（生物化学与分子生物学专业论文）ni2高效结合肽的筛选与作用研究.pdf

西南交通大学硕士研究生学位论文第1 页 摘要 各种环境中重金属的污染已经严重威胁人类的健康。许多重金属元素 如汞、砷、镉、铅、铬等通常对生物有较高毒性，甚至某些生物所必需的 痕量元素铜、锌、镍等在较高浓度时也能对生物体产生明显的毒性效应。 这些重金属元素可与蛋白质结合引起其活性丧失或结构破坏，取代某些必 需微量元素从而导致营养缺乏，以及诱导自由基或活性氧的生成。研究发 现，在多种微生物、动物和植物细胞内普遍存在对金属离子具有亲和能力 的多肽，称为金属结合肽。目前在国内外，有许多关于金属结合多肽( 蛋 白质) 的研究报道，但主要是集中在自然界原有的多肽( 蛋白) ，如植物 络合素( p c s ) 和金属硫蛋白( 盱s ) ，而关于金属结合多肽的专门报道则相 对较少。针对重金属污染的生物修复技术，因其特有的优势，越来越受到 重视，其中一个重要的研究领域是利用金属离子和金属结合蛋白( 肽) 之 间存在的强亲和力特性进行的生物修复研究。 本论文利用噬菌体展示技术，从噬菌体随机十二肽库中筛选对重金属 n i “具有强亲和能力的多肽。扩增噬菌体十二肽库，将扩增噬菌体加入到结 合有金属n i ”的树脂中，通过噬菌体和树脂的结合、l 飓s t 的洗涤和 2 0 0 m m 咪唑溶液的洗脱等步骤进行筛选。经过六轮的筛选，成功地从噬菌 体十二肽库中筛选和富集到对重金属离子n i 2 + 结合能力的十二肽。随机从第 五轮和第六轮筛选物中挑选了多个噬菌体克隆，经过扩增、单链d n a 的制 备和d n a 测序，确定相应的氨基酸组成。经过分析比较，发现筛选得到的4 条十二肽氨基酸序列均含有4 5 个t i i s ，表明多肽中h i s 含量和n i ”结合能 力的强弱有一定的关系。 通过实验确定所获得的金属结合肽对不同金属的亲和能力和专一性， 以及展示有金属肽的噬菌体对重金属离子具耐受和降毒作用。采用噬菌体 展示筛选技术，金属抑菌实验和结合金属多肽克隆重金属螯合树脂的形态 观察，测定重金属螯合树脂( n i ”，c d ”，c r ”，c u ”，z n “，c o ”) 对展示有 n i 2 + 金属多肽的噬菌体克隆的亲和能力( 或专一性) 。经分析比较，可以确 定制备的金属螯合树脂可用于金属结合肽的亲和力的测定；获得的十二多 肽对其它金属也有作用；c u ”、n i “、c o “、z n 2 + 金属离子比c d 2 + 、c r 2 等金属 离子对n i 2 + 金属结合多肽的亲和力要高；多肽中h i s 的含量与n i 2 + 结合能力 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 i 页 的强弱有关；展示金属结合多肽的噬菌体对重金属离子n i ”具有一定的耐受 和降毒作用：同时，树脂螯合金属结合多肽后对树脂粘性有影响。高效或 专一的金属结合肽的获得对于研究金属一多肽相互作用以及环境重金属修 复等均具有重要意义。 本论文同时对基于金属结合蛋白的细菌构象型随机展示肽库的构建进 行了初步的探讨。考虑目前从噬菌体随机肽库中筛选获得的金属结合肽未 发现含有c y s 等重要氨基酸，而从m t s 、锌指结构等已知金属结合蛋白( 多 肽) 中我们早已了解c y s 在金属结合中的重要作用。本论文首次提出利用 c 2 h 2 型锌指结构骨架模型，初步完成了寡核苷酸随机肽库的d n a 设计、合 成、细菌质粒空载体p l b b 9 的制备等工作，设想将锌指片段插入载体构建 重组质粒而在细菌表面展示，目的是插入的目的序列在外膜蛋白l a m b 中展 示，从而构建锌指蛋白基本骨架结构的细菌肽库，实现细菌随机肽库筛选 与细菌表面展示的同步进行。并且，期望通过骨架随机肽库的筛选，获得 c y s h i s 的结合肽序列，为更好的了解锌指蛋白中多肽与高效结合的重金 属的作用机制以及金属结合肽一金属离子的相互作用研究，提供理论基础。 关键词：n i ”；金属结合肽；噬菌体展示技术；筛选：锌指蛋白；细菌展示 技术 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 il 页 a b s t r a c t h e a v ym e t a lp o l l u t i o nh a si nav a r i e t yo f e n v i r o n m e n t sb e e na s e v e r et h r e a t t ot h eh u m a n sh e a l t hw h i c hi sr e g a r d e da saw o r l d - w i d ep r o b l e ma l lt h et i m e m a n yh e a v ym e t a l s ，s u c ha sh g 、c d 、p ba n dc r , u s u a l l ya r et o x i cf o rm a n y o r g a n i s m e v e ns o m eo r g a n i s m s e s s e n t i a lt r a c ee l e m e n t s ，s u c ha sc o p p e r , z i n c a n dn