（化学工程专业论文）三唑类农药分离分析研究.pdf

大连理工大学专业学位硕士学位论文 摘要 本论文主要采用柱层析、固相萃取、高速逆流色谱、高效液相色谱等方法对三唑类 手性农药( 氟环唑、戊唑醇) ，进行了活性组分及同分异构体等杂质的分离，研究了不 同分离方法的分离效果，h p l c 不同分离模式、不同流动相对组分分离结果的影响。深 入进行了三唑类农药三唑环异构体的分离及结构鉴定，确立了同分异构体的高效液相色 谱分析定量方法。对农药中其余杂质( 含量之0 1 ) 也进行了分离定性及色谱定量，主 要采用红外吸收光谱( i r ) 、核磁共振波谱( n m r ) 、质谱( m s ) 进行化学结构鉴定， h p l c 定量测试。 采用手性色谱柱探讨了商品化戊唑醇手性农药的h p l c 分离效果，初步探讨了手性 异构体的彼此拆分条件，分析了手性拆分机理，总结了拆分规律。 关键词三唑类农药；高速逆流色谱；4 h 异构体； 结构鉴定；手性分离 三唑类农药分离分析研究 t h es t u d yo ns e p a r a t i o na n da n a l y s i so ft r i a z o l ep e s t i c i d e s a b s t r a c t 1 1 1 em e t h o d so fs i l i c ag e lc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y ，s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ( s p e ) a n d h i g h s p e e dc o u n t e r c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y ( h s c c c ) w e r ea p p l i e di nt h i sa r t i c l et os e p a r a t e t h et r i a z o l ep e s t i c i d e sw i t hc h i r a lc e n t e r s ( e p o x i c o n a z o l e ；t e b u c o n a z o l e ) t oi n g r e d i e n ti n i s o m e r sa n di m p u r i t i e se t c t h ei n f l u e n c eo fm e t h o d s ，p r o c e s sm o d e sa n ds e v e r a lt y p e so f m o b i l ep h a s ei nh p l ct ot h es e p a r a t i o nw e r es t u d i e d f u r t h e r m o r e ，t h es t r u c t u r e so ft h e i s o l a t e di s o m e r so nt r i a z o l er i n gi nt h et e c h n i c a ls a m p l ew e r ei d e n t i f i e db yu s eo ft h e i n s t r u m e n t a la n a l y t i c a lt e c h n i q u e s ：i n f r a r e d ( i r ) ，m a s ss p e c t r o m e t r y ( m s ) ，a n dn u c l e a r m a g n e t i cr e s o n a n c e 洲m r ) h p l cw i t hu vd e t e c t o rw a su s e dt oc h e c kt h ei s o m e r sa n dt h e o t h e ri m p u r i t i e sq u a n t i t a t i v e l y t h eo p e r a t i o nc o n d i t i o n so fh l p cw i t hc h i r a lc h r o m a t o g r a p h i cc o l u m nt os e p a r a t et h e t e c h n i c a lc h i r a lp e s t i c i d e ( t e b u c o n a z o l e ) w e r es t u d i e d t h eo p e r a t i o na n dm e c h a n i s mo f r e s o l u t i o no ft h i sk i n do fo p t i ci s o m e r sw e r ed i s c u s s e d t h ea r t i c l eh a st r i e dt og e tas u m m a r y t ot h es t u d yo ft h er e s o l u t i o n k e