（微生物与生化药学专业论文）适体筛选方法及分离方法的探讨.pdf

摘要 适体筛选方法及分离方法的探讨 微生物与生化药学专业硕士研究生：马文静 指导老师：田晋红副教授 摘要 核酸适体( a p t a m e r ) 是指从人工构建的随机单链序列中筛选出的能与蛋白质、其他小分 子物质、有机离子等等各种配体特异结合的寡核苷酸片段。它是经体外指数富集配体系统进 化技术( s y s t e m a t i ce v o l u t i o no f l i g a n d sb ye x p o n e n t i a le n r i c h m e n t ，s e l e x ) 筛选出来的一系列单 链寡核苷酸分子，一般由2 0 8 0 个碱基组成，对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲 和力。 目前筛选核酸适体的s e l e x 技术是分子进化工程技术的一种。核酸分子的一级结构上存 在着大量不同顺序的寡核苷酸的排列组合。我们可以利用人工化学合成技术把设计好的一定 长度的不同排列组合的寡核苷酸都合成出来，构建成一个包含了这一长度寡核苷酸分子所有 可能的突变的寡核苷酸文库，这样就可以在实验条件中模拟大自然的进化，有目的地施加选 择压力，筛选出符合特定要求的寡核苷酸分子。 采用s e l e x 方法筛选适体的关键问题是将与靶标结合的s s d n a 与未结合的游离s s d n a 分离。本研究的主要探讨适体筛选过程中的筛选方法和分离问题。全文分为3 部分分别探讨 了3 种筛选适体的方法和相关的分离方法： 一、胶体金为分离介质的s e l e x 技术筛选适体：以猪瘟病毒单克隆抗体和促绒毛膜性腺 激素( h c g ) 单克隆抗体为靶标进行适体的筛选，通过1 2 轮筛选，经聚丙烯酰胺凝胶( p a g e ) 电泳发现目的寡核苷酸条带丢失。用超滤离心管作为分离介质，继续对h c g 单克隆抗体进行 适体筛选，经p a g e 胶电泳发现在第五轮筛选中的第l o 次洗液中仍然有核酸条带。 二、硝酸纤维膜( n c ) 为分离介质的双链d n a 文库法： 以固定在n c 膜上的h c g 单 克隆抗体为靶标，以随机双链d n a 文库为出发库进行核酸适体筛选，经l 轮筛选，p a g e 电泳有目的寡核苷酸条带，但在对照用的空膜中也出现相同的寡核苷酸条带。 三、变性复性法：以硝酸纤维膜( n c ) 和p d f v 膜为分离介质，以蛋白酶k 为靶标， 以硫醇探针作为跟踪检测，通过l 轮筛选，在p a g e 胶电泳中有目的核酸条带，对照和洗液 中没有条带。硫醇探针检测发现在目的核酸及目的核酸的p c r 产物存在的条件下，与硫醇探 针结合后，能增加荧光素马来酰亚胺的荧光量，而对照的荧光量没有明显的增加。 关键词：s e l e x ：快速法：变性：复性；适体 i l i a b s t r a c t t h e i n v e s t i g a t i o n o fs c r e e n i n ga n d s e p a r a t i o n m e t h o do fa m n i t yd n a a p t a m e r c a n d i d a t e ：m a 阢r i li n g s u p e r v i s o r ：t i a nj i n h o n g a b s t r a c t a p t a m e rr e f e r st ot h eo l i g o n u c l e o t i d ef r a g m e n t ss c r e e n e df r o mt h ea r t i f i c i a lc o n s t r u c t i o no f r a n d o ms i n g l ec h a i ns e q u e n c e ，t h es c r e e n e do l i g o n u c l e o t i d ef r a g m e n t sc a l ls p e c i a l l yb i n dw i t h v a r i o u st a r g e t ss u c ha sp r o t e i n s ，s m a l lm o l e c u l e s ，o r g a n i ci o n sa n ds oo n i ti su s u a l l yas e r i e so f s i n g l e - s 仃a n d e dn u c l e i ca c i dm o l e c u l e w h i c hg e n e r a l l yc o n s i s to f2 0t 08 0b a s ep a i r sa n di ss c r e e n e d o u tb yv i t r os c r e e n i n gs y s t e me v o l u t i o nl i g a n d sb ye x p o n e n t i a le n r i c h m e n t ( s y s t e m