（微生物学专业论文）解淀粉芽胞杆菌wh1抗真菌机制的研究.pdf

删删删燃2 0 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密否 如需保密，解密时间年 月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果。也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教瘴对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：朱炭报时阋：矽胗年多月7 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，印学生必须按照 学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本：学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容，并授权中国科学技术信息研究所和北京万方数据股份有 限公司将本入学位论文收录到强中国学位论文全文数据库，并进行信息服务( 包括 但不限于汇编、复制发行、信息网络传播等) ，同时本人保留在其他媒体发表论文 的权力 注：保密学位论文( 印涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在番要提交保密的 论文) 在解密后适用于本授权书 学位论文作者签名：弃发银 导师签名：扛凳三、 签名日期：驯矿年多月7 e l 签名日期：驯d年参月7 e l 注，请将本袭直接装订在学位论文的扉页和目录之问 究 1 4 1 细胞凋亡与特征9 1 4 2 细胞凋亡途径与凋亡机制1 0 1 4 2 1 死亡受体介导的细胞凋亡通路l o 1 4 2 2 线粒体细胞色素c 介导的凋亡通路1 0 1 5 真菌细胞凋亡l l 1 5 1 真菌细胞凋亡的特征与检测1 2 1 5 1 1 细胞的形态学检测1 2 1 5 1 2r o s 积累的检测1 2 1 5 1 3 磷脂酰丝氨酸外翻检测1 3 1 5 1 4d n a 断裂的检测1 3 1 5 1 5 线粒体膜电位的检测1 4 1 5 1 6c a s p a s e 的检测1 4 1 5 2 真菌细胞凋亡的信号通路1 4 1 5 2 1r a s 通路1 5 1 5 2 2 性激素应答通路1 5 1 5 3r o s 是真菌细胞凋亡的一个主要调节剂。1 5 1 5 4 抗真菌物质导致的真菌细胞凋亡1 6 1 6 研究意义1 6 2 材料与方法1 8 2 1 材料l8 2 1 1 菌种18 2 1 2 主要培养基1 8 2 1 3 实验试剂和仪器。1 8 1 2 4 5 5 5 6 6 7 8 9 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 2 2 实验方法19 2 2 1 抗植物病原真菌的水稻内生菌的分离鉴定与抑菌谱的构建1 9 2 2 1 1 抗植物病原真菌的水稻内生菌的分离纯化1 9 2 2 1 2 分离内生菌的分子与形态鉴定1 9 2 2 1 3w h l 无菌发酵液的获取2 0 2 2 1 4w h l 对水稻纹枯病菌的抗菌活性测定2 0 2 2 1 5w h l 发酵液抑菌谱的测定2 0 2 2 1 6w h l 发酵液抑制油菜核盘菌的离体叶片实验2 1 2 2 2 抗真菌活性物质的鉴定一2 1 2 2 2 1w h l 发酵液中抗真菌物质的纯化2 1 2 2 2 2 抗真菌活性物质的薄层层析分析2 1 2 2 2 3 抗真菌活性物质的红外分析2 2 2 2 2 4w h1f u n g i n 的t r i c i n e s d s p a g e 检测2 2 2 2 2 5w h l f u n g i n 的液相色谱电喷雾质谱( l c e s i m s ) 分析2 2 2 2 2 6w h l f u n g i n 酸水解产物的薄层层析2 3 2 2 2 7w h l f u n g i n 浓度的测定2 3 2 2 3w h l f u n g i n 处理细胞的葡聚糖合酶活性检测2 3 2 2 4 依文思蓝染色分析2 4 2 2 5 真菌细胞的凋亡检测2 4 2 2 5 1 双苯甲亚胺( h o e c h s t3 3 2 5 8 ) 染色分析2 4 2 2 5 2a n n e x i nv - f i t c 标记分析。