yw o r d s ： t r i a z o l ep e s t i c i d e s ；h s c c c ； 4 hi s o m e r ；i d e n t i f i e dc h e m i c a ls t r u c t u r e ； c h i r a lr e s o l u t i o n i i 独创性说明 作者郑重声明：本硕士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理 工大学或者其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 作者签名： 必嗍 大连理工大学专业学位硕士学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连理工大学硕士、博士学位 论文版权使用规定 ，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送 交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连理 工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也 可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。 储躲丕翌：叁 导师 大连理工大学硕士研究生学位论文 引言 农药属于有毒产品，对生物及环境有一定的危害性。随着国家对环境保护的目益重 视，农药使用的安全性也日益得到重视，使用低毒甚至无毒的绿色农药是社会发展的必 然要求。目前，农药监督管理部门对农药品种的登记提出了严格要求，必须对商品化农 药进行组分全分析，确定杂质的化学结构，通过分离或定向合成的方法提供杂质标样， 建立规范的定量分析方法。由于杂质的组成可能涉及企业的生产工艺等机密，全分析结 果主要由农药管理部门备案，公开报道的文献资料极少，因此，建立商品化原药的分离 分析方法，为农药合成及登记提供准确的参考信息，具有十分重要的意义。 通过对农药品种进行全分析，可以得到原药的化学组成，建立合理的分析方法。再 根据原药中各种杂质的不同生物活性和毒性大小，对农药的安全性做出客观的综合性评 价。通过全分析知道原药的组成及含量，还可以根据原药中的杂质情况来改进农药的合 成工艺，以提高目标产物纯度和收率，尽可能减少有害杂质。 随着当前农药、医药等研究领域的迅猛发展，越来越多的合成药品，特别是农药合 成过程中有效成分及杂质的分离分析，都需要建立快速、高效的现代分离分析方法。而 对于合成产品中同分异构体的分析，由于在理化性质上的相似性，通常很难将其有效分 离，因此研究同分异构体的分离分析方法就显的极为重要。n 1 ，2 ，仁三唑类农药是 2 0 世纪6 0 年代初期发展起来的新型杀菌剂，对防治各种白粉病有特殊的效果，具有广 谱、高效等优点，因此该类化合物一直是新农药研究的热点。这类原药都存在三唑环氮 原子上的4 h 异构体，而4 h 位取代异构体无杀菌活性，只有1 h 取代衍生物才具有杀 菌活性，二者性质相近，分离有一定的困难：目前农药生产企业对三唑类农药异构体的 分析，还没有建立理想的分析定量方法，制约了产品质量的提高。大多数该类化合物含 有手性异构，是两种对映异构体的外消旋体混合物，其对映体的药效和生物活性有很大 差异，有的甚至一个是高效，而另一个却无效，给环境造成了一定的污染。因此，研究 具有光学活性的手性农药已成为化学领域的热点。 本课题主要以氟环唑和戊唑醇两个代表性的三唑类原药品种进行分离试验，优化了 分离条件，成功分离得到了三唑环氮原子的4 位取代异构体及其余含量大于0 1 的杂 质，进行了结构解析，确立定量分析方法，为三唑类农药分析提供理论依据和实践参考。 为三唑类农药的合成提供了有价值的信息。通过对三唑类农药手性拆分的研究，探讨外 消旋体的h p l c 分析方法，初步研究了三唑类手性化合物与光学活性的关系，建立了三 唑类农药的手性异构体分离方法。对开发高纯度、高活性的手性农药，减少农药投放量、 节省原料以及避免对环境的危害都有十分重要的意义。 三唑类农药分离分析研究 1 文献综述 1 1 三唑类农药的概述 三唑类农药是近年来开发的一类高效、低毒、广谱、持效期长、具有保护作用的内 吸型杀菌剂，部分品种具有生物生长调节活性，此领域的研究发展迅猛，人们设计合成 了各种取代的1 ，2 ，4 三唑衍生物，并对其活性作了系统的研究。目前已有八大类别、 三十多个化合物问世，是现有杀菌剂中销售额最大的一类，典型的商品化品种大致有： 戊唑醇、三唑酮、烯唑醇、氟环唑、腈菌唑、三唑醇、灭菌醇、丙环唑等。 1 1 1 氟环唑简介 氟环唑是一种新型的三唑类含氟杀菌剂，德国巴斯夫公司首先开发，具有广谱、持 效期长等特点，其英文通用名称为e p o x i c o n a z o l e ，商品名欧霸，1 9 9 3 年登记注册，c a s 登记号1 3 5 3 1 9 7 3 2 。近年来国外对其应用研究较多，巴斯夫公司已开发了两个以氟环 唑为主要成分的混剂。氟环唑已在德国和美国注册上市，用于谷物。