a t i ce v o l u t i o no f l i g a n d sb ye x p o n e n t i a le n r i c h m e n t , s e l e x ) a p t a m e rc a l lr e c o g n i s et a r g e t ss t r i c t l ya n dc o m b i n e w i t ht a r g e t si nh i g ha f f i n i t v a tp r e s e n t s e l e xi st h em a i nm e t h o do fs c r e e n i n ga p t a m e ra n do n ek i n do fm o l e c u l a r e v o l u t i o n a r ye n g i n e e r i n gt e c h n o l o g i e s n ep m a r ys t r u c t u r eo fn u c l e i ca c i dm o l e c u l a rc o n s i s to fa n u m b e ro fd i f f e r e n tc o m b i n a t i o n so fn u c l e o t i d es e q u e n c e s a r t i f i c i a lc h e m i c a ls y n t h e s i st e c h n i q u e s c a nb eu s e dt os y n t h e s i z eal e n g t ho fd e s i g n e dd i f f e r e n tp e r m u t a t i o n so ft h en u c l e o t i d e t h e r eb u i l d s an u c l e i ca c i dl i b r a r yw h i c hc o n t a i na l lm o l e c u l a rw i t ht h i sl e n g t ho fa l lp o s s i b l em u t a t i o n s t h i sc a l l s i m u l a t et h ee v o l u t i o no fn a t u r ei nt h ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s 。t oe x e r ts e l e c t i v ep r e s s u r e ，a n dt o s c r e e no u tt h es e l e c t e dn u c l e i ca c i dm o l e c u l ef i n a l l y t h ek e yp r o b l e mo fs e l e xi st h es e p a r a t i o no ft h ec o m b i n a t t v es s d n aw i t ht h et a r g e t t h e s t u d yf o c u s e so nt h ep r o c e s so fs c r e e n i n ga n ds e p a r a t i o np r o b l e m si na p t a m e rs e l e c t i o nm e t h o d s 1 1 1 i sp a p e ri sd i v i d e di n t o3p a r t s ，w h i c hs e p a r a t e l y i n v e s t i g a t e3 m e t h o d so fs c r e e n i n ga n d s e p a r a t i o no fa p t a m e r ： f i r s t l y , t h em e t h o ds c r e e n sc l a s s i c a ls w i n ef e v e rv i r u sm o n o c l o n a la n t i b o d i e sa p t a m e ra n d h c ga p t a m e ru s i n gs e l e xt e c h n o l o g y , a n du s e sc o l l o i d a lg o l d 弱s e p a r a t i o nm e d i u m a f t e r12 r o u n d ss e l e c t i o n ，p o l y a c r y l a m i d eg e l ( p a g e ) s h o w st a r g e to l i g o n u c l e o t i d eb a n d sa r em i s s i n g b y u s s i n gu l t r af i l t r a t i o nc e n t r i f u g et u b ea ss e p