（分析化学专业论文）不同取代基磺酰胺类大环化合物与dna作用研究.pdfVIP

中目农业大学额l 学豫硷交中文摘攀 中文摘要 本文简介了化合物与d n a 作用的研究进展以及d n a 嵌入剂，以及四种磺酰胺类大环化合物 如下图：并且优化了这四种物质与d n a 作用时的环境条件。得到的结果是：本实验水浴加热时 间选择3 0r a i n ，测定环境的p h 值确定为p h = 7 ，实验水浴温度为3 7 c 。 l 1 2 e - 1 0 n 一对氯苯基氧代环十二烷基磺酰胺 水州h b h l 1 2 u 1 7 n - 1 2 , 4 - 二甲苯基氧代环十二烷基磺酰胺 h 嵌n h d 0 2 l 1 2 u i s n - o 一硝基苯基 m 氯代环十二烷基磺酰胺 文章通过紫外光谱和荧光光谱来研究了四种磺酰胺类大环化合物与d n a 相互作用的作用方 式，结果表明：在2 0 ，3 7 c 下小牛胸腺d n a ( c td n a ) 对大环化合物药物l 1 2 u - 1 0 荧光改变的 表观结合常数l o t 分别约为1 0 ”l m o i 一、1 0 ”l m o l l ，在c td n a 分子上的结合位点数1 1 分别为 1 1 7 3 6 和1 2 3 0 4 ；c td n a 对药物l i 2 u - 1 5 荧光改变的表观结合常数k a 分别为1 0 9l m o l 一、 1 0 l - t o o l 一，结合位点数n 分别为! 0 2 7 6 和o 8 3 7 4 ；c td n a 对药物l i 2 u - 1 7 的表观结合常数k a 分别为1 0 ”l - t o o l 、1 0 9l m o l l ，结合位点数n 分别为1 1 7 0 9 和0 9 9 4 4 ；dd n a 对药物l 1 2 u - 1 8 的表观结合常数k a 分别为1 0 “l - t o o l 1 0 “l m o l ，药物在c t d n a 分子上的结合位点数n 分别 为i ”0 3 和1 5 9 9 7 ，表明四种药物分子与c t d n a 均存在一定的嵌插作用，而且药物l 1 2 u 1 8 与 dd n a 相互作用力较强 实验结果表明：取代基的不同对大环药物与d n a 分子相互作用存在影响，影响因素可能与 取代基的个数、大小、位置、组成原予的性质、是否具有孤对电子等相关 关键词：磺酰胺类大环化合物，d n a 嵌入荆，c t d n a 。相互作用 i i 中同农业人学硕卜学位论文 a b s t r a c t i a b s t r a c t t h i sd i s s e r t a t i o nw a sd i v i d e di n t ot h r e ep a r t s ： f i r s to fa l l ，t h er e s e a r c ho ft h ei n t e r a c t i o nb c c w c c nd n aa n dd n ai n t e r c a l a t o rc o m p o u n d sw a l l s u m m a r i z e d f o u rk i n d so fn - a - o x o c y c l o d o d e c y ls u l p h o n a m i d e 恤t h ep i c t u r eb e l o w ) h a v eb e e n i n t r o d u c e da n dt h ee i r e u n m t a n c eh a sb e e no p t i m i z e d t h er e s u l tw a st h a tt h es y s t e mk e e p i n gt h e s i t u a t i o np r t = 7 ，t e m p e r a t u r eh o l d i n gi n3 7 2a n d3 0m i n u t e so f t h eh e a t i n gt i n 吐。嘎h 遗。 n - ( 4 - c h l o r o p h e n y l ) - e - o x o c y c l o d o d e c y is u l p b o n a m l d en - 2 , 5 - d i c h l o r o p h e n y l l m _ o x o c y d o d o d e c y ls u l p h o a a m i d c 水州h b h ，嵌n h g 啦 l 1 2 u 1 7 l 1 2 u - i g n - ( 2 , 4 - x y l y i ) - a o x o c y c l o d o d e c y ls u l p h o a a m i d cn - - ( 3 - n i l r o p h c n y l ) - a - o x o c j c l o d o d e c y l 枷o m u n i d c & n d i yt h ej n 胁c 