陶氏农业科学的 t p e ( 氟环唑+ 苯氧喹啉+ 醚菌酯) 注册用于谷物病害。目前氟环唑已在国内杀菌剂市场 上占据相当的份额，且产品售价高，市场前景十分看好。 氟环唑的化学名称y 勺( 2 r s ，3 r s ) 一l - ( 3 ( 2 - 氯苯基) 2 ，3 环氧2 ( 4 一氟苯基) 丙基】一l 氢一l ，2 ，4 一三 唑 化学结构式为： f 噌h t n 、 氟环唑对一系列禾谷类作物病害如立枯病、白粉病、眼纹病等十多种病害有很好的防治 作用，并能防治糖用甜菜、花生、油菜、草坪、咖啡、水稻及果树等中的病害。 1 1 2 戊唑醇简介 戊唑醇是拜耳公司研制的新一代三唑类高效杀菌剂，英文通用名t e b u c o n a z o l e ， 化学名称：( r s ) 1 ( 4 氯苯基) 4 ，4 一二甲基一3 ( 1 h - l ，2 ，4 三唑- l 一基甲基) 戊一3 一醇， 一2 一 大连理i ：大学硕十研究生学位论文 化学结构式： c c h 一 - c h q 戊唑醇结构中有一个手性碳，具有光学活性，通过用异构体混合物、单一对映体对 不同敏感真菌的离体试验以及不同对映体处理后，甾醇在病原菌中的分布情况两种试验 研究，结果表明，戊唑醇的生物活性主要在于左旋对映体，经x 射线结构分析确定为s 构型体。1 3 】 戊唑醇目前是三唑类杀菌剂中销售额最高的一个品种，1 9 9 8 年全球销售额达2 7 8 亿美元，沈阳化工研究院是国内最早进行工业化生产的单位，目前有1l 家原药生产厂， 原药最高含量9 8 以上，市场前景十分广阔。具有杀菌谱广、活性高和持效期长等特点， 是甾醇脱甲基化抑制剂，主要用于防治小麦、花生、蔬菜、香蕉、苹果等作物上的多种 病害。 1 2 农药分离提纯常用方法 农药的分离提纯富集是农药全分析的基础，传统方法如薄层色谱( t l c ) 、纸色谱( p c ) 及柱色谱( c c ) 在农药提纯、中间体定性鉴别方面应用比较广泛，也有许多文献报道。近 年来一些新的分离方法逐渐得到广泛应用。如固相萃取( s p e ) 、高速逆流色谱( h s c c c ) 在占 守o 1 2 1 薄层色谱法( t l c ) 属于固一液吸附色谱。是近年来发展起来的一种快速、灵敏、高效的分离鉴别微量 物质的方法，且成本较低。它兼备了柱色谱和纸色谱的优点：设备简单，操作方便。只 须一块玻璃板和一个层析缸，在敞开的薄层上可以检查混合物的成分是否分开可观察。 展开的时间短。一方面适用于小量样品( 几到几十微克，甚至0 0 1 p g ) 的分离；另一方 面若在制作薄层板时，把吸附层加厚，将样品点成一条线，则可分离多达5 0 0 m g 的样品， 因此又可用来精制样品。此法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用 气相色谱分析的物质。薄层色谱法扩散作用较少，斑点比较密集，灵敏度较高。可以采 用多种展开方式如：双向展开，多次展开，分步展开，连续展开等。 农药中的杂质含量较低， 2 4 】采用薄层色谱法分离具有广泛适用性。可以分离农药 中的顺反及对映异构体。【6 儿7 】南开大学元素所的陈晓等采用薄层色谱法成功分离了烯唑 醇：( r s ) 1 ( 2 ，4 二氯苯基) - 4 ，4 二甲基2 ( 1 ，2 ，4 三哗1 基) 1 戊烯基3 三唑类农药分离分析研究 醇的顺反异构体，采用 b - c d 手性固定相( 环糊精类) 、非手性c 1 8 反相板，用自制的 反相薄层板( 将自制的g f 2 5 4 板于1 0 的c 1 8 的石油醚溶液中展开至1 0 c m 后取出，使 石油醚挥发尽后制成固定相，以3 5 的d c d 的缓冲液为主体制成手性流动相) ，经 二次展开可使化合物的z ，e 体的对映体得以分离，分离条件为：展开剂：3 5 的d c d 缓冲溶液：异丙醇= l ：0 5 ；温度：1 8 4 - 1 ，r f ( e ) = 0 0 8 ；x r f ( z ) = 0 1 6 。 1 2 2 柱色谱 柱色谱在农药分离中是最广泛使用的方法。柱色谱也属于液固吸附色谱。柱色谱 所用的吸附剂主要有硅胶、氧化铝、聚酰胺、离子交换剂及高分子凝胶等。硅胶是中性 的吸附剂，可用于分离各种有机物，是应用最为广泛的固定相材料之一。在色谱分离过 程中混合物各组分在吸附剂和展开剂之间发生吸附溶解分配，强极性展开剂对极性大 的有机物溶解的多，弱极性或非极性展开剂对极性小的有机物溶解的多，随展开剂的流 过，不同极性的有机物以不同的次序形成分离带。柱色谱的柱子有加压、减压、常压柱， 其中常压柱又称柱层析，是色谱法中最常见的一种。它的突出优点是分离效率比经典的 化学分离方法高的多，不需要昂贵的仪器设备，更换流动相和吸附剂方便，消耗材料少， 成本低，适合分离量从克到微克级范围很宽的各种样品，因此在化学实验室中至今最被 广泛应用。利用柱层析法也可以分离同分异构体，选用不同的吸附剂、洗脱液、层析法 可以实现二者的完全分离。【r 7 】柱层析法分离d l 麝香酮及其同分异构体已有相关的文献 报道。 