2 5 2 2 5 3r o s 积累的检测2 5 2 2 5 4t d t 介导的d u t p 缺口末端标记分析( t u n e l 分析) 2 6 2 2 5 5c a s p a s e 的活性测定一2 6 2 2 5 6w h l f u n g i n 诱导真菌凋亡的剂量分析2 7 2 2 5 7r o s 清除剂对真菌细胞凋亡的影响2 7 2 2 5 8 添加寡霉素对w h l f u n g i n 诱导凋亡的影响2 7 2 2 6w h l f u n g i n 诱导假丝酵母凋亡后细胞色素c 释放情况检测2 8 2 2 6 1 假丝酵母细胞色素c 的纯化2 8 2 2 6 2 假丝酵母细胞色素c 多克隆抗体的制备与效价测定2 8 2 2 6 3 假丝酵母线粒体的纯化2 8 2 2 6 4e l i s a 测定细胞色素c 的释放2 9 2 2 7w h l f t m g i n 相互作用蛋白的分离纯化及鉴定2 9 2 2 7 1 亲和层析柱的制备2 9 2 2 7 2 酵母总蛋白的提取3 0 2 2 7 3 与w h l f u n g i n 相互作用蛋白的亲和层析纯化与鉴定3 0 解淀粉芽胞杆菌w h i 抗真菌机制的研究 2 2 8a t p a s e 活性的测定3 0 2 2 8 1 细胞的处理和总蛋白的提取3 0 2 2 8 2a t p a s e 活性的测定31 3 结果与分析3 2 3 1 水稻内生菌的分离及对病原茵抑茵活性分析3 2 3 1 1 水稻内生菌的分离鉴定3 2 3 1 2w h1 平板抑茵活性分析3 4 3 1 3w h l 对接种核盘菌的油菜离体叶片的抗菌保护分析3 4 3 。2 抑菌活性物质的分离纯化与鉴定3 5 3 2 1 抑菌活性物质的葡聚糖层析柱分离与活性测定3 5 3 2 2 抑菌活性物质的薄层层析分离与抑菌活性检测3 5 3 2 3 抑菌活性物质的红外图谱分析3 6 3 2 4w h l f u n g i n 的t r i c i n e s d s p a g e 检测3 7 3 2 5w h1f u n g i n 酸水解产物的薄层层析3 7 3 2 6w h1f u n g i n 的l c e s i m s 分析3 7 3 3w h l f u n g i n 抑制真菌细胞的葡聚糖合酶3 8 3 4 高浓度的w h l f u n g i n 可导致真菌细胞坏死4 0 3 5w h l f u n g i n 可诱导真菌细胞凋亡4 l 3 5 1 双苯甲亚胺( h o e c h s t3 3 2 5 8 ) 染色分析4 l 3 5 2a n n e x i nv f i t c 标记分析4 2 3 5 3r o s 积累的检测4 3 3 5 4t l 刀n e l 分析4 4 3 5 5c a s p a s e 活性的检测4 5 3 5 6w h l f u n g i n 诱导真菌凋亡的剂量分析4 6 3 6w i l l f u n g i n 诱导凋亡影响因素分析4 6 3 6 1 清除r o s 对w h l f u n g i n 诱导凋亡的作用4 6 3 6 2 添加寡霉素对w h l f u n g i n 诱导凋亡的影响4 6 3 7 凋亡假丝酵母中细胞色素c 的释放4 8 3 8 假丝酵母中与w h l f u n g i n 相互作用蛋白的分离纯化与验证4 9 3 8 1 假丝酵母中与w h l f u n g i n 相互作用蛋白的分离纯化与鉴定4 9 3 8 2 真菌的a t p 酶活性测定5 l 讨论5 2 参考文献5 5 致谢6 2 附录6 3 解淀粉芽胞杆菌w i l l 抗真菌机制的研究 摘要 研究表明，多种芽胞杆菌都可以产生环状脂肽类物质来抑制植物病原真菌的生 长。本研究从水稻根部分离出一株有较广抑菌谱、能产生脂肽的解淀粉芽胞杆菌 w h l ，并通过两步萃取、凝胶过滤层析等方法从w h i 发酵液中纯化到了其产生的 脂肽。经薄层层析、红外图谱、电喷雾质谱等分析后发现其是一种s u r f a c t i n 类的脂 肽，将其命名为w h l f u n g i n 。本研究还对w h l f u n g i n 的抑菌机制进行了研究。 在抑菌试验中发现用1 0 0g g m l 的w h l f u n g i n 处理真菌能使真菌坏死，同时也 检测到了核浓缩、d n a 断裂、活性氧( r o s ) 积累、磷酯酰丝氨酸( p s ) 外翻、c a s p a s e 活性上升等凋亡特征。 