（分析化学专业论文）浮游植物吸收光谱分析方法研究.pdf

浮游植物吸收光谱分析方法研究 浮游植物吸收光谱分析方法研究 摘要 浮游植物种类和数量的测量是海洋科学研究中的一项基础性工作，随着我国 近海赤潮的频发，浮游植物种类和数量的监测分析方法已成为研究的焦点。吸收 光谱法作为常规的分析手段，仪器操作简便、性能稳定，且重复性好。可用于浮 游植物种类的识别和数量的测量，对于赤潮监测具有重要意义。 本文选取分属于6 个门类的1 5 种典型浮游植物赤潮种、优势种( 包括硅藻 门5 种：布氏双尾藻、圆海链藻、旋链角毛藻、柔弱角毛藻、中肋骨条藻；甲藻 门6 种：简裸甲藻、微型原甲藻、锥状斯比藻、塔玛亚历山大藻、裸甲藻、东海 原甲藻；金藻1 种：等边金藻；隐藻1 种；蓝藻1 种：聚球藻；绿藻1 种：岛国 大扁藻) ，在实验室三个温度( 2 5 、2 0 、1 5 ) 和四个光照( 1 8 0 0 0 1 u x 、 1 1 0 0 0 1 u x 、7 0 0 0 1 u x 、1 1 0 0 1 u x ) 条件下进行培养，对不同温度，光照，生长期 条件下浮游植物的吸收光谱特征进行了研究，识别浮游植物类别，并对混合浮游 植物吸收光谱进行了识别和浮游植物含量的估计。本论文主要研究成果如下： 1 考察了各浮游植物吸收光谱的相似性。目视结果表明：同门类的浮游植物吸 收光谱有较高的相似性，而不同门类的浮游植物吸收光谱有较大差异。其中：等 边金藻( 金藻) 和隐藻( 隐藻) 吸收光谱出峰位置少有差别且在3 4 0 n m - 5 0 0 1 ：l m 波长段内隐藻吸收峰较等边金藻要宽；聚球藻( 蓝藻) 和岛国大扁藻( 绿藻) 的 吸收光谱在4 0 0 5 0 0 n m 波段间分别有明显的三峰结构和两峰特征；硅藻和甲藻吸 收光谱比较相似，但在2 0 。c 和强光照条件下，实验所用的6 种甲藻均在小于 3 7 0 n m 处出现吸收峰。 2 对1 5 种浮游植物吸收光谱进行特征提取研究。首先，根据浮游植物吸收光谱 相似程度不同对其进行聚类分析，并利用主成分分析和聚类结果得到能表征各类 光谱共性信息的代表谱。然后，对浮游植物吸收光谱中具有较大判别能力的波长 点进行研究，得到两个特征波长段( 4 4 3 5 5 3 7 5 n m ；6 5 4 6 7 8 n m ) 。最后，我们 将代表谱的特征波长点组成了浮游植物吸收光谱的标准谱。 3 对浮游植物吸收光谱进行了模式识别。首先，运用距离判别法分别对本文所 选的1 5 种浮游植物的吸收光谱进行了判别分析。在种的层次上，代表谱和标准 谱的判别正确率均在8 0 以上；若将判别的层次降低到门上，正确率在9 5 以上。 中国海洋大学硕士论文 判别分析结果表明：本文所的得到的标准谱能够表征吸收光谱的所有信息。其次， 本文利用比值法对吸收光谱比较相似5 种硅藻和6 种甲藻其进行了识别研究。比 值分析表明：波长为4 4 0 h m 的吸光度和4 6 3 n m 波长的吸光度值之比a “o 他6 3 可以将硅藻和甲藻很好的区分开来。 4 对混合藻进行识别研究和藻中叶绿素a 含量的估计。本文采用遍历非负最小 二乘法对混合藻光谱在门类上进行识别，结果表明：对1 3 7 条混合藻的光谱进行 识别，识别正确率为8 6 1 ，结果理想。在混合藻识别正确的基础上进行藻中叶 绿素a 含量的估计，并运用叶绿素a 浓度来表示藻中叶绿素a 含量。叶绿素a 标 准品的浓度和吸光度具有良好的线性关系，线性范围为0 0 1 7 m g l 。在混合藻识 别正确的基础上，根据本文所采用的分析方法来确定检测限，得到该方法的检测 限为o 0 5 m g l 。 总之，本文对浮游植物吸收光谱分析方法进行了初步研究，得到了浮游植物 吸收光谱的标准谱；用比值法对硅藻和甲藻进行识别，可以将实验室培养的硅藻 和甲藻很好的分开；并对混合藻进行了识别研究和藻中叶绿素a 含量估计，实验 结果较理想。 关键词：浮游植物；吸收光谱；光谱特征；标准谱：比值法 浮游植物吸收光谱分析方法研究 s t u d i e so na b s o r p t i o ns p e c t r af o r i d e n t i f y i n gp h y t o p l a n k t o n a b s t r a c t m o m t o r i n gp h y t o p l a n k t o r ic l a s s e sa n dt h e i ra b u n d a n c ei sar o u n t i n et a s ki nm a r i n e s c i e n t i f i c w i t ht h ef r e q u e n to c c u r a n c 2 ：so fr e d - t i d ei nc o a s t a lw a t e ro fo u rc o u n t wa t p r e s e n t ，m o r ea n dm o r es c i e n t i s t sh a v eb e g a nt of o c u s o nt h es t u d yo fm o n i t o r i n g p h ，l o p l a n k t o nc l a s s e