1 2 3 固相萃取( s p e ) 固相萃取( s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ) 是利用固体吸附剂将样品中的目标化合物吸附， 使样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液沈脱，达到分离和富集目标化合物的 目的。是一种可靠和实用的样品前处理和制备新技术。s p e 商品柱自2 0 世纪九十年代 以来，一直以每年1 0 的速度增长，发展迅速。 s p e 是一种柱色谱分离过程，分离机理、固定相和淋洗溶剂的选择等与高效液相色 谱类似。s p e 柱的种类有正相、反相以及离子交换柱。 s p e 柱具有以下主要特点：固相萃取处理过程中不使用大量互不相溶的溶剂，不产 生乳化现象，提高了方法的回收率，重现性好；采用高效、高选择性吸附剂，可以根据 目标化合物与干扰物的性质选择多种分离模式，达到分离富集目标物的作用，提高分离 的灵敏度和准确度，样品预处理过程显著减少溶剂用量，所需溶剂只有液一液萃取法的 大连理工大学硕士研究生学位论文 1 0 ，减少了杂质的引入，简化了样品的预处理过程，缩短了预处理时间，提高了样品 的前处理通量，但柱效比h p l c 低，只能分开保留性质有很大差别的化合物。 s p e 的分离模式主要取决于固定相中吸附剂类型和洗脱液性质。固定相在s p e 柱中 起主要分离作用，固定相的选择取决于目标化合物的性质、样品基质或样品溶剂。固定 相吸附剂的种类有键合硅胶c 1 8 、c 8 、石墨碳( 反相) 、氧化铝等。流动相的选择与固 定相、目标化合物的性质以及分离模式有关。 目前，s p e 方法被广泛应用于农药样品分离的前处理，可以纯化活性组分及富集杂 质，s p e 技术在农药残留分析预处理的应用已有大量的文献报道【4 】o 1 2 4 高速逆流色谱( h s c c c ) 高速逆流色谱( h s c c c ) 是利用溶质在两种互不相溶的溶剂系统中分配系数的不 同，从而进行分离的色谱法，h s c c c 的流动相、固定相均为液体，且互不相溶。利用 螺旋柱运动时产生的离心力，使两相溶剂系统不断混合，固定相保留在聚四氟乙烯管 中，利用恒流泵连续输入流动相，随流动相进入螺旋柱的溶质在两相间持续分配，按 分配系数大小被先后洗脱。 h s c c c 的突出优点：1 无不可逆吸附。聚四氟乙烯管中的固定相无需载体，为液 液色谱系统，克服了固定相载体带来的样品的不可逆吸附、污染、失活和变性等缺点， 特别适用于分离极性物质和生物活性物质；2 高回收率：由于流动相和固定相均为液体， 样品可全部回收，分离纯化和制备可同步完成，特别适用于制备性分离；3 操作简单。 因固定相为液体，体系更换与平衡方便、快捷，与h p l c 相比，h s c c c 进样量，最多 可达数克，是h p l c 的数百倍；与常压、低压色谱相比，h s c c c 的分离能力强，有些 样品经一次分离即得到一个甚至多个组分，且分离时间短，数小时即可完成，纯度多在 9 8 以上。分离效果主要与溶剂体系的选择和旋转速度、样品制备、洗脱方法等有关。 h s c c c 系统中溶剂选择尤为重要，一般在了解化合物的性质后通常由三类体系来分离： 弱极性体系，中等极性体系，亲水性体系。弱极性体系：指适合分离较容易溶于己烷、 石油醚、乙醚、四氯化碳等，也溶于甲醇、乙醇的物质的溶剂体系。通常选用的溶剂条 件为：正己烷一乙酸乙酯一甲醇水：正己烷一甲醇一水；四氯化碳一甲醇一水；石油 醚一乙醇一水；乙酸乙酯：丁醇：水等。中等极性：般指适合分离较容易溶于氯仿、 乙酸乙酯、丁醇、也溶于甲醇、乙醇的物质的溶剂体系。通常选用的溶剂条件：正己烷 一乙酸乙酯一甲醇一水：正己烷乙酸乙酯乙醇一水；氯仿一甲醇一水；氯仿甲醇 一丁醇一水等。亲水性体系：一般指适合分离容易溶于丁醇、甲醇、水等物质的溶剂体 系。通常选用的溶剂条件：正己烷乙酸乙酯甲醇一水；氯仿一甲醇一水；氯仿一甲 醇一丁醇一水等。选择性主要取决于样品在两相溶剂中的分配系数，首先选出一个能使 三唑类农药分离分析研究 样品全部溶解的溶剂体系，然后调整各溶剂的比例，分配情况主要由甲醇调节，使得被 分离各组分满足k 值和o l 值的要求，以提高分离度。 目前，h s c c c 技术在生物化学、医药学、天然产物化学、环境、食品等众多领域 已得到广泛应用。特别是在天然产物有效成分的分离、纯化、制备方面显示出强大优势。 这方面的应用研究已有大量的文献报道。 其他分离方法如：凝胶渗透色谱( g p c ) 、膜分离、超临界流体萃取技术( s f e ) 等也具有一定的应用范围。 1 3 农药分析定量检测技术 通过气相色谱仪、液相色谱仪进行组分定量检测，【1 5 】是目前国际上公认的主流检 测手段。 1 3 1 气相色谱分析( g c ) 是以气体为流动相的色谱法( g c ) 。g c 按色谱柱的粗细可分为填充柱气相色谱 和毛细管气相色谱。毛细管柱气相色谱法由于柱效高，检测限可达p g 级，可同时进行 多组分的分离。常用于农药分析的检测器种类有氢火焰离子化( f i d ) 检测器、热导池 检测器( t c d ) 等。 g c 特点：适用于挥发性、热稳定性化合物的检测，对沸点5 0 0 以下，相对分 子质量小于4 0 0 ，热稳定性良好的农药，大都可用g c 检测；选择性、分离效能高；分 析速度快：灵敏度高；不宜用于热不稳定化合物的检测。 