研究表明r o s 在真菌凋亡中起到非常重要的作用，实验中用脯氨酸、抗坏血酸 或还原型谷胱甘肽等活性氧清除剂处理后检测到活性氧积累减少，但磷脂酰丝氨酸 外翻并不呈相应的减少，表明w h l f u n g i n 诱导的细胞凋亡不完全依赖于活性氧积累。 实验中发现经w h l f u n g i n 处理后真菌的葡聚糖合酶活性有明显下降。而葡聚糖 合酶活性的降低会导致胼胝质合成量的减少，使新形成细胞没有足够的胼胝质来合 成细胞壁，而细胞壁不完整的细胞更加容易发生细胞凋亡。 实验中还利用亲和层析分离到了与w h l f t m g i n 相互作用蛋白，经肽指纹图谱分 析其为线粒体f a t p a s e ，在后续的检测中也验证了经w h l f u n g i n 处理后的真菌细胞 的a t p a s e 活性明显下降。在用f i t c 标记的w h l f u n g i n 处理细胞后能检测到其结合 到线粒体膜上，验证了w i l l f u n g i n 能作用于线粒体。寡霉素是线粒体f o f l a t p a s e 的抑制剂，w h l f u n g i n 处理的真菌细胞在加入寡霉素后凋亡现象更为显著，进一步 验证w h1f i m g i n 能通过作用于线粒体a t p a s e 来发挥促真菌凋亡的作用。 综上所述，w h l 产生的脂肽在低浓度时可通过诱导凋亡的方式表现出抗真菌活 性，这种凋亡可能是通过抑制葡聚糖合酶活性及作用于线粒体a t p a s e 完成的。在 自然生态中芽胞杆菌产生的脂肽并不足以导致细胞膜的穿孔，但却可诱导凋亡的发 生，由此推断，w h l f u n g i n 诱导的细胞凋亡可能在解淀粉芽胞杆菌对真菌的拮抗作 用中起重要的作用。 关键词：解淀粉芽胞杆菌；脂肽；真菌；凋亡 华中农业人学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 a b s 仃a c t s o m es p e c i e so fb a c i l l u sc o u l dp r o d u c el i p o p e p t i d e sf o rc o n t r o l l i n gp l a n tp a t h o g e n i c f u n g i i nt h i ss t u d y , w ei s o l a t e das t r a i no fb a m y l o l i q u e f a c i e n s ，c a l l e da sw h1 ，f r o mt h e r i c er o o t w h1c o u l dp r o d u c el i p o p e p t i d e ，w hlf u n g i n ，t oi n h i b i ts e v e r a lp l a n tp a t h o g e n i c f u n g i w h 1f u n g i nc o u l db ei s o l a t e df r o mt h ec u l t u r eo fw h1 b ye x t r a c t i o na n dg e l f i l t r a t i o n ，a n dc h a r a c t e r i z e da sa na n t i - f u n g a ll i p o p e p t i d e ( s u r f a c t i n ) b yt h i nl a y e r c h r o m a t o g r a p h y , i n f r a r e ds p e c t r u m ，t r i c i n e s d s p a g ea n dm a s ss p e c t r u m w ea l s o s t u d i e do nt h ea n t i - f u n g a lm e c h a n i s mo fi t a f t e rt r e a t e db yw h1f u n g i n ，i tw a sf o u n dt h a tw h if u n g i nc o u l dd i r e c t l yk i l ls o m e f u n g a lc e l l sb ye l i c i t i n gp o r