6 锄b c t w c c nd n a a n dc o m p o u n d sw a ss t u d i e du s i n gf l u o r e s c e n c e 印扭c o p y i f s ) a n du v t h ee x p e r i m m t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ek ac o n s l a n l ga n d t h ec o m b i n e ds p o t si n d i f f e r e n tt e m p e t - a t l l r e2 0 1 2a n d3 7 co f t h el 1 2 u - l ow e r es e p a r a t e l y1 0 o l - t o o l 1 1 0 l ll - t o o l 1a n dn = 1 1 7 3 6 ，1 2 3 0 4 t h el 1 2 u - 1 5ms e p a r a t e l y1 0 9 l - t o o l 1 ，1 0 s l - m o i l la n dn = 1 0 2 7 6 ，0 8 3 7 4 t h e l 1 2 u - 1 7w e g p a t a t e l y1 0 ”l m o l 1 ，1 0 9 l m o l - l la n dn = 1 1 7 0 9 。0 9 9 4 4 t h el 1 2 u - 1 8 懈 s e p a r a t e l y1 0 “l i n o r l 。1 0 1 * l m o l 1 la n dn = 1 2 7 0 3 ，1 5 9 9 7 t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ei n t e a - a e t i o n b e n v e d n aa n dl 1 2 u - 1 8w s t r o n g e s ta b o v ea 1 1 k e yw o r d s ：n 吨- o x o c y c l o d o d c c y ls u | p h o n a m i d s , d n ai n t c r c a l a t o r , c td n a , i n m m c t i o n i i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生躲礅是 帆0 7 年舌胁日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名： 魂是 时间：j 7 年g , e l2 0 日 帆刁年占月加日 中周农业大学硕f 学位论文第一章前言 第一章前言 近年来。农药残留、重金属污染、化学废弃物的排放等因素对环境造成的破坏日益严重，对 人们的影响和伤害也越来越明显，人们正越来越关注有机物和无机元素与生命科学相互之间的联 系，因此，分子生物学和分子药理学近年来得到迅速发展。分子生物学和分子药理学的发展使人 们能够从基因水平理解某些生命现象，并通过分子设计来寻找灵敏的核酸探针和有效的治疗药 物。 而有机小分子与生物大分子的相互作用对生物大分子结构和功能的影响的研究正是近年来 的热门课题i lj 一方面，d n a 靶向化合物成为很重要的核酸探针选择对象或者作为d n a 嵌入剂 另一方面，临床上使用的许多抗癌药物都以d n a 为作用靶点。通过与癌细胞d n a 发生相互作 用破坏其结构，进而影响基因调控与表达功能，表现出抗癌活性；一些致癌物也能与d n a 形成 加合物这种d n a 加合物也是可能癌变的预警标志物。因此，小分子与d n a 的相互作用的研 究不仅有利于探索和开发新的核酸探针而且有助于从分子水平上了解抗癌药物的作用机理阐 明有毒物的致癌、致畸的分子生物学机理为设计临床上更为有效的抗癌药物提供理论指导i z j 1 1 化合物与d n a 相互作用的作用方式 小分子化合物与核酸的结合区位于核酸的碱基，磷酸骨架以及戊塘环部分核酸由平行堆积 的碱基、聚合的阴离子磷酸骨架以及两条核苷酸链形成的大沟、小沟组成了小分子的识别位点 作用方式主要有3 种：非共价键结合，共价键结合和剪切作用 裘而结台 o u t s i d eb i n d i n g 淘撼结合 l n 麓毽箜怠gr o o v eb i n d i 蝎爵溢i 菇 图l l 小分子与d n a 的作用模式 非共价键结合又可分为表面结合( o u 纽i d eb i n d m g ) 、沟槽结合( g r o o v eb m c l i n g ) 和嵌插结合 ( h m - c a h t i o nb i n d i n g ) 3 种模式b q 。非共价结合则以这三种不同的方式进行，其中外部静电作用 此作用沿着d n a 双螺旋结构的外壁，没有选择性，且受到溶液中离子强度的影响严重、嵌插结 合即嵌入作用、沟区( 大沟区，小沟区) 结合。