a r a t i o nm e d i u m ，w ec o n t i n u e dt os c r e e nh c ga p t a m e r f i n a l l yp a g es h o w st h a tl o t hl o t i o ns t i l lh a v ed n a b a n d si n5 t hs c r e e n i n g s e c o n d l y , d o u b l e s t r a n d e dd n al i b r a r ym e t h o du s i n gn i t r o c e l l u l o s em e m b r a n e ( n c ) 舔 s e p a r a t i o nm e d i u ms c r e e n i n gh c ga p t a m e r t h i sm e t h o du s e sp r o d u c t e dn cm e m b r a n e - l a b e l e d a n t i b o d y 弱at a r g e ta n dr a n d o md o u b l e s t r a n d e dd n al i b r a r y 鹪t h es t a r t i n gl i b r a r y t os c r e e n a p t a m e r a f t e rl r o u n ds e l e c t i o n , p o l y a c r y l a m i d eg e l ( p a g e ) s h o w st a r g e to l i g o n u c l e o t i d eb a n d h o w e v e r , t h eb a l n km e m b r a n ew i h c h i su s e df o r c o m p a r i s o na l s o h a dt h es a m eb a n do f o l i g o n u c l e o t i d e s t h i r d l y , d e n a t u r a t i o n r e n a t u r a t i o nm e t h o ds c r e e n sa l k a l i n ep r o t e a s eka p t a m e r t h em e t h o d u s e sn ca n dp d v fm e m b r a n e s 嬲s e p a r a t i o nm e d i u ma n da l k a l i n ep r o t e a s eka st a r g e t p o l y a c r y l a m i d eg e l ( p a g e ) s h o w st a r g e to l i g o n u c l e o t i d eb a n d ，c o n t r o la n dl o t i o nd o e sn o th a v e t a r g e to l i g o n u c l e o t i d eb a n d t h i o lp r o b en u c l e i ca c i df o u n dt h a tu n d e rt h ec o n d i t i o n st h a tt a r g e t n u c l e i ca c i d sa n dt h e i rp c rp r o d u c t sa r ee x i s t e n t , a f t e rc o m b i n e dw i t ht h et h i o lp r o b e t h ea m o u n to f f l u o r e s c e n c eo ff l u o r e s c e i nm a l e i m i d ec a ni n c r e a s e t h ea m o u n to ff l u o r e s c e n c eo fc o n t r o la n di o t i o n d i dn o t s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e k e yw o r d s ：s e l e x ；o n e - s t e pm e t h o d ；d e n a t u r a t i o n ；r e n a t u r a t i o n ；a p t a m e r v 主要缩略表用语 囊置量皇舅量量量鼍曼曼量量量一 主要缩略表用语 6 1 独创性声明 学位论文题目：适体筛选方法及分离方法的探讨 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了特 别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁在 文中作了明确说明并表示衷心感谢。 