e so nm e m b r a n e ，w h i l ew h 1f u n g i na l s oc o u l di n d u c e a p o p t o s i s c l a s s i ca p o p t o t i cm a r k e r ss u c ha sn u c l e u sc o n d e n s a t i o n ，r o sa c c u m u l a t i o n ， p se x t e r n a l i z a t i o n ，d n as t r a n db r e a k sa n dh i g hc a s p a s e - l i k ea c t i v i t yw e r ed e t e c t a b l e b e c a u s er o si sak e yf a c t o rf o rf u n g a la p o p t o s i s ，f u r t h e ri n v e s t i g a t i o nw a sd o n ef o r e l u c i d a t i n gt h er o l eo fr o si na p o p t o t i cf u n g a lc e l l s w h e nf u n g a lc e l l sw e r et r e a t e db y w h1f u n g i n ，a n t i o x i d a n t ss u c ha sa s c o r b i ca c i d ，p r o l i n ea n dr e d u c e dg l u t a t h i o n e ( g s h ) w e r eu s e df o rc l e a n i n gr o sr e s p e c t i v e l y i tw a sf o u n dt h a ta s c o r b i ca c i dh a dn oe f f e c to n t h er o s ，w h i l ep r o l i n ea n dg s hc o u l d s i g n i f i c a n t l y i n h i b i tr o sa c c u m u l a t i o ni n w hlf u n g i n t r e a t e df u n g a l c e l l s u n f o r t u n a t e l y , c l e a no fr o sb yp r o l i n ea n dg s h c o u l d n ti n h i b i tt h er e l e v a n tp se x t e r n a l i z a t i o ni nf u n g a lc e l l s i tw a sr e p o r t e dt h a ts e v e r a lc y c l i cl i p o p e p t i d e sc o u l di n h i b i tt h ea c t i v i t yo ff u n g a l g l u c a n es y n t h a s e ，r e s u l t i n gi nas y n t h e s i sd e c r e a s eo fc a l l o s e n e wg e n e r a t e df u n g a lc e l l s w i t h o u te n o u g hc a l l o s ef o rf o r m i n gc e l lw a l lw e r ee a s i l yf o u n di na p o p t o s i s i nt h i ss t u d y w ef o u n dt h e a c t i v i t y o ff u n g a lg l u c a n es y n t h a s ew a s o b v i o u s l yd e c r e a s e d ，a n d c o r r e s p o n d e n ta p o p t o t i cm a r k e r sc o u l db ed e t e c t e di nw h 1f u n g i n - t r e a t e df u n g a lc e l l s i no r d e