一般认为表面结合的小分子作用于d n a 双螺旋结构 的外壁，无选择性。沟槽结台是与核酸的大沟或小沟的碱基对边缘直接作用，大分子蛋白质结合 于d n a 的大沟槽中，而大多数小分子则是在小沟槽区作用。嵌插结合是小分子中的平面成分嵌 中国农业夫学硕卜学位论文第一章前言 入核酸的碱基之间。因为小分子的结构不同，嵌插制义可细分为单嵌插剂和双嵌插剂pj 。 非共价键一般称作次级键，其中最主要的是氢键、离子键、范德华力和疏水键。这些均属于 弱作用键，而在分子水平的生命现象中，上述弱作用键是一种决定性的因素，形成了各种大分子 生物功能所要求的空间结构，因而决定了基因转录、调控的主要分子机制。药物分子镶嵌或嵌插 于d n a 螺旋沟或碱基中，或以静电引力作用于磷酸骨架阻碍d n a 信息的正常表达，达到对 细菌或癌变细胞生长、繁殖的破坏晦1 。同时小分子作用到d n a 上还可能引起d n a 断裂 与非共价键结合作用相比，小分子与d n a 的麸价键结合的序列特异性识别能力要强的多 共价键结合的小分子多表现为链内交联或链间交联，与特定碱基作用形成加和物，使核酸双链解 旋且产生弯曲 1 2 化合物与d n a 相互作用的研究方法 研究化合物与d n a 相互作用的方法有很多，现在人们使用比较多的实验手段是：紫外可见 吸收光谱、线二色光谱、圆二色光谱、荧光光谱、拉曼光谱、傅里叶转换红外光谱、核磁共振、 质谱、电化学、电泳及粘度等，运用这些方法从不同角度对小分子与核酸之问的作用进行了广泛 的研究。 1 2 i 紫外可见吸收光谱法 紫外可见吸收光谱是研究小分子与核酸相互作用的一种最方便，最常用的技术。小分子与核 酸的相互作用会引起吸收带的红移或蓝移现象，以及增色或减色效应吸光度减小、吸收带红移 以及等吸收点的形成是小分子与d n a 发生嵌插作用的光谱标志 s j 热和碱的作用可破坏d n a 双链螺旋结构，使双链变成单链，吸光度a 增大小分子与d n a 结合后会给这种变性带来影响，进而可考察小分子与d n a 的作用方式嵌插作用对d n a 的双螺 旋结构起稳定作用，可导致熔链温度增大5 墙，而非嵌插作用的小分子不会使温度值增大如此 明显 9 1 g a n e s h 等i 删报道了阳离子表面活性剂与寡聚核苷酸作用后a 随温度的变化曲线为双 s i g m a 曲线，由此推断阳离子表面活性剂首先通过静电作用与寡聚核苷酸结合，然后在疏水力的 驱动下以协作方式结合于相同的寡聚核苷酸上，从而使溶液中同时存在两种寡聚核苷酸，即自由 和与表面活性荆结合的寡聚核苷酸，最终导致出现两个熔链温度跟踪小分子与d n a 作用前 后a 狮随p h 值的变化情况，也可判断小分子与d n a 之间的作用方式 1 2 2 荧光光谱法 荧光光谱法是研究小分子与核酸相互作用的主要手段。溴化乙锭( e b ) 是应用最早的荧光探 针，被广泛应用于抗癌药物的筛选和小分子与d n a 作用的研究1 1 1 1 3 。d n a 三螺旋结构的发现， 扩展了溴化乙锭的应用范围，使其在检测三螺旋d n a 和研究其与三螺旋d n a 作用等方面发挥了 作用”。 和l ( 4 f e ( c n ) 6 为典型荧光猝灭剂，通过考察其对小分子荧光的猝灭作用可以判断小分予与 d n a 之问的作用方式。与纯水介质相比，当小分子与d n a 属于嵌插作用时，i 或f e ( c n ) 4 晰 灭作用减弱【l q ；而当小分子与d n a 属于沟槽作用时，猝灭作用增强 9 1 2 中囿农业夫学硕 学位论史第一章前言 小分子与d n a 作用后荧光偏振的变化情况是判断小分子是否与d n a 发生嵌插作用的又一 标准通常当小分子嵌插到碱基中时，其转动受阻，荧光偏振会随之变大，而非嵌插作用不会引 起荧光偏振的增大。 1 2 3 线二色光谱和圆二色光谱 线二色光谱( u ) ) 采用与固定光轴方向平行或垂直的平面偏振光，能快速区分经典的嵌入结 合、沟槽结合和表面结合模式，并能获得小分子结合在d n a 上的准确方向信息及动力学数据【l q 。 圆二色光谱( c d ) 以高频变换的左旋或右旋偏振光作为入射光，为有机化合物的绝对构型、构象和 反应机理的研究提供了很多信息，是研究有机化台物和生物大分子的构型、构象和三维空间结构 强有力的工具。一方面根据d n a 在2 6 0 r i m 处的吸收提供有关结构信息，另一方面对些本身没 有c d 信号。但与d n a 结合后能产生诱导c d 信号的分子。可获得一定的有关其结构的闻接信 息。f i e l 等”研究t n l - 啉配体与d n a 之间的相互作用，圆二色光谱技术为二者之间的嵌插和非 嵌插作用提供了有力的证据。彭小彬等刚通过圆二色光谱等手段研究了手性苏氨酸卟啉锌配合物 的超分子聚集体与小牛胸腺d n a 构建的新超分子。依据卟啉与d n a 作用时c d 光谱的外型来 判断卟啉与d n a 的结合模式，提出了具有不同构型的手性苏氮酸卟啉锌配合物聚集体与d 嗍a 构建新的超分子时不同的构建方式。 1 2 4 核磁共振分析法和质谱法 核磁共振( m 偶扮析法可以定量确定结合位点的化学变化。