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交联型羧甲基壳聚糖的制备及其生物相容性与免疫佐剂活性研究 交联型羧甲基壳聚糖的制备及其生物相容性 与免疫佐剂活性研究 摘要 目的：羧甲基壳聚糖( c a r b o x y m e t h y lc h i t o s a n ，c m - c t s ) 是迄今为止所报 道的6 0 0 多种甲壳素衍生物中，研究最多的一种水溶性壳聚糖衍生物。研究证明， c m - c t s 具有良好的生物相容性、生物降解性、降解可控性和抑菌性，它以其特 有的理化性质已成为医药界及生物医学领域的研究热点。但c m c t s 在制备过程 中要经过较长时间的浓碱高温等条件，故制成的c m - c t s 的相对分子量和黏度会 显著降低，作为医用高分子材料，在体内降解吸收太快，难以满足生物高分子材 料的要求，因此在一定程度上限制了c m c t s 的应用范围。已有研究表明，c m - c t s 具有一定的免疫调节作用。本研旨在探讨一种通过交联使c m - c t s 黏度得到极大 提高的的方法，并对其生物相容性及其作为免疫佐剂的应用前景进行研究。 方法：实验分四部分：1 、对c m c t s 的制备、纯化方法及部分理化性质进 行研究，通过细胞毒性和组织相容性对c m c t s 的生物相容性进行了初步评价。2 、 以戊二醛作为交联剂，通过对交联剂加入量、交联体系温度、p h 值以及交联反 应时间等交联条件的试验，确定了所需要的交联反应体系；对c m - c t s 进行适度 交联，制备了具有一定交联度且能溶于水的交联型羧甲基壳聚糖( c - c m - c t s ) 。对 交联形成的西佛碱结构进行还原，制备了交联还原型羧甲基壳聚糖( d c m - c t s ) 。 3 、以体外培养的小鼠成纤维细胞株l 9 2 9 为研究对象，对c - c m - c t s 和d _ c m c t s 进行细胞毒性评价，考查了二者的组织相容性。4 、研究d c m - c t s 的溶血活性， 通过m t t 法测定了d c m c t s 体外对c o na 诱导的小鼠淋巴细胞增殖反应的影 响。以不同剂量的d - c m c t s 联合卵清白蛋白( o v a ) 免疫小鼠，观察d c m c t s 对 o v a 受免小鼠细胞免疫和体液免疫应答的影响。 结果：1 、制备了高纯度，无菌无热原的c m c t s ，细胞毒性结果表明c m c t s 对l 9 2 9 成纤维细胞没有明显的毒性作用，并且对l 9 2 9 细胞增殖有一定的促进作 用，其中以1 0 0 “g m l 浓度对l 9 2 9 细胞的促增殖作用最为显著；肌肉注射8 天后 交联型羧甲基壳聚糖的制备及其生物相容性与免疫佐剂活性研究 观察不到炎症细胞，说明c m - c t s 具有良好的生物降解性和组织相容性。2 、通过 戊二醛和c m - c t s 的适度交联，制备了黏度提高1 7 0 倍且能溶于水的c - c m - c t s 和d c m - c t s 。3 、细胞毒性和组织相容性试验表明d c m c t s 比c c m c 1 s 具有更 好的生物安全性，该结果为d c m c t s 在生物医用材料、药物缓释载体等的研究 和应用方面提供了一定的理论基础。4 、溶血性实验表明d - c m - c t s 没有溶血作用， d c m c t s 在卜1 0 0 0 p g m l 浓度范围内对c o na 诱导的小鼠t 淋巴细胞的增殖反 应有显著促进作用，其中1 和1 0p g i i l l 浓度促进作用极显著；不同剂量d c m - c t s 联合o v a 免疫小鼠后，均能增强c o na 和o v a 诱导的o v a 受免小鼠脾淋巴细胞增 殖反应和提高o v a 特异性抗体的效价水平，其中以2 5 组免疫效果最好。 结论：本研究制备的d c m - c t s 可将c m - c t s 黏度提高1 7 0 倍，无细胞毒性 并能促进细胞增殖，且具有良好的生物相容性。将d c m c t s 联合o v a 免疫小 鼠，证明d c m c t s 具有良好的免疫佐剂活性。该研究结果为d - c m c t s 在生物 医用材料、药物缓释载体等的研究和应用方面提供了理论基础。 关键词：羧甲基壳聚糖，交联，生物相容性，免疫佐剂 交联型羧甲基壳聚糖的制备及其生物相容性与免疫佐剂活性研究 p r e p a r a tio nc r o s sl n k e dc ：a r b o x y m e t h y 。c h 。