rt od e t e c tt h e t a r g e t e dp r o t e i n s o fw hif u n g i n , w eu s e dw h1f t m g i n c o n j u g a t e ds e p h a r o s e4 bt oi s o l a t ep r o t e i n si nf u n g a lc e l l s ap u r i f i e dp r o t e i nw a s c o l l e c t e da f t e ri s o l a t i o n b yt h i sa f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y , a n d w a si d e n t i f i e d 鹤a m i t o c h o n d r i a lf - a t p a s eb yp e p t i d em a s sf i n g e r p r i n t i n g a f t e rt r e a t e db yf i t cl a b e l e d 2 m e m b r a n e a sac o n c l u s i o n ，l o wl e v e lo fw h1f u n g i np r o d u c e db yw h1c o u l ds u p p r e s st h e f u n g a lg l u c a n es y n t h a s e ，i n h i b i tt h em i t o c h o n d r i a la t p a s e ，a n dt h e ni n d u c ea p o p t o s i si n f u n g a lc e l l s n o r m a l l yb a c i l l u sc o u l d n tp r o d u c ee n o u g hl i p o p e p t i d et oe l i c i tp o r e so n f u n g a lm e m b r a n ei nt h en a t u r a le n v i r o n m e n t ，s ow ed e d u c e dt h a ti n d u c t i o no fa p o p t o s i s m i g h tb et h ec o m m o na n t i - f u n g a lm e c h a n i s mo f b a c i l l u si nt h en a t u r a lh a b i t a t k e yw o r d s ：b a c i l l u sa m y l o l i q u e f a c i e n s ；l i p o p e p t i d e ；f u n g i ；a p o p t o s i s 3 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 缩略语表( a b b r e v i a t i o n s ) 4 淀粉芽胞杆菌w h i 抗真菌机制的研究 染严重，生物防治受到青睐 随着单一品种农作物的大面积种植，植物病虫害也越来越猖獗，如何对其进行 有效的防治已经成为农业生产的一个刻不容缓的问题。现今有化学防治和生物防治 两种主要的防治方法，而且到目前为止前者所占比例仍然占优。化学防治具有一系 列的优点，如杀虫谱广、见效快、应急性强、价格低廉和操作简单等，但是长期大 量使用容易使病虫产生抗药性，杀伤天敌，由此还造成了环境及农产品污染的问题。 而生物防治，由于其无毒无害，对环境友好、污染小、易降解、残留低、病虫害不 易产生抗性、在田间可以长期控制病虫害的发生等优点正越来越受到人们的青睐。 在已经批准使用的植物病害生防剂中，苏云金芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌等芽胞杆菌 已成为重要的病害生防制剂而得到应用。芽胞杆菌类除了苏云金芽胞杆菌和枯草芽 胞杆菌外，其它如解淀粉芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌等也被发现具有广谱的抗菌活性 而受到人们的重视( 管瑶等，2 0 0 7 ；a r g u e l l e s a r i a se ta 1 ，2 0 0 9 ) 。 