n m r 中的s a r 是最早报道的用 n m r 方法筛选靶向r n a 小分子的方法，并且可以通过靶向蛋白质的二维1 h 1 n 光谱筛选附近 亚结合位点的小分子物质阱j z h o n 等1 2 2 的n m r 研究结果证明抗癌药物放射苗素d 以嵌插方式 与寡聚核苷酸 c t ( a t c g a t ) z 作用j u n g 等硎利用核磁共振方法研究冷休克蛋白啪在3 4 3 k 及 室温下三维结构特征时发现，c s p 的分子开关功能直接与相邻于两个i i - b u l g e s 的氨基酸残基的构 象变化相关。随着软电离技术的发展，质谱法在小分子与d n a 加合物的结构分析中发挥着独特 的作用，该方法能灵敏快速地获得小分子与d n a 作用的结合区域、结合位点数、亲和力以 及非共价键结合方式等信息 1 2 5 红外光谱法 近年来，傅里叶变换红外光谱法在小分子与d n a 相互作用的研究中得到了广泛应用n c a u l t 等田1 利用傅里叶转换红外光谱技术研究了叶绿酸( c h 【，n ) 及叶绿索( c 玎0 与d n a 之间的相互作 用，并对c h l n - d n a ，c h l - d n a 以及金属卟啉- d n a 3 种加合物的性质进行了比较z h o u 等嘲 通过红外等光谱手段对聚二烯丙基二甲基氯化铵( p d d a ) 与d n a 之间的作用方式进行了研究红 外光谱研究结果表明，p d d a 与d n a 分子中的碱基和磷酸基团发生了作用，且d n a p d d a 复 合物的形成导致d n a 二级结构构象发生了变化。d l | p i l i s 等( z g l 利用傅里叶转换红外光谱和拉曼光 谱对c d 2 + 与d n a 之间的相互作用进行了研究，证明其结合位点为磷酸基团和碱基通常硬离子 主要与核酸分子的磷酸基团结合，软离子与碱基结合l 刈。按照l e w i s 理论，c 舻+ 是介于硬离子和 软离子之间的一种交界离子，因此c 一+ 既可与磷酸基团作用，又可与碱基作用 3 中囝农业大学硕十学位论文 第一章前言 1 2 6 拉曼光谱法 拉曼光谱是一种富含信息的分析技术，这种特定技术与共振和表面增强现象相结合使其逐渐 成为一种极具诱惑力的生物医学分析技术。l s o l a 等1 3 ”对h i vd n a 进行标记，并与表面增强拉曼 技术相结合，使拉曼信号显著增强，其灵敏度与荧光标记法相当，却比后者能提供更多的结构信 息已经有文献利用共振拉曼光谱研究了抗癌药物a m 僦n e 、a d f i a m y c i n 及 1 1 - d e o x y c a r m i n o m y c i n 与d n a 之间的相互作用。表明它们均以嵌插方式与d n a 结合田”；而 s a v o i e 等”1 借助拉曼光谱对c a 2 + 、m 矿、历“和0 1 2 + 与小牛胸腺d n a 相互作用的构象变化、 结合位点进行了研究。研究表明，金属离子浓度较低时。金属离子与d n a 上的磷酸基团结合， 并导致聚核苷酸结构的微小变化当c d 2 + ，z n 2 + 与碱基对结合时，二者的亲和力相当，而当与a t 碱基对结合时，c d 2 + 比z n 2 + 表现出更强的亲和力。 1 2 7 能量转移方法和微量热法 一些染料与核酸结合时，光谱特性往往允许从染料到核酸或在染料之间进行有效的长距离能 量转移。发生有效能量转移的条件是苛刻的主要包括：给体分子本身能发荧光；给体的荧光光谱 和受体的吸收光谱有相当程度的重叠；给体与受体之间的距离必须足够接近( 根据理论计算大约在 7 m 以内k 对于生化分析者来说能量转移现象的重要意义在于转移效率是发生转移的两个基 团距离的函数，因此由转移效率可以测定分子之间的距离。 能量转移技术对生物大分子结构的分析在溶液中进行，无需复杂的结晶等样品处理步骤，因 而快速，灵敏，与x 埘线晶体衍射法相比，其测定结果更能反映生物大分子结构与功能之间的关 系能量转移技术也可用于d n a 点突变的探测、跟踪记录分子结构的动态变化从而对反应机理 的研究提供大量宝贵信息1 3 5 , 蚓此外，能量转移技术利用普通的荧光仪可以进行灵敏、快速的核 酸杂交测定与放射分析相比具有相当的灵敏度，却避免了繁琐的分离手续。s i x o u 等”以能量 转移技术在活细胞内进行了核酸杂交实验，标记了寡聚核苷酸单链及其互补链，并将二者的杂交 物注入活细胞中，观察其降解反应，发现注入细胞的寡聚核苷酸可以与胞浆中及核内非同源的互 补链杂交 徽量热法在测定过程中不会干扰生物体系的正常活动与代谢，对反应体系的光谱性质、电学 性质及溶剂性质等无任何限制条件，因而有许多独到之处网微量热法已先后被用于一些抗肿瘤 药物、生物染料以及金属配合物与d n a 相互作用的研究，包括热力学性质、结合位点及键合模 式的研究 1 2 8 凝胶电泳方法 凝胶电泳法是生物学中最常用的分离、纯化、鉴定、翻备d n a 片段以及研究d n a 分子结 构、构象和断链的重要手段f i c l 等m 认为嵌插作用可导致小分子- d n a 复合物电泳迁移率明显 降低，而仅仅静电作用不会对迁移率产生大的影响，据此可初步判断小分子是否与d n a 发生了 嵌插作用。