e g i o n o fh t e r tp r o m o t e r ( - 4 6 t o 一2 2 ) ，am u h a t e d - t y p eo l i g o n u c l e o t i d ep r o b e ( m r ) a n d a d e l e t e d - t y p eo l i g o n u c l e o t i d ep r o b e ( d t ) t w o p r o t e i n sn a m e d p 1a n d p 2 ，w h i c hi n t e r a c tw i t hc o u p t f i i ，w e r es e p a r a t e df r o m h e l ac e l ln u c l e a re x t r a c t sb yp u l l d o w n a s s a y t h r o u g ha n a l y s i s w i t hl c e s i 4 当奎盔主竖主兰垡鎏兰 m s m sa n ds e a r c h i n gi nn c b in r , w ek n o w n t h a tp 1w a sah o m o l o g o u sp r o t e i no f n e u r o t e n s i nr e c e p t o ra n dp 2w a sv e r ys i m i l a rt oc h r o m o d o m a i nh e l i c a s ed n a b i n d - i n gp r o t e i n 3i n t e r a c t i n gp r o t e i n 4 t h er o l eo f c o u p - t f i ii nr e g u l a t i o no f h t e r t t r a n s c r i p t i o ni nh e l a c e l l c o u p - i t l lw a sc o n s t r u c t e di n t op c d n a 3i ns e n s eo ra n t i - s e n s ed i r e c t i o n s t h e r e s u l t so fl u c i f e r e s er e p o r t e ra s s a ys h o w e dt h a tc o u p t f i ic o u l ds u p p r e s st h et r a n - s c r i p t i o no fh t e r tp r o m o t e r ，a n dt h e i n h i b i t i o nt os o m ee x t e n tc o u l db er e v e r s e d b y c o - t r a n s f e c t i o no ft - m y c p l a s m i d sw e r et r a n s f c c t e di n t oh e l ac e l l s ，a n ds t a b l ee x p r e s - s i o nc e l ll i n e sw e r eo b t a i n e db yg 4 1 8 ( 4 0 0 ug m 1 ) s e l e c t i o n i nn o r t h e r nb l o ta s s a y ， h t e r t t r a n s c r i p t i o nw a s i n h i b i t e di nt h eh e l ac e l l sw h i c hc o n t a i no v e r l o a dl e v e l o fs e n s em r n a e x p r e s s i o n ，a n dt h e “k n o c ko u t o f c o u p - t f i ii nh e l a c e l l sb ya 1 1 t i s e n c ec o u p t f i im r n al e a d st oi n c r e a s eo fh t e r tm r n a e x p r e s s i o n t h ed a t a f r o mt r a p - p c re l i s ac o n f i r m e dt h a tc o u p - t f l lc o u l d d e p r e s st e l o m e r a s ea c t i v i 批 t h i ss t u d y p r o v i d e d t h ef i r s te v i d e n c e st h a tc o u p - t f i ii n v o l v e di nr e g u l a t i o n o f h t e r t t r a n s c r i p t