1 3 2 高效液相色谱法( h p l c ) 高效液相色谱法( h p l c ) 是以液体为流动相的一种色谱法。h p l c 具有高压( 高 压泵) 、高速( 流动相流速达1 - - 1 0 m l m i n ) 、高效( 柱效能可达每米5 0 0 0 塔板以上) 和高灵敏度( 最小检测量可1 0 p g ) 等特点。可对8 0 的有机化合物进行分离分析。 高效液相色谱最适宜农药分析检测【1 6 1 ，广泛应用于热不稳定和强极性农药及其杂质 的分析，1 2 1 1 2 2 i h p l c 法尤其适用于不易气化和热不稳定的农药检测，是农药定性定量分 析的最有效手段。h p l c 检测器可分为通用型检测器( e l s d 、r i d ) 和选择性检测器 ( u v d 、p d a d 、f d 等) 。目前应用于农药分析最多的是紫外吸收检测器( u v d ) ， 二极管阵列检测器( p d a d ) ，其次是荧光检测器。 一6 一 大连理工大学硕七研究生学位论文 1 4 农药化学结构鉴定方法 1 4 1 红外吸收光谱( i r ) 属于分子吸收光谱范畴，根据分子振动频率确定化合物的官能团及结构组成。具有 较强的特征性：测试用量少；对结构的差异非常灵敏，用来鉴别异构体比较直观。 1 4 2 核磁共振波谱( n m r ) 核磁共振波谱( n m r ) 技术不仅通过1 h - n m r 谱和1 3 c n m r 、d e p t 谱提供结构中质 子、碳的信息，通过c o s y 、h m q c 、h m b c 、n o e 以及其它技术还可给出它们之间的 一些关联信息。因此，它是最有效也是最普遍应用的有机结构分析法，能准确判定结构 的构型甚至构象。 1 4 3 联用技术 有时试样的提纯难度很大，很难得到纯度高的组分，此时可利用联用技术而不需要对 试样进行提纯。近年来发展起来的g c m s 、h p l c m s 、l c n m r 、g c i r 等已成为分 析复杂化合物的重要手段。可以根据组分的分子量进行结构解析。 1 5 手性农药的色谱分离分析方法 1 5 1 农药手性对映体分离的意义和方法 在现有的农药品种中，分子中含有手性原子的化合物越来越多，据报道，在所有商 品化使用的农用化学品中有2 5 是手性化合物，它们光学异构体之间的生物活性大多表 现出很大差异。例如：【8 】李正名等研究了杀菌剂三唑醇和三唑酮立体异构体和光学异构 体的生物活性。结果发现：三唑醇以左旋体的药效最高，而三唑酮的一对对映体的药效 几乎无差别。 1 3 1 b u r d e n 等采用立体有择合成方法，分别得到了三哗醇和烯效唑的四种 光学异构体。结果发现，这些异构体在杀菌和植物生长调节剂两种作用中所起的药效是 完全不同的。如烯效唑四种光学异构体的杀菌活性顺序为：2 r ，3 r 2 s ，3 r 2 r ，3 s 砭s ， 3 s ；而植物生长调节作用活性顺序为：2 r ，3 s 2 r ，3 r 2 s ，3 s 2 s ，3 r 。为了开发 生产这些高效异构体，必须采用立体有择合成、拆分和差向异构等新技术、新工艺。同 时，研究外消旋体农药立体异构与生物活性关系，筛选新的生物活性高的异构体，亦是 新农药筛选领域的重点。 目前，大部分手性农药仍以外消旋体形式出售，主要是因为：1 限于分离、测定技 术上的困难，化学合成的外消旋体混合物对映体的拆分花费较昂贵。2 对种新研制的 手性农药来说，其对映体拆分技术的发展并不是同步的。3 新手性农药纯对映体使用的 三唑类农药分离分析研究 有利之处仍没有被深入研究。手性农药高效异构体的开发生产常用两种方法：一种是立 体有择合成方法，但合成的化合物纯度较低，后期的提纯分离较困难；另一种是手性拆 分方法。目前，随着现代分离、分析技术的飞速发展，人们越来越倾向于使用第二种方 法。在当今特别强调环境安全，要求选用高效农药的情况下，人们必须不断改进手性拆 分方法，进而对手性农药中各个立体异构体的含量和生物活性有个全面评价，最终筛 选分离出活性高的单一异构体，不仅有利于提高产品性能，而且可以降低开发成本，减 少环境污染。 吲由于对映体之间在物理化学性质方面的差异很小，所以拆分分离是十分困难的。 对映体的拆分方法主要分两类。一类为非色谱分离法：主要采用结晶法、微生物或酶的 消化法把对映体的混合物转换成非对映异构体，然后利用它们在物理或化学性质方面的 差异进行拆分。这些方法过程烦琐，不z 日匕l - - , 制备较纯的对映体，难以普遍接受。另一类为 色谱法，目前已大量采用，其中高效液相色谱( h p l c ) 作为一种快速、高效的拆分分 离手性化合物的方法获得了迅速发展，己成为测定光学纯度和获得纯光学异构体十分有 效的方法。h p l c 中最为常用的是手性固定相法( c s p ) ，其优势在于可拆分多种外消 旋体，同时高收率地得到两种高旋光纯度的对映体，还可用于拆分一些特殊结构的如螺 旋或螺旋桨结构的化合物，并且可以实现大量制备。目前广泛采用的c s p 的机理是把具 有光学拆分能力的手性聚合物键合或涂布于硅胶上，其手性识别能力取决于手性聚合物 高度有序的刚性结构，由于聚合物有这种高度有序的刚性结构，才能具有高手性识别能 力。