c h e r t 等【卅比较了耐尔蓝- d n a 、e b - d n a 和d n a 电泳迁移率的大小，得出耐尔蓝以 嵌插方式与d n a 发生作用。张志刚等通过琼脂糖凝胶电泳技术研究3 - - 茂钛二甘氨酸盐与 4 中国农业大学硕 二学位论文第一帝前言 p b r 3 2 2d n a 的作用。发现它与p b r 3 2 2d n a 之间不存在任何嵌插作用，而且不会引起d n a 链 的缺刻。王自春等 4 6 1 报道3 - 价金属离子对平阳霉素与d n a 作用的影响。电泳实验表明，当f 矿 浓度较低时，其作用主要是促进平阳霉囊对丸- d n a 的降解；当f e 2 + 浓度较高时，一方面起促进 作用另一方面它本身也会降解1 - d n a 随着f e 2 + 的浓度增大，产生平阳霉素严重降解d n a 的现象。而在人体内，金属离子属微量元素，因此猜想e c 2 + 主要起促进作用。王玉琦等1 4 1 利用生 化分离流程及琼脂糖凝胶电泳从铁芒萁叶中提取出纯度比较商的稀土元素- d n a 复合物，并证明 稀土元素与d n a 的结合是紧密的。 除了上述的主要方法此外，还有许多种方法如平衡渗析、顾子力显微镜( a f t 0 、扫描隧道显 微镜( s t m ) 、亲和色谱法以及煳 线晶体衍射法等可用于小分子与d n a 相互作用机理的研究 其中x - 射线晶体衍射法结合分子动力学模拟计算可获得非常详细的小分子与d n a 结合位点及结 构变化的信息，以及一定的动力学数据总之，对于小分子与d n a 复杂体系的研究，必须综合 运用各种方法和手段进行全方位、多层次的深入研究以确保准确理解其相互作用。 1 3 化合物作为d n a 嵌入剂 近年来随着科学的进步，现代生物学已经进入了微观分子领域，d n a 嵌入剂的研究尤为突 出运用先进的仪器和技术从分子水平上去研究d n a 嵌入剂的设计合成和反应机理从而衍生 出更多的抗癌药物、抗生素药物和核酸染色荆，已经成为了新兴的研究热点所以了解d n a 嵌入剂的结构性质，类别状况以及应用领域是很有必要的。 d n a 嵌入剂( i n t e m a l a t o f ) - - 词是1 9 6 1 年由l c n n a n l ”j 提出以来。指的是小分子化合物( 尤以多 环芳烃为主) 与d n a 通过非共价结合以镶嵌的方式，发生可逆的相互作用d n a 嵌入荆在结 构上具有体积小处于缺电子状态，易吸电子插入d n a 碱基对之间的特点这种结构上的特点 决定了d n a 嵌入剂在性质上表现为： ( 1 ) d n a 嵌入剂在嵌入过程中。与d n a 的碱基对发生反应，若破坏原有的氢键，则d n a 嵌入剂的两极取代氢键与碱基对相连接；若未破坏原有的氧键，则d n a 嵌入剂直接与碱基对结 合，从而改变d n a 结构闻；c 2 ) d n a 嵌入剂与d n a 作用之后，d n a 的一级和二级结构保持不 变，三级双螺旋结构发生变化，部分解旋，其糖环和磷酸骨架的扭转角发生较大改变：( 3 ) d n a 嵌入剂和d n a 双螺旋内的碱基对之问存在反电性唧j ，这样使电荷分布的更均匀稳定这些特点 可以由光谱分析来说明，倒如紫外减色效应、荧光猝灭等光谱现象。 d n a 嵌入剂的分类方式有很多，按结构分有金属配合 # j d n a 嵌入剂和非金属化合物m 忱嵌 入剂；按类别分有吖啶类d n a 嵌入剂、吩嚷类d n a 嵌入剂、葸醌类d n a 嵌入剂等；但按其发展 的过程分为：传统单d n a 嵌入剂和新型d n a 嵌入剂。传统单d n a 嵌入剂包括有机化合物d n a 嵌 入剂和金属配合物d n a 嵌入剂；新型d n a 嵌入剂包括双嵌入剂和三链d n a 嵌入剂。下面按照这 种分类略微介绍一下 1 3 i 有机化合物d n a 嵌入剂 有机化合物d n a 嵌入剂是最早的一类d n a 嵌入剂，也是研究的较为成熟的一类，它们共同的 特性是都具有苯环结构，都处于缺电子状态，都易进攻富电子基团，并且这些有机化合物d n a 嵌 5 中国农业大学硕i 学位沦文第一节前言 入剂具有一定的生物活性i ，例如抗菌性、酶抑制性、抗癌性等等，从早期简单的芳环化合物吖 啶类d n a 嵌入剂和吩嗪类d n a 嵌入剂，发展到现今的芳香稠环类系列和葸醌类化合物及其衍生 物，例如2 ，6 - - - - 取代蒽醌衍生物，其结构式如下所示： d m 吼叫b j j p k “锄t l l “雠 d i s 曲嚷砌嗣锄酗f l l l l 唧i 默嚣 图1 2 两种常见的有机化台物嵌入拥 有机化合物d n a 嵌入剂与d n a 作用具有以下特点：( 1 ) 对d n a 的g - c 碱基对进行选择性 嵌入引起d n a 的断裂；( 2 ) 对d n a 的的亲和性能影响较大：( 3 ) 与d n a 相互作用，对其自身 的生物活性有影响；( 4 ) 造成电子由富电子的o - c ( 鸟嘌呤和胞嘧啶) 发生转移。 