（植物学专业论文）灰花纹鹅膏菌毒素毒理研究及解毒药物初探.pdf

湖南师范大学二o o 二届硬士研究生毕业论文 摘要 本论文运用反相高效液相色谱技术( r p h p l c ) 、d n a 琼脂糖凝 胶电泳技术、苏木素一伊红( h e ) 染色技术、荧光染色技术、电镜技术、 免疫组化技术( i m u n o h is t o c h e m i s t r ya s s a y ) 和流式细胞术( f l o w c y t o m e tr y ，f c m ) 等对灰花纹鹅膏粗毒液和0 【一鹅膏毒肤( o 【 - a l n a n i t i l l ) 的毒理、解毒药物进行了较深入的研究，取得的结果如下： 1 利用反相商效液相色谱技术，分离纯化了几种主要的鹅费毒 素，测定了鹅膏菌中毒患者的体液中毒素的代谢情况，发现在患者的 血液与尿液中有痕量的鹅膏毒素存在。 2 运用苏木素一伊红( t i e ) 染色技术，发现受毒处理的鼠肝细胞 核染色质浓聚，边集，产生凋亡小体，细胞连接开始丧失，表现出凋 亡特征。肝细胞有再生现象。凋亡、坏死细胞的数目随处理时间的延 长而增多。 3 对受毒小鼠肝细胞悬液进行吖啶橙( a o ) 、a o 与溴化乙嚏( e b ) 共染、l l o e c h s t3 3 2 5 8 荧光染色，发现受毒处理后小鼠肝细胞表现出 核固缩、核碎块等凋亡特征。 4 在透射电镜下观察受毒小鼠的肝细胞超微结构，发现细胞核 染色质浓聚，甚至成半月形分布于核膜下；线粒体、内质网、核膜等 结构完整，但线粒体内嵴不清晰，电子密度增大；细胞内出现凋亡小 体：细胞内有空泡现象。 5 在琼脂糖电泳凝胶上，经鹅膏菌粗毒素处理的小鼠肝细胞表 现出细胞凋亡的典型特征一d n a “梯形带”现象，而且该现象与毒素 作用存在量效和时效的关系，说明鹅膏菌褪毒素可诱导小鼠肝细胞凋 亡。a 一鹅膏毒肽处理同样可诱导小鼠肝细胞出现d n a “梯形带”现 象，有时效关系，并发现毒素处理后的死亡小鼠亦存在该现象，说明 a 一鹅膏毒肽对鼠肝的毒害早期为诱发细胞凋亡，晚期为坏死与凋亡 灰花纹籀纛篮毒素毒理研究及解毒药物鹳衲探刘建强 同存。 6 运用s a b c 免疫组化技术，对受毒小鼠肝细胞内的凋亡蛋白 b c l - 2 、b a x 进行了检测，发现灰花纹鹅膏菌粗毒液和a 一鹅膏毒肽处 理的的小鼠肝细胞内b c l 一2 、b a x 均有阳性表达，早期b c l - 2 的表达 较b a x 强，后期则两者表达量均下降。 7 对a 一鹅膏毒肽处理的小鼠肝细胞悬液进行流式细胞术( f c m ) 分析，发现a 一鹅膏毒肽可诱导细胞周期的g 期停滞，且g i 期的o n a 相对含量随时问延长而呈缓慢下降趋势。 8 以小鼠为实验对象，检验了鸟蕨与紫灵芝提取液对鹅膏毒素 中毒的解毒效果，证明鸟蕨提取液没有解除该毒害的作用，紫灵芝提 取液有一定的解毒效果。 关键词：鹅膏菌粗毒液。【一鹅膏毒肽细胞凋亡肝细胞 潮南师范大学二o o = 届硕士研究生毕业论文 s t u d yo ft o x i ct h e o r yo ft h ep e p t i d e s t o x i n sf r o m a m a n t i a 丘f i g i n e a a n dp i l o ts t u d y ina l e x i p h a r m cf o rt h e s et o x i n s a b s t r a c t t h et o x i c t h e o r y o fa m a n i t a t o x i n s ( i n c l u d i n g a l p h a - a m a n i t i n ) a n d a l e x i p h a r m i cf o rt h e s et o x i n si nl i v e ro f m u r i n ew a ss t u d i e d t h er e s u l ta s f o - i l o w s ： j 。 l s o u g hak n o w ns y s t e ma n dt e c h n o l o g yo fi s o l a t i o n ，p u r i f i c a t i o n a n da n a l y s i so f a m a n t o x i n s ，t h em a i np e p t i d e st o x i n so f a m a n t i a f u l i g i n e a h o n g ow e r ep r o d u c e d 功eb o d y f l u i do fs u f f e r e rd u et oa m a n t i a 励7 i g i n e a w e r es t u d i e da n dt h em i n i l nt o x i n sw e r ed e t e c t e d 2 t h e p h e n o m e n o nw a sf o u n d w i t hh ed y e i n gt h a tt h en u