sa n dt h e i ra b u n d a n c e b e c a u s eu v s p c c t r o p h o t o m e t e ri se a s y ， s t e a d y ，a n dh a v eg o o dr e p e t i t i o n ，c a l lb eu s e dt oa n a l y s ep h y t o p l a r t k t o n i f t h ec l a s s e so f p h y t o p l a n k t o nc a n b ei d e n t i f i e df a s ta n dt h e i ra b u n d a n c ec a nb ec o n f i r m e de x a c t l y ，t h a t w i l lm a k eg r e a ts i g n i f i c a n c ef o rr e d - t i d e t h i sp a p e ra i m st os t u d yt h ec h a r a c t e r i s t i c so f t h ea b s o r p t i o ns p e c t r ao fp h y t o p l a n k t o na n dm a k es u r ew h i c hs p e c i e si si nt h em i x e d p h y t o p l a n k t o na n di t sc o n c e n t r a t i o n s i n g l es p e c i e s c u l t u r e so ff i f t e e nc o m n l o np h y t o p l a n k t o n , r e p r e s e n t i n gs i x d i v i s i o n s ，w e r eu s e d m i x t u r e so fp h y t o p l a n k t o nw e r ea l s op r e p a r e df o ra n a l y s i st h e y w e r ec u l t i v a t e du n d e rt h r e ed i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s ( 2 5 。c 、2 0 、1 5 c ) a r i df o u r i l t u m i n a t i o n s ( 1 8 0 0 0 1 u x 、1 1 0 0 0 1 u x 、7 0 0 0 1 u x 、1 1 0 0 1 u x ) + t h e nt h e i ra b s o r p t i o ns p e c t r aa t d i f f e r e n tg r o w x hp e r i o dw e r em e a s u r e d 。t h ef i n g e r p r i n tf e a t u r e sw h i c hp a ee x t r a c t e db ， s o m ec h e m o m e t r i c sm e t h o d s ，w a su s e dt oi d e n t i f yt h e s ed i f f e r e n tp h f t o p l a r & t o n s p e c i e s t h em a i nr e s e a r c hw o r ki sa sf o l l o w s ： 】s e e i n ga b o u tt h es i m i l a r i t yo fd i f f e r e n tp h y t o p l a n k t o n a l lo ft h ea b s o r p t i o ns p e c t r a o f p h y t o p l a n k t o nw e r ep u tt o g e t h e r ，t h es i m i l a r i t i sw e r eo b t a i n e d w i t he y e s w ef o u n d t h a ts o m ep h y t o p l a n k t o nb e l o n g i n gt ot h es a m ed i v i s i o na r ev e r ys i m i l a r ，a n db e t w e e n d i f f e r e n td i v i s i o nt l l e yh a v er e s p e c t i v ec h a r a c t e r i s t i c f o re x a m p l e ，t h o u g hi s o c h r v s i s a n dg c d b a n ar h o d o m o n a ss p h a v et h es a n ea b s o r p t i o na tt h es a l l l ep l a