i c k l ea l s op r o d u c eo b v i o u st o x i c i t ye f f e c ta g a i n s tt h er i v i n gc r e a t u r ea t h i g h e rc o n c e n t r a t i o n ，h e a v ym e t a l s c a l lb i n dt o p r o t e i n sa n dr e d u c et h e i r a c t i v i t i e so rb r e a kt h e i rs l r u e t u r e ，r e p l a c es u m ee s s e n t i a lt r a c ee l e m e n t sa n dt h u s c a u s et h el a c ko fn 删i h m e n le v e nt oi n d u c ea n dc r e a t et h ef o r m a t i o no ft h e f r e eg r o u po rl i v eo x y g e n t h e r ea r em a n ym e t a l - b i n d i n gp e p t i d e sw i t hh e a v y m e t a l sa f f i n i t i e st h a tw e r ef o u n di np l a n t s , m i c r o o r g a n i s m sa n da n i m a l s t h e r e a r eal o to fr e p o r t sa b o u tm e t a l - b i n d i n gp o l y p e p t i d e s ( p r o t e i n s ) w h i c hm a i n l y c o n c e n t r a t e do nt h en a t u r ep o l y p e p t i d e s ( p r o t e i n s ) ，s u c ha sp h y t o c h e l a t i n s ( p c s ) a n dm e t a l l o t h i o n e i u s ( m t s ) ，h o w e v e rt h e r ea r es t i l lf e wr e p o r t sa b o u tt h es h o r t a n dn e wm e t a l - b i n d i n gp o l y p o p t d e sw h i c ha r eo fs p e c i a lm e r i t sa n dh a v eg r e a t v a l u e si nt h eh e a v ym e t a lb i o r c m e d i a t i o n o n i no r d e rt of i n dh i 曲a f 硒t yn i ”b i n d i n gp p e t i d e s ，p h a g ed i s p l a yt e c h n i q u e w a su t i l i z e d t h ep h a g el i b r a r yw a sa m p l i f i e da n dl a t e rt h eq u a n t i f i e dp h a g e s w e r ea d d e di n t on i ”r e s i n s , w a s h e dw i t ht b s tb u f f e ra n da tl a s te l u t e db y i m i d a z o l e ( i d ) s o l u t i o n s t h ep r o c e d u r ew a sr e p e a t e df o r s i xt i m e s , t h e 1 2 - p s p t i d e sw i t ha f f i n i t yf o rn i w e r es u c c e s s f u l l ys e l e c t e d p h a g ec l o n e sw e r e s e l e c t e dr a n d o m l ya n dt h ed n as e q u e n c ew a sd e t e r m i n e df o re a c hc l o n e f o u r d i f f e r e n ta n i n l oa c i ds e q u e n c e sw e r eo b t a i n e dw h i c hw e r ef o u n dc o n t a i n i n gf o u r t of i v eh i s t i d i n er e s i d u 船 i nt h i sr e p o r t ，t h ea f f i n i t i e so ft h em e t a lb i n d i n gp e p t i d e sa c q u i r e df r o m r a n d o