（微生物与生化药学专业论文）野葛内生菌抗氧化及抗衰老作用的研究.pdf

r e s e a r c ho na n t i o x i d a n ta n dt h e t n t ia g i n ge f f e c t so ft h em e t a b o l i t e sofanti-age ct h et a p u e r a r i ai o b a t a se n d o p h y t e s m a s t e rd e g r e ec a n d i d a t e ：z h o ul i j i a n g s u p e r v i s o r ：p r o f l is h u b i n at h e s i ss u b m i t t e dt os o u t hc h i n an o r m a lu n i v e r s i t y f o rp a r t i a lf u l f i l l m e n to fm a s t e r sd e g r e eo fm i c r o b i o l o g y a n db l o c l l e m l s t r ym e d l c m e g u a n g z h o u ，p r c h i n a ，m a y , 2 0 1 0 摘要 微生物与生化药学周理江导师：李淑彬 研究已经证实氧化特别是氧自由基与高等动物许多疾病的发生、发展以及 衰老密切相关，天然抗氧化剂在医药卫生、食品、化妆品以及饲料等领域有巨 大的应用前景。植物内生菌是新型天然生物活性物质研究开发的重要资源。本 论文开展野葛内生菌抗氧化及抗衰老作用的相关研究，旨在为野葛内生菌的研 究利用和新型抗氧化及抗衰老天然活性物质的研究开发提供依据。主要研究内 容和结果如下： 1 野葛内生菌代谢产物体外抗氧化活性的研究。采用d p p h ( 1 ，1 二苯基 苦基苯肼) 自由基清除法、a b t s ( 2 ，2 连氮双( 3 乙基苯并噻唑6 磺酸) ) 自 由基清除法、羟基自由基清除体系，超氧阴离子自由基清除体系、还原能力测 试体系研究四株野葛内生细菌( 编号分别为n c l 、n d l 、n e 2 、n a 2 ) 的体外抗氧 化活性。结果表明，所测试的菌株代谢产物均显示出不同程度的体外抗氧化活 性。在l o m g m l 的浓度下，菌株n c l 、n d l 、n e 2 、n a 2 代谢产物粗提物对d p p h 自由基清除率分别为7 4 、5 7 、8 2 、6 9 ；对a b t s 自由基清除率分别为8 0 、 7 1 、8 8 、6 8 ；对羟基自由基清除率分别为4 0 、9 5 、6 7 、7 4 ；对超氧 阴离子自由基清除率分别为6 2 、2 3 、5 4 、4 5 ；还原能力大小依次为 n c l n e 2 n a 2 n d l 。不同浓度样品对自由基清除效果的研究结果表明，所有样 品对自由基的清除率均呈现明显的量效关系。n c l 、n d l 、n e 2 、n a 2 ，对超氧阴 离子自由基的5 0 清除率( i c 5 0 ) 依次为8 3 1m g m l 、2 3 8 m g m l 、9 1 3m g n 1 l 、 1 1 1m g m l ，对羟基自由基的5 0 清除率( i c 5 0 ) 依次为1 2 5m g m l 、5 7m g m l 、 7 9m g m t 、6 9m g m l 。 2 野葛内生菌n e 2 代谢产物粗提样品对d - 半乳糖致衰老加速小鼠的抗衰老 摘要 作用。采用d 半乳糖致亚急性衰老法建立小鼠衰老模型，以v c 为阳性对照组， 通过对小鼠体征、行为学观察、脏器系数和对防御性抗氧化酶( s o d 、g s h p x ) 、 脂质过氧化产物( m d a ) 等指标的检测，测定野葛内生菌n e 2 代谢产物样品低、中、 高剂量组对d 半乳糖致亚急性衰老小鼠抗衰老能力的调节作用。结果表明，d 半乳糖能明显加速小鼠衰老各项体征，包括记忆和学习能力显著降低，脑组织 s o d 、g s h p x 含量显著降低，血清m d a 含量显著增高等。与模型组比较，野葛 内生菌n e 2 代谢产物样品高剂量组小鼠的脑组织s o d 含量提高1 2 5 ( p o 0 5 ) 、 血清g s h p x 含量提高5 2 3 ( p 0 0 1 ) 、血清m d a 含量降低4 0 9 r p 0 0 1 ) 、学 习记忆能力明显提高( p 0 0 1 ) 、胸腺系数提高1 5 5 ( p 0 0 1 ) 、脾系数提高 1 3 9 ( p o 0 5 ) 、心脏系数提高1 9 2 ( p n a 2 n d l t h es t u d i e ss h o w e dt h a tt h er a d i c a ls c a v e n g i n ga c t i v i t ya n d t h ed i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fs a m p l e se x i s t e dag o o dd o s e - e f f e c tr e l a t i o n s h i p t h e i c 5 0o fn c l ，n d l ，n e 2 ，n a 2a g a i n s ts u p e m x i d er a d i c a lw e r e8 31m g m l ，2 3 8 m g m l ，9 13m g m l ，11 im g n ：l l t h ei c s oo f n cl ，n d l ，n e 2 ，n a 2a g a i n s th y d r o x y l r a d i c a lw e r e1 2 5m g m l ，5 7m g m l ，7 9r n m l ，6 9r n m l 2 e x p e r i m e n ts t u d ya b o u tt h ee f f e c to ft h ee x t r a c t sf r o mc u l t u r eb r o t ho f e n d o p h y t i c b a c t e r i af r o mp u e r a r i al o b a mn e 2o n a n t i - a g i n gc a p a c i t y o f s e n e s c e n c e - a c c e l e r a t e dm o u s ei n d u c e db yd - g a l a c t o s e d u p l i c a t et h ea g i n gm i c e s m o d e lb ym e a n so fs u b a c u t ei n s e n e c e n ei n d u c e db yd g a l a c t o s e ，t a k ev ea sp o s i t i v e c o n t r o l , o b s e r v et h em i c e sc o m m o ns t a t e sa n da c t i v i t y , a n dt h ea p p a r a t u si n d e x , a n d m e a s u r et h ea c t i v i t yo fd e f e n s i v ea n t i o x i d a s e s ( s o d ，g s h - p x ) ，t h el i p i dp e r o x i d eo f m d a t od ot h e s e ，a u t h e n t i c a t et h ef u n c t i o nt h a tl o w , m i d d l e ，a n dh i g hd o s eo ft h e e x t r a c t sf r o mc u l t u r eb r o t ho fe n d o p h y t i cb a c t e r i ao fp u e r a r i al o b a t an e 2 a c c o m m o d a t et h ea n t i - o x i d a t i o nc a p a b i l i t yo ft h es u b a c u t ea g i n gm i c e si n d u c e db y d - g a l a c t o s ea n dt h a tt h ee x t r a c t sf r o mc u l t u r eb r o t ho fe n d o p h y t i cb a c t e r i ao f p u e r a r i al o b a t an e 2p o s t p o n e si n s e n c e n c e c o n s e q u e n c e ：a f t e rd u p l i c a t i n gt h e m o d e lm a n yp a t h o - r e p r e s e n t a t i o n so c c u ri nt h ea g i l l gm i t e si n c l u d i n gt h ew o r s e g e n e r a ls t a t e s ，r e d u c i n g t h el e a r n i n ga n dm e m o r ya b i l i t y , i n c r e a s i n gt h ea c t i v e o x y g e nf r e er a d i c a la n dl i p i dp e r o x i d a t i o n a f t e rt h ei n t e r v e n t i o no ft h et h r e ed o s e s o ft h ee x t r a c t sf r o mc u l t u r eb r o t ho fe n d o p h y t i cb a c t e r i ao fp u e r a r i al o b a mn e 2 ， o c c u rm a