c e ，b u tt h e a b s o r p t i o ns h a p eo fg a l b a n ar h o d o m o n a ss p i sw i d e r t h a nl s o e h r v s i sb e t w e e n 3 4 0 n m - 5 0 0 n m ；t h ea b s o r p t i o ns p e c t r u mo fs n e c h o e o o c u ss p a n dp l a t ) , 7 o n a s h e l g o l a n i d i c ar e s p e c t i v e l yh a v et h r e ed e e pa b s o r p t i o n a n dt w o d e e pa b s o r p t i o n b e t w e e n4 0 0 n m - 5 0 0 n m ；p h y t o p l a n k t o nb e t w e e nb a c i l l a r i o p h y t aa n dd i n o p h y t aa r e m o r es i l i l a r ，b u tu n d e rd i f f e r e n ts i t u a t i o nt h ea b s o r p t i o no fd i n o p h y t aw i l lh a v ed e e p a b s o r p t i o na tt h ew a v e l e n g t hl e s st h a n3 7 0 n m t h i si sac l e a rd i f f e r e n c eb e t w e e n 中国海洋大学硕士论文 b a c i l l a r i o p h y t aa n dd i n o p h y t a t h i sa v a i l e df o rt h e i ri d e n t i f i c a t i o n 2 f e a t u r ee x t r a c t i o nm e t h o d sw e r es t u d i e d f i r s t l yt h em a t r i xm a d eu pb yp r i m i t i v e s p e c t r u md a t aw a sp r o c e s s e db yc l u s t e ra n a l y s i s ，t h er a t i ov a l u eo fs 1a n dz sw a s u s e dt oc o m p a r et h es i m i l a r i t i e so fs p e c t r a a c c o r d i n gt ot h ec l u s t e rr e s u l ta n dt h e s i m i l a r i t y , w eo b t a i n e dr e p r e s e n t a t i v ea b s o r p t i o ns p e c t r a , w h i c hh a v e t h em o s t i n f o r m a t i o no ft h ep r i m i t i v es p e c t r u md a t a t h ew a v e l e n g t h st h a th a v eg r e a ta b i l i t yt o d i f f e r e n t i a t es p e c i e sw e r ea b s t r a c t e db ym a t h e m a t i cm e t h o d sa n d2i n c o n t i n u o u s w a v e l e n g t h sw e r er e c e i v e d t h e ya r e4 4 3 5 - 5 3 7 5 n m ；6 5 4 6 7 8 n m f i n a l l y ，t h e2 i n c o n t i n u o u sw a v e l e n g t h so fa l lt h er e p r e s e n t a t i v es p e c t r am a k eu pt h es t a n d a r d s p e c t r a 3 u s i n gd i f f e r e n tm e t h o dt oi d e n t i f yp h y t o p l a n k t o n f i r s t l y ，d i s t a n c ed i s c r i m i n a n t a n a l y s i sw a sp r o c e s s e do nt h ef i f t e e np h y t o p l a n k t o n b o t ht h er e p r e s e n t a t i v es p e c t r a a n dt h es t a n d a r ds p e c t r