1 2 芽胞杆菌分布广泛、无毒无害、抑菌谱广 芽胞杆菌是一类好氧、能产芽胞的革兰氏阳性的杆状细菌，在自然界中分布非 常广泛，生理特性丰富多样，是土壤和植物微生态的优势种群( 唐娟等，2 0 0 8 ) ，同 时还是常见的植物内生细菌，尤其是在植物的根部和低茎部位。由于芽胞杆菌生长 繁殖速度很快、营养需求却很简单、还具有芽胞抗逆性强和易于在植物根系周围定 殖等特点，使其在植物病害的生物防治中被广泛的研究和利用( 任争光等，2 0 0 6 ) 。 这主要是由于芽胞杆菌能产生耐热抗逆的芽胞以及种类繁多的抗菌物质，而且这些 抗菌物质易于降解，许多都被鉴定出具有环状脂肽( c y c l i cl i p o p e p t i d e ) 的特征 ( v a n i t t a n a k o me ta 1 ，1 9 8 6 ) 。芽胞对热、干燥、紫外辐射和有机溶剂等都具有很强 的抵抗力。研究表明许多芽胞杆菌，如枯草芽胞杆菌( b s u b t i l i s ) ，蕈状芽胞杆菌( 口 m y c o i d e s ) 和解淀粉芽胞杆菌( 口a m y l o l i q u e f a c i e n s ) 等，都可以产生某种抑菌活性 物质来抑制多种植物病原真菌和人类病原真菌的生长( o n g e n aa n dj a c q u e s 。2 0 0 8 ) 。 华中农业大学2 0 1 0 届硕上研究生学位论文 经田间应用研究证实，芽胞杆菌生防菌剂在稳定性、与化学农药的相容性和在不同 植物、不同年份的防效等方面，明显优于非芽胞类细菌和真菌生防菌，是一种理想 的生防微生物( 陈中义等，2 0 0 3 ) ，由此众多科技工作者对其产生了浓厚的兴趣和极 大的关注。 1 3 脂肽种类繁多，功能多样，应用前景广泛 1 3 1 脂肽种类繁多 芽胞杆菌产生的环状脂肽是由一个脂肪酸链与连接的多肽形成一个环，所以脂 肽是一种生物学上的表面活性剂，它包括一个亲脂和一个亲水基团，具有抗高温、 抗逆、适应性广等特点。目前发现的环状脂肽已有十多种，根据其结构主要分为枯 草菌素( s u r f a c t i n ) 、伊枯草菌素( i t u f i n ) 和芬荠素( f e n g y c i n ) 等三大类。s u r f a c t i n 具有很高的生物表面活性剂活性，所以又称之为脂肽表面活性剂，具有抗真菌 ( b e m h e i m e re ta 1 ，1 9 7 0 ) 、抗肿瘤( k a m e d ae ta 1 ，1 9 7 2 ) 、抗支原体( v o l l e n b r o i c he t a 1 ，1 9 9 7 ) 、抗病毒( k r a c h te ta 1 ，1 9 9 9 ) 和一定程度的抗细菌( t s u k a g o s h ie ta 1 ，1 9 7 0 ) 活性。i t u r i n 和f e n g y c i n 具有广谱的抗真菌活性，尤其对丝状真菌有极好的抑制效果 ( v a n i t t a n a k o me ta 1 ，19 8 6 ) 。 s u r f a c t i n 是一类脂肽抗生素，脂肽分子中的多肽链形成亲水基，脂肪酸链则形 成亲脂基。亲水的氨基酸能和脂肪酸链上的羧基、羟基或氨基结合而形成环状，因 此，脂肽类生物表面活性剂一般是以内酯或酰胺键结合而成的环状脂肽。如枯草芽 胞杆菌产生的s u r f a c t i n ，是p 羟基脂肪酸和肽以内酯键结合( 崔艳红和黄现青，2 0 0 6 ) 。 多数细菌产生的脂肽表面活性剂是七元肽，d 羟基脂肪酸的碳原子数为1 2 1 7 个( 杨 福廷，2 0 0 6 ) ，多肽中典型的氨基酸顺序为：l g l u l l e u - d l e u 叶l v a l _ l a s p _ d l e u 叶l l e u 。不同的s u r f a c t i n 主要是其肽链的2 、4 或者7 位氨基酸的不同，以及脂 肪酸链的长短变化。其中根据其第七位氨基酸是亮氨酸，缬氨酸，还是异亮氨酸依 次分为s u r f a c t i n a 、b 、c 三个类群。其基本结构式如图1 1 a 所示。 i t u r i n 是d e v i g n a t 和d e l c a m b e 最先发现和命名的，1 9 5 7 年他们发现其分离的一株 枯草芽胞杆菌能产生一种强烈抑制真菌生长的物质，命名其为i t u r i n ，中文译为伊枯 草菌素。