1 3 2 金属配合物d n a 嵌入剂 金属配合物d n a 嵌入剂主要集中过渡金属区域，尤以z n ，c o ，r n 为主p w 这三种过渡元 素易与三邻二氮杂菲形成金属配合物带正电荷的三邻二氮杂菲z n ，c o 、r u 络合物以三种 非共价键方式和d n a 作用，分别为：静电作用；小沟槽疏水结合；配体部分嵌入d n a 的碱基对 中嗍 通过对金属配合物d n a 嵌入j f l f 与双螺旋的小牛胸腺d n a 的荧光光谱研究，人们发现这些配 体主要嵌插到富电子的g c ( 鸟嘌岭和胞嘧啶) 碱基对之间嘲。这主要是因为金属配合物d n a 嵌 入剂在结构上处于缺电子状态，易吸电子插入富电子的d n a 碱基对o - c ( 鸟嘌呤和胞嘧啶) 之间。 金属配合物d n a 嵌入剂与d n a 的作用一般发生在大沟部分在这个过程中，金属配合物 d n a 嵌入剂若以“头对头”的方式嵌入，此时荧光值基本不发生改变；若以“肩对肩”的方式 嵌入，则易造成荧光猝灭侧实验发现，具有右旋光学结构的配体在嵌入到d n a 中以后，能够 和d n a 更稳定的作用从而导致其激发态寿命明显增强p 日 金属配合物d n a 嵌入剂由于具有较高的活性，能够和d n a 发生多种反应，从而导致d n a 的断裂，金属配合物d n a 嵌入剂由于嵌入作用为其本身提供了更好的断裂d n a 的途径。其对 d n a 的作用具体表现为：( 1 ) 通过糖环反应与d n a 相互作用，氧化d n a ，引起d n a 的断裂嗍； ( 2 ) 造成d n a 的水解切断；( 3 ) 与d n a 的碱基发生作用，氧化碱基；( 4 ) 造成电子由富电子的 g - c ( 鸟嘌岭和胞嘧啶) 碱基对转移致嵌入的金属配合物。 1 3 3 双嵌入剂d n a 探针 人们对嵌入剂早期的研究中，经常以溴乙锭，碘丙锭，亚德里亚霉素等作为核酸探针，在寻 找更为有效的探针的过程中，人们很自然地想到通过提高其与核酸的亲和力来改善探针的性能， 6 中同农业大学硕l + 学位论史第一章前寄 理论上，当一个探针分子中能与核酸作用的官能团数目为n 时，由于协同效应，其与核酸的亲和 力应以的n 的指数形式增长i 叫， 例如单嵌入剂在低盐条件下与双链d n a ( d s d n a ) 的亲和常数为 l 旷一1 0 6 l m o l ，而当同一分子中有两个该官能团时，预期的亲和常数应为1 0 0 1 0 ”u m o l 【神i ，因 此化学家尝试将简单的单嵌入剂分子进行聚合。形成二聚体的双嵌入剂，实验证明二聚体双嵌 入剂是性能更好，灵敏度更高的d n a 探针1 6 l 】 而且在双嵌入剂中，亲和常数还可以通过适当的选择桥基来迸一步提高。目前，已有许多性 能良好的双一嵌入剂被合成，并在一定程度上达到了提高亲和性及对核酸检测灵敏度的目的。例如 t o t a b ( 1 h i a z o l eo r a n g e - t h i a z o l cb l u eh e 魄硼i m 砷噻吩橙噻吩蓝杂型二聚物；t o t o ( t h i a z o l eo r a n g e h o m o d i m e r ) 噻吩橙同型二聚物其结构式如下所示： 田1 - 3 两种常见的双嵌入秆 从结构上可以看出，双嵌入剂探针具有两个嵌入基团的分子，它由两个单嵌入剂分子经一桥 基联结而成，更容易嵌入d n a 的碱基对中，而且这种双嵌入剂探针具有很明显的荧光特性：( 1 ) 与 d n a 间极高的亲和常数，形成的荧光络合物在电泳条件下稳定，便于测定；( 2 ) 以游离状态存在 于溶液中时荧光很弱，故显示低背景；( 3 ) 与d n a 结合后荧光大大增强，灵敏度高：( 4 ) 具有高 消光系数，有利于灵敏度豹提高：( 5 可以被普通的荧光仪器检测 可见，当使用双嵌入剂这类探针时，由于其与核酸亲和常数很高，不仅可咀提高对双螺旋 d n a 分析的精确度，而且由于双嵌入剂探针与核酸作用后荧光增强倍数又很大，灵敏度大大提 高，因此双嵌入剂的检测也更加便捷。其检测关键在于检测装置的改进，目前应用极广的高灵敏 度检测装置是激光激发的共聚焦荧光扫描仪，它具有激发光强。空闻分辨率高，灵敏度高等优点 畦叫近年来，双嵌入剂被广泛应用于d n a 大小分析，溶液中核酸的定量分析。流体中单分子 核酸的测定与大小分析和单分子m 执静态及动力学性质的研究等多个方面 1 3 4 三链d n a 嵌入剂 1 9 5 7 年，f c 删d 岬1 等即提出三螺旋核酸的概念，三链d n a 是由一条含多聚嘧啶或多聚嘌 岭的寡核苷酸在靶基因双链d n a 局部再一次成链，并在靶基因的大沟区缠绕而形成的。根据第三 条链与含多聚嘌岭链靶基因的取向不同，三链d n a 可分为平行与反平行三链嘲。三链d n a 与双 链d n a 相比。其稳定性差了很多，不过小分子化合物嵌入三链d n a 的原理依然是基于静电作用、 沟区间结合、嵌入作用三种。 