t o s a nandprepara 0 sin k e da r b o x y m e t h yi 1 110 s a n lic s t u d yo n it sbio c o m p a tibiiit ya n dim m u n oio gig al a d i u v a n ta c t l v i t y - a b s t r a c t p u r p o s e ：c a r b o x y m e t h y lc h i t o s a n ( c m - c t s ) i so n eo ft h ew a t e rs o l u b l e d e r i v a t i v e so fc h i t o s a nw h i c hh a sb e e nw i d e l ys t u d i e d c m c t sh a su n i q u ec h e m i c a l ， p h y s i c a la n db i o l o g i c a lp r o p e r t i e ss u c ha sl o wt o x i c i t y ，b i o c o m p a t i b i l i t yf i l ma n d g e l - f o r m i n gc a p a b i l i t i e s ，a l lo fw h i c hm a k ei tas u c c e s s f u lm a t e r i a lt h a ta t t r a c t e dm o r e a n dm o r ea t t e n t i o n s t h ep r e p a r a t i o no fc m c t sn e e ds e v e r a lt i m ec o n s u m i n g p r o t o c o l si nac o n s t a n ta l k a l i n ea n dh e a t i n ge n v i r o n m e n t ，s ot h em o l e c u l a rm a s sa n d v i s c o s i t yh a v er e m a r k a b l yr e d u c e d t h ep r o p e r t yo ff a s td e g r a d a t i o na n da b s o r p t i o n r e s t r i c tt h e a p p l i c a t i o no fc m c t s p r e s e n ts t u d i e si n d i c a t e dt h a tc m c t sh a s i m m u n i t ya d j u s ta c t i v i t y 1 1 l ep u r p o s eo ft h i ss t u d yi s t oe x p l o r eaa p p l i c a b l e p r e p a r a t i o nm e t h o dw h i c h c a nm a i n t a i nt h eh i 9 1 1v i s c o s i t yo fc m c t s ，a n dt os t u d y t h ei m m u n o l o g i c a la d j u v a n ta c t i v i t yo fm a t e r i a l sp r e p a r e db yt h i sm e t h o d m e t h o d s ： 1 c m - c t si sp r e p a r e df r o mc h i t o s a na n dm o n o c h l o r o a c e t i ca c i di naa l k a l i n e a n d h e a t i n ge n v i r o n m e n t t h ec e l lp r o l i f e r a t i o na c t i v i t y , c y t o t o x i c i t ya n db i o c o m p a t i b i l i t yo f c m c t si sm e a s u r e d 2 t h eo p t i m u mc o n d i t i o no fa p p l i e dg at oc r o s s l i n kc m - c t si se s t a b l i s h e d ：t h e c i n c e n t r a t i o no fc m - c t si s2 0 ，c m c t s ：g a = 8 0 ：l ，t h er e a c t i o nt i m ei s3 h ，t h e r e a c t i o np hi s8 0a n dr e a c t i o nt e m p e r a t u r ei sa t2 5 0 c c c m c t si ss y n t h e s i z e d ，a n dt h e n d e o x i d i z e dt oe l i m i n a t et h es c h i f f b a s es 仃1 j c t u r ei nb r a n c h e s 3 t h ee f f e c t so ft h ec - c m - c t sa n dd c m - c t