i t u r i n 是一类小分子环状脂肽类物质，其中包括l t u r i na 、b 、c 、d 、e 和芽 6 解淀粉芽胞杆菌w h i 抗真菌机制的研究 胞菌素( b a c i u o m y c i n ) d 、f 、l 等，其中以i t u r i na 抗真菌的活性最强( 张彦杰等，2 0 0 9 ) 。 它们都是由7 个氨基酸残基组成的一个肽环，然后与一个含1 3 1 7 碳原子的p 胺基脂 肪酸( 这与其它环状脂肽有显著的差别) 连接而成，其结构式见图1 1 b 。 1 9 8 6 年，v a n i t t a n a k o m 等人在枯草芽孢杆菌中发现了一种抗丝状真菌而对酵母和 细菌不起作用的活性物质，命名为f e n g y c i n ( v a n i t t a n a k o me ta 1 ，1 9 8 6 ) 。f c n g y c i n 是 含1 6 1 9 个碳原子的脂肪酸链与l o 个氨基酸相连而形成的另一种环状脂肽，其对丝状 真菌有显著的抑制活性，与其它环状脂肽不同的是只有后面8 个氨基酸参与形成肽 环。根据第6 位氨基酸的不同分成f e n g y c i na 和b ，f e n g y c i na 为d 一丙氨酸，而 f e n g y c i nb 为n 缬氨酸。基本的分子结构式见图l l c 。 c h 3 ( c h = ) 8 b e h c h 2 c o i 广g l u l l e u 专d l u ll a o 卜l l e u 卜d l e u 卜l 舢p 卜l l c h 3 化h 2 b m i h c h 2 c 。一l 舡n d 。b r d 。缸i l n h 一l s e r 卜d 缸n 一l p r o - k g l u b 嘶哑u h c h 2 0 h 乩铀m 咖1 聊1 n m 珊吐伽1 il a ：x = a i a 0 一l m _ d t 弦p l 锄一i r n o c b ：x = v a l 图1 1 环状脂肽的基本分子结构式 f i g 1 - 1m o l e c u l a r s t r u c t u r eo fc y c l i cf i p o p e p t i d e a 是枯草菌素，b 为伊枯草菌素，c 为芬荠素： ai ss u r f a c t i n ，bi si t u r i n ，ci sf e n g y c i n 1 3 2 脂肽类抗生素功能多样，应用前景广泛 产环状脂肽微生物的高度多样性( m o f f i t ta n dn e i l a n ，2 0 0 0 ) 和环状脂肽化学结构 的明显不同说明，微生物产生环状脂肽的作用是不同的，可能具有多重功效( 侯红 漫等，2 0 0 6 ) 。 最初人们对环状脂肽类生物表面活性剂感兴趣，主要是因其具有高效、低毒、 无污染等优点，可替代化学表面活性剂，例如发泡和促进疏水性物质( 如碳水化合物、 脂质、固醇等) 的溶解，以提高细胞的同化作用。随着研究的深入和广泛进行，有关 7 华中农业大学2 0 10 届硕士研究生学位论文 脂肽的功能报道越来越多，例如在石油开采中的应用，除去受污染土壤中的重金属 离子，降解有害农药等( g r a n g e m a r de ta 1 ，2 0 0 1 ) 。环状脂肽除具有生物表面活性剂 的功能外，近年来发现其还具有对潜在的其他生物体的抗性作用。例如，枯草芽胞 杆菌产生的脂肽类抗生素i t u r i na 具有广谱抑制植物病原菌的作用。达托霉素对革兰 氏阳性菌( g + ) 有广谱抗性，包括许多有多重抗药性的菌群( s c h r i e v e r e ta l ，2 0 0 5 ) ， 2 0 0 3 年获得美国f d a 批准用于医疗应用( 刘伯宁，石磊和蒋沁，2 0 0 7 ) 。还有一些 脂肽的抗肿瘤活性也得到了关注，此外还有报道具有促进细菌聚集作用( l i n d u m e t a 1 ，1 9 9 8 ) 。现在有许多研究者对芽胞杆菌产生的脂肽产生了浓厚的兴趣，关注的内 容主要包括它很高的表面活性和潜在的疗效方面的特性。由于其特殊的化学组成和 两亲型分子结构，作为生物表面活性剂在医药、食品、化妆品及微生物采油等领域 有重要的应用前景，已成为研究开发的热点。 