n yb e t t e rp a t h o - r e p r e s e n t a t i o n si nt h em o d e lm i c e si n c l u d i n gt h en o tt o o b a dg e n e r a ls t a t e s ，t h ee n h a n c i n gs o d12 5 ( p 0 0 5 ) i nt h em i c e sb r a i na n d g s h - p x5 2 3 ( p o 0 1 ) i nt h em i c e sb l o o d ，a n dt h ee l e v a t i n gc a p a b i l i t yo fm d a 4 0 9 ( p o 0 1 ) i nm i c e sb r a i n , i n c r e a s i n gt h em o u s e st h y m u si n d e x15 5 i v a b s t r a c t ( p 0 0 1 ) ，b r a i ni n d e x2 1 5 ( p 0 0 1 ) ，s p l e e ni n d e x1 3 9 ( p 0 0 5 ) ，h e a r ti n d e x 19 2 ( p p g ) b h a ) b h t ) 生育酚。 4 第章前言 当一种能够提供氢原子或正电子与自由基进行反应，使的自由基转变成非 活性的或较稳定的化合物。阻断氧自由基氧化反应进程，达到清除自由基的目 的，这种物质称为自由基吸收剂，大多数抗氧化剂是有效的自由基吸收剂，它 给出氢原子提供自由基，有两个途径可以达到提供氢原子的目的，一种是向已 被氧化脱氢的脂质，自由基统一供氢原子还原到脂质的原来的结构和原来的状 态，从而达到阻断氧自由基的目的；另一种方法是向过氧化自由基提供氢而使 之成为氢过氧化物，终止了有过氧化自由基与未氧化的脂质自由基，从而阻止 脂质的自动氧化过程。生物体的各类抗氧化剂主要有以下作用机制发生抗氧化 作用：l ，减少氧化底物中的局部氧浓度。2 ，清除启动脂质过氧化的引发剂。3 ， 结合金属离子，使其不能启动脂质过氧化的羟基自由基或使其不能分解脂质过 氧化产生的脂质过氧化氢。4 ，将脂质过氧化物分解为非自由基产生。5 ，阻断 脂质过氧化的反应链，即脂质过氧化的中间自由基，如脂自由基，脂氧自由基 和脂过氧化自由基。正常氧原子是具有4 对电子，机体正常代谢可使原子失去_ 个电子，这样就形成了自由基，自由基主要通过抢夺其他分子上的电子而使自 己配对。当自由基从细胞膜上夺取一个电子后，就产生了另一个新的自由基， 并开始了链锁反应，电子夺取链锁反应侵蚀细胞膜，导致细胞完整性的丧失为 癌症及其它疾病打开了方便之门，由于其特殊的分子结构，抗氧化剂能给出一 个电子给自由基而自身不会形成有害的能引发链锁反应的危险物质，因此阻断 自由基的损害后果( 尼加提等，2 0 0 8 ) 。 抗氧化剂在体内作用的可能机制概括为一，直接清除自由基。包括直接清 除羟基自由基，超氧阴离子，单线态氧，多种氧自由基等。二，抑制活性氧的 产生。机体中性粒细胞及巨噬细胞同通过n a d p h 氧化酶系统产生活性氧，而天 然植物中含有丰富的抑制这些吞噬细胞产生活性氧的药理成分，可通过抑制中 性粒细胞来抑制过氧化物的产生。天然抗氧化剂对金属离子有一定的螯合作用， 可以减少自由基的产生。三，影响内源性抗氧化蛋白酶的生物活性。生物体内 有很多有清除自由基的酶，比如超氧化物歧化酶( s o d ) ，过氧化氢酶( c a t ) ， 谷胱甘肽过氧化物酶( g s h p x ) ，天然植物抗氧化剂可以通过增强对氧自由基 的清除作用，从而抗氧化损伤。四，对s o d m r n a 表达的作用。有部分天然抗氧 化剂，不仅在组织水平上能提高抗氧化酶如s o d m r n a 转录水平的表达量，对 s o d 基因表达呈现出正调节作用，加快了s o d 蛋白在细胞中的合成，使s o d 量 增加而导致酶活性的调高从而提高抗氧化作用( 杜玉等，2 0 0 6 ) 。五，提供还原 5 华南师范大学硕士学位论文 剂或维持还原剂的水平。六，参与已损伤分子的修复和替代。七，将活性氧与 其特异作用部位相隔离( 凌关庭，2 0 0 4 ) 。 抗氧化剂的作用引起人类的应用抗氧化剂的研究开发。现代抗氧化剂的应 用越来越广泛，如医药、食品、化妆品、饲料、治疗等领域广泛应用。现代化 妆品和日用化学品中天然抗氧化剂的应用较广泛的，如s o d 中极性氨基酸含量 很高，占有3 0 以上，具有很强的穿透进入细胞内的能力。s o d 可用做化妆品的 添加剂，可使色斑淡白，有增白效果，同时对皮肤瘙痒、痤疮、日光性皮炎等 都有治疗作用，与维生素类物质和过氧化酶配合使用效果更好。因此s o d 取得 了在各种化妆品中广泛应用。v e 具有抵抗衰老，润肤等作用而应用在日用化妆 品中。抗氧化剂在医药和治疗方面的应用也广泛，尤其是天然抗氧化剂的应用 如老年人患病率较多的白内障，动脉硬化等的疾病治疗中原花色素的作用较突 出。在食品中的应用来说最简单的例子是法国人的红葡萄酒，它是一个食品保 健品( 李华等，2 0 0 9 ) 。