so nt h ep r o l i f e r a t i o no fl 9 2 9c e l l s nv i t r oa r es t u d i e d t h e i rb i o c o m p a t i b i l i t i e sa let e s t e d i i i 交联型羧甲基壳聚糖的制备及其生物相容性与免疫佐剂活性研究 4 d - c m c t si se v a l u a t e df o ri t se f f e c to nm i c es p l e n o c y t ep r o l i f e r a t i o n nv i t r o ， h a e m o l y t i ca c t i v i t ya n da d j u v a n tp o t e n t i a l so nt h ec e l l u l a ra n dh u m o r a li m m u n er e s p o n s e so fm i c e t oo v a l b u m i n ( o v a ) r e s u l t s ：1 c m c t si sp u r i f i e da n dp r e p a r e df o ri t sg e r m - f r e ea n d p y r o g e n f r e eq u a l i t i e s c e l lc u l t u r ea s s a ys h o w st h a tc m - c t sd o e sn o th a v e c y t o t o x i c i t ye f f e c to nl 9 2 9f i b r o b l a s t s o nt h eo t h e rh a n d ，c m - c t sc a np r o m o t e l 9 2 9f i b r o b l a s tp r o l i f e r a t i o n t h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o ni s10 0l a 酌n l 2 c - c m - c t sa n dd c m - c t sa r es y n t h e s i z e dw i t hg l u t a m l d e h y d ec r o s s l i n k i n g m e t h o d b o t ho ft h e ma r ed i s s o l v a b l e c o m p a r e d 谢t 1 1c m c t s ，t h ev i s c o s i t i e so f b o t ha r ei n c r e a s e db y17 0t i m e s 3 d - c m - c t sp e r f o r m sb e t t e ri nb i o c o m p a t i b i l i t yt e s t 4 d c m c t sd o e sn o ts h o wh a e m o l y t i ca c t i v i t y d - c m - c t se n h a n e e dt h ec o n a - a n do v a s t i m u l a t e d s p l e n o c y t ep r o l i f e r a t i o ni n o v a - i m m u n i z e dm i c e t h e o v a - s p e c i f i ci g ga n t i b o d y l e v e l si ns e r u m a r ee n h a n c e de s p e c i a l l ya tt h e c o n c e n t r a t i o no f2 5 c o m p a r e dw i t l lo v ac o n t r o lg r o u p c o n c l u s i o n s ：c o m p a r e dw i t hc m - c t s ，t h ev i s c o s i t yo f d - c m - c t sw h i c h i ss y n t h e s i z e dw i t hg l u t a m l d e h y d ec r o s s l i n k i n gm e t h o di si n c r e a s e db y17 0t i m e s b u t s t i l ld i s s o l v a b l e d c m c t sh a sg o o db i o c o m p a t i b i l i t yb u tn oc y t o t o x i c i t ya ta 1 1 b e s i d e s , d - c m c t sa l s oh a sg o o di m m u n o l o g i c a la d j