mp e p t i d ep h a g el i b r a r ya g a i n s td i f f e r e n tm e t a lc h e l a t i n gr e s i n sa n dt h e t o l e r a n c ea n dt h ed e t o x i f i c a t i o no ft h ep h a g ed i s p l a y i n gm e t a lp e p t i d ea g a i n s t h e a v ym e t a l w e r e a s s a y e d p h a g ed i s p l a yt e c h n i q u e ，b a c t e r i ar e p r e s s i o n e x p e r i m e n ta n dt h ep h y s i c a lo b s e r v a t i o no f t h eb i n d i n go f p h a g e st oh e a v ym e t a l c h e l a t e dr e s i n su n d e rm i c r o s c o p ew e r eu s e dt om e a s u r et h ea f f i n i t ya n d o r s p e c i a l i t yo fh e a v ym e t a lc h e l a t i n gr e s i n sa g a i n s t t h ep h a g ec l o n e sw h i c h d i s p l a y e dn i ”m e t a l - b i n d i n gp o l y p e p t i d e r e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ：t h ep r e p a r e d 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 v 页 m e t a l c h e l a t e dr e s i n sc o u l db eu s e dt od e t e c tt h ea f f i n i t yo fn i 2 + m e t a l - b i n d i n g p o l y p e p t i d e s ；t h eo b t a i n e dm e t a - b i n d i n gp e p d d e sh a dt h es i m i l a re f f e c t st ot h o s e o fo t h e rh e a v ym e t a l s ；c u 2 + 、n f 、c o ”a n dz d + h a dh i g h e ra f f i n i t i e sf o rn i ” m e t a l b i n d i n gp o l y p e p t i d e st h a nt h o s eo fc d 2 + 、c f ；s 。q u e i l c 髓w e r er i c hi nt h e c o n t a l to fh i sa m i n oa c i d , i n d i c a t i n gt h ec o n t e n to fh i sa m i n oa c i di n p o l y p e p t i d ep l a y i n ga l li m p o r t a n tr o l ei nt h eb i n d i n go fh e a v ym e t a l sp l l a g e s d i s p l a y i n gm e t a l b i n d i n gp o l y p e p t i d e s i n c r e a s e dt h e i rd u r a t i o na n d d e t o x i f i c a t i o no f h e a v ym e t a li na r e p r e s s i o na s s a y ；a tt h es a m et i m e ，t h er e s i n s v i s c o s i t yw a sa f f e c t e da f t e rt h em e t a l - b i n d i n gp o l y p e p t i d ed i s p l a y e dp h a g e s m i x i n gw i t ht h em e t a lc h e l a t i n g i ti so fg r e a tv a l u et oa c q u i r ee f f e c t i v ea n d s p e c i a lm e t a lp e p t i d e sr e s i n sb o t hf o rt h eb i o r e m e d i a t i o no f t h eh e a v ym e t a l sa n d t h es t u d yo f t