在医疗临床方面，依达拉奉( e d v r a v o n e 3 甲基1 苯基2 吡唑啉5 酮) 是一个用于治疗脑梗死的药物，可猝灭自由基( 王震宇等，2 0 0 9 ) 。 自由基的生成可以通过多种方法检测，包括荧光法、分光光度计、化学发 光、电子顺磁共振等。( 杨芬等，2 0 0 7 ) 1 1 2 2 抗氧化剂的研究方法 目前用于评价物质抗氧化能力的方法分为体内法，体外法和细胞损伤模型 法。体内法主要采用动物实验，结论可靠，但周期长，经费多。体外法，操作 简单，但很难模拟体内真实环境，但方法选取适当也有一定的可靠性。 评价或表征抗氧化活性的方法有许多种，这些方法都是为了说明在特定条 件下被测物抑制底物氧化的效力或清除自由基的能力。评价或表征抗氧化活性 的方法有，一，在指定的时间测量氧化产物或官能团的浓度或吸光度值。二， 测量反应速率。三，测量诱导期或氧化达到一定程度所需的时间。四，测量速 度的积分。五，测量被测物产物产生与标准抗氧化剂相当作用的浓度。抑制率 和i c 5 0 常用来表征抗氧化能力，他们与被测抗氧化剂的反应性能和氧化底物有 关，并且只有在其他参数相同的情况下，两组数据的抑制率和i c 5 0 才可以进行直 接比较。体外测定抗氧化活性的方法有许多种，对同一物质抗氧化活性的测定 需要几种方法的综合使用才能比较客观的评价( 王会等，2 0 0 6 ) 。 抗氧化剂的抗氧化活性主要表现在抑制脂质的氧化降解，清除自由基，抑 6 第章前+ 吉 制促氧化剂和还原能力等方面。可以分为直接和间接测量，以底物或氧的衰减 和氧化产物的生成的测量方法是直接法，而用特征自由基的形成或衰减的速度 和程度的测量方法是间接法。测定抗氧化的方法很多，具体概况来说有：一， 以抗氧化剂抑制脂质氧化为基础的方法。食品工业中，以抑制脂质氧化降解为 基础的方法是测定抗氧化活性最方便和常用的方法，原理是脂质中的不饱和脂 肪酸自动氧化，生成不稳定的氢过氧化物，氢过氧化物继续分解形成短碳链的 醛，酸等小分子化合物，抗氧化剂的加入可以延缓氢过氧化物及其分解产物的 形成，由此可以测得抗氧化活性。常用的底物有甘油三酸酯、猪油、鱼油、磷 脂和脂蛋白等，采用的反应体系有有机溶剂或( 水) 胶束和反胶束体系，以及 乳化体系等。为保持实验的可重复性，底物的选择应考虑采用单一的物质。实 验过程中，常规条件下，脂质氧化过程非常慢，因此采用各种加速反应氧化的 方法，比如烘箱法、活性氧法、r a n c i m a t 法、o s i 法等。目前文献报道中常用自 由基引发剂加速脂质氧化，常用热不稳定的偶氮化合物作为引发剂，水溶性的 a a p h 2 ，2 - a z o b i s ( 2 a m i d i n o p r o p a n e ) d i h y d r o c h l o r i d e l 和脂溶性的 a m v n 2 ，2 - a z o b i s ( 2 ，4 d i m e t h y r l v a l e r o n i t r i l e ) 】。这些反应体系中，自由基的生成速 度和引发剂的浓度成比例，与反应体系的其他成分无关。这个体系的缺点是， 抗氧化能力主要体现在供氢的速度上，没有考虑抗氧化剂自身生成的自由基的 作用，并且有些抗氧化剂被氧化后的产物也能参与抑制作用，对抗氧化活性有 一定影响。食品工业中，过渡金属或过渡金属的氧化还原反应也经常用于引发 加速氧化。另外，还有用光照或紫外光方法来加速氧化。但是光引发脂质氧化 可能引起氧化机理的改变，因此这种方法不常用。脂质氧化可用化学，物理方 法检测。过氧化值、碘值、游离脂肪酸的含量、t b a r s 法、羰基化合物、克雷 斯实验和茴香胺值等方法都是常用的化学方法。物理方法中，如粘度、颜色、 共轭二烯含量、红外光谱、折光指数、介电常数和气相色谱法、液相色谱法、 气质色谱联用等方法。除此之外，测量体系中氧的减少造成压力变化的氧压法， 测量氧消耗的氧电极法，测量底物中不饱和脂肪酸的减少以及氧化后底物的增 重等方法也常用于检测脂质的氧化( 左玉等，2 0 0 9 ) 。 过氧化值( p e r o x i d ev a l u e ，p v ) 法是测量脂质氧化的最常用的化学方法， 反映了脂质和含脂原料中氢过氧化物和脂质过氧化物的总含量。此法的缺点是 灵敏度低，选择性差，碘化氢易被氧化，并且极易与碳碳双键加成，而且生成 的碘也能与不饱和双键加成，测量结果会偏低( 汪焕林等，2 0 0 9 ) 。 7 华南师范大学硕士学位论文 共轭二烯氢过氧化物法。1 9 3 1 年g i l l a m 等人发现天然脂肪在贮藏期间在 2 3 0 2 3 5 n m 处逐渐显示有一吸收峰，2 年后发现这个吸收峰是共轭二烯形成的。 直到上19 6 0 年代共轭二烯的检测才被当作研究脂质氧化的一个有用的方法。目 前，共轭二烯作为测量脂质氧化的一种简单的方法和有用的指标已普遍用于样 品抗氧化活性的测定。共轭二烯的量可通过在某一时间的吸光值计算。此法适 合纯脂质体系中脂质氧化的研究。由于组织样品和生物体液含有许多在紫外光 区有强吸收的物质( 如血红蛋白、叶绿素、嘌呤和嘧啶等) 干扰测定，所以一般 不能直接测量其共轭二烯。