手性固定相包括刷型、配位交换、环糊精、蛋白质、和多糖等，多糖类固定相( 包 括纤维素和淀粉) 被证明是应用最广泛的一类固定相，固定相的种类及性能如下所述。 1 5 2 环糊精类手性固定相 环糊精简称c d ，为d 吡喃葡萄糖单元通过q 1 ，4 糖苷键以椅式构象结合而成的 环状低聚糖，分子整体上具有光学活性和立体识别能力，将a 、p 、丫环糊精或其衍生 物共价键合到硅胶颗粒表面上，形成对水稳定的c s p ，其立体选择性主要来源于被拆分 的环糊精空腔入口葡萄糖单元外露的伯仲羟基产生的手性结构，以及手性空腔入口和两 种对映体取代之间不同的相互作用。用于色谱固定相的g t 、p 、y - c d 分别含有6 ，7 ，8 个葡萄糖单元，其中 3 - c d 应用最多。r i t s u k o 等在反相色谱条件下，高效液相色谱 3 - c d 键合柱上，拆分了烯唑醇，考察了流动相改性剂、p h 、柱温对对映体的保留和分离的影 响，优化了色谱条件。 大连理一r 大学硕士研究生学位论文 1 5 3 纤维素衍生物c s p 手性固定相 纤维素衍生物c s p 手性固定相是发展最快，拆分手性化合物范围最广的。纤维素 是d ( + ) 。葡萄糖单元由1 ，4 一糖苷键形成的高度有序呈螺旋型空穴结构的光学活性天 然高分子，具有手性识别能力，但由于很容易在溶剂中溶解，不适合做固定相。通过纤 维素的羟基衍生化，可以改善其色谱行为和选择性。目前，相当一部分商品化的纤维素 衍生物c s p 得到广泛应用。如：纤维素苯甲酸酯衍生物( c h i r a l c e lo b ；o j ) ；纤维素 氨基苯甲酸酯衍生物( c h i r a l c e lo d ；o c ) ；纤维素乙酯衍生物( c h i r a l c e lo a ) 等。 脚j 纤维素氨基苯甲酸酯衍生物中，纤维素三( 3 ，5 二甲基苯基氨基甲酸酯) ( c d m p c c h i r a l e e lo d ) 的手性识别能力非常高，可以拆分芳香碳氢化合物、轴和平 面非对称化合物、手性磷和硫化合物、胺、醇、氨基酸衍生物以及拆分一些重要的手性 高分子，其中，在o d 柱上拆分商品化的手性三唑类农药也有相关报道。 纤维素苯甲酸酯的衍生物中，纤维素三( 4 甲基苯甲酸酯) c h i r a l c e lo j 的手性 识别能力最强，已成为十分实用的商品化的c s p 。o j 柱可用于拆分金属化合物、醚类 化合物及含氮的化合物。【1 0 】【1 8 】兰州大学的韩小茜采用c h i r a l c e lo j h 手性柱，正相色谱 条件下，直接拆分了三唑类手性农药戊唑醇，同时考察了流动相对手性拆分的影响。 b 9 l h e s s e 等通过纤维素乙酰化制备的微径纤维素三乙酸酯( c t a i ) 具有很高的手 性识别能力，在水和醇为流动相的条件下，可拆分各种消旋体，尤其是非极性化合物和 芳香药物。由于c t a i 的高负载能力，使其成为在中等压力l c 条件下用于制备手性化 合物最有效的c s p 之一。 1 4 h u t t a 使用h p l c 自制的微晶纤维素三乙酯m c t a 手性固 定相分离了氟环唑的两个对映体。 1 5 4 流动相的选择： 流动相的选择对于对映体手性拆分十分重要。纤维素衍生物c s p 常用的流动相是正 己烷与异丙醇或乙醇的混合物，其中醇的结构可以影响对映体选择性。同时，水乙腈 和水甲醇的混合物也可用作流动相，其他的溶剂如氯仿和t h f 不能作为主要的流动相， 因为它们对纤维素衍生物c s p 有一定的溶解性。选择合适的溶剂对减少峰的拖尾及提高 分离效果十分重要。 1 5 5 应用： 纤维素衍生物c s p s 能够拆分的化合物非常广泛，在已商品化的这类c s p s 中， c h i r a l c e lo d 和c h i r a l c e lo j 的手性识别能力最强，已成功拆分了8 0 以上的手性化合物， 不仅用于分析目的，而且可用于对映体的制各级分离。多糖纤维素c s p s 已用于对映体 的大规模制备分离，f r a n c o t t e 全面评述了对映体制备级色谱的拆分，得出结论：用于制 三唑类农药分离分析研究 各级拆分中的c s p s 有近7 0 是多糖衍生物c s p s ，尤其对于近几年发展起来的模拟流动 床色谱( s m b ) 用于工业范围的纯对映体制备有巨大潜力，而且已经变为了现实，s m b 色谱是一个持续地固液同时发生的过程，可持续迸样，节省了大量流动相。c h a m p i o n 等以多糖类手性柱拆分了五种有机氯对映体：s p i t z e r 等用涂敷纤维素三( 3 ，5 - - 甲基 苯基氨基) 甲酸酯手性柱在2 3 0 n m ，异丙醇体积分数为1 0 时，分离氯氟草醚乙酯对 映体的分离度达3 9 ；【1 2 j 王鹏等人以c d m p c 高效液相色谱c s p 正相色谱条件下，成功 拆分了三唑酮对映异构体，优化了色谱分离条件；金琼等等在c h i r a l c e lo j - h 柱上，正 相色谱条件下，实现了烯唑醇的拆分。鉴于以上意义，本论文对沈阳院生产的戊唑醇原 药进行了手性初步分离研究，对生产实践提供有价值的数据。 