u v a n ta c t i v i t y t h e s ei n f o r m a t i o n w i l lb eu s e f u lf o rd e v e l o p i n gd - c m - c t sb i o m e d i c a lm a t e r i a l sa n dn e wd r u gd e l i v e r y c a r r i e r s k e yw o r d s ：c a r b o x y m e t h y lc h i t o s a n ，c r o s s l i n k ，b i o c o m p a t i b i l i t y ，i m m u n o lo g i c a l a d j u v a n t 交联型羧甲基壳聚糖的制备及其生物相容性与免疫佐剂活性研究 缩略语 a p c ( a n t i g e np r e s e n t i n gc e l l s ) c m c t s ( c a b o x y m e t h y lc h i t o s a n ) c o n a ( c o n c a n a v a l i na ) c t l ( c y t o t o x i etl y m p h o c y t e ) c t s ( c h i t o s a n ) d d ( d e g r e eo fd e a c e t y l a t i o n ) d m s o ( d i m e t h y ls u p h e o x i d e ) e d t a ( t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d ) g a ( g l u t a r a l d e h y d e ) h e ( h e m a t o x y l i n - e o s i n ) h e p e s ( 2 - 4 一( 2 - h y d r o x y e t h y l ) 一 1 - ，e r a z i n y l lethanesulfcacid)plperazmyl e u a a n e s u l l o m ca c i d ) - j i l ( i n t e r l e u k i n ) i n f ( i n t e r f e r o nr e g u l a t o r yf a c t o r ) l a k 细胞( 1 y m p h o k i n ea c i t v a t e dk i l l e r ) m h c ( m a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x ) m t t ( 3 - ( 4 ，5 ) - d i m e t h y l t h i a h i a z o 一 ( - z - y 1 ) 一3 ，5 一d i p h e n y t e t r a z o l i u m r o m i d e ) m ( m o l e c u l a rw e i g h t ) o d ( o p t i c a ld e n s i t y ) o v a ( c h i k e ne g g ) p b s ( p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e ) r g r ( r e l a t i v eg r o w t hr a t e ) n k 细胞( n a t u r a lk i l l e rc e l l ) 抗原提呈细胞 羧甲基壳聚糖 刀豆蛋白a 细胞毒t 淋巴细胞 壳聚糖 脱乙酰度 二甲基亚砜 乙二胺四乙酸二钠 戊二醛 苏木精一伊红 羟乙基呱嗪乙硫磺酸 白细胞介素 干扰素调节因子 淋巴因子激活杀伤细胞 组织相容性复合体 四甲基偶氮唑盐 分子量 光密度 卵清白蛋白 磷酸盐缓冲液 相对增殖率 自然杀伤细胞 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含未获得或其 他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文 压签字日期：扣8 年6 月5 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论 文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。( 保密 的学位论文在解密后适用本授权书) 靴做储签铸皆心 签字日期：抄8 年彳月日 导师粹云忉 恢 签字日期多汐绣年多月j 日 交联型羧甲基壳聚糖的制备及其生物相容性与免疫佐剂活性研究 第一章文献综述 1 羧甲基壳聚糖( c a r b o x y m e t h y lc h i t o s a n ，c m c t s ) 近十几年来，壳聚糖的化学改性一直是甲壳素研究中十分活跃和引人注目 的课题。