a ，t h er e c o g n i t i o nc o r r e c tr a t ew a sm o r et h a n8 0 o nt h e s p e c i e s i fo nt h ed i v i s i o nl e v e l ，t h er e c o g n i t i o nc o r r e c tr a t ew a s m o r et h a n9 5 t h e n w ea l s ou s e dt h er a t i om e t h o dt oi d e n t i f yd i a t o m sa n dd i n o f l a g e l l a t e ，t h er a t i o a n a l y s i s i n d i c a t e dt h a tm 4 4 0 m 4 6 3c a n d i s t i n g u i s h d i a t o m sf r o md i n o f l a g e l l a t e s e f f e c t i v e l y 4 a s s e s s m e n to fp h y t o p l a n k t o nc l a s sa b u n d a n c eu s i n gt h en o n n e g a t i v el e a s ts q u a r e f r 叮n l s ) m e t h o d i nt o t a l ，13 7m i x t u r e so fp h y t o p l a n k t o nw e r ee x a m i n e do nt h e d i v i s i o nl e v e l t h er e c o g n i t i o nr a t ew a s8 6 1 w es t i l ld e a lw i t ht h em i x t u r e sw h i c h c a nb er e c o g n i z e dc o r r e c t l y , a n da s s e s st h ea b u n d a n c eo fe a c hp u r es p e c i e si nt h e m i x t u r e t h er e s u l ts h o wt h a t ：t h em i n i n m mo ft h ed e t e r m i n i n gr a n g ew a s0 0 5 m g l c h l o r o p h y l l a l m o r et h a no 0 5 m g lc h l - a c a nb eo b t a i n e dt h ea s s e s s e da b u n d a n c e i naw o r d ，t h i sp a p e rt a k et h ep r e l i m i n a r yr e s e a r c ht ot h ea b s o r p t i o ns p e c t r u mo f t h ep h y t o p l a n k t o n t h es t a n d a r ds p e c t r aw e r eo b t a i n e d t h er a t i om e t h o dw a su s e dt o i d e n t i f yd i a t o m sa n dd i n o f l a g e l l a t e ，a n dt h er a t i oa n a l y s i si n d i c a t e dt h a ta 4 4 0 a 4 6 3c a n d i s t i n g u i s ht h e me f f e c t i v e l y a tl a s t ，t h ec l a s sa n da b u n d a n c eo fp h y t o p l a n k t o nw a s a s s e s s e d ，a n dw e h a v eg o ts o m eg o o dr e s u l t k e yw o r d s ：p h y t o p l a n k t o n ；a b s o r p t i o ns p e c t r a ；c h a r a c t e r i s t i c o ft h es p e c t r u m ； s t a n d a r ds p e c t r a ；r a t i om e t h o d 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究】作及取得的研究成果。 掘我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写 过的删究成果，山不包含未获得i 逵! 麴遮杰：基也煎要挂别直盟 的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：否孝粥签字 期a 硼年g 月卯 学位论文版权使用授权书 本，i 吖沦交作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保黜爿。