h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nh e a v ym e t a l sa n dm e t a l - i n d i n gp e p t i d c s i nt h i sr e p o r t ，t h ec o n s t r u c t i o no f h a c t e r i a l - d i s p l a y e dr a n d o mp e p t i d el i b r a r y o n m e t a l b i n d i n gp r o t e i n w a s a l s o 印p r o a c h e d p r e l i m i n a r i l y a t p 瑚髓t ，c o n s i d e r i n gt h a tw ed i m l tf o u n dm e t a lb i n d i n gp e p t i d e sw h i c hw e r e s e l e c t e df r o mp h a g ed i s p l a yt e c h n o l o g yc o n t a i ni m p o r t a n t 出 n i n oa c i d ss u c ha s c y s h o w e v e r , f r o mm e t a lb i n d i n gp r o t e i n ( p o l y p e p t i d e ) s u c ha sm t s ，z i n c f i n g e r sa n ds oo n , w e h a v ea l r e a d yu n d e r s t o o dt h a tc y s p l a y sa r ii m p o r t a n tr o l e i nb i n d i n gm e t a l i nt h i st h e s i s , w eu s e dt h es c a f f o l do fc y s 2 h i s 2z i n cf i n g e r p o l y p e p t i d e ，a n dc o m p l e t e dt h ed e s i 班a n ds y n t h e s i so ft h eo l i g o n u e l e o t i d e r a n d o mp e p t i d el i b r a r y 勰w e l la st h ep r e p a r a t i o no ft h ee m p t yv e c t o ro f b a c t e r i a lp l a s m i dp l b b 9 ，i n t e n d i n gt oi n s e r tt h ef r a g m e n to fz i n cf i n g e ri n t o t h ep l a s m i dt oc o n s t r u c tt h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw h i c hd i s p l a y e do nt h es x l l f a c e o f b a c t e r i a w eh o p et oo b t a i nc y s - - h i sc o n t a i n g i n gb i n d i n g - p e p t i d es e q u e n c e s b ys c r e e n i n go ft h ec o n s t r u c t e dr a n d o mp e p t i d el i b r a r y , w h i c ho f f e r i n gt h e t h e o r e t i c a lb a s i sf o rt h eb e t t e ru n d e r s t a n d i n go ft h em e c h a n i s m so fi n t e r a c t i o n b e t w e e np o l y p e p t i d ei nz i n cf i n g e rp r o t e i n s ( p e p t i d e s ) a n dh e a v ym e t a l sw i t h h i g l la f 鲥t y , a sw e l la sf o rt h es t u d yo fi n t e r a c t i o nb e t w e e nm e t a lb i n d i n g p e p t i d ea n dm e t a li o n s k e y w o r d s ：n i “；m e t a lb i n d i n gp e p t i d e ；p h a g ed i s p l a yt e c h n o l o g y ；s e l e c t i o n ； z i n cf i n g e rp r o t e i n s ；d i s p l a y t e c h n i q u ei nb a c t e r i a 西南交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借阅。