脂质中的脂肪酸在紫外区也有吸收，对测定结果也 有一定的影响。此外，共轭二烯不稳定，在生成的同时也会分解，因此共轭二 烯的量反映的只是氧化早期阶段脂质氧化的程度。该法不适合测量饱和脂肪酸 含量高的油，如棕榈油( d o r m a n d y t l 等，1 9 8 7 ) 。 硫氰酸铁( f e r r i ct h i o c y a n a t em e t h o d ，f t c ) 法。此法是根据脂质氧化产生的过 氧化物将f e 2 + 氧化成f e 3 + ，f e 3 + 与硫氰酸铵反应，生成的硫氰酸铁5 0 0 n m 处有强吸 收，通过5 0 0 n m 吸光度的变化可测得过氧化物的含量( 吴青等，2 0 0 1 ) 。 检测脂质氧化终产物的这些方法中，t b a r s 法是目前使用最普遍的方法( 赖 泽仁，2 0 0 6 ) 。对于脂质氧化的不同终产物采用不同的测定方法。醛基分解物常 采用的方法有克雷斯实验法，茴香胺值，硫代巴比妥酸法。克雷斯( k r e i st e s t ) 法原理是油脂氧化产生的醛与间苯三酚反应，生成物在5 4 6 n m 处有最大吸收峰 ( 郑炜，2 0 0 4 ) 。茴香胺法原理是油脂氧化产生的q b 不饱和醛可与甲氧基苯胺或 联苯胺试剂反应，生成物在3 5 0 n m 处有最大吸收峰( 张佳欣等，2 0 0 5 ) 。硫代巴 比妥酸法，脂质氧化生成的丙二醛( m d a ) 与硫代巴比妥酸( t b a ) 反应，生 成物在5 3 5 n m 处有最大吸收峰( 杨李等，2 0 0 4 ) 。羰基分解物的测定方法有羰基 值( 2 ，4 二硝基苯肼法) ，原理是，羰基化合物可与2 ，4 二硝基苯肼反应，生 成物在4 4 0 n m 处有最大吸收峰。 a b t s 法最初是m a r k l u n d 根据含有蛋白质的血红素过氧化物酶使无色的 a b t s 2 ，2 - a z i n o b i s ( 3 - e t h y i b e n z t h i a z o l i n e 6 s u l f o n i ca c i d ) d i o m m o n i u ms a l t ，2 ，2 - 连 氮( 3 乙基苯并噻唑啉6 磺酸) 二胺盐】变成蓝绿色的a b t s + ，用于测定组织样 品中血红蛋白的含量。后来这个方法被m i l l e r 等人加以改进，用于测定生物样品 的抗氧化活性，然后广泛应用于食品和天然水溶性酚类物质抗氧化活性的测定 ( m a r k l u n ds 等，1 9 7 9 ) 。a b t s ( x m a x = 3 4 2 n m ) 可被k 2 s 2 0 s ，m n 0 2 ，a b a p 和h 2 0 2 等各种试剂氧化生成蓝绿色的自由基阳离子a b t s + 。a b t s + - 与之反应，变成没 8 第一章前言 有颜色的a b t s 。抗氧剂清除a b t s + 的能力可用4 1 4 或7 3 4 n m 处吸光度的变化测 量( m i l l e rn j 等，19 9 3 ) 。测得的结果t e a c ( t r o l o xe q u i v a l e n ta n t i o x i d a n tc a p a c i t y ) 表示，既被测抗氧化剂清除a b t s + 的能力，与标准抗氧化) 菁u t r o l o x 清除a b t s + 的能力的比值。t r o l o x ( 2 c a r b o x y - 2 ，5 ，7 ，8 t e t r a m e t h y r b c h r o m a n - 2 c a r b o x y l i ca c i d ) 的 t e a c 值是m i l l e r 等人提出的a b t s 与铁肌红蛋白自由基( f e r r y lm y o g l o b i n ) 反应 生成的，而铁肌红蛋白自由基由高铁肌红蛋白和h 2 0 2 反应生成。在这种方法中， 被测物是在h 2 0 2 引发生成a b t s + 前加入，抗氧化剂也能和铁肌红蛋白自由基反 应，造成t e a c 值被高估。a b t s 法广泛用于评价抗氧化剂清除自由基的能力， 快速简单，用于常规测定。由于生成a b t s + 的方法，被测物的浓度，反应持续 的时间，测试体系的p h 值和测试使用的波长不同，因此，同一物质，测出的t e a c 值会不相同。由于反应体系的问题，抗氧化剂在反应时间内没有充分的反应或 者反应产物再次与a b t s + - 反应，都能让测试结果偏高或者偏低。a b t s + 在与氢 原子供体的反应中选择性差是此法的一个缺陷，他可与羟基化的芳香族化合物 反应，但是芳香族化合物没有抗氧化作用，因此测定结果不能真实的表现抗氧 化能力( a r t sm jt 等，2 0 0 2 ) 。 d m p d + 法，f o g l i a n o 等人提出的清除自由基的方法与a b t s 法类似，在酸性 件下，d m p d 9 ( n , n d i m e t h y l - p p h e n y l e n e d i a m i n e ) 可被a b a p ，f e c h ，c u c h ，h 2 0 2 等氧化，生成稳定的d m p d + ，它在5 0 5 n m 处有最大吸收峰。