向国家有 父e 机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学 傅论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制于i 段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 、# f 节论叟作者签名：荽痞两 导师签字：张亏芗 ( 月rf 1签字f 1 期：函旧净占月jf 学似沦殳作者毕业后去向：海口 l 州1 1 、f ：lp 圈热带农, i k i ：t 学院分析测试中一巴 通讯地川：海南省海i - i l 市龙华区学院路4 号 电话：0 8 9 8 6 6 8 9 5 0 0 8 邮编：5 7 1 1 0 1 浮游植物吸收光谱分析方法研究 1 文献综述 浮游植物是海洋中主要的初级生产者，提供了海洋初级生产力的9 0 - 9 5 ( 李冠国，2 0 0 4 ) 。海洋生态环境的改变将直接导致浮游植物群落结构的变化。 浮游植物在一定环境条件下爆发性繁殖或聚集，引起水体变色并以一定形式表现 出来，在海洋中称为赤潮，其成因至今尚无定论。大量的研究结果表明，赤潮发 生的控制因素主要可分为：物理因素( 如：光照、温度和盐度等) ：化学因素， ( 如 营养盐和微量元素) ；生物因素( 如赤潮生物间的竞争和互助) 等( 黄小 平，2 0 0 2 ；王洪礼，2 0 0 3 ) 。赤潮的危害很大，已成为全球性的海洋灾害之一。 赤潮不仅使海洋生态系统失衡恶化、渔业资源和海产养殖业受损、制约着海洋产 业经济与海洋生态环境的协调持续发展，同时赤潮藻毒素严重威胁着海洋生物和 人类生命的安全，也给人类对海洋资源的开发带来了一定阻碍( 高洪峰，1 9 9 7 ： 周名江，2 0 0 1 ) 。 综上所述，对浮游植物进行定性和定量分析具有重要意义。从生态系统角度一 说，它为人类分析和研究海洋初级生产力提供了研究的基础g 从预防自然灾害的 角度，有助于人类了解赤潮发生的机理和危害，以便采取必要的措施，力争防止 赤潮的发生和减轻赤潮灾害带来的损失。 1 1 浮游植物种类识别和数量测定的光谱方法研究 浮游植物种类和数量的监测是海洋科学研究的一项基础性工作。近年来频发 的赤潮问题更凸显了海洋浮游植物研究工作的重要性( 张诚，1 9 9 6 ) 。辨别出海 洋中浮游植物的类别和浓度，可以了解海区内生态系统的群落结构和分布状态， 有效的监测和预报赤潮。近来，海洋浮游植物种类识别和数量测定的分析方法成 为国内外研究的热点( 张玉珍，2 0 0 3 ) 。目前使用和正在研究的方法，除传统的 显微镜方法外( 侯建军，2 0 0 4 ) ，主要有图像法( p e c h p a c h e c ojl ，1 9 9 8 ) ，高 压液相色谱法( g i b bsw ，2 0 0 1 ；r o d r i g u e zf ，2 0 0 2 ：f u r u y ak ，2 0 0 3 ：q l a n y ，2 0 0 3 ；姚鹏，2 0 0 3 ) ，流式细胞仪法( 焦念志，1 9 9 9 ；b o d d yl ，2 0 0 0 ；张利 华，2 0 0 2 ) ，化学发光流动注射法( a s a ir ，1 9 9 9 ) 和分子探针法( 于志刚等 2 0 0 3 ，2 0 0 4 ；侯建军，2 0 0 4 ) ，以及荧光光谱法和吸光光谱法。其中，光谱法具 有操作简便、分析速度快的优点。 利用荧光光谱法鉴定浮游植物色素种类的研究开始于2 0 世纪7 0 年代，美国研 中国海洋大学硕士论文 究者y e n t s c h 等( y e n t s c hcs ，1 9 8 5 ) 根据叶绿素辅助色素比率( c h l o r o p h y l l a c c e s s o r yp i g m e n tr a t i o ，c a p - r a t i o = f ( 5 3 0 ，6 8 5 ) f ( 4 5 0 ，6 8 5 ) ，其中f ( e x ， e m ) 等于激发荧光强度与发射荧光强度之比) ，识别硅藻甲藻球实 藻，绿藻，隐藻和蓝藻四个门类。k a i t a l a 等( k a i t a l a ，1 9 9 4 ，1 9 9 5 ) 发现辅助 色素与叶绿素的荧光比值不随生长周期变化，可以利用荧光光谱来分析浮游植物 群落的色素组成。2 0 世纪9 0 年代，德国h b e m o l d a e n k e 公司制造的荧光浮游植物 分析仪，可以测定并存储五个门类浮游植物的激发荧光光谱指纹，用于浮游植物 的粗略分类。2 0 0 3 年以来，张前前等( 2 0 0 4 ，2 0 0 5 ，2 0 0 6 ) 选择中国东海主要浮 游植物，尝试使用三维荧光技术对实验室培养的活体纯种浮游植物进行研究。测 量了各培养条件下1 1 种浮游植物的三维荧光光谱，从三维光谱数据中提取、选择 能够反映浮游植物本质信息的特征光谱，通过系统聚类分析将得到的每种浮游植 物的特征光谱进行分类，并建立了1 1 种东海典型浮游植物的标准荧光光谱谱库， 这在国内还属首次。