c m c t s 是壳聚糖进行羧甲基化反应后得到的一类甲壳素衍生物。在迄 今所报道的6 0 0 多种甲壳素衍生物中，c m c t s 是研究最多的一种。c m c t s 的 研究活动可上溯到1 9 3 7 年，k i g b y 将氢氧化钠加入到壳聚糖的氯乙酸溶液中， 得到一种水溶性产物- - - - c m c t s 。经研究发现，这是一种自然界中唯一的两性 多糖；在水溶液中是一种两性电解质i 蒋挺大，2 0 0 1 ；夏文水，2 0 0 1 。 1 。1 羧甲基壳聚糖的制备 由于壳聚糖分子中存在活泼的氨基和羟基，反应时取代基可进入o ( c 3 、c 6 ) 和n ( c 2 ) ，则相应的产物有0 - 羧甲基壳聚糖( o c m c t s ) 、n - 羧甲基壳聚糖 ( n c m c t s ) 和n ，o - 羧甲基壳聚糖( n ，o c m c t s ) ，可以通过不同的工艺条件制 备出不同的羧甲基壳聚糖。 1 1 1 羧甲基壳聚糖的制备 1 1 1 1o c m c t s 的制备 o - c m c t s 一般是在碱性和低温条件下，甲壳素的c 6 伯羟基与一氯乙酸发 生反应制彳导的。这种制备方法是由m u z z a r e l l i 等人 m u z z a r e l l ir ，1 9 9 8 首先提出 来的：用氢氧化钠溶液( 4 2 ) 浸渍过的壳聚糖，与氯乙酸钠低温3 0 。c 进行羧 甲基化反应5 小时，得到o - c m c t s 。也有用甲壳素为原料通过不同的工艺方法 制备出o c m c t s 。 1 1 1 2n c m c t s 的制备 n c m c t s 通常是在酸性介质中进行，采用乙醛酸作为羧甲基化试剂，通过 壳聚糖上的自由氨基与乙醛酸的反应生成可溶性的醛亚胺，然后用适当的还原剂 交联型羧甲基壳聚糖的制备及其生物相容性与免疫佐剂活性研究 还原产物制得 m u z z a r e l l ir ，1 9 9 4 1 。第一步反应是在均相体系进行因而非常容易 制备，反应在常温下即可进行。反应生成的n c m c t s 含有乙酰基、羧甲基和 自由氨基等基团，其比例取诀于壳聚糖的选择( 脱乙酰度及摩尔质量) 以及乙醛酸 所用的量。该反应的特点是取代有选择性，不需要加热，可在均相体系水溶液中 进行。但由于所选用的原料壳聚糖的来源不同，制得的n c m c t s 水溶性差别 较大。 1 1 1 3n o c m c t s 的制备 目前，羧甲基壳聚糖的制备方法中，以n ，o c m c t s 的制备最为普遍。由 于以壳聚糖为原料的接枝反应中，糖单元上的o h 和- n i l 2 均能与氯乙酸发生亲 核反应，而在碱性条件下- o h 相对活泼，空间位阻小，反应容易发生，一般c 6 位接枝率大于c 2 位- n h 2 的接枝率，其产物为n ，o c m c t s 。由于该反应属非均 相反应，批次间的收率和取代度均有差异【林友文，2 0 0 0 ；韩笑，2 0 0 0 ；唐振兴， 2 0 0 4 ；邱增萍，2 0 0 5 ) g eh c ，2 0 0 5 】。 1 2 羧甲基壳聚糖的结构性能 羧甲基壳聚糖与壳聚糖相比，增加了碱性条件下的水溶性，可以在除等电点 附近以外的p h 范围内溶解，为应用提供了方便，有优良的分散性、乳化性、保 湿性、成膜性、凝胶性和增稠性，同时还具有两性高分子电解质和螯合重金属离 子的特性。这些特性和独特的功能是由于其化学结构所决定的。 羧甲基取代位置、取代度、分子量和脱乙酰度这四个参数基本决定了羧甲基 壳聚糖分子的一级结构，并对羧甲基壳聚糖分子链的高级结构及其物理化学性质 和生物活性产生影响。因此，对羧甲基壳聚糖分子结构四种参数的表征十分重要， 而且，现代分析仪器的发展为羧甲基壳聚糖分子结构的测定提供了必要手段。 1 2 1 羧甲基的取代位置 在壳聚糖分子链上，与化学性质有关的功能基团是氨基葡萄糖 ( g l u c o s a m i n e ，g l u ) 单元上的6 位伯羟基、3 位仲羟基和2 位氨基或乙酰氨基以及 糖苷键。其中，糖苷键比较稳定，不易断裂，也不与其他羟基形成氢键；乙酰氨 2 交联型羧甲基壳聚糖的制备及其生物相容性与免疫佐剂活性研究 基化学性质稳定，但参与形成氢键。所以，通常壳聚糖的化学反应只涉及到两个 羟基和氨基。理论上，羧甲基可以分别取代在壳聚糖的6 位羟基上、3 位羟基上 和2 位氨基上；也可同时取代在壳聚糖的3 、6 位羟基上或在2 位氨基、3 位和6 位羟基上全部取代。相应产物分别为6 - 0 羧甲基壳聚糖( 6 o c m c t s ) 、3 o 羧 甲基壳聚糖( 3 o - c m c t s ) 、n 羧甲基壳聚糖( n c m c t s ) 、3 , 6 o 羧甲基壳聚糖 ( 3 ，6 o c m c t s 或0 c m c t s ) 和n o 羧甲基壳聚糖( n o c m c t s ) 。壳聚糖的 羧甲基取代位置与其生物活性密切相关，如：6 o c m c t s 具有良好的保湿性能 c h e r tl y ，2 0 0 2 ，而n c m c t s 能使农作物贮存蛋白质含量显著提高 谢桂先， 2 0 0 3 。