c l e a r c h r o m a t i nc o n d e n s e sa n dm a r g i n a t e sb e l o wn u c l e a re n v e l o p e ，a p o p t o i c b o d i sa r ef o n n e da n dt h ec e l l u ri u n c t i o n sa r ea h n o s tl o s ei nl i v e rc e l l si n m 0 1 1 s ea r e ri n j e c t e dt h ec r u d ea m a n t o x i n so ra l p h a - a m a n i t i n t 1 1 en u m b e r o t n e c r o s i sc e l l si n c r e a s ep a t a l l e lw i t ht h et r e a t e dt i m eb yt h e s et o x i n s 3 t r e a t e dw i t hf l u o r e s c e n c e d y e a sa o ( 0 1 ) ，h o e c h s t3 3 2 5 8a n de b ， t h ec o n d e n s e dn u c l e a rc h r o m a t i nw a so b s e r v e da n dt h e a p o p t o s i s i n d e x ( a 1 ) c a nc a l c u l a t ef r o m v i s u a lf i e l do ff l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p e a i i sc o r r e l a t ew i t ht h et r e a t e dt i m eo f t o x i n s 4 f r o mt h ef i g u r eo fu l t r a s t r u e t u r eo fl i v e rc e l l si nt o x i cm o u s e ，t h e p y k n o t i c c h r o m a t i o nw h i c hl i k e sl u n e ，i n t e g r a t e do r g a n e l l ei nc e l ls u c ha s m i t o c h o n d r i o n ( m t ) ，e n d o p l a s m i cr e t i c u l u m ( e r ) a n dn u c l e a re n v e l o p ea n d v a c u o l a t i o no fc y t o p l a s mw e r eo b s e r v e d ，b u tt h ec r i s t a eo fm tc a n n t o b s e r v e dd i s t i n c t l y 5 t h ed n a - f r a g m e n tb ya g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s ( 1 5 ，5 v c l n ， 6 0 m i n ) d e m o n s t r a t e dt h et y p i c a ll a d d e rp a t t e r no nt h el i v e rc e l l sd i r e c t l y 3 灰花姣籀青簋毒素毒理璎究及押毒药铀的韧掇刘建强 e x p o s e d t ot h ec r u d ea m a n t o x i n sa n da l p h a - a r n a n i t i n ，a n di tw a sc o r r e l a t e w i t ht h et r e a t e dt i m ea n dd o s eo f t h e s et o x i n si nm o u s e 6 u s e di m m u n o h i s t o c h e m i s t r ya s s a y s a b c ，t h ep o s i t i v ee x p r e s s i o n s o f b c l 一2 ，b a xp r o t e i n si nl i v e rt i s s u e si nm u r i n ew h i c ht r e a t e dw i t hc r u d e a m a n t o x i n sa n da l p h a - a m a n i t i nw e r ed e t e c t e d ，b u tt h ep o s i t i v es i g n a lo f b c l 一2w a s l a r g e r t h a no n eo f b a xi nf o r e p a r t 7 t h