1 6 农药全分析 2 0 0 1 年4 月1 2 日发布的中华人民共和国农业部农药登记资料明确规定：对境内外 农药品种的登记，必须出具五批次原药有效成分的定性鉴定谱图( 红外光谱、紫外光谱、 核磁共振、质谱) 和定量结果；0 1 以上对脯乳动物、环境有明显危害的杂质名称、定 性谱图和定量方法。这就是农药全分析。全分析的目的，一方面在于明确其中所含的各 种组分情况，进而评价他们对环境的潜在危害，另一方面还可以为生产企业提供一些信 息，改进生产工艺，提高产品收率和质量。因此，农药全分析工作越来越受到企业及相 关研究机构的重视。 1 6 1 农药原药的定性分析方法 与其他有机化学品相比，农药的全分析工作难度更大，其难点主要在于样品的分离 和纯化，由于必须将其中含量在0 1 以上的杂质全部鉴定出来，可能含有多个组分， 这样通过常规的分离方法得到适于鉴定化合物结构的用量及纯度较高的组分是非常困 难的，必须结合新的分离技术和方法。目前在定性分析中，常用的方法可总结为传统剖 析法、直接分析法和合成验证法。 1 6 1 1 传统剖析法1 2 3 j 即利用各种分离手段对原药中所有组分进行分离富集，得到足够量和纯度的样品 后，对所得到的各组分进行结构鉴定。常见的分离方法有重结晶、萃取及前面所述分离 方法。国外已有采用制备色谱等现代分离手段。 1 6 1 2 直接分析法 不经过分离而直接确定杂质结构的方法，主要利用一些联用技术，如g c m s 、 l c m s 、l c - n m r 等。其中g c m s 、l c m s 为农药全分析最常用的方法。在利用l c m s 大连理工大学硕七研究生学位论文 分析时，同位素峰可以提供非常有用的信息，尤其是含c l 、b r 等原子时，可以相对较 容易地判定杂质结构。但此方法有时得不到分子离子峰，需结合合成工艺才能得出准确 结构，无法得到杂质的纯品进行准确定量。 1 6 1 - 3 合成验证法 当从其他分析渠道获得了有关杂质的一些信息，但对所掌握的杂质结构不能准确确 定时，可以对合成工艺进行分析，猜测可能含有的杂质，此时可以合成所猜测的化合物， 再与原药进行l c 等对照，从而确定相应的杂质。 综上所述，农药全分析是一项难度很大的工作，采用何种分析方法，要根据现有条 件和具体情况而定。 1 6 2 农药的定量分析 农药的定量分析包括有效成分和杂质的定量分析，主要采用气相和液相色谱法。用 有效成分和杂质的标准样品进行外标和内标法定量测定。 1 7 三唑类农药的分析研究及存在的问题 目前，对三唑类农药的研究报道主要集中在化合物的合成工艺、色谱定量分析方法、 对映体的手性拆分、残留分析等方面。例如：钱宝英等采用高效液相色谱定量分析研究 了三唑类农药；王乃兴等概括了三唑类化合物合成的新进展，对主要的合成反应机理做 了详细介绍；薛维嘉做了戊唑醇的高效液相色谱定量分析研究；陈振山等研究了氟环唑 高效液相色谱定量分析；j 李秀娟等对两种三唑类杀菌剂进行了拆分研究。而对于三唑 类农药，在合成过程中都会产生位置异构体问题( 三唑环1 ，2 ，4 和l ，3 ，4 异构) 和 手性对应异构体，大多数存在顺反异构体( e 式体及z 式体) ，这方面目前尚无研究报 导，如何准确分离出其中的异构体组分，进行详细的结构解析，并对其进行准确定量， 是三唑类农药分析的重点，也是目前存在的难点。本文主要以氟环畔和戊唑醇两种三唑 类农药为研究对象，首次通过h s c c c 等分离方法，提取富集了异构体等杂质组分，并 进行了详细结构鉴定，确定了相应的定量方法；对戊唑醇原药进行了手性分离分析研究， 确定了合理的手性分离条件，对三唑类农药的全分析及合成提供了有价值的信息。 三唑类农药分离分析研究 2 实验部分 2 1 氟环唑和戊唑醇的分离 本文以沈阳院生产的氟环唑( 9 8 ) 和戊唑醇( 9 7 ) 原药进行分离，先将原 药在合适的液相色谱条件下进行归一化分析，得出组分含量的初步结果，从h p l c 谱图 观察，两种原药都有四种含量大于o 1 的组分，对每种组分进行分离富集，主要采用 下图所示分离试验过程。 围 固相萃取 高速逆流色谱 上多次分离上多次分 i 活性组分 ii 组分q 组分爿 组分 f 2 1 1 实验仪器及试剂 柱层析硅胶( 2 0 0 - - 3 0 0 目) ：先经过净化处理：将硅胶依次用丙酮、乙醇、水清洗； 将处理后的硅胶放入1 1 0 4 c 的恒温烘箱干燥2 小时，保存于广1 ：3 瓶中备用。 玻璃柱( 内经仁5 c m ，长度5 0 c m ) ；烧杯( 1 0 0 m l ) ；脱脂棉； s p e 小柱：d i k m a 公司的键合硅胶c i s ( 反相固定相) 正己烷；苯：二氯甲烷：乙酸乙酯：丙酮；无水乙醇；无水甲醇；乙酸； s p e 洗脱液：甲醇( 1 0 ) ：甲醇；乙腈；丙酮 大连理工大学硕十研究生学位论文 2 1 2 实验过程 2 1 2 1 柱色谱及固相萃取分离过程 样品处理：由于原药的杂质含量很低，先将原药进行粗分，用少量的二氯甲烷溶剂 溶解，全部溶解后加入适量的硅胶搅拌，调成糊状，挥干溶剂，使样品吸附于硅胶上。 