由于双链d n a 和三链d n a 结构上的不同，经典的双链d n a 嵌入剂对于三链d n a 并不适用 近来基于对三链d n a 这些高度有序的碱基体系结构信息f 如溶液n m r 、x 晶体射线、分子模型) 7 中国农业大学硕l 学位论史第一帝前言 和相芙的分子模型的不断认识m j ，设计出对于三链d n a 具有稳定作用而对于双链d n a 分子具有 很小或不起作用的新型三链d n a 嵌入剂。例如，在寻找潜在有效的抗h i v 药物的过程中，发现4 氨基喹啉衍生物是一种抗h i v 很有潜力的化合物，后来实验证明其2 号位被萘取代后成为一个有选 择性的三链d n a 嵌入剂其结构式如下： n 8 l p i l m y i q l l i i 嘛 围l _ 4 萘基睦啉衍生物的结构式 三链d n a 嵌入剂具有以下特点：( 1 ) 大的芳香环平面有利于和三碱基的兀电子堆积；( 2 ) 侧链 古有正电荷以补偿三链d n a 上很高的负电荷密度；( 3 ) 三碱基的相互堆积形成两个扭转的接触点； ( 4 ) 末端具有质子化的侧链，协助将偶联剂传递到目标分子上，与沟区间或磷酸酯骨架的相互作 用而将偶联剂固定。 三链d n a 嵌入剂是近两年来新兴的d n a 嵌入剂，它对d n a 的结合具有高效性和专一性。睫 着对三链d n a 嵌入剂认识的不断深化，可以相信不久的将来三链d n a 嵌入剂在基因学、生物化学， 遗传学和医药学等领域都会得到广泛应用 1 4d n a 嵌入剂的应用 d n a 嵌入剂有很多方面的应用，例如d n a 荧光分析，d n a 染色，d n a 色谱分离，d n a 链裂解和识别。药物分折以及d n a 光切断剂f 明。近年来，d n a 嵌入剂的应用已经引起人们的广 泛关注 1 4 1 d n a 嵌入剂应用于d n a 光敏切割 d n a 光切断剂的研究是近年来生物化学和分子生物学中最话跃的前沿领域之一d n a 光 切断是通过化学反应将长链的d n a 分子断裂成较短的碎片，在光激发的情况下，分子进入激发 态并催生活性碎片( 例如自由基、单线态氧、超氧负离子y 6 州，引起一系列的化学反应，对生物 大分子进行结构上分解( 损伤、剪切) d n a 光切断剂可以作为核酸结构探针研究核酸的结构；也 可以作为足迹试剂研究d n a 与蛋白质的相互作用；还可以作为光动力疗法治疗癌症的药物。 1 4 2d n a 嵌入剂应用于电泳分离过程机理研究 在毛细管电泳中，因自由d n a 分子的迁移率与分子大小无关故需加入一特定分离介质，妇 线状高分子聚丙烯酰胺，来帮助分离。至今，对分离介质是如何起作用的仍无定论利用荧光 8 中同农业人学颂卜学位论文第一章前言 显微镜直接观察d n a 嵌入剂标记的d n a 分子在毛细管中的运动情况，当d n a 溶液浓度较稀时， 由于与介质高分子的作用d n a 分子以有节奏的伸展收缩伸展变化方式通过毛细管1 7 0 “。而 当溶液浓度更稀时，在布朗运动、介质影响及电场力作用下，d n a 以一种旋转运动的方式通过毛 细管这些观察无疑对分离过程机理的研究提供了直接依倨 1 4 3d n a 嵌入剂应用于蛋白质核酸络合物的定性分析 凝胶电泳迁移率分析法是目前最常用的蛋白质核酸的络合物定性分析方法。本方法是基于核 酸与蛋白质络合后电泳迁移率下降的原理。常规分析中使用的多为放射性同位素标记物”，而现 在，遥过选择适当的双嵌入剂探针，已可以达到与放射标记物相同的灵敏度同时具有荧光法的 快捷、安全、灵活等优点脚等i 川以双嵌入剂探针标记靶d n a ，发现当以适当的碱基对与双 嵌入剂探针标记时，并不会影响特定蛋白质对其靶d n a 的识别与结合作用。当以扫描仪进行检测 时。达到的空间分辨率远高于传统的放射性自显影法，且能做到后者无法完成的对组成比例不同 的蛋白质核酸络合物的区分。 1 4 4d n a 嵌入剂应用于新型药物的研究 新型药物的研究一直是医药化学的热点，d n a 嵌入荆的研究可以为新型药物设计及癌症和其 它病毒的化疗提供一定的理论基础【”j 。d n a 嵌入剂主要通过对d 1 蛆双螺旋进行解旋，和d n a 可 逆结合，与d n a 共价结合形成烷基化试剂三种方式对药物的物理性质和化学性质发生改变。 d n a 嵌入剂由于自身的特点。体积小具有芳环，对d n a 有一定的碱基选择性等特点，在分子 生物学，生物技术，药物分析，法庭鉴定，免疫分析等领域具有广泛的应用前景 7 6 - 7 8 1 。单嵌入 剂是很好的抗癌剂，在临床诊断中具有实际意义，不仅如此，单d n a 嵌入剂在新药物研究中也起 着重要作用丽双嵌入剂与d s d n a 形成的稳定荧光络合物也可作为荧光探针，它们凭借安全， 方便、高灵敏度、低背景等优点跻于最理想的核酸探针之列三链d n a 嵌入剂对于双链d n a 序列 识别的专一性并且通过形成三链达到调节基因表达的功能【明，在理论上任何基因或基因组表达所 引起的疾病都可以作为应用对象，也必将在药物的潜在应用包括治疗病毒感染、癌症、免疫疾病 等l m l 方面发挥巨大作用 当然，事物都是具有两面性的，由于任何核酸嵌入剂都有些具有致突变的性质，d n a 嵌入 剂自然也不例外因此，在研究和使用的过程当中中应加以注意，在充分运用d n a 嵌入剂的优点 时应尽量避免d n a 嵌入剂造成损害 1 5 大环化合物作为d n a 嵌入剂的研究现状 1 5 1 国内相关研究的现状 由于d n a 嵌入剂是最近三十年才兴起的研究课题。