ec e l lc y c l ea n dt h er e l a t i v ec o n t e n to fd n ao fh e p a t o c y t e si n , n u r i n ew e r ei n v e s t i g a t e dw i t hf l o wc y t o m e t r y ( f c m ) a l p h a - m n a n i t i nc a l l i n d u c et h eg i s t a g n a t i o ni nc y c l ea n dr e d u c e dc o n t e n to fd n a ，b u tt h e o b v i o u s a p o p t o s i sa p e x w a s n tf o u n di nm a p so ff c mw h e nt h ed o s ew a s o 6 b g gf a v o i r d u p o i so f m u r i n e ) 8 t h el i q u i dd i s t i l l e df r o mt u h u a n l i a n ( s p h e n o m e r i sc h i n e n s 缸) c 曲n t f l e et h es u f f e r e rf r o mt h e p o i s o n o ft h e p e p t i d e t o x i n so fa m a n t i a f u l i g i n e a ，b u t t h eo n e sf r o mg a n o d e r m a j a p o n i c u mc a n s e r v ea sa e f f e c t i v ea l e x i p h a r m i cf o rt h i sp o i s o nt ol i v e ri nm u r i n e c o n c l u s i o n ：t h et h ep e p t i d et o x i n so f a m a n t i a f u l i g i n e ac a ni n d u c et h e a p o p t o s i so fh e p a t o c y t e si nm u r i n e a l p h a - a m a n i t i nc f l l l i n d u c ea p o p t o s i s o rt h et h e g i s t a g n a t i o ni n c e l lc y c l ei nd i f f e r e n t e x p e r i m e n t k e y w o r d s ：a p o p t o s i s ，a m a n i t a t o x i n s ，a l p h a a m a n i t i n ，l i v e r c e l l s 湖南师范大学= o o 二届硕士研究生毕业论文 鹅膏菌环肤毒紊毒理研究进展 鹅膏菌是一种高等担子菌，属于真菌界、真菌门、担子菌亚门、 层菌纲、伞菌目、鹅膏菌科、鹅膏菌属( a m a n i t a ) 。据记录，全世界 已发现6 2 3 种，我国已发现6 0 余种。这类真菌为壳斗科等植物的共 生菌根菌，常生于针阔叶混交林。许多该属真菌有毒，人们常因误采 误食而发生中毒事故。根据我们研究室多年的调查，在1 9 9 4 2 0 0 0 年度，湖南省长沙市周边地区共发生毒菌中毒事件3 6 起共2 0 5 例， 死亡8 3 人，死亡率达4 4 2 9 。其中因误呆误食而中毒死亡的5 0 人， 死亡率达4 3 6 4 。引起中毒的鹅膏菌主要有灰花纹鹅膏、白毒鹅膏、 新卵状鹅膏等，其中主要为灰花纹鹅膏且其毒性最烈。 一鹅膏菌毒素分析 人类对鹅膏菡毒素的研究始于1 8 6 9 年德国人s c h i m e d e b e r go 和k o p p cr ”对毒蝇碱的研究。t 8 9 1 年1 8 9 3 年，德国人k o b e r tr 开始研究毒鹅膏菌( a p h a l l o i d e s ) 的毒素。但由于条件所限， 所提取的毒素基本为混合毒素，没有取得实质性进展。1 9 0 3 1 9 0 9 年，美国f t o p k i n s 大学的f o r d ”用醋酸铅和磷钨酸沉淀以抽提毒素 成分。从1 9 3 0 年开始德国的f t e i n r i c hw i e l a n d 指导其学生r a a b ，j r e n z ，l y n e n 以及i j r i c hw i e l a n d 从事鹅膏菌毒素分析，基本确定了 p h a lt o i d i n 的元素组成及分子量。二战以后，t h e o d o r w i e l a n d ( 1 9 4 9 ) “接着工作，取得不少成果。进入2 0 世纪七十年代以 后，德国的m a x - p l a n c k 医学研究所、美国的b e li 实验窒、美国海军 物质结构实验室合作解决一些问题。