本人授权西南交通大学可以将本论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复印手段 保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 保窖昀，在量年解密后适用本授权书； 2 不保密使用本授权书。 ( 请在以上方框内打“”) 学位论文作者签名：形冬彳鑫 日期： a 。矿7 ，。， 指导老师签名： 日期： 膨 少哆o ， 西南交通大学学位论文创新性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是在导师指导下独立进行研究工 作所得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和 集体，均已在文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由 本人承担。 本学位论文的主要创新点如下： 1 利用噬菌体展示技术，从噬菌体随机十二肽库中筛选对重金属n i “ 具有强亲和能力的多肽( 序列) 。经过六轮的n i ”噬菌体结合肽筛 选，噬菌体克隆呈现出极强的富集能力，从第一轮的3 6 8 倍剧增 到第六轮的1 5 3 0 0 倍。 2 通过设计以c 2 h 2 型锌指骨架为基础的偏性寡聚核苷酸双链，硬性 包括h i s 和c y s ，未见报道。以细菌外膜l a m b 蛋白为锚定蛋白在 细菌表面展示金属结合肽，并构建以锌指蛋白为骨架的偏性肽库， 进而分析固定的氨基酸残基临近氨基酸的组成，更有助于深入研 究锌指蛋白中多肽与高效结合的重金属的作用机制。 3 与实验室同组成员一起，提出和创建了展示噬菌体重金属解毒研 究的细菌滤纸圈新方法，通过细菌平板生长，滤纸片和重金属离 子的添加，测定噬菌体抑菌圈的大小，检测n i ”结合肤的抑菌解毒 能力。该针对重金属的细菌培养噬菌体解毒方法，国内外未见报 道。 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 页 第1 章绪论 1 1 前言 重金属污染是当今世界环境保护中面临的两大难题之一。在无机污染中， 重金属由于不能被微生物降解和在土壤中难以迁移使得治理非常困难，特别 是对于矿区土壤、大型冶炼工厂周边和核事故发生地土壤等的治理，至今， 没找到理想的方法。随着人们对环境保护的日益重视，一些科学家开始探索 利用生物来修复重金属污染土壤的新方法。 生物修复( b i o r e m e d i a t i o n ) 是利用生物来恢复被破坏了的环境，以其 独特的优点，成本低，不破坏土壤环境，不易造成第二次污染，一种绿色修 复，易被公众接受。生物修复包括微生物修复和植物修复哪。其中微生物修 复主要包含两方面的技术：生物吸附和生物氧化还原。基因工程生物吸附是 利用蛋白质多肽结合重金属的特性，构建工程菌，放到环境中，修复重金属 污染。生物吸附是生物修复一个重要研究领域。在国内已有许多报道，如利 用金属硫蛋白能结合大量重金属的性质，构建金属硫蛋白基因工程菌或水生 生物( 包括藻类) 来去除环境中受污染土壤或污水中的有毒金属”。1 ，为环境重 金属污染治理开辟了一条崭新的道路。 目前，利用金属结合蛋白和重金属之间存在的强亲和能力特性进行环境修 复是一条绿色、高效修复途径。而自然界天然存在的抗重金属生物( 如一些 细菌、真菌、藻类和植物) 的生物修复由于生理条件或金属结合蛋白的限制， 往往难以达到理想效果。通过基因工程技术，将金属结合蛋白( 肽) 展示在 微生物表面或在植物细胞中表达，获得对重金属离子具有高效吸附能力的基 因工程菌或植物，有望成为一种高效、经济、方便的生物修复方法。利用噬 菌体展示技术，从噬菌体文库中筛选出对重金属结合能力强且具有专一性和 选择性的多肽，再利用多种重金属螯合树脂的筛选技术，对多肽进行亲和力 测定，分析多肽与金属结合位点的关键氨基酸，分析关键氨基酸与重金属间 可能的结合关系，为构建基因工程菌，释放环境修复菌，提供理论基础。现 在国外开展了很多关于这方面的的基础理论研究。相比之下，国内研究较少”3 。 重金属n i ”对环境的污染普遍存在，本论文的主要工作是对从噬菌体随机 十二肽库中筛选出的对重金属n i ”有强亲和能力的十二肽进行多种金属螯合 树脂的亲和力测定和多方面的鉴定分析，一方面为搞清不同重金属和结合蛋 白间的作用机理及治理重金属污染打下一定的理论基础。另一方面，对比其 西南交通大学硕士研究生学位论文第2 页 他金属结合多肽序列与金属间的关系，可用于分析金属与氨基酸( 多肽) 之 间结构与功能的关系。 1 2 项目来源及主要内容 1 ) 国家自然科学基金项目，编号：3 0 2 7 0 0 4 1 ，重金属高结合肽的筛选与 展示研究 2 ) 国家中医药局项目，编号：0 4 - - 0 5 z l l 9 ，微生物展示技术在药用植物 重金属污染修复中的应用研究 3 ) 西南交通大学校基金，编号：2 0 0 5 8 1 4 ，基于微生物展示技术的川芎 c d 污染修复研究 1 3 文献综述：噬菌体展示技术和重金属结合蛋白( 肽) 研究 进展 1 3 1 噬菌体展示技术 1 9 8 5 年s m i t h “1 最先将外源基因插入丝状噬茵体f 1 的基因皿，使目的基 因编码的多肽能以融合蛋白的形式展示在噬茵体表面，从而创建了噬茵体展 示技术，噬菌体展示技术对生物学许多领域的研究带来了巨大影响，被誉为 生命科学研究中又一次技术上的重大突破。