根据加入抗氧化剂 后吸光度的变化可测得样品清除自由基的能力。f o g f i a n o 等人用f e c l 3 与d m p d 反 应测定葡萄酒的抗氧化活性。d m p d 只溶于水，不能用于疏水性抗氧化剂的测定 ( f o g f i a n ov 等，1 9 9 9 ) 。 d p p h 法。d p p h 法是1 9 5 0 年代提出的，最初用于发现食物中的供氢体，后 来广泛用于定量测定生物样品，酚类物质和食品的抗氧化能力。d p p h ( 2 ， 2 - d i p h e n l 1 p i c r y l h y d r a z y l ，2 , 2 二苯代苦酰基苯肼) 是一种稳定的自由基。其乙 醇溶液显紫色，在5 1 5 n m 处有最大吸收，当有供氢能力的抗氧化剂存在时，d p p h 自由基溶液的颜色变浅，吸光度值变小。根据吸光度的变化可测得抗氧化剂的 活性( l i uj i k a i 等，2 0 0 4 ) 。d p p h 法可分为动力学法和静力学法两种。动力学法测 的是添加完含有供氢能力的样品后d p p h 自由基减弱的速率，表征的是被测物的 反应性，一般用d p p h 自由基减弱的起始速率表示，静力学法测的是被测样品清 除d p p h 自由基的量，或d p p h 自由基与某一种供氢体反应的化学计量关系或负 责混合物中活性羟基自由基的量。用i c s 0 定结果( p e n gc l 等，2 0 0 0 ) 。 9 华南师范大学硕十学位论文 s a n c h e r z m o r e n o 等人把上述2 种方法结合在一起表示。被测物清除d p p h 自由基 的产物也能与d p p h 自由基作用，影响测起，用抗氧化效率a e 表示，a e 用参数 1 i c 5 0 t 5 0 ，d eb e e r 等人也提出类似的参数，自由基清除效率r s e ( r a d i c a l s c a v e n g i n ge f f i c i e n c y ) ，r s e 由d p p h 自由基减弱的起始速率与i c 5 0 的比率计算 ( s a n c h e z - m o r e n oc 等，19 9 8 ) 。 a b t s 自由基和d p p h 自由基是测定抗氧化活性使用最广泛的两种人工生成 的自由基。但是这两种反应体系也有很多的不同之处，一，d p p h 自由基不需要 制备就可直接得到，而a b t s 自由基必须由酶或化学反应生成。二，a b t s 自由 基可溶于水，也可溶于有机溶剂，因此，对水溶性和脂溶性化合物都能测定， 而d p p h 自由基只溶于有机溶剂，比如乙醇，但是不容于水，因此，在评价水溶 性抗氧化剂的作用时，这是一个很大的局限。三，在供氢体的反应上，d p p h 自 由基比a b t s 自由基的选择性强。a b t s 自由基可以与任何羟基化的芳香族化合 物反应( l e ei k 等，2 0 0 4 ) 。 以抗氧化剂抑制自由基对底物的氧化降解为基础的抗氧化活性测试方法。 这个测试体系中，既有底物又有自由基，抗氧化剂的加入使底物与自由基反应 产生的产物减少而达到抗氧化效果。o r a c ( o x y g e nr a d i c a la b s o r b a n c ec a p a c i t y ， 氧自由基吸收能力) 法是近年来由c a o 等人在g l a z e r 研究的基础上发展起来的， 原理如下，天然蛋白质b 藻红蛋白在5 4 0 n m 光波激发下可发射5 6 5 的荧光，在有 自由基或氧化剂时，肛p e 的荧光逐渐减弱，当有抗氧化剂存在时，p p e 的荧光 减弱被抑制( c a og 等，1 9 9 3 ) 。自由基的产生剂可用a a p h ，h 2 0 2 c u 2 + 体系产 生h o 。该法优于其他类似方法的原因有2 个，( 1 ) 使用了曲线下面积( a u c ) 的方法，将抗氧化剂对自由基作用的抑制时间和抑制程度结合成一个单独的量。 ( 2 ) 使用不同的自由基生成剂或氧化剂，因为抗氧化活性与分析中使用的自由 基或氧化剂有关，而且p e 和自由基间的反应完全。a a p h 与抗氧化剂的摩尔比非 常高，使得这个方法专一性强，测量的是抗氧化剂直接清除自由基的能力，由 于使用荧光技术，此法也能测量含有抗氧化剂的稀释的油乳状液。此法测得的 是总的抗氧化能力( g h i s e l l ia 等，1 9 9 5 ) 。 w a y n e r 等人的t r a p ( t a t a lr a d i c a lt r a p p i n ga n t i o x i d a n tp a r a m e t e r ，总自由基清 除抗氧化能力) 法是过去1 0 年中测量血浆或血清总抗氧化能力最广的方法。