i o na sas u p p r e s s o rv i ab i n d i n gt ot h ee - b o xc l o s et ot h ei n i t i a ls t a r t s i t ea n dt h eo t h e rt w o b i n d i n g s i t e si nh t e r t p r o m o t e li th i g h l i g h t s t h a tc o u p t f i i c a nf u n c t i o na sah u m a nu l n l o rs u p p r e s s o rg e n ei ns o m ec i r c u m s t a n c e s t h ec l o n i n g a n dc h a r a e t e r i z a d o no fc o u p - t f l lw i l lg r e a t l yf a c i l i t a t eu n d e r s t a n d i n go f t e l o m e r a s e r e g u l a t i o ni nn o r m a la n dc a n c e rc e l l s ，a n dm a yo p e nu pan e ws t r a t e g yf o rt e l o m e r a s e - t a r g e t e da n t i c a n c e r t h e r a p y k e y w o r d s ：y e a s to n e - h y b r i d a s s a y ；c o u p - t f i i ；h t e r t ；t e l o m e r a s e ；t r a n s c r i p t i o n r e g u l a t i o n 5 些奎盔兰壁主兰堡垒苎 一 符号说明 英文缩写 英文全名 中文 a m p a m p i c i l l i n 氨苄青霉素 a p a m m o n i u mp e r s u f a t e过硫酸铵 a s a n t l 一s e n c e反义 c l a pc a l fi n t e s t i n a la l k a li n ed h o s p h a t a s e小牛肠内碱性磷 酸酶 c m vc y t o m e g a l o v i r u s巨细胞病毒 d m s o d i m e t h y ls u l f o x i d e二甲亚砜 d t td i t h i o t h r e i t o l二硫苏糖醇 e d t a e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca d i d乙二胺四乙酸 e g t a e t h y l e n eg l y c o l b i s ( 2 - a m i n o - e t h y l - e t h e r ) - t e t r a a c e t i c 乙二醇一双一( 2 a c i d一氨基乙基) 四乙 酸 e l i s a e n z y m e l i n k e di m m m u n o s o r b a n t a s s a y 酶联免疫吸附 分析 e m s a e l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t y凝胶迁移阻滞 s h i f ta s s a y f b sf e t a lb o v i n es e r u m 胎牛血清 b g a lb g a l a c t o s i d a s eb 一半乳糖昔酶 h e p e s 4 一f 2 一h y d r o x y e t h y l ) 一1 - p i p e r a z i n e e t h a n en 一双( 2 一羟乙基) s u l f o n i ca c i d 哌嗪一n 一2 一( 乙磺 酸) i p t g i s o p r o p y l b e t a - d ，- t h i o g a l a c t o s i d e异丙基一b d 一硫 代 半乳糖萤 m o p s 3 一i n m o r p h o l i n o p r o p a n e s u l f o n i ca c i d3 一( n 一吗啉代) 丙 7 坐奎盔堂坚圭兰些鎏兰 磺酸 p e g p 0 1 y e t h y l e n e聚乙二醇 p a g e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s聚丙稀酰胺凝胶 电泳 p b s p h o s p h a t e b u f f e r e ds a li n e磷酸盐缓冲液 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应 