学位论文作者： 马趱 签字日期：矽，夕年，月；7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：马复翥争 导师签名： 锣豸厶 签字日期：沙矿年j 月弓 日签字日期：砂年上月岁日 第一章文献综述 第一章文献综述帚一早义陬琢尬 1 1 适体研究进展 核酸适体【1 1 ( a p t a m e r ) 指的是从人工构建的随机单链序列中筛选出的能与蛋白质、其他 小分子物质、有机离子等等各种配体特异结合的寡聚核苷酸片段。a p t a m e r 源于拉丁语a p t u s t 2 1 ， 即钟，适应配、对之意，也可翻译为核酸识体、核酸适配子、核酸适配体等。它通常是一 系列单链核酸分子，一般由2 0 - 0 8 0 个碱基组成，经体外筛选技术指数富集配体系统进化 ( s y s t e m a t i ce v o l u t i o no fl i g a n d sb ye x p o n e n t i a le n r i c h m e n t ，s e l e x ) 筛选出来，对可结合的配体 有严格的识别能力和高度的亲和力。核酸适体在生物传感器、新药开发以及纳米技术等方面 有着广泛的用途，引起了人们的极大兴趣。 核酸适体与一般寡核苷酸组成相同，只是核酸的2 端碳原子被修饰，因此提高了其抗核酸 酶降解的能力。它不是携带遗传信息的线性分子，和t r n a 一样，它是具有一定空间构像的球 形分子【3 1 。稳定的三级结构是其与靶标高效特异结合的基础。在大多数情况下，溶液中的单链 d n a 或r n a 的空间构像是不确定的，当靶标分子存在时，单链d n a 或r n a 发生适应性折 叠，形成发夹( h a i r p i n ) 、假结( p s e u d o k n o t ) 、凸环( b u l g e ) 、g 四分体( g - q u a r t e t ) 等特殊三维空间 结构，通过氢键、疏水堆积作用、范德华力等与靶分子紧密结合【4 】。这种特性能使核酸适体识 别靶标分子间如一个甲基、羟基或d l 镜像体间的极其细微的差别。核酸适体与靶标分子的 结合不依靠常规的核糖磷酸骨架的亲和力，而是通过“假碱基对”的堆积作用、氢键作用、静电 作用和形状匹配等产生高效特异的结合力【5 1 。“假碱基对”的堆积是指配体的芳香环部位与核酸 分子的碱基平面平行，并有重叠，类似于核酸分子里的碱基堆积作用。在多数的核酸识体一 配体复合物里，尤其是核酸识体一蛋白质复合物，堆积作用扮演一个关键角色，其次是氢键作 用1 6 1 。n g u y e nd h 7 1 等人在利用磁共振波谱法研究孔雀绿与其r n a 适体相互作用时发现，孔 雀绿( 配体) 在适体的诱导下产生了电荷分布及构像的变化，提示适配体间的识别是相互诱导 的适应性识别。核酸适体与靶标分子的结合是结构依赖性，即只识别与其互补的空间结构， 而不是序列依赖性，这一特性同抗原和抗体结合的特性很相似。核酸适体与靶标分子间的亲 合力通常要强于抗原抗体之间的亲合力，解离常数在皮摩和纳摩之间【8 l 。凡是涉及到抗体的应 用领域，几乎都可以用核酸适体来替代。核酸适体的出现，冲破了传统意义上关于核酸只是 遗传信息存储和转运载体的认识，利用核酸适体结构的多样性，可使它与各种靶标分子产生 高选择性的结合。由于核酸适体具有易合成、易存储、易修饰等优点，它在蛋白质核酸诊断 和治疗、传感器、分子开关等诸多方面的应用引起了人们的极大兴趣。 1 1 1 核酸适体的特点和优势 核酸适体和靶标分子的结合和抗原抗体间的结合相似，但它具有许多明显优于抗体的优 势 9 1 。 西南大学硕士学位论文 1 1 1 1 适体亲和力和特异性好 经多次筛选获得的核酸适体与靶标分子有很高的特异性和亲和力，解离常数经常在 p m o l l 和n m o l l 之间，高于其它类型的配体，有些甚至强于其天然配体，几乎完全可以避免 非特异性结合。核酸适体能够分辨不同靶标分子结构上一个基团的细微差别，甚至能识别同 一蛋白分子的不同构像、不同功能状态。核酸适体与靶标分子之间有较大的接触面积 ( 3 0 ，4 0 r i m 2 ) ，靶标分子方面极其细微的变化即可被核酸适体感知，形成了识别的高度特异性【1 0 】。 1 1 1 2 适体靶分子结合范围较广 寡核苷酸随机区的每个核苷酸种类都存在4 种可能性( a 、t 、c 或g ) ，如果随机区有n 个核苷酸，那么随机序列的多样性有4 “种。假设随机区域长度为3 0 个核苷酸左右，文库的含 量就能达到1 0 1 5 【1 0 l 。另外单链寡核苷酸很容易形成各种形状的二级结构和三级结构。随机文 库中寡核苷酸随机序列的多样性决定了寡核苷酸立体构像的多样性，多达1 0 1 4 以上的随机寡 核苷酸所蕴含的丰富的核苷酸立体构象可与自然界存在的几乎所有种类的分子发生作用。