因此，通过羧甲基基团的定向取代可以得到诸多不同生物活性的产品。 1 2 2 取代度( d s ) 以平均每个氨基葡萄糖( g l u c o s a r n i n e ，g u ) 或n 乙酰氨基葡萄糖 ( n - a c e t y l g l u c o s a m i n e , a g u ) 单元上被羧甲基化的基团数目来表示取代度。对于 o c m c t s 、n c m c t s 其平均d s 只能是小于等于2 ，而对于n o c m c t s 其 最大d s 为3 。通常情况下，羧甲基壳聚糖的取代度都是小于2 。取代度的大小 直接决定了羧甲基壳聚糖的溶解性，取代度大于0 6 的c m c t s 易溶于水，随着 取代度的提高，其溶解性也随之增加，其溶液的透明度也愈好。 1 2 3 分子量和分子量分布 羧甲基壳聚糖分子量的高低和其分散程度的大小对材料的物理机械性能如 成膜性、成胶性与强度以及对生理活性的影响都至关重要。陈凌云等采用凝胶渗 透色谱和光散射仪联用法研究了羧甲基壳聚糖在0 1 m o l ln a c l 中的溶液性质， 发现由于分子问强氢键作用，羧甲基壳聚糖分子链主要以聚集态形式存在，即使 在很稀的溶液中，仍能形成少量尺寸较大的聚集体，这对羧甲基壳聚糖的表观分 子量、物理性能及生物活性产生较大的影响。 1 2 4 脱乙酰度( d d ) d d 表征了脱乙酰化部分所占的百分比，即氨基葡萄糖单元在羧甲基壳聚糖 分子链中所占的比例。d d 与取代度一起决定了羧甲基壳聚糖的电荷性。羧甲基 3 交联型羧甲基壳聚糖的制各及其生物相容性与免疫佐剂活性研究 壳聚糖在溶液中表现出两性电解质的性质，并存在特定的等电点【c h e n l y ，2 0 0 4 。 1 3 羧甲基壳聚糖的应用 作为壳聚糖的衍生物，羧甲基壳聚糖不仅具有生理适应性、可生物降解性、 多功能反应性等优异性能，还具有吸湿保湿、增溶性和成膜性等多种理化性质及 生理活性，越来越受到世界范围内糖类科学研究的广泛关注，并在农业、食品、 化妆品、医药、新材料等领域得到一定的研究和应用。 1 3 1 在农业上的应用 羧甲基壳聚糖可作为一种新型的植物蛋白质生长调节剂，提高玉米、水稻等 粮食和蔬菜的品质和蛋白含量 f a j a r d oj e ，1 9 9 4 ；师素云， 9 9 9 ；李科，2 0 0 1 。 当n c m c t s 作为生长调节剂应用于玉米、马铃薯时，可使贮存蛋白质的含量 增加2 3 成，应用于西红柿使贮存蛋白质含量增倍。师素云【师素云，1 9 9 8 1 等人 用c m - c t s 溶液浸泡玉米种子发现能够促进玉米种子的萌发，提高发芽势和发 芽率。 n o c m c t s 对水稻氮代谢也具有一定的调节作用，能够明显的提高抽穗期 叶片内硝酸还原酶、谷氨酰胺转化酶、谷氨酰胺合成酶和蛋白水解酶的活性，其 中，对谷氨酰胺转化酶和蛋白水解酶活性的增强作用可持续到成熟后期，并能增 加叶片中可溶性蛋白质含量和籽粒内全氮、蛋白氮的含量。这些结果不仅对增加 玉米和其它庄稼的经济价值有重要意义，还为研究植物代谢调节机制提供了新途 径。 羧甲基壳聚糖本身就是生物农药【杨越冬，1 9 9 8 ，它可以作为植物病原菌生 长抑制剂、杀线虫剂，还可以作为农药的载体，生产低毒、高效、优质的农药。 在收获前的庄稼如玉米、花生中存在的黄曲霉素对人体和动物有毒害作用。 n c m c t s 作为生物农药，可使黄曲霉素减少9 0 以上，而真菌生长降低到一 半以下。产毒性真菌细胞显示，n c m c t s 的存在抑制了孢子发芽和真菌体孢子 形成 c u r e or g ，1 9 9 1 。 4 交联型羧甲基壳聚糖的制备及其生物相容性与免疫佐荆活性研究 1 3 2 在食品工业上的应用 n o c m c t s 水溶液形成的薄膜对气体有选择性的通透作用，特别适合用作 水果保鲜剂，它能调节二氧化碳和氧气的通过率，防止或推迟果蔬的氧化作用 【c a r o l a nc a ，1 9 9 1 ；张敏，2 0 0 4 ；洪伯铿，2 0 0 4 。刘流【刘流，2 0 0 2 等人还利用 c m c t s 研究对酱油中酵母菌的抑制作用，从而达到对酱油的保鲜作用。 羧甲基壳聚糖的螯合性能在保存肉类方面发挥了防腐剂的作用，会与对脂肪 氧化腐败有促进作用的铁、铜等金属离子形成螯合物，从而抑制了金属离子的催 化活性，能避免乙醛和不愉快气味的产生，起到延缓脂肪的氧化酸败的作用【杨 文鸽，2 0 0 3 。 1 3 3 在化妆品工业上的应用 羧甲基壳聚糖具有优良的吸湿和保湿性能以及乳化、成膜性，所以适合做水 性的润肤化妆品。杨继生【杨继生，1 9 9 7 系统考察了羧甲基壳聚糖在化妆品中的 应用，发现羧甲基壳聚糖不仅有相当于透明质酸的吸湿保湿性，价格相对低廉外， 而且通过皮肤刺激性等试验证明对皮肤是绝对安全，无任何刺激作用【郑立， 2 0 0 3 。 羧甲基壳聚糖具有的增强抗菌作用也是应用在化妆品的又一个优点。如羧甲 基壳聚糖对口腔中重要的厌氧菌有一定程度的抑制作用，特别是对口腔中典型的 蛀齿细菌有非常高的抑菌作用，可以作为牙膏的配方成分【刘瑾，2 0 0 2 。 