随后，唐晓静( 2 0 0 6 ) 首次运用同步荧光光谱对试验选取的 1 0 种分属于4 个门类的中国东海典型浮游植物进行了研究，得至0 l o 种浮游植物标 准谱，并对浮游植物进行分类识别研究，成功的将本试验所用的甲藻和硅藻区分 开来。国内学者金海龙等( 2 0 0 6 ) 基于荧光光谱法对活体浮游植物进行了研究， 分析得到不同浮游植物的特征信息，为浮游植物活体识别提供了有效的分析手 段。 吸收光谱法最初主要用于浮游植物叶绿素的估计( r i c h a r de ta 1 。1 9 5 2 ) 和其他色素组分的估计( 8 i d i g a r e ，1 9 8 9 ；r o e s l e r ，1 9 8 9 ) 以及某些物质的测 量( y e n t s c h ，1 9 6 2 ) 。1 9 6 7 年，l o r e n z e n ( 1 9 6 7 ) 提出单色法用于对浮游植物 叶绿素a 的测定，此法只测定叶绿素a ，并对脱镁叶绿素8 的干扰进行了校正。 1 9 8 4 年，王建等( 1 9 8 4 ) 对浮游植物叶绿素与脱镁叶缘素的测定方法进行了研 究。2 0 0 0 年，陈宇炜等( 2 0 0 0 ) 对国内常用的丙酮萃取分光光度法和国际上较 通用的热乙醇萃取分光光度法测定浮游植物叶绿素a 含量进行了比较，发现两种 方法有显著统计差异及很好的相关性，并且热乙醇法具有操作简便、快捷，萃取 完全，低毒害等优点。随后，越来越多的研究者对浮游植物体内叶绿索a 测定方 法进行了研究和改进( 吴志旭，2 0 0 2 ；王振祥，2 0 0 4 ；李振国，2 0 0 6 ) 。有的研 究者( 朱晶晶，2 0 0 6 ) 还对浮游植物光合色素的提取方法进行了研究，对主要提 2 浮游植物吸收光谱分析方法研究 取技术进行了综述，并比较了各种方法的提取能力、保真性、广泛适用性、准确 性等。美国国家航空和宇宙航行局n a s a 第四版的海洋光学测量规范中给出了测 量海水样品中浮游植物、溶解有机物和颗粒物的标准方法( g i t c h e l le ta l ， 2 0 0 3 ) 。实验室研究表明，利用浮游植物的吸收光谱。可以部分识别浮游植物的 种类。 2 0 0 4 年，l e ezp 等( 2 0 0 4 ) 运用水色算法( o c e a n - c o l o ra l g o r i t h m ) 从遥 感反射光谱中分别导出叶绿素a 等各种色素的吸收光谱，并将其与传统的化学测 量方法( 滤膜过滤海水法) 得到的吸收光谱进行了对比，平均误差为2 1 4 。这 一结果显示：导数算法( i n v e r s i o na l g o r i t h m ) 适用于从沿岸海水的遥感反射 光谱导出各个色素的吸收光谱。对各种色素吸收光谱的研究信息将有利于科学家 利用遥感技术监测浮游植物的种类 2 0 0 5 年，m o o r ecm 等( 2 0 0 5 ) 运用h p l c 和荧光光谱相结合的方法，对北 大西洋春季赤潮区内的浮游植物的生物光学性质进行了研究，测量不同浮游植物 色素的特征，并用这些色素数据重构了浮游植物的吸收光谱。 应用吸收光谱法进行海洋浮游植物种类鉴别有体内( i nv i v o ) 和体外( i n v i t r o ) 两种方式。大多数研究都是选择浮游植物体外吸收光谱来消除色素的“包 络效应”( k o n o v a l o vbv ，1 9 5 9 , p f i e u rl1 9 8 1 ；h o e p f f n e r ，1 9 9 1 ) ，提高分 析的灵敏度。b a ry ( 1 9 9 0 ) 对紫球藻的体内和体外吸收光谱进行了研究，报道 了在室温下用紫外分光光度计测定了红藻门中紫球藻的活体吸收光谱( 如图1 1 所示) 和提纯的紫球藻藻红蛋白的吸收光谱( 如图1 2 所示) 。可以看出：体外 吸收光谱的基线比较高，峰形也不明显，这是由于色素的“包络效应”造成的， 对于体外吸收光谱即提纯的藻红蛋白其吸收峰在5 4 5 5 6 3 n m 处峰形明显。 对浮游植物色素的分析可用于浮游植物的分类和生物量的测定，因此浮游植 物色素经常被作为鉴定不同浮游植物和估测浮游植物群落组成的特征标示物。浮 游植物是由多种色素组成的海洋生物，这些色素组成了浮游植物的光合色素系 统，大致可将其分为3 类：叶绿素、类胡萝h 素和藻胆蛋白( 韩博平，2 0 0 3 ) 。其 中叶绿素a 是负责光合作用的主要色素，叶绿素b 、叶绿素c 、类胡萝h 素， 藻胆色素等都作为辅助色素。叶绿素a 存在于所有的浮游植物中，其浓度通常 用于估测浮游植物的生物量和生产力，而其降解产物则用于研究浮游植物的生理 3 中萤晦洋大学硕士论文 获溅、碎嚣禽量蠢猪食过程。其毽主要辖蘩盼绿素( 盱缭素b 和砖缘素e ) 、些 类胡萝卜素( 如岩藻黄质及其1 9 一衍生物、多甲藻黄质、玉米黄质、葱绿黄质 p r a s i n o x a n t h i n 、剐黄质) 、藻膳蛋臼( 藻蓝蛋白、藻红蛋自、剐藻麓蛋白) 的存 在与否是浮游植物分类豹重器特征( 赢洪峰，1 9 9 7 ) 。