抗 体只可以与抗原结合，酶只与其底物结合，单链d n a 只与其碱基配对的单链d n a 结合，而 核酸适体除了能与蛋白质 1 1 , 1 2 , 1 3 l 、核苷酸( d n a 或r n a ) 等大分子结合外，还可以和染料1 4 1 、 金属离子【1 5 , 1 6 】、药物1 7 , 1 8 , 1 9 1 ( 如咖啡因和茶碱等) 、辅因子( 如f m n 和c a m p 等) 1 2 0 , 2 1 1 、生长 因子【2 2 1 、类固醇、糖类2 3 , 2 4 1 、氨基酸( l 精氨酸) 2 5 1 等小分结合子，甚至可与超分子结构如 完整的细刺2 6 1 、病毒【2 7 1 、孢子结合，就连很难用做半抗原的毒素和朊病毒也能被核酸适体特 异性识别。相比之下，抗原性弱的蛋白很难获得其抗体，抗体的靶分子范围也窄得多【2 引。 1 1 1 3 适体制备方便 抗体的筛选和制备周期长，从免疫动物或细胞培养到蛋白纯化至少需要3 6 个月，且筛 选和制备过程繁琐，成本昂贵。而适体是由体外筛选和扩增获得的，不需要免疫动物或培养 细胞，有极佳的准确性和重复性，有很高的纯度，可以避免产生批间差异。s e l e x 选周期一 般只需2 3 个月。目前，s e l e x 程已实现了自动化，随着b l a c k w e l l 、w e i n t r a u b 、b e c k m a nc o u l t e r 和b i o m e k2 0 0 0 等自动化工作站的应运而生，适体的制备将更快速、更经济。 1 1 1 4 适体稳定性好 d n a 适体稳定性较好，r n a 适体在嘧啶戊糖2 位引入氨基或氟后，能抵抗r n a 酶降解， 也有较好的稳定性，便于长期保存和运输【2 8 】。适体在变性的条件下分离纯化，稳定性好，可 长期保存，在常温下运输。适体耐受性好，可以在不同温度、盐浓度、变性剂等条件下反复 变性和复性，可逆且速度快，可反复使用、长期保存和室温运输。 1 1 1 5 其它 2 第一章文献综述 除此之外，核酸适体还有许多优于抗体的优势。例如，无免疫原性，可在体内反复使用； 在合成过程中，各种报告分子( 荧光素或生物素) 和功能集团可精确地结合在操作者能识别 的核酸适体位点上；分子较小、稳定性好：适体( 8 1 0 3 1 5 x 1 0 3 ) 比抗体分子小，易于通透细胞 膜进入细胞内，可以检测细胞内的靶分子，应用更灵活方便：易修饰性：适体为寡核苷酸片 段，可进行精确的位点修饰，且修饰后的适体保持原有的生物活性【2 们。 1 2 核酸适体的筛选方法 1 2 1 s e l e x 技术 1 9 9 0 年，t u e r k 和e l l i n g t o n 等建立了s e l e x 方法，这种方法是从含有大量随机序列的寡 核苷酸库中筛选出一种数量很少的与特定配体具有很强亲和力的核酸序列，它是一种通过体 外反复筛选和放大富集从库容量庞大的核苷酸组合库中筛选特定核苷酸序列的方法。s e l e x 技术是分子进化工程技术的一种。核酸分子的一级结构上存在着大量不同顺序的核苷酸的排 列组合。我们可以利用人工化学合成技术把设计好的一定长度的不同排列组合的核苷酸都合 成出来，构建成一个包含了这一长度核酸分子所有可能的突变的核酸文库，这样就可以在实 验条件中模拟大自然的进化，有目的地施加选择压力，在很短的时间里筛选出符合特定要求 的核酸分子。 图1s e l e x 流程图 这里以图1 为例进行说明。s e l e x 采用的筛选文库一般是人工组合化学合成的的s s d n a 或r n a 随机序列库，随机序列两端通常是带有限制性内切酶位点的固定序列，两端的固定序 列是多聚酶链反应及其他酶学反应相关引物的结合位点在特定缓冲体系和选定的温度下，随 机文库与靶标进行孵育结合，在首轮筛选中仅有少量s s d n a 与靶标结合。可以通过多种物理 3 两南大学硕+ 学位论文 方法进行将与靶标结合的s s d n a 与游离的s s d n a 分离。如果实验选用的靶标是蛋白质分子， 一般选用与硝酸纤维素膜相结合、滤膜分离、酚氯仿回收的方法。对于小分子靶目标，预先 将靶标首先与固体分离介质相结合，将靶标固定在固相介质上制成亲和基质，通过洗脱即可 分离与靶标结合的s s d n a 和游离的未结合s s d n a 序列。这样筛选出来的序列通过p c r 扩增 获得一个新的核酸筛选文库，再开始下一轮筛选。随着每一轮筛选条件的不断加强，与靶标 低亲和力较低的序列被逐步淘汰。洗脱的严格程度与孵温度、p h 值、金属离子浓度、靶标浓 度等有关。大约经过5 - - 一2 0 轮富集筛选后可达到亲和饱和度，p c r 扩增产物即可用于克隆、 测序。一般情况下，最后一轮富集的s s d n a 中9 0 以上的序列都是能与靶标特异性结合，就 是筛选到得适体。 1 2 1 1s e l e x 技术筛选的基本程序 s e l e x 技术筛选各种分子的程序基本大同小异，大多采用亲和方法，即固定配体。一般 分以下几个步骤： ( 1 ) 在体外化学合成一个含有极多随机序列( 包括靶序列) 的单链寡核苷酸库，库容量在 1 0 1 4 1 0 ”之间。随机寡核苷酸文库可以是d n a 文库，也可以是r n a 文库，一般以r n a 文库 常见。合成的寡核苷酸文库中间为随机序列，中间随机序列不能太长也不能太短，太长可能 由于全套文库单链寡核苷酸序列一定，导致降低了选择分离出来的配基的概率，并且会增加 合成的难度，同时增加成本；太短可能会导致没有足够的二级结构和靶标分子结合，随机序 列一般为2 0 - - 6 0 b p 。