进入八十年代，意大利的r o m a 大学、l u d w i g s h s f e n 氨基酸实验室也加入了这项研究。毒素研究进 入应用研究领域。 本研究室在张志光教授的指导和国家科委重点课题资助项目基 金的资助下从九十年代初开始即从事鹅膏菌资源调查、中毒病例调 灰花纹鹅青菌毒素毒理研究及解毒药物纳初探刘建强 查、毒素分析、毒素制备研究，陈作红博士”、李东屏博士“、张晓 元博士”等对湖南鹅膏菌种类进行了调查、对鹅膏菌毒素种类和含量 的分析及检测该类毒素的方法学研究进行探讨，取得了很大的进展。 曹福祥博士”利用反相高效液相色谱法( r p h p l c ) 分析较精确地测 定了灰花纹鹅膏菌的毒素种类及含量，优化了毒素分离、制备、提纯、 检测的方法，利用飞行时间质谱仪( m a l d i - t o fm s ) 和电喷雾质谱 仪( e s im s ) 对几种主要毒素的分子量进行确定。其工作包括对小 鼠l d 5 0 的测定。表1 为其主要实验结论。 淤 毒素含量分子量 l d 5 0 毒素种类、( g t g m 1 g 干重) ( d a ) ( m g k g 体重) a 1 p h a a m a n i t i n 6 7 6 89 4 1 40 1 4 1 4 b e t a - a m a n iti n12 1 49 1 9 30 4 9 7 a m a n l n9 2 5 3 p h a l l o i d i n 1 9 2 18 1 1 3 h t l w - i6 8 2 2o 50 二鹅膏菌肽类毒素的毒理研究进展 i 临床研究 早在1 9 3 7 年，l y n e n 和u r i c hw i e l a n d 从毒理研究实验中已初 步确定三类毒素。h m a t o x i n s 属于慢作用毒素，p h a l l o t o x i n s 和 v r i o t o x i n s 属于快作用毒素。 a m a t o x i n s 中毒后，一般有6 1 2 h r 的潜伏期。首发症状为“霍 乱型”腹泻、低血糖，然后有“假愈期”。中毒后主要症状为爆发性 肝衰竭( f u li m i n a n th e p a t i cf a il u r e ，f t l f ) ，在肝脏酶血清浓度中， 可监测到患者体内g o t 、g p t 和l d h ( 乳酸脱氢酶) 的变化。随着这 些酶活性的增高，血凝性被严重扰乱，引起内出血。j i mj g 等( 2 0 0 0 ) 湖南师范大学二o o 二届硪士研究生毕业论文 ”的工作表明，在中毒初期，凝血酶原时间( p t ) 似乎是一个比血 清转氨酶水平更有效的诊断指标。在中毒后3 4 天，可检测到肾小 管型和肾小球型蛋白尿。肌酸酐和尿素的高值表明肾细胞受到较严重 的损害。大多数病例中，中毒6 8 天后，患者因肝、肾、脑等脏器 的功能衰竭、昏迷而死亡。 a r e a t o x i n s 通过消化道吸收进入血液，在肝脏处进入特殊的“肠 肝循环”而极不易被除去。k r o n c k e 等( 1 9 8 6 ) “”用鼠肝细胞膜所做 实验发现，肝细胞膜具有主动运输a m a t o x i n s 的能力。a m a t o x i n s 同 血清白蛋白及其他蛋白的结合会使其毒性得到很大的增强，因为肝臣 噬细胞等非肝实质细胞能依靠吞噬作用快速吸收这些复合物，并在细 胞内释放a m a t o x i n s 而侵袭细胞，并被相邻肝细胞吸收。( d e r e n z i n i e ta 1 1 9 7 3 ) p h a l l o t o x i n s 和v r i o t o x i n s 属于快作用毒素，腹腔注射小白鼠， 一般在2 4 h r 后死亡。其动物毒理学研究始于1 9 3 8 年v o g t “”。这 两类毒素均主要损害肝，对肾有部分损害。其临床主要症状为肝肿大 明显。a g o s t i n i ( 1 9 8 3 ) 认为中毒动物最可能死于血液循环功能混 乱和缺氧性休克。 2 鹅膏毒素细胞毒理研究 2 1 a m a t o x i n s 的细胞毒理 f l u m e 和l a s c h i ( 1 9 6 5 ) “”首次观察到受毒小鼠肝、肾细胞核的损 害，细胞核仁片裂。f l u m e ( 1 9 6 6 ) ”报道了染色质的浓缩，并得到 了此后多人的实验证实。受毒大鼠不仅肝肾细胞而且肾上腺丛生细跑 也受损害，表现出核成分片裂、染色质浓聚和出现周生染色质颗粒等。 用a l p h a - a m a n i t i n 处理3 0 分钟后的人成纤维细胞，核染色质片段由 完全分离的颗粒和纤维状核糖体蛋白组成，最后由于r n a 减少而仅仅 留下蛋白质残片( m a g n a l h a e s ，1 9 8 5 ) “”。 通过f i u m e ( 19 7 2 ) “”，d e r e n z i n i i 等( 1 9 7 5 ) “，( t 9 7 8 ) “”，( 1 9 7 8 ) 灰花纹鹅青菌毒素毒理研究及解毒药物的韧探刘建强 的工作表明，8 ip h a - a m a n i t i n 引起的核染色质片段化是由于毒素对 选择性的h n r n a 合成的初始抑制所引起的。 