丝状噬菌体作为载体具有多方面 的巨大应用潜力。丝状噬菌体的利用，在分子生物学研究以及基因工程发展 中起了重大作用。 1 3 1 1 丝状噬菌体的特点 丝状噬菌体的形态结构：丝状噬菌体主要包括大肠杆菌丝状噬菌体m 1 3 、 f d 、f l 等，属于丝杆噬菌体科( i n o v i r i d a s ) 丝杆噬菌体属( i n o v i r u s ) 。它们 的亲缘关系十分密切，特性相似，都含一分子单链环状d n a 。且d n a 同源性 高达9 8 以上。噬菌体颗粒形状、大小相近，都属雄性噬菌体，仅感染雄性 细菌。 m 1 3 噬菌体是一种丝状噬菌体，也是噬菌体展示技术中用的最多的载体。 m 1 3 噬菌体呈长纤维状的柔性长丝，长约8 6 0 n m ，直径约6 n m 。外壳蛋白围绕 西南交通大学硕士研究生学位论文第3 页 基因组d n a 呈规则螺旋排列。它的基因组s s d n a 由6 4 0 7 个脱氧核苷酸组成， 其d n a 链内并不自我互补，只有少数碱基配对。基因组共有十个基因，分别 编码1 0 种不同的蛋白质。基因v i i i ( 9 8 ) 所编码的p 8 蛋白是噬菌体的主要外 壳蛋白，约含2 7 0 0 个拷贝，围绕d n a 呈螺旋对称的管状排列。基因i ( 9 3 ) 、 ( 9 6 ) 、( 9 7 ) 、i x ( 9 9 ) 分别编码p 3 、p 6 、p 7 、p 9 蛋白，它们在外壳蛋白中 各有约5 个拷贝。p 7 与p 9 构成噬菌体外壳顶端“塞子”，p 3 与p 6 蛋白构成噬 菌体外壳的尾端，基因i i ( 9 2 ) 所编码的p 2 蛋白是亲代r fd n a 位点特异性 缺口酶，基因v ( 9 5 ) 所编码的p 5 蛋白是s s d n a 合成时螺旋去稳定蛋白。基因 i ( 9 1 ) 、i v ( 9 4 ) 所编码的p l 、p 4 蛋白可能涉及噬菌体装配。基因x ( g l o ) 所编 码p 1 0 蛋白是基因i i i 启动子的激活蛋白。 1 3 1 2 噬菌体展示技术 噬菌体展示( p h a g ed i s p l a y ) 是一种基因表达产物和亲和选择相结合的 技术。它是将目的基因与编码噬菌体外壳蛋白基因通过接头( 1 i n k e r ) 相连， 并插入到噬菌体的表达载体上，从而使多肽或蛋白质与外壳蛋白融合并展示 在噬菌体的表面：被展示的多肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构和生物 活性。通过反复的亲和选择和扩增、可直接测定所展示的多肽或蛋白质的某 些生物活性并分离以带有目的基因的噬菌体。 在丝状噬菌体所编码的1 0 个蛋白质中、与噬菌体展示有关的主要蛋白质 是外壳蛋白p 3 相p 8 。外源基因插入到外壳蛋白基因或基因时、外源多肽 与p 3 或p 8 的n 端连接，能以融合蛋白形式展示在噬菌体的表面。外壳蛋白 p 3 位于噬菌体的最尾端、呈球形或线状：含4 0 6 个氨基酸。其c 端锚在外壳 上、n 端游离在外，外源多肽或蛋白质与p 3 的n 端连接后、可独立展示其结 构域。p 8 蛋白是噬菌体的主要外壳蛋白，位于噬菌体的外侧，含5 0 个氨基酸， c 端与d n a 结合，n 端伸出噬菌体外，外源小肽可与p 8 的n 端融合。融合蛋 白必须运送到细胞质膜上切除信号肽后，才能被组装而展示。 当以一组随机多肽编码序列或基因群插入噬菌体载体进行展示表达时， 其总体称为噬菌体展示文库( p h a g ed i s p l a yl i b r a r y ) 。在噬菌体展示文库中 的每一个噬菌体粒子只展示一种序列的外源肽链，不同噬菌体粒子展示不同 的序列的外源肽链。目前所获得噬菌体展示文库的最大容量均在1 0 9 左右，这 是受d n a 转化效率所限制的。 噬菌体展示技术中另一个重要环节，就是如何从噬菌体展示文库中高效 挑选出带有目的基因的重组噬菌体( f u s i o np h a g e ) ，这个过程称为淘选a 一 西南交通大学硕士研究生学位论文第4 页 般采用亲和选择方法，即利用在噬菌体表面上展示的多肽可与特定的选择体 进行亲和结合，从而得到分离。通常先将选择体固相化，如将选择体预先加 在一块9 6 孔板的孔中或预先结合在亲和柱上，然后使文库中重组噬菌体所展 示的目的多肽与固相化的选择体亲和结合。通过洗脱，即可收集到带有目的 多肽或蛋白质的重组噬菌体，并可利用这些噬菌体再感染大肠杆菌而得到进 一步扩增。通过一轮亲和结合一洗脱一扩增，即所谓“淘选”的富集过程， 就可富集约1 0 2 到1 0 3 倍，经过几轮“淘选”，可以从噬菌体文库中筛选到带 有目的基因的重组噬菌体。这是一种前所未有的高效快速选择方法。最后将 选择到重组噬菌体进行测序，读出该噬菌体所展示目的多肽或蛋白质的基因 编码序列和氨基酸序列。同时可从重组噬菌体d n a 中将目的基因切下，再克 隆到其它宿主细胞中、经表达以获得大量的目的多肽或蛋白质。 