该 法中的过氧自由基由a a p h 产生，在向血浆中添加完a a p h 后，通过测量反应过 程中消耗的氧检测底物的氧化情况，诱导期内，氧化被血浆中的抗氧化剂抑制， 1 0 第章前言 结果以血浆的诱导期与标准抗氧化剂t r o l o x 的诱导期的比值表示( w a y n e r d d 等，1 9 8 5 ) 。 v a l k o n e n 和k u u s i 报道的d c f h d a ( d i c h o r o f l u o r e s c i n - d i s t a n c e ，二氧荧光素 二乙酸酯) 法也是测定总的自由基清除能力。a a p h 产生的过氧自由基氧化 d c f h d a ，生成d c f ( d i c h l o r o f l u o r e s c e i n ，二氯荧光黄) 。d c f 有很强的荧光， 在5 0 4 n m 也有吸收，因此可用荧光法或分光光度计法检测( v a ( o n e nm 等，1 9 9 7 ) 。 化学发光( c h e m i l u m i n e s c e n c e ，c l ) 法的基本原理是活性自由基氧化发光 剂形成的发光剂自由基能发光，发出的光可由发光计检测。抗氧化剂是活性自 由基清除剂，它能抑铝j j c l ，使发光强度减弱，通常有一个明确的诱导期。抗氧 化活性以t r o l o x 当量的形式给出。由抗氧化剂抑s u c l 的能力与t r o l o x 抑制c l 能力 的比值可定量得出样品的抗氧化能力( w h i t e h e a dtp 等，1 9 9 2 ) 。 b 胡萝卜素漂白法是根据乳状液中的亚油酸能自动氧化，生成的自由基与肛 胡萝卜素反应，引起肛胡萝卜素的黄色衰减( 毛e 4 7 0 n m 处吸光度减少) ，在有抗 氧化剂存在时，肛胡萝卜素漂白的速率被减缓( 郑鹏等，2 0 0 8 ) 。藏花素漂白法 ( c r o c i nb l e a c h i n gt e s t ) 最初是由b o r s 等人提出( b o r sw 等，19 8 4 ) ，t u b a r o 等人 加以改进( t u b a r o 等，1 9 9 8 ) ，用于测定发杂混合物和食品的抗氧化能力。藏花 素是一种天色化合物，在可见光区有强吸收，在有过氧自由基时，藏花素颜色 变浅( 被漂白) ，添加抗氧化剂后，葬花素的漂白速率减慢。藏花素漂白法是一 种动力学方法，对于单一化合物a ，在加入偶氮化合物之后，藏花素漂白的速率 在大约l m i n 内呈线性关系，记录没有抗氧化剂时藏花素漂白的速率( v o ) 与有 抗氧化剂存在时的漂白速率( v ) ，通常记录1 0 m i n ，两者的比率符合方程， v 0 v = i + ( k a k c ) ( a 】【c 】) 。其中，【a 】和 c 】分别是被测抗氧化剂和藏花素的浓度， k c 和l 【a 是过氧自由基分别与藏花素和抗氧化剂反应的速率常数。 是一个自动分析法。也是一种测定清除过氧自由基活性的方法。该法以 p v 法的原理为基础，用a a p h 产生的过氧自由基取代脂质过氧化物，将氧化 成碘分子，抗氧化剂抑制过氧自由基引起的氧化，使碘释放的速率降低。氧化 生成的碘量可通过自动电位滴定仪用硫代硫酸钠滴定得出( s a n om 等，2 0 0 3 ) 。 t o s c ( t o t a lo x y r a d i c a ls c a v e n g i n gc a p a c i t y ，总氧自由基清除能力) 法是 r e g o l i 等人提出的一种相当新的测量体外抗氧化活性的方法。此法是根据过氧自 由基，过氧化氮或o h 将k m b a ( a k e t o - r - m e t h i o l b u t y r i ca c i d ) 氧化，生成乙烯， 生成的乙烯可用气相色谱检测。在有抗氧化剂存在时，抗氧化剂与k m b a 对过 华南师范大学硕十学位论文 氧自由基竞争反应，乙烯的形成被部分地抑制。t o s c 值可根据方程 t o s c = 1 0 0 ( fs a fc a xl o o ) 来计算，fs a 和fc a 分别是被测样品和空白反应 的动力学曲线下的积分面积。t o s c 值由0 1 0 0 ，此值给出的是某一化合物在特定 浓度下的抗氧化能力( r e g o l if 等，1 9 9 9 ) 。 抗氧化剂的抗氧化还原能力测定。f r a p ( f e r r i cr e d u c i n ga n t i o x i d a n tp o w e r ， 铁离子还原抗氧化剂能力) 法的原理如下，在低p h 下，抗氧化剂( 还原剂) 将 f e 3 + - t p t z ( t r i p y r i d y l t r i a z i n e ，三吡啶三嗪) 还原成f e 2 + - t p t z ，f e 2 + t p t z 呈蓝色， 在5 9 3 n m 处有强吸收峰。结果以f e 2 + 当量或相对于标准抗氧化剂的能力来表示。 此法真正测量的是被测物将f e 3 + 还原成f e 2 + 的能力。这个方法操作简单快捷，重 复性好，易于标准化，最初用于测量血浆的活性，后来也用于测定其他生物体 液，食品植物提取物等的抗氧化活性，但不能用于测量含有s h 的抗氧化剂 ( b e n z i eif 等，1 9 9 6 ) 。 