f iu n i c 和slr i p e ( 1 9 6 6 ) “”发现a l p h a - a m a n i t i n 中毒小鼠的肝细 胞核r n a 含量持续下降。1 9 6 7 年，他们又发现经a l p h a - a m a n it i n 处 理的鼠肝细胞r n a 合成被严重削弱，由此提出一个假设： a l p h a - a m a n i t i l l 可能抑制了依赖于d n a 的r n a 聚合酶活性。 s e t i f a r t ”和s e k e r is 发现1 0 n g m l 的a l p h a - a m a n i t i n 在体内抑 制了r n a 聚合酶活性。l i n d e l1 ( 1 9 7 0 ) o ”进一步发现仅仅r n a 聚合酶 i i 的活性被高效抑制，后来s e i f ar t ( 1 9 7 2 ) 。“又发现r n a 聚合酶l i i 也 受到抑制，但所需抑制浓度为聚合酶i i 的10 1 _ i o 倍。 b a r t o l o m e im s ( 19 9 5 ) ”通过抗性突变的方法，发现r n a 聚合酶 l i 大亚基c 端的亮氨酸l e u 7 4 5 、精氨酸a r 9 7 4 9 、异亮氨酸i l e 7 7 9 可能构成一个“p o c k e t ”，为a l p h a - a m a n i t i n 的结合部位。如果这三 个氨基酸分别被苯丙氨酸p h e 、脯氨酸p r o 、p h e 所取代，则可抵抗 a l p h a a i l i a i l it i n 的作用。g i a c c i aa 、k o u m e n i s c ( 1 9 9 7 ) “”构建一个 表达载体，含有r p i i2 15 的编码基因，但其上6 8 1 9 有一点突变，使 其编码产物由天冬酰胺转变为天冬氨酸，则可使细胞对 a l p h a - j m a n it i n 的抗性增大5 0 0 倍。c o c h e t - m e i l h a cm 和c h a m b o n p ( 1 9 7 4 ) ”7 发现a l p h a - a m a n i t i n 与r n a 聚合酶i i 以1 ：i 的比例紧密 结合，但不影响其吸附核苷的酶活性。d a y i dr ( 19 9 5 ) ”通过对果蝇 r h a 聚合酶i i 对d c t a il 酣模板的作用观察，证明a l p h a a m a n i t i n 只能减缓而不是阻断转录链的延长( 即核苷的添加、移除) 和磷酸化， 并且显示出毒素对延长效率的影响大于对磷酸化速率的降低作用。 2 2p h a | 1 0 t o x i ns 和vr i o t o x i i t s 的细胞毒理 1 9 6 5 年，m a ts c h i r i s k yf ”等观察到p h a l l o t o x i n s 中毒后引 起细胞液泡化。1 9 7 9 年，p o p o v 等”观察到高剂量的p h a ll o i d i n 可 致鼠淋巴绷胞膜的渗漏。此后又有不少研究人员报道了其他细胞的膜 ：叻能亦受到泫毒索的损害。d e c k e n ( 1 9 6 0 ) ”、g r a v e l a ( 1 9 7 7 ) ”分别 湖南师范大学二o o 二届磺士研究生毕业论文 发现、证实了p h a l l o t o x i n s 中毒引起蛋白质合成受阻。此后， w i e l a n d ( 19 7 5 ) ”实验证明p h a ll o t o x i n s 和v r i o t o x i n s 专一性与细 胞内丝状肌动蛋白( f a c t i n ) 结合，使f a c t i n 稳定化，破坏体 内f a cl i j l 与球状肌动蛋白( g a c t i n ) 的动态平衡，从而改变细 胞内骨架系统，引起膜相系统改变，从而改变膜渗透性等。 3 细胞凋亡与o 【一a m a n i t i n 3 1 细胞凋亡”4 细胞凋亡( a p o p t o s is ，a p o p t o s e s ) 一词予1 9 7 2 年由澳大利亚病 理学家k e rr 等率先提出( h p o p t o s i s ，ab a s i cb i o l o g i c t lp h e n o m e n o n w l t hw i d e - 1 a n g i n gi m p l i c a t i o ni nt is s h r ok i n e t i c s ，细胞凋亡， 一种在组织动力学方面有广泛应用前景的基础生物学现象) 1 9 8 0 年，其合作者剑桥大学的w y i i n e 等( g 1 u c o c o r t i c o i dt h y m o c y t e a p o p t o s is sa s r o c i a t e dw it h e n d o g e n o u s e n d o n u c l e a s e a cl i r a li i ) 1 1 、糖皮质激素诱导的胸腺细胞凋亡与内源性核酸内切酶激 活确关) 揭示了细胞凋亡的独特的生物学特征一l8 0 一2 0 0 b p 的d n a 片段( d n a l a d d e r p a t t e r n ) 及其本质是诱导或激活了内源性核酸 内切酶( e n d o n u c l e a s e ，e n d o g e n o u sm i c l e a s e ) 。