p m s f p h e n y l m e t h y l s u l f o n y lf l u o r i d e苯甲基磺酰氟 p n k p 0 1 y n u c l e o t i d ek i n a s e多核昔酸激酶 r p mr e v o l u t i o n sp e rm i n u t e每分钟转数 ss e n c e正义 s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e十二烷基磺酸钠 s s cs o d i u mc h l o r i d e ，s o d i u mc i t r a t eb u f f e r标准柠檬酸盐缓 冲液 t a et r is c 1 ，a c e t e t e ，e d t ab u f f e rt r i s c 1 、乙酸、 e d t a 缓冲液 t b e t r i s c 1 ，b o r a t e e d t ab u f f e rt r i s c 1 、硼酸、 e d t a 缓冲液 t r a p - p c r t e l o m e r i c - r e p e a ta m p l i f i c a t i o np r o t o c o l p c r t r a p p c r n b tn i t r ob l u et e t r a z o l i u mc h l o r i d e 氧化硝基四氮唑 蓝 x - g a l 5 _ b r o m o - 4 - c h l o m _ 3 - i n d o l y l - b - d - g a l a e t o - p y r a n o s i d e5 一澳一4 氯一3 一吲哚 一b - d 一半乳糖营 8 文献综述 人端粒酶催化亚基h t e r t 转录调控研究进展 端粒是真核细胞线性染色体末端核酸和蛋白质的复合体结构，对维持染 色体稳定性和防止d n a 融合有重要作用。端粒酶可以通过合成重复的核苷酸序 列来维持端粒长度，调节细胞的分裂寿命。生殖细胞和干细胞的增殖，体细胞 癌变等生理病理过程，与端粒酶的激活及其活性的维持密切相关。正常情况 下，端粒随细胞分裂而渐进性短缩，细胞进入衰老状态；而在肿瘤细胞和永生细 胞中，端粒长度延长或相对稳定。在多数( 9 0 ) 恶性肿瘤以及具有再生和分化 潜能的干细胞( 例如胚胎组织细胞、成人胚系细胞、造血干细胞、皮肤表皮和毛 囊中的基底细胞) 中，端粒酶处于激活状态，而在大多数终末分化的正常体细胞 中处于抑制状态。 到目前为止，关于人类端粒酶的三种成份已被确认：( 1 ) r n a 成份( h t r h t e r c ) 提供端粒重复合成的模板，广泛表达于各组织细胞中。；( 2 ) 端粒酶的催化亚单 位( h t r t h t e r t ) 是其催化活性中心，拥有与已知的反转录酶相似的结构，表达组 织基本与细胞端粒酶激活组织相一致“1 ：( 3 ) 端粒酶相关蛋白( t e p i t l p i t p i ) 几 乎在所有的细胞中都有表达，其明确的功能尚不清楚。体外实验发现仅有h t r 和h t e r t 即可重建端粒酶活性，h t r 和h t e r t 构成了人类端粒酶的最小催化活性 中心“1 。h t e r t 可使正常细胞端粒酶呈阳性而使细胞寿命延长。3 ，抑制h t e r t 可降低端粒酶的活性，进而抑制癌细胞生长“：，表明h t e r t 的调控是人端粒酶 活性的限制性因素。尽管影响h t e r t 活性的因素是多方面、多水平的”! ，但研究 表明转录调控是其中的关键步骤4 j 。因此，h t e r t 在肿瘤细胞和正常细胞中的转 录调控机制，已经成为肿瘤发生和细胞衰老研究中的热点。 1 h t e r t 基因启动子的克隆及其结构特征 h t e r t 基因启动子的克隆和序列测定，是研究其转录调控分子机制的基础。 在1 9 9 9 年，有几个研究小组几乎同时独立的完成了这项工作睁，但他们在确定 转录起始位点时却得到了不同的结果。t a k a k u r a 等使用c a p s i t eh u n t i n g 技术， 确定h t e 解的转录起始位点位于a t g 翻译起始位点上游7 7 b p 处1 ，然而h o r i k a w a 夸 山东大学博士学位论文 等使用r n a s ep r o t e c t i o na s s s y s 却揭示其转录起始位点在a t g 翻译起始位点上游 5 5 b p 处“。w i c k 等使用r t - p c r 的方法没有精确的得到转录起始位点的位置，但他 们确定其位于a t g 翻译起始位点上游6 0 1 1 2 b p 之间“”。几个小组结果不同，有可 能是由于使用了不同的细胞系和不同的实验技术，也有可能h t e r t 基因本来就具 有多个转录起始位点。h t e r t 基因的翻译起始位点是确定的，并被所有的研究小 组接受，因此，一般地，在h t e r t 基因转录调控研究中，把翻译起始位点标记为 + 1 。 