1 3 4 在环保方面的应用 由于羧甲基壳聚糖是一种水溶性的两性电解质，所以在水中的应用研究最为 广泛。其分子中含有o h 、- n h 2 、c o o h 等基团有良好的絮凝能力以及螯合二 价及多价金属离子的能力，因而，可应用于废水和污水处理领域。n c m c t s 能螯合过渡金属离子形成有色的不溶性产物的研究早有报道 n g a hw s ，1 9 9 9 ； h o nd n s ，2 0 0 0 ；t a n gl q ，2 0 0 1 。羧甲基壳聚糖絮凝处理重金属废水具有用量 少、脱出率高、产生的絮凝体大、沉降速度快等优点，具有良好的应用前景。 1 3 5 在医学上的应用 交联型羧甲基壳聚糖的制各及其生物相容性与免疫佐剂活性研究 羧甲基壳聚糖具有优良的生物可降解性，抗菌性、抗凝血性，所以在医学上 的应用前景广阔。 利用羧甲基壳聚糖易于阻止组织间粘结的性质，可将其凝胶或膜做成伤口 贴、包扎带用于外科伤口，由于羧甲基壳聚糖形成的凝胶黏度和弹性大于血浆， 可阻止血液在组织表面凝结从而阻止粘结【曹农，1 9 9 8 。 o c m c t s 还可以作为固定化酶的载体，如固定d 葡萄糖异构酶、溶茵酶 等，将可防治癌细胞生长的天门冬酰胺酶固定在o - c m c t s 上，可用于医治白 血病的新型药物研究【尹淑敏，19 9 0 。 羧甲基壳聚糖具有抑菌杀菌功能，口服羧甲基壳聚糖具有促进肠内有益共生 菌群的繁殖，提高身体免疫力，有显著的降血脂和降胆固醇的作用，并能清除机 体内铅、汞等重金属离子。 利用n ，o c m c t s 与亚铁离子络合的基本性质【李柱来，2 0 0 1 可以用于治疗 缺铁性贫血，因为人体对于c m c t s c t s 亚铁络合物的吸收远远大于传统的 f e s 0 4 药物，这方面的研究为开发天然生物补铁制剂开辟了新途径。 羧甲基壳聚糖膜具有良好的细胞相容性 郑立，2 0 0 3 ，其浸渍液对细胞无毒 性效应，皮肤成纤维细胞能很好地贴附、生长在羧甲基壳聚糖膜上，没有聚集和 脱落现象，表现出良好的细胞相容性，为其作为细胞生长支持物和医学应用提供 了基础。 2 免疫佐剂 2 1 概述 a d j u v a n t 即佐剂，最早来源于希腊语“a d j u v a r e ”，也就是帮助的意思。免疫 佐剂广义上是指免疫系统的调节剂，与抗原同时或预先应用，能非特异性地改变 或增强机体对该抗原的特异性免疫应答，增强该抗原的免疫原性或改变免疫反应 类型，而本身并不引起机体产生免疫应答的物质。 1 9 2 5 年法国免疫学家r a m o n 发现在疫苗中加入某些与之无关的物质可以特 异性地增强机体的免疫反应 d o t s i k ae ，1 9 9 7 。1 9 2 6 年，g l e n n v 最先应用铝化 6 交联型羧甲基壳聚糖的制各及其生物相容性与免疫佐剂活性研究 合物作为免疫佐剂应用于白喉外毒素疫苗。1 9 5 1 年，f r e u n d 将液体石蜡与羊毛 脂( 乳化剂) 按一定比例混合后，加入抗原研制成油包水的乳胶，免疫动物后效果 极佳，可产生高效而持久的抗体。1 9 5 6 年，j o h n s o n 发现革兰色阴性细菌的内毒 素具有佐剂活性。此后，许多国家都不同程度地开展了这方面的研究。近年来随 着疫苗研究的进展，对疫苗佐剂的研究也越来越深入。 免疫佐剂的功能可以概括为：增强抗体应答；增强疫苗的粘膜传递；增进免 疫接触；增强弱免疫原的免疫原性，如高度纯化的抗原或重组抗原：减少抗原接 种剂量和接种次数；促进疫苗在免疫应答能力弱的人群中的免疫效果；加快免疫 应答的速度和延长持续时间；改变抗原的构型；改变体液抗体的种类、i g g 亚类 和抗体的亲和性 v e g e le r ，2 0 0 0 。 2 2 免疫佐剂的分类 随着研究的不断深入，越来越多的物质被发现有佐剂的功能。由于佐剂的种 类丰富，因此分类的方式也很多。 根据其作用机制不同分为两大类：一是免疫刺激性佐剂，另一类是投递系统 佐剂。 根据其性能差别，又可分为免疫刺激佐剂、颗粒佐剂、粘膜佐剂和治疗性疫 苗佐剂。 根据其来源，把佐剂分为非细菌来源的佐剂和来源于细菌成分的佐剂【雷连 成，2 0 0 2 。 根据其物理和化学性质，又把佐剂分为凝胶型佐剂、微生物来源佐剂、微粒 型佐剂、乳剂和合成佐剂( 如非离子阻断共聚物) 【管孝鞠，2 0 0 1 。 2 3 几类常用的佐剂及其作用机理 2 3 1 盐类佐剂 盐类佐剂是传统佐剂中的一类，包括氢氧化铝胶和磷酸铝等，其中铝盐佐剂 最常用，至今这类佐剂仍是美国食品和药物管理局( f d a ) 准许用于人类疫苗的唯 一佐剂。 铝佐剂是目前应用最广泛的一类佐剂，已批准的含铝佐剂的疫苗包括包括 7 交联型羧甲基壳聚糖的制备及其生物相容性与免疫佐剂活性研究 d t p 、无细胞百日咳疫苗d t p ( d t a p ) 、b 型流感杆菌( h i b ) 疫苗( 不是所有的) 、乙 型肝炎( 船) 疫苗，以及所有的d t a p 、h i b 或h b 的联合疫苗，还包括甲型肝炎 疫苗、莱姆病疫苗、炭疽疫苗和狂犬病疫苗【栗克喜，2 0 0 3 。 