此后，凋亡即成为 生物学和生物医学的研究热点，公开发表的论文呈指数级增长。1 9 9 4 年，美国著名的科学杂志主编c u l o t t a 和k o s h l a n d 将其评为当 耷世界生命科学中仅次于d n a 修复酶的第二个研究热点i 他们谈到凋 亡研究的几个里程碑：( 1 ) 8 0 年代以来，在秀丽隐秆线虫 ( f 备们1 h a b d i t i se t e g a n s ) 的发育研究中，发现了1 4 个与细胞凋亡 有关的基因，其中c e d 9 抑制细胞凋亡，c e d 3 、4 诱导细胞凋亡。1 9 9 4 年，证明7 ：f = j 哺乳动物细胞中有c e d 9 的同源基因b c 卜2 。( 2 ) 1 9 9 3 年 底，发现啪乳动物i l 一1p 转化酶( i c e ) 与c e d 3 同源，此后又证明 il ( e 响启动细胞凋亡的功能。( 3 ) 1 9 9 4 年，在果蝇的研究中，克 隆出细胞凋芒基因r e a p e r 。 获花纹鹅青苗毒素毒理研究及解毒药物的初探刘建强 近年来，其他有关细胞凋亡研究的重要事件有：( 1 ) j c e c e d ( c a s p a s e ，半胱天冬酶) 蛋白酶家族的发现，1 9 9 6 年1 0 月提 出“i c e c e d ( c a s p a s e ) 蛋白酶家族”命名法则。( 2 ) 死亡受体f a s t n f 及其相应配体f a s l t n f 的发现。( 3 ) 1 9 9 5 1 9 9 6 年掀起的对细胞凋 亡发生过程中信号传导途径的研究，并已对凋亡发生的信号传导途径 及其相豆影响基本阐明。( 3 ) t h o m p s o nc b 19 9 5 年较全面阐述了细 胞凋亡与疾病的关系，从而对细胞凋亡的研究价值予以证明。 现以发现3 0 多种分子参与了细胞凋亡的调控，另外至少有2 0 各分子参与细胞凋亡的信号传导。d n a 复制、转录和修复，也参与影 响、调节细胞凋亡的发生发展。 细胞凋亡是细胞在一定的病理或生理条件下，遵循自身的程序， 自己结束自己的生命的过程，最后细胞脱落离体或裂解为若干凋亡小 体。细胞凋亡与细胞坏死的区别主要在于凋亡表现为单个细胞的非炎 性反应行为。形态上表现为皱缩、细胞连接丧失、细胞膜完整或出泡 形成凋亡小体、细胞器完整、细胞核皱缩、染色质浓聚、溶酶体完整、 线粒体完整肿胀等。其生化变化包括d n a 片段化、c a s p a s e 、 c a lp a i n s ( 钙依赖的中性蛋白酶) 的激活、凋亡蛋白b c l - 2 家族等的表 达。 细胞凋亡的常用研究方法：1 细胞形态学检测：结合不同染色 的光镜观察，如对组织切片的苏木素一伊红染色( h e ) 、甲基绿一派 诺宁染色、吉姆萨染色( g i e m a s ) 、台盼蓝染色等。电镜观察， 包括透射电镜( t e m ) 和扫描电镜( s e m ) 观察。荧光显微镜观察， 以荧光染料吖啶橙( a o ) 、t t o e c h e s t3 3 2 5 8 、溴化乙锭( e b ) 等对凋亡 细胞进行观察。2 i ) n a 降解分析：一般采用琼脂糖平板电泳、脉冲场 凝胶电泳、单细胞凝胶电泳( 彗星试验) 等。3 流武细胞分析( f c m ) 等。4 凋亡细胞膜改变分析。5 相关凋亡蛋白酶的分析。6 电化学分 析、7 核磁共振分析等”。” 3 2 细胞凋亡与a l p h a a i l i a n it i n 湖南师范大学二oo - - 届硕士研究生毕业论文 细胞凋亡与鹅膏菌毒素的国内外相关报道很少，均为 a l p h a a m a n i t i n 对细胞凋亡的影响，而且这种作用很少作为论文研 究的主题，只是讨论a l p h a a m a n i t i n 作为一种转录抑制剂时对细胞 活动的影响。 g i a c c i aa 和k o u m e n isc ( 1 9 9 7 ) “”发现在经a l p h a - a m a n it i n 2 、 10 、2 0 g m l 处理1 6 h r 后，h e l a 细胞、p 53 + + 、p 5 3 一_ m e f 细胞 均表现出剂量依赖型的细胞凋亡，而且这种细胞凋亡与p 5 3 的表达有 关。如果r n a 聚合酶i i 大亚基( r p i i2 1 5 ) 的h s n 6 8 1 9 替换为a s p ， 则在该实验条件下不能诱导细胞凋亡而使细胞存活。d a m m a a r dj 等 ( 1 9 9 6 ) “”发现在a l p h a - a m a n i t i n 处理时中国仓鼠卵巢细胞会出现 核染色质浓聚、多型核等现象，并可以观察到时间依赖性的d n a 片段 化。