噬菌体展示技术的意义在于：它能按照空间结构互补关系从数量巨大的 多肽序列或多肽构象库中直接选择出任意所需要的对象：被选择的多肽展示 在噬菌体表面在获得多肽的同时也得到了编码该多肽的基因序列；用亲和 选择( a f f i n i t ys e l e c t i o n ) 代替筛选，被吸附的是亲和力强的融合噬菌体， 其余均被淘汰，故称为淘选，由此大大简化了分离多肽及其基因的过程。这 一过程与动物体内抗原对抗体克隆选择的原理相同，也与生物分子进化的自 然选择相类似。从本质上说，通过噬菌体展示技术选择特异蛋白和基因是对 生物获得信息过程的模拟。 1 3 1 3 噬菌体肽库技术的局限及展望 虽然噬菌体肽库技术已经得到极为广泛的应用。然而这一技术在纷繁复 杂的现代生物学研究课题面前仍然有其局限性。 首先，噬菌体肽库中肽的多样性并不是完全意义上的随机。其主要原因 来源于如下几点： 其一，丝状噬菌体仍然是依靠原核生物( 细菌) 作为宿主来进行复制和组 装，因此任何一个肽库的构建都首先要经历原核生物细胞内的层层筛选，也 就是说最后展示在噬茵体表面的肽不能对宿主细胞有毒害作用，而且也不能 影响噬菌体的组装和穿膜成熟过程。这一“自然”的筛选过程也就降低了库 的多样性。 其二，噬菌体肽库的建库过程仍然依赖于d n a 的转化，而目前最为有效 的电转化效率也只能达到lo 口一1 0 ”pgd n a 。 其三，本身噬菌体库的筛选过程也有一个灵敏度问题，对于多样性高于 西南交通大学硕士研究生学位论文第5 页 l o ”的库，是很难从中富集所要的噬菌体肽的。 “针对这一点，g e o r g ep s m i t h 。1 提出了利用亲和力成熟这一过程来弥补 这一缺陷。所谓的亲和力成熟是借用免疫学中的一个术语，即通过模拟多次 免疫反应过程中发生的体细胞突变和克隆选择的过程来达到分离高特异性和 高亲和力噬菌体肽的目的。其基本原理就是在体外通过对经过筛选得到的低 亲和力的一个或多个肽的序列中引入突变而构成一个突变体库，然后用同样 的目标蛋白对突变体库进行另外一轮的筛选，这样多次的交替进行之后，最 终得到高亲和力的噬菌体肽。其次，肽本身结构的单一性也限制了它在研究 复杂的蛋白质分子之间相互作用的应用。可以想象，单一的线性肽段是很难 模拟结构复杂的构象的。基于这一点，许多研究者通过加长肽的长度“。，从 而增加其结构的复杂性，或者将肽段固定于一定的结构域内而赋予肽以一定 的构象。在一定程度上缓解了这一技术的局限性。 噬菌体展示技术最为成功的一点也就在找到了丝状噬茵体这样一个相 对稳定而且便于对其进行一系列的遗传和生化操作的遗传载体。受这一思想 的启发，许多研究者已经开始尝试用其他的一些系统来代替丝状噬菌体作为 载体，希望能够超越目前的这一体系。例如： 噬菌体的组装成熟过程并不 是通过跨膜装配进行的，而是通过体内包装，然后裂解细菌而释放的，因而 对外源插入的蛋白质分子的耐受性要优于丝状噬菌体，目前已有人尝试用 噬茵体来取代丝状噬茵体作为载体嘲。另外，也有人尝试用酵母的结构蛋白 作为外源蛋白的插入载体而构成重组酵母库，从而赋予表达的蛋白以真核生 物表达产物的持点。尽管这一些思路值得探索和改进，但噬菌体肽库技术本 身不断的发展和完善，在生物学的诸多研究领域中都会产生更为广泛的影响。 1 3 2 重金属结合蛋白( 肽) 研究进展 重金属污染是全球关注的重要环境问题。针对重金属的生物修复技术， 因其特有的优势，越来越受到重视，其中一个重要的研究领域是利用金属离 子和金属结合蛋白或结合肽之间存在的强亲和能力特性进行的生物修复研 究。 生物细胞对金属离子形成了不同的防卫系统，如排斥、区域化作用或合 成金属结合蛋白等。研究发现在多种微生物、动物和植物细胞内普遍存在对 金属离子具有亲和能力的蛋白质( 肽) ，称为金属结合蛋白( 肽) ，它们可与 环境中的金属离子通过化学结合作用形成复合物而降低、富集或消除金属离 子对生物细胞的毒性。 西南交通大学硕士研究生学位论文第6 页 金属结合蛋白( 肽) 有多种研究和应用前景，如蛋白( 肽) 分子与金属 间相互作用、金属离子的溶出与提取、金属离子解毒研究等。金属结合蛋白 ( 肽) 的一个重要的应用领域是环境重金属污染的生物修复 ( b i o r e m e d i a t i o n ) 。消除环境中重金属污染的传统物理和化学方法等存在着 一些局限性，如成本高、效率地低、容易造成二次污染等，而生物修复的方 法可克服这些缺点。利用自然界天然存在的抗重金属生物( 如一些细菌、真 菌、藻类和植物) 进行生物修复往往难以达到预期的效果，通过基因工程技 术将金属结合蛋白( 肽) 展示在微生物表面或在植物细胞中表达，获得对重 金属离子具有高效结合能力的基因工程菌或植物，有望成为一种高效、经济、 方便的生物修复方法。 i 3 2 1 金属结合蛋白( 肽) 的结构特点和作用机理 金属结合蛋白( 肽) 最重要的结构特征是其富含h i s 、c y s 等氨基酸，前 者如用于蛋白亲和纯化的6 x h i s 标签或更长序列的h i s 标签、锌指结构蛋白、 以及从生物文库筛选获得的富含h i s 的高亲和力多肽，后者如金属硫蛋白 m t s ( m e t a l l o t h i o n e i n s ) 、锌指结构蛋白、人工合成的多肽等”3 。目前用于重 会属修复研究的会属结合蛋白( 肽) 主要来源于生物体、人工合成和生物文 库筛选获得。 