随机寡核苷酸文库两端为固定序列，固定序列是为增加文库的稳定性和扩 增做准备，两端的固定引物序列作为p c r 引物的识别序列。如果筛选的是r n a 适体，需要 在5 ，端固定引物序列前加一个加一段便于进行体外转录的t 7 启动子序列，可被t 7 r n a 聚 合酶识别，并合成相应的p c r 引物。为了提高适体的稳定性，增加其功能多样性及生物利用 度，可以对寡核苷酸进行化学修饰，构建各种不同的s e l e x 修饰基团文库：如抗核苷酸酶修 饰基团、有利于适体复制、扩增的修饰基团、结构类似物修饰基团等【3 们。从理论上讲，自由 核酸的长度越大，库容就越大，但一般说来与蛋白或其他分子相互作用的核酸序列不会超过 1 0 0b p ，多集中于1 5 4 5 b p 之间。为保证p c r 扩增的效果，寡核苷酸两端应为a t 丰富区且不 应有对称结构。p c r 扩增时，为防止某些特殊序列的超比例扩增，循环次数一般不超过2 0 次， 但为保证库容量，加大体系进行大规模扩增是必需的【3 1 1 。 4 第一章文献综述 表1 不同随机区域长度时随机寡核苷酸文库的容量 随机区域长度随机寡核苷酸文库的容量 l 4 1 0 2 0 3 0 4 0 4 2 5 6 1 0 6 1 0 1 2 1 0 1 8 1 0 2 4 ( 2 ) 将随机寡核苷酸文库在特定缓冲体系和温度下和靶标物质温育，形成靶标物质核酸的 复合物，根据靶分子的特性，一般选择室温或者3 7 c 1 3 2 1 。此步中，可以同靶标物质亲和作用 的特异性序列非常少，只有通过物理分离技术加以纯化。靶标物质核酸的复合物通过洗脱、 亲和层析法、硝酸纤维素膜过滤、变性凝胶电泳法或磁珠等分离技术与未结合的序列分离。 ( 3 ) 将筛选到的蛋白核酸复合物分离，分离出的结合序列经p c r 或r t - p c r 扩增。p c r 产物变性成单链以准备进行下一轮筛选，若筛选对象为r n a ，则需先反转录为d n a ，然后扩 增成为d s d n a 并进行体外转录生成次一级文库，这种扩增达到了达尔文进化论中的大量增殖 的效果。次一级文库作为下一轮筛选使用的d n a 模板，然后继续循环进行相同的步骤，随筛 选轮数的增加，寡核苷酸与靶分子的亲合力逐渐增强，最后得到亲合力和特异性很高的核酸 适体，再与原靶目标温育，进入第二轮筛选。随着筛选严谨度( 温度、p h 值、金属离子、靶目 标浓度、温育时间等) 的不断增加，低亲和力序列逐渐被淘汰。在每轮筛选的同时，设立平行 的亲和力检测实验。经过大约8 1 5 轮筛选富集后，与靶目标高度特异结合的核酸适体呈指数级 增长，k d 值逐渐下降，亲合力逐渐增加。 ( 4 ) 经过多次的选择性分离扩增后，达到了饱和状态。采用p c r 或r t - p c r 扩增筛选出的 适体分子，将其克隆入质粒载体，挑选若干克隆测序，分析适体分子可能形成的空间结构及 其特征，并进快速鉴定不同适体分子与靶分子亲合力。 1 2 1 2s e l e x 技术的特点 s e l e x 技术主要具有以下3 个特点： ( 1 ) 高分辨率。根据j e n i s o n 等【3 3 】的研究结果，用茶碱c o r o n c h o d i l a t o rt h e o p h y l i r i e ) 筛选得到 的核酸适体与茶碱结合的解离常数k d 为0 1 p m o l l ，这是其与咖啡因( c a f f e i n e ) 的1 0 0 0 倍，尽 管茶碱与咖啡因的差别只是在嘌呤环n 7 位置上有无甲基。 ( 2 ) 高解离常数。以蛋白质为靶物质，筛得适体的解离常数可以达到n m o l l 水平甚至p m o f l 水平；对于小分子量的靶标物质，其解离常数也可以达到“m o l l n m o 儿水平。 5 西南大学硕+ 学位论文 ( 3 ) 同抗体( m = 1 5 0k d ) 相比，适体的分子量小( 8 1 5 k d ) ，使得适体在体内有更好的渗透能 力，更容易被血液清除，同时没有免疫原性，具有较好的信噪比【3 4 1 。 1 2 2 快速法 2 0 0 8 年范茂棉3 习等人提出了一种与传统的s e l e x 技术筛选适体不同的方法，新方法用 d s d n a 文库筛选，只需要进行1 2 轮便可筛选到适体。他们根据d e c 的原理，建立了用双链 随机d n a 快速筛选特异性适体的方法。其机理是d s d n a 与靶标相遇时，如与d s d n a 有一个 结合的切入点，则d n a 双链就会像打开拉链样被彻底打开变成单链，其中一条s s d n a 会与 靶标形成特异性结合关系。把它与d s d n a 分离，扩增s s d n a 就得到特异性的适体。 图2 快速法流程图 这里以图2 做说明。将s s d n a 经过p c r 扩增为d s d n a 文库，靶标与d s d n a 文库在特定 缓冲体系和选定的温度下作用，能与靶标特异性结合的d s d n a 被打开，形成s i n g l e s t r a n d e d ( s s ) 的- d n a t a r g e t - b o u n d 复合物，然后通过水洗将s i n g l e s t r a n d e d ( s s ) 的- d n a t a r g e t = b o u n d 复合物 6 与错离的s s d n a ，d s d n a 分离开来，然后p c r ，p c r 扩增产物即用于克隆铡序。 