他们认为a l p h a a m a t l i t i n 诱导细胞凋亡仅仅是由于毒素抑制了 r n a 聚合酶f l 活性而没有其他的特殊途径。l e i s tm 等( 1 9 9 7 ) “”发 现t n f ( 肿瘤细胞坏死因子) 在体内与a l p h a - a m a n it i n 以一种糟类 似的方武诱导小鼠肝细胞同样的毒害，单独使用转录抑制剂 a l p h a - a m a n ic i l l 、k c t d ( 放线菌素”处理，肝细胞中t n f 的m r n a 水平提高而且肝细胞凋亡发生，提示a i p h a - a m a n i t i n 通过一种间接 途径激活内源性t n f 产生以诱导肝细胞衰竭。h e n t z eh 等( 2 0 0 0 ) ” 在不同的鼠科动物模型中通过监测转氨酶的释放和组织病理学观察 发现，在p h o r o n e 处理后由于内源性酶的结合所致y 一谷胱甘肤 ( g s l ) 的损耗能够抵抗死亡受体贪导的损伤。在凋亡模型中， e n g a g e m e n tc d 9 5 或给半乳糖胺敏感的小鼠注射t n f 、脂多糖，c a s p a s c 3 样的蛋白在g s t 损耗的情况下没有被激活，因a l p h a - a m a n i t i n 等 t n f r 1 ( 肿瘤死亡因子受体1 ) 介导的损害也被完全中断。实验提 示足够的肝细胞g s i i 水平是执行死亡受体介导的肝死亡的先决条件。 l j u n g m a nm 等( 1 9 9 9 ) “”发现在人成纤维细胞中，某些毒素 ( a l p h a - a m a n i t i n 、a c i d 等) 对p 5 3 的诱导并不引发d n a 片段化， 可能与m r n a 的合成抑制相关，但会导致细胞周期g 。期停滞。s i b l e 灰花纹鹅青苗毒素毒理研究及解毒药物的初探刘建强 j c “”的工作显示，用a l p h a - a m a n i ti n 抑制非洲爪蟾胚胎的合子转录 也可诱导细胞凋亡，这一过程可被注射编码b c l - 2 的m r n a ( 即反义 核酸显微注射) 所阻止，暗示这一过程可被一个细胞抑制因子的表达 所阻断。这种凋亡应答仅只当胚胎不能支持合子转录的起始时所引 发， 3 3 肝损伤与细胞凋亡 很多研究表明细胞凋亡与肝损伤( 病毒性肝炎、肝癌、乙醇肝及 化学药物所引发的肝损害) 有密切的关系。致敏因素诱导实验动物肝 细胞凋亡主要与细胞内f a s f a s l 、穿孔素一颗粒酶杀伤机制、单核 巨噬细胞t n f o 【( 肿瘤坏死因子一a l p h a ) 、b c 卜2 b a x ，b a k 、t g f p ( 肿瘤生长因子一b e t a ) 等相关。l e is t 等证实了无论是用内毒 素( 脂多糖，l p s ) 还是t n f o 【处理半乳糖胺或放线菌素d ( a c i d ) 致敏鼠生成的肝损伤早期均表现为凋亡特征，晚期则凋亡和广泛性细 胞坏死同时发生。当在电镜下观察到凋亡小体时，血清中转氨酶水平 还未见升高。说明在肝损伤时，早期发生细胞凋亡，晚期则为细胞坏 死。梁秀彬等( 1 9 9 9 ) ”的工作也证实了这一结论，且发现凋亡抑制 剂金红三羧酸( h u r i n tr i c a r b o x y l i ca c i d ) 可以抑制l p s 诱导的小 鼠肝细胞凋亡。张斌等( 1 9 9 9 ) “”的实验证实乙肝患者的肝组织中 b c l - 2 的表达较对照组有不同程度的增强，而且在增生区的表达显著 高于各坏死区的表达。而在各类坏死区及其周围，b a x 、b a k 表达的 阳性程度明显高于b c l - 2 的表达。说明在乙肝患者肝内，b c l - 2 与b a x 、 b a k 的表达比例与肝细胞的受损状态直接相关。 三本论文研究的目的和意义 1 理论意义 对于鹅膏菌肽类毒素的动物毒理研究，多年来取得了不少成果， 但是也有很多问题难以得到确切的解释，对众多的结果没有找到其内 部的合理联系。随着细胞分子生物学、分子遗传学的快速发展，对于 湖南师范大学= o o = 届硕士研究生毕业论文 这类毒素在生物学和一医学领域的应用、推广带来了很多不确定的因 素。本论文从一个新的方向一细胞凋亡的角度，对鹅膏菌毒素在动物 体内作用机理进行研究，希望为鹅膏菌毒素毒理研究提供新思路 2 现实临床意义 鹅膏苗在我省分布地域较宽，资源丰富，年发生量大。每年均有 不少无辜百姓因头采误食有毒鹅膏而中毒死亡，中毒死亡率高居不 下，给社会、家庭带来了沉重的负担，也给临床医学带来了严峻的挑 战。目前世界上对于该类毒菌毒素的防治方法还相 - 3 少。临床上报道 应用效果较好的主要有原位全肝移植、血浆置换术 ( p l a s m a e x c h a n g e ，p e x ) 、血浆去除术、肝保护辅以阻止鹅膏菌毒素 进入血液的支持疗法、注射青霉素和水飞蓟素等6 ”o ”6 7 “”但移 植所需肝的供源异常紧张，有效治疗应在中毒后3 6 4 8 h r 内进行， 血浆去除的效果估价等原因的存在，故整体疗效不佳。