装柱：于玻璃柱底部铺一层脱脂棉，采用干法将硅胶装入柱内，装柱内的硅胶应平 整密实，不能引入气泡，硅胶的高度为玻璃柱的五分之三，再将烘干后吸附了样品的硅 胶装入柱中，铺平，在上面铺一层滤纸，以保证硅胶顶部平整。柱层析分离实验装置如 图2 1 1 所示。 r m s 图2 1 1柱色谱分离过程示意图 梯度洗脱：按极性从d , n 大的溶剂( 正己烷、苯、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、无 水乙醇、无水甲醇、乙酸) 进行梯度洗脱，洗脱速度控制在1 3 滴秒，每份收集等量 的洗脱液，洗脱液蒸发掉溶剂，进行高效液相色谱分析，并与原样的色谱图对照，按保 留时间不同分开活性组分和杂质，将杂质含量高的洗脱份进行分类，按含量不同进行多 次分离富集，得到含量相对较高的各组分。 将分离得到的极性较大组分和含量最大的活性组分分别采用固相萃取柱( s p e ) 进 行分离，该实验操作过程如图2 1 2 所示( 萃取柱需进行活化处理，过程如下) ： oqoq abc d 图2 1 2 固相萃取( s p e ) 操作过程示意图 三唑类农药分离分析研究 f i t ；柱活化处理( 3 - 5 m l 水活化，3 - 5 m l 甲醇淋洗) b ：吸附样品( 牛原药杂质，活性组分) c ：纯化( 用水和有机物的混合液洗除杂质) d ：洗脱( 用纯净的有机溶剂淋洗纯净的活性组分) 用极性相对较弱的丙酮溶剂溶解少量待分离样品，通过己活化的上述s p e 小柱，分 别用甲醇( 1 0 ) 、甲醇、乙腈、丙酮洗脱，收集并真空烘干各洗脱液，各洗脱液经 h p l c 分析，确定分离效果，对纯度相对较低的组分进行二次分离富集。 2 1 2 2 柱色谱及固相萃取分离结果 通过多次分离富集，选用不同的溶剂洗脱，按保留时间差异，氟环唑共得到三个含 量大于o 1 的组分，色谱测试纯度都在7 0 左右；通过s p e 柱分离，在甲醇洗脱液中 得到了组分( t a = 2 3 m i n ) ，经二次分离可提纯到9 5 左右；含量最大的活性组分 ( t a = 5 3 m i n ) 经上柱分离，在甲醇、乙腈、丙酮洗脱液中，得到混合物( t r = 3 7 m i n ； t r = 5 3 r a i n ) ，t a = 3 7 m i n 的组分含量逐渐降低，再用氯仿将柱吸附活性物洗脱下来，色 谱分析纯度归一含量在9 9 以上，说明s p e 固相萃取分离效果较好。对戊唑醇原药也 采用重结晶、薄层色谱、上述柱层析色谱、s p e 固相萃取等常规分离方法进行初步分离 富集，分离出的含量相对较高的杂质组分，采用高速逆流色谱进一步分离纯化，得到高 纯度的活性组分和含量较高的杂质成分，柱色谱及固相萃取具体分离结果如下表： 氟环唑戊唑醇 组分 保留时间( t r ) 纯度( )组分 保留时间( t r ) 纯度( ) 活性组分 5 3 m i n9 9 活性组分 4 。7 9 m i n9 8 8 c2 3 m i n7 526 8 m i n8 2 3 3 7 m i n 8 7 2 1 2 3 柱色谱及固相萃取分离效果讨论 柱色谱分离的优点是分离的样品数量较大，能够富集一定数量的目标产物：缺点是 分离效果一般，难以分离得到纯度高的样品，硅胶会吸附一定量的样品，洗脱溶剂也会 引入微量杂质，给分离工作带来麻烦，同时洗脱溶剂的选择也需要大量的摸索实验。s p e 方法存在样品处理量较少的缺点，只能分离富集痕量物质。 2 1 3 高速逆流色谱分离 2 1 ，3 1 试剂及仪器 大连理t 大学硕士研究生学位论文 氟环唑原药( 9 8 ) 、氟环唑杂质富集份、戊唑醇原药( 9 7 ) 、戊唑醇杂质富 集组分、正己烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、纯净水( 溶剂均为分析纯) 。高效液相色谱 中使用的甲醇、乙腈为色谱纯、水为纯净水。 高速逆流色谱仪( t b e 3 0 0 a 型上海同田生物技术有限公司) ：a g i l e n t l1 0 0 高 效液相色谱仪( h p l c ) 2 1 3 2 实验方法 h s c c c 分离条件： 溶剂体系：正己烷：乙酸乙酯：乙醇：水( 1 ：1 ：l ：1 ) ( 体积比) 转速：8 5 0 r m i n流速：2 0 m l m i n温度：2 5 首先选择合适的溶剂体系配好上下相。以上相作为固定相，下相作为流动相。将上 下相按v 上相：v 下相= 8 - 2 的比例泵满螺旋管柱，开动h s c c c 主机，使螺旋管柱按顺时 针方向转动，调节转速至8 5 0 r m i n ，同时以2 0 m l m i n 的流速泵入下相。待分离体系平 衡后，取2 0 0 m g 经柱层析分离接收的含氟环唑相对较少的组分，用1 0 m l 下相溶解，进 样。继续以2 0 m l m i n 的流速流脱。根据色谱图显示收集各峰样品，待目标组分峰被洗 脱出后，停止仪器操作。将收集到的含有目标组分的洗脱液减压浓缩，用于h p l c 检测。 h p l c 检测条件：色谱柱：( a n a l y t i c a l ，1 5 0 m i n x 4 6 m mi d ，5 p m ，a g i l e n t 公司) ， 柱