可见不薅浮游植物所含色素 的种类以及备色素的比例不间( k s ，1 9 8 9 ) ，加之各色素吸光度具有加和饿并 与该耪色素豹浓度残芷毙，联毅不羁浮游蕴物啜瘦光谱遥褰舆鸯不羁鹃强度秘形 状( 见图1 3 ) ，可作为其分类的依据。 笔 簧 譬 渡长 黼1 1 紫球藻的活体吸收光谱 鞋长( n ， 匿1 2 紫球藻藻数蛋白的吸收光谱 垃长血神 豳1 3 畦绿素8 ( ) 和许蠓素b ( 一) 的吸收光谨 常规的光谱数据分析的算法是基于b e e r 定律和加和性原理而建怠的多绦分 分光悲疫法分叛测量模型( 李恚爨，2 0 0 0 ) 。由于这秘方法怒建立冬筏单期嬲性 和良好线性关系的基础上，同时要求溶液中所有组分浓度已知，因此当溶液中存 在菜麓耒象缀分、蘸寝懿毒 线性或缀分之楚鸯强烈懿交蔓终悉薅，运耀鬻援稳分 析方法就会产生较大的误差，得到的结果不w 靠( 倪永年，2 0 0 4 ) 。 国于浮游植物垒物体多凭混合体系的复祭往，魏禽对这些竞谱数据送行分 浮游植物吸收光谱分析方法研究 析，达到区分海洋浮游植物种类和数量测定的目的，成为吸收光谱分析中的关键 和难点。我们要从吸收光谱大量的数据中挖掘出未被人们发现、但却十分有用的 最能反映本藻种特征的光谱数据信息。随着化学计量学的发展，吸收光谱法开始 与数学方法结合用于浮游植物的检测( h o e p f f n e r ，1 9 9 2 1h o e p f f n e r ，1 9 9 3 ) 。 研究传统化学方法难以解决的复杂问题( b r o w n , 1 9 9 5 ) 。近年来，国际上采用化 学计量学方法进行研究的文献报道日益增多，海洋化学家也开始尝试利用化学计 量学的各种方法对海洋浮游植物吸收光谱进行分析处理。如逐步判别分析、主成 分分析、偏最小二乘等方法开始用于海洋浮游植物种类和数量的分析。 j o h n s e n 和m i l l i e 等( j o h n s o ngo ，1 9 9 4 ；m i l l i edf ，1 9 9 7 ) 都利用“逐步 判别分析”对多浮游植物吸收光谱进行了研究。由于“逐步判别分析”采用的都 是和类胡萝卜素相关波长处的数据，而类胡萝b 素在绿、黄、橙光波长处的吸收 比叶绿素在蓝、红光波长处的吸收要弱的多，因此增加了消除。包络效应”的难 度。为了解决这个问题，k i r k p a t p i e k gj 等( 2 0 0 0 ) 第一次将“逐步判别分析” 结合“四阶导数分析”( b u t l e r w l ，1 9 7 0 ) 和“相似性算法”( g u i m a r a e sl v ， 2 0 0 1 ) 应用于测定天然浮游植物群落中裸甲藻的数量。但这种方法目前仅限于识 别裸甲藻，未用于其它浮游植物的识别。 a u g i r r e g o m e z ( 2 0 0 1 ) 运用导数分析方法处理海洋浮游植物的吸收光谱， 来测定浮游植物体内不同色素组分对其光谱特征的贡献。他们认为连续的吸收光 谱是每种组分的光谱合成的结果，运用该方法可以成功的将各种色素单一吸收光 谱特征提取出来。但是他们并没有将此方法得到的结果应用到海洋浮游植物的分 类和数量测定上。 c h a z o t t e sa 等( 2 0 0 6 ) 对浮游植物吸收光谱进行研究，运用统计学和自组 装图像法( s e l f - o r g a n i z i n gm a p s ) 对浮游植物色素含量进行估计。为了减少浮游 植物吸收光谱中冗余信息，使之成为更利于分析的数据集，作者用神经网络方法 对吸收光谱数据集进行预处理；在对吸收光谱进行处理的过程中，用图形的方式 ( 即自组装图像) 显示出色素浓度之间的关系，以便于对他们进行比较分析。然 后作者利用得到的自组装图像，选取其它色素浓度和叶绿素a 浓度之比的相关信 息，并给出了f u c o x a n t h i n t c h l - a 及t c h t - b t c h l - a 比率与浮游植物分别在5 1 0 n m 和6 4 0 n m 波长处的吸光度之问的关系。最后，作者尝试利用导数光谱分别获得 中国海洋大学硕士论文 了各个色素的浓度，并与用回归分析方法在4 4 0 n m 波长处得到的总叶绿素a 浓 度的方法相比，前者具有更好的精密度。作者指出这种分析方法的普遍适用性， 更易于分析巨大复杂的数据集 国内学者李继刚等( 2 0 0 0 ) 对浮游植物活体的吸收光谱进行了研究。通过对 中肋骨条藻、圆筛藻及两种甲藻在悬浮颗粒物存在的情况下的透光率曲线的研 究，提出了赤潮浮游植物与悬浮物光谱的辨别方法。该方法可用于浮游植物和悬 浮物浓度测量仪( 王世忠，2 0 0 1 ) ，由于没有考虑到黄色物质的干扰，因此对浮 游植物的识别受到限制。 刘雪锋等( 2 0 0 6 ) 运用人工神经网络技术，提出了一种从海中粒子吸收光谱 提取浮游植物吸收光谱的方法。基于现场实验结果表明，利用人工神经网络技术 从海中粒子吸收光谱导出的浮游植物的吸收光谱与化学方法得到的浮游植物的 吸收光谱比较，准确性很好，且其提取精度与传统的实验方法相当。 m o b e r g 等( 2 0 0 2 ) 研究了九种分属于六个门类的浮游植物的体外可见吸收 光谱。研究者对处于平稳期以后的浮游植物取样并测量光谱。