1 3 核酸适体筛选中的分离方法 131 毛纲瞥电泳s e i e x ( o e - $ e l e x ) s e l e x 筛选中最关键的问题就是将与靶标结台的s s d n a 与游离s s d n a 分离完全这个 问题一直限制经典s e l e x 技术的发展。m e n d o n s a 等根据# d n a 与靶标孵育结合后能够使 其构象和质量发生变化从而导致其电泳行为发生显著变化的特性，通过毛细管电林( c e ) 成 功地将与靶标结合的s s d n a 与游离的s s d n a 分离完全。c e s e l e x 方法只需要2 4 轮筛选 就可获得与靶分子亲和力较强的特异性配体。d r a b o v i c h 等9 ”根据c a p i l l a r ye l e c t r o o p h o r e s i so f e q u i l i b r i u mm i x t u r e a 的特征利用与靶标亲和力的不同，a p t a m e r 迁移率随之不同，并且这种 不用有可预测的特性，收集不同时相的平衡混合物只用了三轮筛选就获得了拥有很强亲和 力的m u t s 蛋白的a p t a m e r 。利用毛细管电泳进行分离的s e l e x 技术出现后，极大地提高了 s e l e x 筛选富集效率大大缩短了s e l e x 筛选过程以后s e l e x 筛选技术中一定会大蕾应 用c e s e l e x 。 田3c e - s e l e x 漉程田p 。 132 超滤青心膜作为分离介质分离 邬芳玉川在运用s e l e x 法筛选适体时选用了超滤离心膜作为分离介质成功筛选出 了a f p - l 3 s s d n a 复合物。超澹离心膜有两部分组成，一部分为淀膜滤芯另一部分为套管， 进行分离离心时套管套住滤芯，将需要分离的液体加在滤芯上通过高速离心将来与靶标结 合的游离寡核苷酸滤掉，将与靶标特异性性结合的s s d n a 留在超滤离心膜上。根据靶标以及 核苷酸分子量的不同选用不同规格的超滤离心膜。超滤离心膜在s e l e x 技术中的应用可以满 足分离要求，而且操作简便。 西南大学硕士学位论文 1 3 3 磁珠、凝胶、微量滴定板等做为固相介质分离 因为采用硝酸纤维素膜迸液行相结合、滤膜分离、酚氯仿回收方法过程较为繁琐，酚氯 仿回收过程中又容易出现损失，现在出现了多种改良方法，将靶目标预先吸附到固相洗脱载体 上再进行适体筛选，即是其中的一种方法h o ，方法中采用的固相支持物可以是磁珠、凝胶、干燥 的硝酸纤维膜、尼龙膜、微量滴定板、胶体金等，这种改良过后的洗脱分离技术基于固体分离 介质容易洗脱，不易损失等的特性在进行s e l e x 筛选中利用固相介质进行分离已经大量应用 并多次筛选到了适体。 1 3 4 硝酸纤维素膜作为分离介质分离 经典s e l e x 实验系采用液相结合、滤膜分离、酚氯仿回收方法从随机库中筛选出特异性 的s s d n a1 4 1 。这个方法中采用的滤膜就是硝酸纤维膜。刘晓静1 4 2 1 采用了硝酸纤维素膜作为分 离介质筛选到了人t g f 3 r i ia p t a m e r 。这个方法是将硝酸纤维素膜浸湿后，置于真空抽滤网上， 用负压抽滤冲洗膜片，达到将与靶标结合的s s d n a 与游离s s d n a 分离的效果。这种方法虽然 操作时间较长，也比较繁琐，但想比较其他方法而言更容易富集到特异性亲和的目的序列。 1 4 核酸适体筛选分离方法的研究展望 通过s e l e x 技术筛选出能与靶标高度特异结合且亲合力高的核酸适体，但分离方法一致 是个难题，采用的分离介质往往不能有效的把与靶标亲和的s s d n a 与游离的s s d n a 分离开来， 同时s e l e x 技术耗时时间较长，一般需要5 一- - 2 5 轮才能富集到亲和力较强的适体。找寻到合 适的分离介质已经提高筛选时的富集效率是未来核酸适体筛选的重要方向。 8 第二章引言 第二章引言 近年的研究表明，d n a 和r n a 不仅起遗传信息储存和传递的作用，还可以藉自身形成的空 间结构与其它类型的分子相互作用，以此为基础建立随机寡核苷酸文库，施加选择压力( 结合靶 目标) ，淘选与靶目标高度特异结合片段的过程，被称为指数富集的配体系统进化( s y s t e m a t i c e v o l u t i o no fl i g a n db ye x p o n e n t i a le n r i c h m e n t , s e l e x ) 技术。筛选出的分子被称为核酸适体 ( a p t a m e r ) ，它通常是一系列单链核酸分子，一般由2 0 - 8 0 个碱基组成，对可结合的靶目标有严 格的识别能力和高度的亲和力。 