1 3 3 脂肽抑菌机制 文献报道脂肽具有抗真菌、抗病毒、抗支原体和抗肿瘤活性，普遍认为这是凭 借其特殊结构而与细胞膜相结合，然后发挥其表面活性剂的作用影响细胞膜表面张 力，最终导致微孔的形成，k + 及其他重要离子的渗漏，最后引起细胞死亡( f e i g n i e r e ta 1 ，1 9 9 5 ；t o u r 6e ta 1 ，2 0 0 4 ；d e l e ue ta 1 ，2 0 0 8 ) 。 脂肽抑菌的机制可能不仅仅局限于此，近几年不断有人报道脂肽能诱导细胞凋 亡。2 0 0 7 年，k i m 等人( 2 0 0 7 ) 报道称晟s u b t i l i s 产生的s u r f a c t i n 能通过诱导凋亡 的方式抑制人结肠癌细胞系的增生，w a n g 等人( 2 0 0 7 ) 也在同年报道b s u b t i l i s n a t t o t - 2 产生的一种环状脂肽可以诱导人白血病k 5 6 2 细胞发生细胞凋亡。w r a s i d l o 等做了更为细致的工作，他们发现一株海洋巨大鞘丝蓝细菌( l y 刀g b y am a j u s c u l a ) 产生的脂肽s o m o c y s t i n a m i d ea 能通过细胞外和细胞内通路诱导细胞凋亡，并且经 s i r n a 技术使c a s p a s e8 沉默后能显著提高细胞对s o m o c y s t i n a m i d ea 的耐受性 ( w r a s i d l oe ta 1 ，2 0 0 8 ) 。近期c a o 等人报道s u r f a c t i n 能通过r o s 删k 介导的线粒体 c a s p a s e 通路诱导人乳腺癌细胞m c f 一7 发生凋亡( c a oe ta 1 2 0 1 0 ) 。 8 解淀粉芽胞杆菌w h i 抗真菌机制的研究 知道的细胞死亡方式至少有两种：细胞坏死和细胞凋亡 细胞因病理而产生的被动死亡，如受到强烈理化或者生物 因素作用而引起的细胞无序变化的死亡过程。而细胞凋亡则是1 9 6 5 年澳大利亚科学 家最先报道的，研究中他们结扎鼠门静脉后在鼠肝细胞中发现了一些完全不同于坏 死能保持溶酶体完整的死亡细胞，这些细胞从其周围组织中脱落、细胞皱缩、染色 质凝集。1 9 7 2 年k e r r 等三位科学家首次提出了细胞凋亡的概念，才开始了对细胞凋 亡的真正探索之路。 细胞凋亡本质上是一种程序性细胞死亡( p r o g r a m m e d c e l ld e a t h ) ，是机体在不 利条件下，启动自身内部机制，经过多途径的信号传递，结束其自身生命的过程。 它是一个主动过程，是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程( 李超等， 2 0 0 7 ) 。 细胞凋亡发生早期细胞会膨胀变圆，与邻近细胞的联系断绝并脱离后皱缩，这 一特征用光学显微镜就能观测到，如果用电子显微镜则能更好的观测亚细胞结构的 变化。在细胞质中，内质网肿胀积累细胞液形成液泡；在细胞核中，染色质浓缩逐 渐形成新月状并附在细胞核周围，这被认为是凋亡最典型的特征。最终细胞核断裂， 染色体d n a 被切成以核小体为单位的梯状片段，被称为“d n al a d d e r ；细胞膜表面 起泡形成凋亡小体，但凋亡小体很快就会被周围细胞识别、吞噬并降解。凋亡过程 中细胞膜和核膜保持完整，细胞质等内容物不会渗透至细胞外，凋亡发生后组织不 发生炎症仍保持原有的结构及功能( e l m o r e ，2 0 0 7 ；周建华等，2 0 0 8 ) 。除开这些形 态学上的改变，细胞凋亡发生后生理生化水平也发生了一些特定改变，例如线粒体 膜电位下降、活性氧r o s ( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ) 积累和天冬氨酸特异性半胱氨 酸蛋白酶c a s p a s e ( c y s t e i n e c o n t a i n i n ga s p a r t a t e - s p e c i f i cp r o t e a s e s ) 活性上升等。 9 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 1 4 2 细胞凋亡途径与凋亡机制 常见的细胞凋亡的信号通路为死亡受体( d e a t hr e c e p t o r ) 介导的凋亡通路及线 粒体细胞色素c 介导的凋亡通路( g r e e n , 2 0 0 0 ) 。“死亡受体通路”是由细胞表