铝佐剂能和抗原形成复合物，注射后在局部形成抗原贮存库，其稳定性取决 于抗原的释放速度。铝佐剂主要促进体液免疫应答而对细胞免疫应答几乎无作 用，产生的抗体以i g g l 为主，刺激产生t h 2 型反应。 铝佐剂虽然广泛应用，但其仍存在许多缺点，如不能诱导产生砌型反应， 干扰细胞免疫，并阻断c d g + c t l 的激话，使得疫苗的免疫保护不全面，不持久， 并且也有一些毒副作用。不断有报告认为铝佐剂由于其自身的缺陷可能会引起局 部的不良反应 r a j e s hk ，1 9 9 8 ，如轻度局部反应形成肉芽肿，甚至发生局部无菌 性脓肿。此外，铝胶疫苗冷冻后胶体状态会被破坏，故不能冷冻干燥，需要在低 温状态下运输，分批制备相同的疫苗比较困难。但由于铝佐剂的应用已经有几十 年的历史，就安全性而言相对于其它的新型佐剂还是较为可靠，目前非铝佐剂还 无法完全取代铝佐剂。 磷酸三钙佐剂与铝胶一样具有吸附抗原作用，使用更加简单，但缺点是含盐 量高，贮存日久有结晶沉淀。 2 3 2 油乳佐剂 主要有弗氏佐剂和可降解的油类佐剂，如佐剂一6 5 、白油s p a n 佐剂、m f 5 9 由譬 号手。 弗氏佐齐u ( f r e u n da d j u v a n t ，f a ) 是免疫学上广泛应用的油类佐剂，并应用于很 多兽医疫苗中，分为弗氏完全佐剂( f r e u n dc o m p l e t ea d j u v a n t ，f c a ) 和弗氏不完全 佐齐l j ( f r e u n di n c o m p l e t ei m a d j u v a n t ，f i a ) 两种。f i a 是由低引力和低黏度的矿物油 及乳化剂组成的一种贮藏性佐剂。f c a 是在不完全佐剂的基础上加一定量的分 支杆菌而成。f c a 是细胞免疫的强刺激剂。而f i a 则仅能刺激体液免疫。f c a 和f i a 主要不足之处：可引起局部肉芽肿和无菌性脓肿，使用矿物油佐剂的小 鼠曾发生肿瘤，因此可能有致癌问题；稳定性差，难以长期保存；有对结核菌素 致敏等毒副作用，故仅限用于兽用。 佐剂一6 5 在体内可被代谢或分泌。用于人的流感疫苗安全有效，但较弗氏佐 8 交联型羧甲基壳聚糖的制各及其生物相容性与免疫佐剂活性研究 剂效果稍差。 白油s p a n 佐剂是用轻质矿物油作油相，用s p a n - 8 0 或s p a n 一8 5 及t w e e n - 8 0 作为乳化剂制成的油乳佐剂，是当前兽医生物制品中最常用、最有效的佐剂之一， m f 5 9 为水包角鲨烯乳剂配方。由角鲨烯、t w e e n 8 0 、s p a n 8 5 等组成，已 泛用作于各种亚单位疫苗佐剂。可增强体液免疫应答和细胞免疫应答，副反应轻 微。 2 3 3 微生物及微生物来源的佐剂 某些微生物或微生物菌体成分同抗原一起注射时，具有明显的佐剂效应。 已经证明有佐剂活性的有分枝杆菌及其成分；革兰氏阴性茵类及其产物；革兰氏 阳性菌。此外，霍乱毒素( c d 、c p g d n a 等也有佐剂作用。 2 3 3 1 微生物佐剂 微生物佐剂主要是细胞壁上的肽聚糖起作用，如胞壁酞二肽( m d p ) 、胞壁酞 三肽( m t p ) 、蜡质d 、海藻糖双霉菌酸脂( ) n ) 等。其中对m d f 研究较多。m d f 是从分枝杆菌细胞壁上提取的一种免疫活性成分，与链球菌变异抗原混合，给大 鼠口服能刺激产生i g a 。m d f 可刺激免疫细胞如t 细胞的增殖，单独使用也可 激活机体的非特异防御机制。最近研究表明：m d f 能诱导机体产生细胞因子， 被认为是最有发展前途的佐剂之一。其优点为虽然在注射局部有轻微反映，但极 少发生局部化脓等不良反应：无抗原性、过敏性和致癌作用；相对分子质量小， 对生物降解作用有抵抗力，可以口服。不良反应是存在热原反应，在动物体内会 引起赖特尔过敏综合症( r e i t e r ss y n d r o m e ) 。m t p 已用在疟疾疫苗中并取得了效 果。 2 3 3 2 细菌毒素( b a c t e r i a lt o x i n s ) 现在通常所用的许多疫苗都是通过肠道外注射的方法( 肌肉注射或皮下注射) 接种。近几年来，通过粘膜组织作用的疫苗受到了广泛的重视。在模式动物中普 遍所用的粘膜佐剂是霍乱毒素( c t ) 、大肠杆菌热稳定肠毒素( l t ) 及其衍生物 【f r e y t a gl c ，1 9 9 9 。在c t 中，a 亚单位( c t a ) 为毒性亚单位，b 亚单位( c t b ) 9 交联型羧甲基壳聚糖的制备及其生物相容性与免疫佐剂活性研究 为非毒性亚单位。 c t 佐剂的特点是：( 1 ) 一般来说必须与抗原同时同一途径给药。实验表明， c t 佐剂与抗原同时口服免疫的效果最好：延迟或提前2 4 h 使用c t 佐剂都会大 大降低它提高特异性抗体反应的效果。( 2 ) 使用方便，可经口服和鼻腔免疫。 t a k a d aa k i d a t a k a d aa ，1 9 9 5 以伪狂犬病毒糖蛋白( g b ) 作为抗