本研究希望从 毒素诱导细胞凋亡的角度为寻找细胞凋亡抑制剂阻断凋亡进程以获 得较好的解毒效果，降低患者病死率的努力服务。 另外一方面，希望了解清楚鹅膏菌毒素在体内的作用途径后，为 鹅膏毒素在生物学、医学领域中应用提供新的应用机会。 灰花纹鹅膏蘸毒素锥理研究及解毒药物的初探刘建强 第一章材料与方法 1 材料 灰花纹鹅膏菌( a m a n i t af m i g i n e ah o n g o ) 子实体系2 0 0 1 年 采自湖南省望城县、长沙县星沙镇两地。剔除泥土及他物后，真空冷 冻干燥。 实验小鼠购自湖南师范大学生命科学学院生物化学研究室动物 房。 紫灵芝购自中药店，乌蕨采自衡山和岳麓山。 2 仪器与药品 2 1 仪器 w a t e r sd e lt a 6 0 0 e 液相色谱系统，w a t e r s2 4 8 7 双波长紫外检 测器( 美国w a t e r s 公司) ， h sv 4 0 + f o rw i n 9 8 色谱工作站( 杭州 英谱公司) 。y w gc i8 ，1 0 “n l 2 5 0 1 0f i l m 反相半制备柱。y w gc 1 8 ， 1 0 “m ，3 0 0 3 9 m m 反相分析柱( 大连依利特公司) 。m a l l 0 电子天 平( 上海产) ，m p 2 2 0 酸度计( 德国m e t t l e rt o l e r d o 公司) 。p d z 一1 真空冷冻干燥仪( 北京博医康医疗技术有限公司) ，奥林帕斯 ( o l y m p u s ) b i i 一2 荧光显微镜及自动曝光组件，日立( h i t a c h i ) h 一6 0 0 e 透射电子显微镜，g l 一13 2 紫外照射仪( 江苏海门麒麟医用仪 器厂) 、d y y 1 1 1 2 水平电泳仪及d y y i i l 3 1 a 电泳槽( 北京六一仪器 厂) 、t g l l 6 台式高速冷冻离心机( 湖南仪器仪表总厂) ，细胞计数分 析仪c c h - i i ( c e l lc o u n ta r i a l y z e r ，德国p a r t e c 公司) 。 2 2 药品、试剂 醋酸铵购自s i g m a 公司，乙腈为国产色谱纯( 湖南化工研究院 精细所) ，航空汽油，氯仿，水( 自制三蒸水或市售娃哈哈纯净水) ， 甲醇( 色谱纯，湖南化工研究院精细所) 。t r i s 、e d t a 购自华美生物 工程公司的s i g m a 公司分装品；n a a c 、n a c l 、氯仿、磷酸氢二钠、磷 酸二氢钠、磷酸氢二钾、氢氧化钾、硼酸为国产分析纯。苯酚( t r i s 湖南师范大学- z o o 二届硕士研究生毕业论文 饱和酚，p i l 7 9 ) 、蛋白酶k ( m e r c k ，g e r m a n y ) 、r n a 酶a 、d n al a d d e r 标样、琼脂糖( i i r b 3 ：1 ，) 、琼脂糖( a m r e s c o 公司) 均购自上海生 工生物工程公司进口分装品。抗b c l - 2 一抗、抗b a x 一抗、s a b c 免 疫组化试剂盒、d a b 显色试剂盒、苏木素染色剂、0 1 mp b s ( p h 7 4 ) 、 a p e s 、枸橼酸盐缓) 中液( p i t 7 4 ) 、阳性白片均购自武汉博士德公司。 d a p i 染色a 、b 液( 德国p a r t e c 公司) 。 3 方法 3 1 鹅膏毒素提取、分离及纯化方法 3 1 1 材料处理与粗毒抽提 已完全冷冻干燥的灰花纹鹅膏子实体，称量2 9 ，磨成细粉，按样 品：5 0 甲醇= 1 ：1 0 ( v v ) 力口入5 0 甲醇，置摇床振荡1 2 h r ( 2 0 0 r p m ) ， 其中颠倒振荡多次。8 0 0 0 r p m 离心取上清液。在沉淀中再加入5 0 甲 醇溶液，重复抽提二次。合并上清液，冷冻干燥后，加入同体积双蒸 水重溶后，倒入分液漏斗中，再在其中加入同体积航空汽油或氯仿颠 倒振荡多次，待静置分层后取毒素部分所在液体。重复抽提三次，以 完全除去脂类物质。所得液体在热水中去除残余有机溶剂或直接真空 冷冻干燥，后重新定溶至适当体积。粗毒液用0 4 5 、0 2 2 “- n 滤膜双 层过滤。 3 1 2 流动相及梯度洗脱方法 3 1 2 1 制备方法 流动相：h 液乙腈：0 0 2 m 醋酸胺( 10 ：9 0 ) ； b 液乙腈：0 0 2 m 醋酸胺( 2 4 ：7 6 ) p l 值用冰醋酸调至5 0 。 梯度洗脱模式：0 15 r a i n ，b 液。一5 ；1 5 3 5 m i n ，b 5 一8 0 ，并 保持5 m i n ；4 0 4 5 m i n ，b 液8 0 一1 0 0 ，并保持5 m i n ；5 0 5 5 m i l l ，b 液10 0 一0 ，保持1 0 m i n 。流速：2 m l m i l l 。 流动相脱气：超声处理3 0 分钟后，2 5 m l m i n 氦气在线脱气。 灰花纹鹅膏萤毒素毒理研究及解毒药