清除羟自由基能力。产生羟自由基的体系有f e 2 + - e d t a - 抗坏血酸h 2 0 2 体系， f e 2 + e d t a - h 2 0 2 体系，黄嘌呤黄嘌呤氧化酶h 2 0 2 体系及紫外光照h 2 0 2 体系。 二甲基亚砜法( d m s o ) ，羟自由基可使d m s o 氧化成甲醛，于4 1 2 n m 处测吸光 度，可了解样品清除羟自由基的情况。脱氧核糖核酸降解法。根据羟自由基使 脱氧核糖降解，降解产物在酸性环境中与t b a 反应形成粉红色物质，利用比色 法测脱氧核糖的降解情况，就可以测定样品清除羟自由基的能力。亚硝基二甲 苯胺( n p a ) 漂白法。羟自由基可使n p a 漂白，测4 4 0 n m 处的吸光度，了解样品 是否具有清除羟自由基的能力。水杨酸法，用紫外光照射h 2 0 2 产生羟自由基， 羟化水杨酸生成加合物二羟苯甲酸，用h p l c 法检测加合物的生成情况，就可以 测定样品的清除羟自由基的能力。茜素紫显色法。羟自由基和茜素紫发生氧化 反应后，茜素紫的颜色发生变化，用紫外分光光度计测定其5 6 0 n t o 处的吸收值， 可间接测定羟自由基的产生量( y l i 等，2 0 0 5 ) 。 检测清除h 2 0 2 能力的方法。过氧自由基包括水溶性r 0 2 和脂溶性r o 。水溶 性r 0 2 是用热降解水溶性2 ，2 偶氮( 2 脒基丙烷) ，盐酸化物( 丸心h ) 产生以 碳为中心的自由基与0 2 快速反应而生成，脂溶性r 0 2 的产生是用脂溶性的2 ，2 偶氮( 2 ，4 - 甲基戊腈) ( a m v n ) 产生脂溶性的r 0 2 。或将c c h ，丙二醇和缓冲 液混合物暴露于离子辐射产生水化电子和羟自由基，最后生成脂溶性过氧自由 基c c b 0 2 。r 0 2 。可使顺式十八碳四烯酸脂质过氧化，测定荧光强度( 于3 2 4 n m 激 发，4 1 2 n m 处释放) 可了解脂质过氧化的情况，推测受试物清除r 0 2 的情况。检 1 2 第。章前言 测c c h 0 2 体系，可用线性加速器测样品与c c h 0 2 的反应动力学了解其清除 c c l 3 0 2 的能力。 超氧阴离子自由基清除能力测定。邻苯三酚在碱性条件下自氧化产生超氧 阴离子，蛋氨酸作用于核黄素时可产生超氧阴离子，黄嘌呤黄嘌呤氧化酶，碱 性d m s o ，甲硫酸非那宗- n a d p h 等。邻苯三酚法可通过测定邻苯三酚的自氧化 速率来测定样品的抑制作用。超氧阴离子可还原细胞色素或硝基四氮唑蓝 ( n b t ) ，可用比色法测定其含量变化，了解受试物清除超氧阴离子的情况( 金春 英等，2 0 0 8 ) 。 1 2 衰老和抗衰老的研究综述 1 2 1 衰老的研究进展 衰老是指生物体细胞，组织，器官在结构，功能上表现出的种种退化性变 化( t u m b l ei m 等，2 0 0 3 ) 。衰老是不知不觉中长期积累的结果。但老化速度个体 差异比较大。人老化后最明显的是须发由黑变灰白，皮肤由洁白光滑变暗淡松 弛，出现老年斑，特别是在面部和颈部。皮下脂肪减少，肌肉开始由丰满变萎 缩。关节磨损，韧带失去弹性，行动迟缓，步履蹒跚。五官功能明显减退：眼 睛晶体的物理变化，耳蜗神经的退化，听力会减退并会发生耳鸣，牙龈萎缩导 致牙齿脱落而使面部变形，舌头味蕾的减少而导致味觉迟钝，骨质疏松等症状。 不仅外表，内脏个系统器官功能也开始老化，在2 0 岁开始，肌肉、动脉、心脏、 胸腺、大肠。从3 0 岁开始，食管、气管、肾脏、输尿管、膀胱开始老化，4 0 岁 开始，软骨、骨洛、静脉、毛发和耳鼓膜开始退化，5 0 岁时，肌键、牙齿、红 细胞和皮肤开始老化，到了6 0 岁，神经、角膜、巩膜开始老化。由于神经细胞 不可再生，一旦死亡，胶质细胞便增生填充，衰老的神经细胞树突变短，神经 网络减少。其上有色素沉淀，同时脑动脉血管出现粥样硬化。血管壁萎缩，所 以老年人经常脑供血不足。神经递质是由突触释放的传导信息物质，由于递质 问出现不平衡，引起神经系统功能衰老，传导速度下降。心脏功能是推动全身 血液循环，衰老时心肌收缩和舒张效力降低，搏出血量少，使主要内脏因缺氧 合营养而受到损伤。呼吸系统老化表现首先是肺组织弹性下降，体积萎缩，肺 泡比例减少。消化系统的改变主要表现在胃的结构和功能改变，胃粘膜萎缩， 胃液分泌减少，消化功能下降，肝细胞再生能力差，肝细胞减少导致肝脏萎缩， 1 3 华南师范大学硕士学位论文 重量变轻，解毒功能下降，胆汁和胰腺分泌减少。肾脏的衰老比较明显，体积 缩小，重量变轻，肾小球数目减少，肾血管硬化，肾功能降低，输尿管，膀胱 和尿道也由于萎缩而容量减少，易发生尿频现象。骨髓是制造血球的场所，随 着年龄的增加，脂肪细胞增多，红骨髓减少，不能及时补充血液中损失的红细 胞，容易发生贫血，血球中的白蛋白减少，血沉加快，血液中总蛋白量减少。 衰老后，与骨代谢有关的激素改变，钙的代谢不平衡，股组织破坏大于形成， 使骨密度降低，内部空隙加大，骨基质减少，骨骼变脆变薄，易于发生骨折。 衰老过程中，细胞也会有很多的变化，胞核减少，核仁大小和数