t a t a 盒、g c 盒和c a a t 盒等是真核生物转录调控重要的调节元件。目前， 在后生动物果蝇及酵母、人类和其它哺乳动物基因中均发现有缺乏t a t a 盒的 启动子存在。这些启动子所在基因编码的蛋白依其功能可简单分为以下几 类：看家基因、一些生长因子及其受体、类圃醇激素受体、癌基因、某些转 录因子和许多组织细胞特异性表达的基因等。由于缺乏t a t a 盒的启动子先从 管家基因中发现，所以人们猜想此类基因不受或很少受调节。但事实并非如 此，如h m g c o a 还原酶对不同胆固醇水平反应不同，d h f r 在d n a 合成期转录水 平增高“。通过对h t e r t 上游调控区的分析发现。其主要调节区为结构简单 的看家基因类启动子，缺乏t a t a 盒及其相似序列，富含g c 序列，形成c p g 岛，具 有多个s p l 结合位点。做为在细胞衰老和肿瘤发生中有重要作用的基因， h t e r t 受到了严格的调控。在胚胎发育过程中，人类多种胚胎组织h t e r t 表达水 平较高，具有端粒酶活性，如肌肉、肺、皮肤、肾上腺等，成年后大部分人类正 常组织中h t e r t 的表达被抑制，端粒酶活性消失，仅在生殖细胞和某些有高度复 制潜能的体细胞中有低水平的端粒酶活性，如淋巴细胞、造血干细胞、肠隐窝细 胞、皮肤基底层细胞和滋养层细胞等，其中的端粒酶活性可能源于其中有高度再 生和增殖潜能的多能干细胞“。 2 蜊a 修饰对h t e r t 转录调控的影响 从理论上来看，h t e r t 启动子区c p g 岛的形成增加了d n a 甲基化的发生机会， c 碱基的甲基化可能通过干扰转录因子与启动子的结合，或者影响d n a 的构象， 使染色质结构处于不活跃状态，抑制基因的转录“”1 。h t e r t 表达阴性的成纤维 细胞系s u s m 一1 的启动子区甲基化水平高，其d n a 去甲萋化后会诱导h t e r t 表达， 1 0 说明在这种细胞中d n a 的甲基化与h t e r t 的表达抑制相关。最近用甲基化特异的 p c r 和重亚硫酸盐基因组序列分析h t e r t 的启动子发现：在端粒酶阴性的正常组 织和培养细胞中，h t e r t 基因的c p g 岛为非甲基化或低甲基化状态，而在许多端 粒酶阳性的培养细胞和肿瘤组织中为部分甲基化状态，这说明甲基化程度与 h t e r t 表达水平没有必然联系。总而言之，在某些细胞系中c p g 岛的甲基化对 h t e r t 表达有一定的抑制作用，大多数端粒酶阴性的细胞中h t e r t 基因表达抑制 的机理并不完全是d n a 甲基化，而可能是转录激活抑制因子的综合作用。h t e r t c p g 岛的甲基化在体内h t e r t 转录调节中没有特别重要的作用“7 “”。 人们旱已发现功能活跃的基因中核心组蛋白n 端乙酰化水平较高，而其 他功能较低的基因中乙酰化水平则很低，从而提示组蛋白的乙酰化是基因转 录活化的重要调节因素。自从研究证明酵母g c n s p 基因具有组蛋白乙酰转移 酶( h a t ) 功能以来“，关于组蛋白乙酰化和脱乙酰化的研究日益受到重视。 2 0 0 1 年，两个不同的研究组几乎同时发现了一种组蛋白脱乙酰酶抑制剂t s a ( t r i c o s t a t i na ) 可以显著增加细胞中h t e r t 基因m r n a 的表达。实验确切 证实t s a 可以诱导h t e r t 核心启动子区的高乙酰化，进而可以活化正常端粒 酶阴性细胞中的h t e r t 基因，上调端粒酶阳性肿瘤细胞h t e r t 表达水平。而 且有证据显示激活的t 细胞中自然活化的h t e r t 基因启动子区组蛋白乙酰化 水平较高。所以组蛋白的赢乙酰化可能是肿瘤中端粒酶活化的一种机制。“1 。 最近，本实验室分离到一种类组蛋白乙酰基转移酶的蛋白( h i s t o n ea c e t y l t r a n s f e r a s e l i k ep r o t e i n ) ，命名为h a l p 。初步的研究表明h a l p 对端粒 酶h t e r t 的作用是通过结合于启动子区一1 1 7 一5 8 部位，通过组蛋白乙酰转 移酶功能改变染色质构像，从而达到促进转录的作用。“。 3 肿瘤相关病毒对h t e r t 转录调控的影响 与肿瘤相关的病毒可以把其基因组中的调控序列，比如启动子或增强子插入 宿主细胞基因组中，激活原癌基因的转录，导致肿瘤的发生”。这种通过病毒的 核心调控序列来激活转录的机制，同样对于h t e r t 的转录也有影响。在肝癌细 胞h u h 一4 、中，乙肝病毒h b v 的基因组整合到h t e r t 的启动子区，从而h t e r t 既 可以从内源的启动子转录，又可以以h b v 的启动子转录3 。h b v 的增强子序列， 山东大学博士学位论文 整合到h t e r t 转录起始位点上游约1 6 k b 处，起