大多生物都含有金属结合蛋白( 肽) ，如m t s ，金属硫蛋白样蛋白，金属 抗性调节蛋白，锌指结构蛋白等，其中以m t s 为代表的金属结合蛋白在结构、 机理研究等方面最为广泛和深入，而锌指结构蛋白则主要在结构和相互作用 研究方面有深入的报道。 1 9 5 7 年m a r g o s h e s 和y a l l e e 在研究马肾中c d 天然结合蛋白时发现并命 名m t s ，迄今为止，m t s 仍是唯一发现的天然含c d 2 + 的生物化合物。m t s 分子 量通常6 - 7 k d a ，富含c y s ( 2 0 3 0 9 6 ) ，通常不含芳香族氨基酸，普遍存在于动 物、高等植物、真核微生物及少数原核生物中。现在仍未了解清楚 g r s 在细 胞中的基本功能，普遍的共识是：盯s 可作为金属伴侣将金属转运到其它的 蛋白( 如锌指结构蛋白) 上，控制细胞内微量元素的浓度，为细胞躲避重金 属的伤害提供保护作用等嘲。盯s 存在两个功能结构域，其c y s 连接方式有固 定不变的重复特征：c y s - c y s 或c y s x - c y s 或c y s - x y - c y s ( x ，y 为除c y s 外 的任何氨基酸) ，c y s 在m t s 对金属离子的作用中发挥重要作用。不同来源的 m t s 根据c y s 的结构和含量的不同主要分为两类：1 ) 来自于动物，通常含有 6 1 个氨基酸，其中2 0 个c y s 残基；2 ) 来自于植物、藻类和真菌，称为植物 西南交通大学硕士研究生学位论文第7 页 螯和素( p h y t o c h e l a t i n s ，简称p c s ) 。天然p c s 的合成是一个酶反应过程( 图 卜1 ) ，其中c 矿是最强的诱导剂”。p c s 的基本结构为( 徭l u - c y s ) n x ( 见图 l - 2 a ) ，x 可为g l y 。s e r 或g l u ，n 因p c s 来源的物种和该物种所处的金属环 境不同而不同，在2 一l l 范围内，通常为2 - 4 肽。研究发现在m t s 与重金属的 结合过程中，c y s 起着最为重要的作用，c y s 数量越多，结合越牢固。w e o nb a e 等“”于1 9 9 7 年人工合成了p c 。的结构类似物e c 2 ( g l u - c y s ) 2g i y ，e c 2 与 i l p c m y n t h n o p t y t m 州a u n 图卜1p c s 的合成过程 f i g u r ei - is y n t h e s i so fp c s “0 1 天然p c 2 在氨基酸组成上相同，但在c y s 与g l u 的连接上存在结构差别，前 者为g i u ( 见图卜2 b ) ，后者为们l u ( 见图l - 2 a ) ，同时测定了b e 2 和p c 2 结合c 矿，h g ”，p b 2 + 的能力，结果表明，两者结合能力相同，g l u 结构上的差 别并不影响它们结合重金属的能力。类似物e c 2 可通过基因表达直接获得， 这为以( g l u c y s ) 2g l y 替代t ( g l u - c y s ) 2 g l y 研究p c 2 提供了极大的方便。w e o n b a e 等后来相继合成了e c 2 j e c 2 0 ，用于转基因植物的重金属脱毒研究。 除了c y s 的作用外，m t s 中氨基酸上的羧基在结合金属时也起着重要作 用。h i r o y u k i “”等2 0 0 1 年为了探讨p c s 中是哪一部分化学结构负责结合重金 属，人工合成了8 种富含c y s 的多肽( x - c y s ) ，一g l y ，x 分别为g l u ，a s p ，l y s ， g l y ，s e r ，g l n ，测定了8 种多肽对c d 2 + 的结合能力，结果为：p c s 中c y s 的一s h 多少对p c s 结合重金的能力起主要作用，羧基可增强多肽对金属离子的亲和 能力并对金属一蛋白复合物起稳定作用。 西南交通大学硕士研究生学位论文第8 页 a b 图卜2p c s 和e c s 的化学结构“” f i g u r e1 - 21 1 l es t r u c t u r eo fp g sa n de c s 【l o 】 计算机科学的发展，使得在分子水平通过计算机模拟来研究金属结合蛋 白和金属离子间的作用成为可能，关于这方面的研究报道较少。j a y n ac h a n 和z u y u nh u a n g 等4 1 2 0 0 2 年通过核磁共振( n 搬) 和扫描隧道显微技术等方法 探讨了小鼠肝脏的c d “- m t s 和z n l g r s 的结构，对金属一蛋白复合物中金属 和巯基结合键的长度、弯曲度、牵张力、蛋白折叠形式以及反应能量等进行 测量和计算，然后通过计算机软件模拟了l f f l s 的三维结构与m t s 和z n 2 + 结合 蛋白中金属结合位点结合金属的动力学行为。美国s c r i p p s 研究所在网上建 立了关于金属离子与蛋白( 多肽) 研究的专门生物信息学网站 ( h t t p ：m e t a l l o s c r i p p s e d u ) ，该网站提供了各