先用窗口移动多项 式平滑对光谱进行平滑标准化处理，发现在4 4 0 5 4 0 n m 区间范围内类胡萝卜素及 一些辅助叶绿素( c h l b 和c h i c ) 光谱的不同。然后用“主成分分析”取其吸收光 谱的第一和第二主成分分别作为x 轴和y 轴成功将分属于不同门类的藻种区别开。 另外，m o b c r g 等用“最小二乘法”建立起数学模型对上述算法进行检验，得到 该算法的交叉有效验证的均方误差( a n d e r s o nkj ，2 0 0 3 ) 为8 6 ，即相对丰度 小于2 0 的浮游植物门类不能别分辨出来。作者宣称将来有可能通过互联网创建 浮游植物吸收光谱的数据库，该数据库可以方便的添加新物种的光谱和同类浮游 植物在不同生长条件下的光谱。据此数据库，运用化学计量学，建立光谱解析模型， 可以快速的对浮游植物色素进行分类。 王磊( 2 0 0 5 ) 利用吸收光谱对东海典型赤潮藻检测进行研究。对不同温度、 光照和生长周期条件下的浮游植物吸收光谱的进行了特征分析，运用主成分分析 等多种化学计量学方法得到了9 种浮游植物吸收光谱的标准谱，并尝试性的进行 了定量分析，获得了阶段性的研究成果。但还需要扩大实验藻种来充实和验证作 者的一些结论，对于混合光谱定量分析中的检出限和正确率等还需进一步完善。 本文的工作就是在王磊的基础之上进行的。 6 浮游植物吸收光谱分析方法研究 1 2 本文的研究内容和意义 本文针对东海赤潮多发区典型赤潮种、优势种的吸收光谱进行研究，为建立 浮游植物吸收光谱分析方法奠定基础。，本文研究的主要内容为： ( 1 ) 浮游植物吸收光谱的特征研究。包括不同温度、光照及生长周期下浮游植 物吸收光谱的相似性分析；浮游植物吸收光谱代表谱的形成；浮游植物特征波长 点的提取：浮游植物标准谱的建立：浮游植物的判别分析。 ( 2 ) 混合藻的识别和藻中叶绿素a 含量的估计包括混合藻种识别的结果讨论； 混合藻中叶绿素a 含量估计，及该方法的检出限。 随着我国海洋开发利用、环境检测以及海洋调查和研究的发展，迫切需要研 究新的简便的浮游植物识别方法。吸收光谱法作为常规的分析手段，仪器操作简 便、性能稳定，且重复性好。可以预见，随着吸收光谱不断深入研究和化学计量 学方法的发展，建立快速识别浮游植物种类及数量分析的光度法，对海洋研究、 开发和保护将具有重要的实用价值和应用前景，这对于海洋环境科学和海洋赤潮 监测都具有重要意义。 7 中国海洋大学硕士论文 2 实验部分 2 1 仪器和试剂 2 1 1 仪器 ( 1 ) 紫外可见分光光度计( s h i m a d z u u v - 2 5 5 0 ) ( 2 ) 光照培养箱( l r a - 2 5 0 - - ( 3 ) ( 3 ) 自动电热压力蒸汽灭菌器( l d z x - 4 0 8 1 型立式) ( 4 ) 多探头自动控制数字式水下照度计( z d s 1 0 w 系列) ( 5 ) 电热恒温真空干燥箱z - 8 8 ) ( 6 ) 水流抽气泵( 上海爱朗仪器有限公司) ( 7 ) 全玻滤器g l a s sm i c r o a n a l y s i sf i l t e rh o l d e r a s s e m b l y ( u s a ) ( 8 ) 多参数仪( m u l t i - p a r a m e t e ri n s t r u m e n tm u l t i3 0 4 i ) ( 9 ) 加液枪：1 把；枪头：若干 ( 1 0 ) 具塞比色管；若干；试管：若干 ( 1 0 ) 锥形瓶：1 0 0 0 m l 若干 ( 1 2 ) 移液管：5 m l 若干、l m l 若干 ( 1 3 ) p h 计( p h s 3 c 酸度计) 2 1 2 试剂 ( 1 ) 浓硫酸：分析纯( 烟台三和化学试剂有限公司) ( 2 ) 乙醇：分析纯( 烟台三和化学试剂有限公司) ( 3 ) 丙酮：分析纯( 烟台三和化学试剂有限公司) ( 4 ) 丙酮：h p l c 纯( 美国进口分装4 l ) ( 5 ) 叶绿素标准品( s i g m a 公司) ( 6 ) 0 4 5 肛m 醋酸纤维滤膜( 杭州海洋局二所) ( 7 ) o 7 岬w h a t m a ng f f 玻璃纤维滤膜( 德国进口) 2 2 浮游植物样品的采集和培养 2 2 1 样品的采集 本文所选的1 5 种浮游植物( 见表2 1 ) 包括：硅藻5 种，甲藻6 种，金藻1 种，隐藻1 种，蓝藻1 种，绿藻1 种。藻种由9 7 3 赤潮项目组提供，均由生物专 e 浮游植物吸收光谱分析方法研究 家鉴定纯化。藻种是依据n a s a 在2 0 0 3 年推出的海洋光学测量规范，在东海赤 潮多发区水域，通过采水的方法通过收集和浓缩。 表2 - 1 实验选用的1 5 种浮游植物名称及类属 编号种s p e c i e s类d i v i s i o n l 布氏双尾藻d i t y l w nb r i g h t w e l l i l ( d b )硅藻f b a c i l l a r i o p h y m 2圆海链藻t h a l a s s i o s i r ar o t u l a ( 仃) 硅藻f b a c i l l a r i o p h y , a 3 旋链角毛藻c h a e t o c e r o sc u r