采用s e l e x 方法筛选适体的关键问题是把与靶标结合的s s d n a 同未结合游离的s s d n a 分离的问题。本研究的主要探讨适体筛选过程中的筛选方法和分离问题。全文分为3 部分分 别探讨了3 种方法进行适体的筛选和分离： 采用s e l e x 方法筛选适体的关键问题是把结合了靶标的s s d n a 与游离s s d n a 或d s d n a 分离的问题。全文分为3 部分分别探讨了3 种方法进行适体的筛选和结合与游离d n a 分离： 一、活性琼脂凝胶f f 、纳米磁珠等颗粒型材料已经成功的作为s e l e x 技术筛选适体适当 分离介质，吸附在胶体金表面的猪瘟病毒单克隆抗体和h c g 单克隆抗体在相应的快速检测试 纸条上能产生明显的红色条带，说明吸附在胶体金表面的单克隆抗体的抗原结合部位仍然保 持活性状态。本文拟使用胶体金快速检测试纸条上的吸附了猪瘟病毒单克隆抗体和h c g 单克 隆抗体的胶体金为靶标和分离介质，并以这两种单克隆抗体互为反筛物，筛选单克隆抗体抗 原结合部位的适体。邬芳玉在其硕士论文中，成功的用超滤离心管作为分离介质筛选到适体， 本文拟用同样的方法筛选h c g 单克隆抗体的抗原结合部位的适体。 二、双链d n a ( d s d n a ) 文库筛选适体：传统s e l e x 技术筛选适体是用单链d n a ( s s d n a ) 或r n a ( s s r n a ) 文库进行多轮或几十轮筛选，才能得到适体。d n a 捕获元件系统( d n ac a p t u r e e l e m e n ts y s t e m ，d c es y s t e m ) 是以适体及它的互补链组成的d s d n a ，在双链的一端连磁珠， 另一端的两条链分别修饰荧光基团及淬灭基团构成f r e t 体系，用于高灵敏和特异性的检测相 应的靶标。2 0 0 8 年范茂棉等人提出了一种与传统的s e l e x 技术筛选适体不同的方法，新方法 用d s d n a 文库筛选，只需要1 2 轮。他们是根据d e c 的原理，建立了用双链随机d n a 快速 筛选特异性适体的方法。其机理是d s d n a 与靶标相遇时，如与d s d n a 有一个结合的切入点， 则d n a 双链就会像打开拉链样被彻底打开变成单链，其中一条s s d n a 会与靶标形成特异性 结合关系。把它与d s d n a 分离，扩增s s d n a 就得到特异性的适体。范茂棉等用s e l e x 技术 筛选出的适体，构建了炭疽芽孢、肉毒毒素、志贺样毒素和土拉热弗朗西丝菌四种d c e 系统， 然后将它们混合，再用炭疽杆菌芽孢从混合物中把炭疽杆菌芽孢适体筛选出来。随后，他们 用快速法筛选到肉毒梭菌的肉毒毒素适体。 9 两南大学硕+ 学位论文 本文拟用d s d n a 随机文库筛选h c g 单克隆抗体的适体，用胶体金快速检测试纸条上固 定在n c 膜上的抗体作为靶标，n c 膜做为分离介质，通过1 2 轮筛选后，用目的核酸进行阻 断试验，检测目的核酸的特异性。 三、变性复性法筛选适体：据报道d s d n a 在纯水中由于磷酸基团失去了阳离子的保护作 用，所以阴离子之间互相排斥，使d s d n a 在2 0 以下出现自然变性，形成s s d n a 。盐离子 有稳定d s d n a 的作用，一般d s d n a 在1 m 的n a c i 溶液中可长期保存。在一定条件下盐离子 浓度越高，d s d n a 变性的温度越高。向纯水中自然变性的d n a 溶液中加入n a c i 可以使s s d n a 复性，重新形成d s d n a 。d n a 最佳复性温度是在低于t m 值2 0 2 5 。 基于s e l e x 技术的s s d n a 或s s r n a 随机文库和范茂棉的d s d n a 随机文库都能筛选到 适体的情况，在分析了适体筛选的基本原理和d n a 核酸中、自身的性质，本文提出了用变性 复性法筛选适体理论。我们认为并不是所有的靶标都能有效的打开d s d n a ，但如果用s s d n a 随机文库为出发库，则所有的靶标都能在库中找到相应的d n a 序列，该序列经p c r 扩增后 形成d s d n a ，把d s d n a 自然变性，形成s s d n a ，s s d n a 与靶标结合后，升高温度和增加盐 离子浓度，配对的s s d n a 就会复性形成d s d n a ，而那些已经与靶标结合的s s d n a 序列就不 会形成d s d n a ，把d s d n a 与s s d n a 分开，就可以筛选到特异性的适体。变性复性法对所有 的靶标都能筛选到相应的适体，并且极大的缩短了筛选的时间。 本文拟以蛋白酶k 为靶标，以n c 膜和p d f v 膜作为分离介质，将膜浸在蛋白酶k 溶液 中，然后干燥。用变性复性法筛选蛋白酶k ，p a g e 电泳判断目的核酸条带，用巯基荧光探 针跟踪检测特异性寡核苷酸。 1 0 第三章s e l e x 法筛选猪瘟病毒核酸适体和h c g ( 促绒毛膜性腺激素) 核酸适体 第三章s e l e x 法筛选猪瘟病毒核酸适体和h c g ( 促绒毛膜 性腺激素) 核酸适体 3 1 试验