因此国内相关的报道并不是特别丰富，在 相关的研究中，国内主要集中在金属配合物d n a 嵌入剂领域。金属配合物d n a 嵌入剂是指过渡金 属元素，( 尤以盈锌，c o 钻，r u w 为主) t s l 捌这三种过渡元素易与多环化合物形成金属配合物。在 结构上具有体积小，处于缺电子状态的特点。这种结构上的特点决定了其具有较高的活性，能够 9 中固农业人学硕卜学位论文 第一章前言 和d n a 发生多种反应。从而导致d n a 的断裂。改变d n a 性质l 鼽跳。目前国内的相关研究中t 中 山大学的计亮年教授和他的课题小组主要研究钌配合物作为d n a 结构探针，其研究结果表明多吡 啶钉配合物作为d n a 嵌入；f ! | 一般通过静电、插入和沟结合三种方式尤其以插入的方式居多h ” 另外，计亮年教授的研究结果还表明不同配体的多吡啶钌配合物作为d n a 嵌入剂对d n a 的性质有 较大影响配体的平面性越好，平面面积越大与d n a 作用越强阁。此外，兰州西北大学的高锦章 教授的研究结果也表明钴配合物作为d n a 嵌入剂也对d n a 的性质有影响，但作用方式主要以静电 作用为主而以磺酰胺类大环化合物作为d n a 嵌入剂，国内还鲜有相关报道国内对磺酰胺类大 环化合物的报道主要集中在中国农业大学王道全教授的课题小组，不过主要集中在药物的合成和 杀菌活性等方面 s o 。 1 5 2 国外相关研究的现状 国外对d n a 嵌入剂的研究已经由早期的对d n a 嵌入荆自身特点的研究，例如lsl e n a 教 授研究的d n a 嵌入剂在嵌入过程中，与d n a 的碱基对发生反应，从而改e d l q a 结构：发展到d n a 嵌入剂对d 时a 三级双螺旋结构改变的研究，例如e cl o n g 教授和j rb a r t o n 教授对d n a 嵌入剂与 d n a 作用之后，d n a 的一级和二缀结构保持不变，三缓双螺旋结构发生变化。磷酸骨架的扭转角 发生改变的研究l s s - 9 1 l ；再发展到现在，d n a 嵌入剂的大家庭有了较大扩展。新的d n a 嵌入剂不断 涌现，从单d n a 嵌入剂到双m 帆嵌入剂和三链d n a 嵌入剂以及f a n d 出a r j m a n a 教授研究的新的不 匀称大环复杂d n a 嵌入剂刎 最近几年，d n a 嵌入剂越来越朝着大环、平面性好、空间立体位阻小的趋势发展，例如 1 v t i 卫 n i 教授2 0 0 4 年研究发现的多环聚胺类复杂d n a 嵌入荆，以及f m - u k hx , j m a n d 教授研究发现 的类似九元大环复杂d n a 嵌入剂：近年来，d n a 嵌入剂的另一个发展方向就是更微观更高选择性， 例如y w e i m m a a n 教授等人研究的电子传导d n a 嵌入剂和ls u m m a 教授的研究小组研究的选择性 d n a 嵌入剂；d n a 嵌入荆另外前进潮流是逐步应用到医学方面，例如ls w a n s o n 教授等人所带领 的研究小组目前尝试着将d n a 嵌入剂运用到流行病学等方面通过研究d n a 嵌入剂的设计合成和 反应机理，而合成新的抗癌药物、抗心血管疾病药物等等f g s 9 9 1 1 0 中国农业j 、学顾f 学位论史第一章论文选题f f 勺h 的，依据和要内容 第二章论文选题的目的、实验设计和主要内容 2 1 实验目的 本课题是以磺酰胺类大环化合物作为d n a 嵌入剂磺酰胺类大环化合物的结构式如下图所 水棚b h ，求：硼d 0 2 磺酰胺类大环化合物因为在结构上具有苯环结构，处于缺电子状态，易吸电子插入d n a 碱 基对之问，符合d n a 嵌入剂的特点，可以作为d n a 嵌入剂 而磺酰胺类大环化合物一直是有机化学中一个引人注目的研究领域，它在香精香料、医药、 农药、兽药、食品添加剂等方面均占有特殊的地位，是我们经常接触，与我们的日常生活有着十 分密切的联系因此，以磺酰胺类大环化合物作为d n a 嵌入剂，研究其与d n a 的相互作用，并 且改变环境条件，引起d n a 性质的变化，通过仪器手段进行检测，推断出d n a 与d n a 嵌入剂 大环化合物的作用方式，迸一步确定作用位点，计算热力学参数，从而判断大环化合物对d n a 的损害程度，这就具有非常重要的现实意义 另一方面，由于d n a 与大环化合物的作用方式与大环化合物本身的结构( 例如特征官能团、 取代基的种类和位置，空间位阻等) 相关，所以当确定了d n a 与大环化合物的作用方式和作用位 点之后，可以反过来推导大环化合物的结构对d n a 与大环化合物的作用方式和作用程度有何影 响；并且通过对带有各种不同取代基的大环化合物其生物活性的研究，可以指导大环化合物的设 计和合成，为以后新型药物、营养保健品和新的d n a 嵌入剂的设计合成以及改良制备提供条件， 对今后同类型