（果树学专业论文）平邑甜茶SnRK1基因的克隆、表达及其功能的研究.pdf

山东农业大学硕士学位论文 中文摘要 模式植物研究发现蔗糖非发酵1 型相关蛋白激酶1 在植物碳氮代谢 过程中有关键性开关的作用，为探讨s n r k i ( 蔗糖非发酵1 型相关蛋白激 酶1 ) 在果树碳氮代谢中的分子生物学功能，以水培平邑甜茶幼苗为试材， 克隆蔗糖非发酵1 型相关蛋白激酶1 的a 和p y 亚基的编码基因，同时采 用实时荧光定量p c r 研究a 和所亚基的编码基因表达量的变化，并构建 a 亚基的编码基因m h s n r k l 的正、反以表达载体，成功转化番茄，初步 研究了其生理生化功能，主要结果如下： 1 根据已知苹果s n r k l 的0 【亚基编码基因的e s t 序列，设计特异引 物利用r t - p c r 结合r a c e 技术获得了蔗糖非发酵1 型相关蛋白激酶1 的q 亚基的全长编码基因，命名为m h s n r k l ，g e n b a n k 注册号为 e f 6 9 0 3 6 2 ；并利用相同技术扩增到平邑甜茶s n r k l 的脚亚基编码基因的 片段，命名为m h a r a n z r 。序列分析表明，m h s n r k l 基因全长2 0 6 3b p ， 包含一个1 6 6b p 的5 端非编码区，1 5 4 8b p 的编码区共编码5 1 5 个氨基酸 和3 4 8b p 的3 端非编码区，预测分子量为5 8 7k d 。同时m h s n r k l 的氨 基酸序列分析显示该基因与拟南芥、黄瓜、番茄和烟草相比有8 2 8 8 的同源性；系统进化树分析显示，m h s n r k l 基因与黄瓜a 亚基编码基因 ( s n r k l ) 基因的同源关系最近。p 丫亚基的片段( m h a k n ，r ) 与已知蔗 糖非发酵1 型相关蛋白激酶1a k i n l 3 1 , 亚基编码基因具有较高同源性，故 进一步确定其为平邑甜茶蔗糖非发酵1 型相关蛋白激酶1 的a k r n l 3 r 亚 基编码基因片段。 2 。荧光定量p c r 分析q 和p 丫亚基的编码基因在不同组织的表达发 现，m h s n r k l 和m m r u n , e r 基因在平邑甜茶的根、茎、叶中均有表达， 且均在叶中的表达量最大。本文对这两个亚基的编码基因在不同环境条件 下在不同组织中的表达特性的研究结果显示：硝态氮处理抑制了 掀r 尉基因在叶、根中的表达；在p e g 处理下，m h s n r k l 的表达水平 在根中先上升( 2 4 小时) ，但4 8 小时后又恢复到初始状态：叶片中， m h s n r k i 的表达初期下降而4 8 小时后又上升到初始态；在硝态氮和p e g 处理下，m h a k i n f l r 表现出与m h s n r k l 相似的表达特性。外施硝态氮， 根中m u k i n & 转录水平2 4 小时内降低3 倍，4 8 小时后叶中也较低：在 平邑甜茶s n r k i 基因的克隆、表达及其功能的研究 p e g 处理下，朋m 脚的表达水平在根中先上升：叶片中，m h a k n , o r 的表达初期下降1 0 倍而4 8 小时后又上升到初始态。 3 为进一步研究平邑甜茶s n r k l 的生理生化功能，将蔗糖非发酵1 型相关蛋白激酶1 的c 【亚基的全长编码基因，构建了p b l l 2 1 m h s n r k l 正、反义表达载体，并对番茄进行农杆菌侵染的遗传转化。对转基因番茄 果实内含物进行测定后初步发现：与对照相比，正义转基因番茄果实中可 溶性总糖和淀粉含量最大升高分别3 0 和5 6 ；而正义转基因番茄果实 中有机酸和可溶性蛋白含量最大分别下降8 8 和7 6 。转基因植株果实 发育期比野生型提早1 0 天；果实直径在发育早期明显大于野生型。本研 究测定了转基因株系和野生型叶片中淀粉含量的日变化，白天结束时，转 基因株系叶片淀粉含量明显高于野生型，与野生型相比，t 2 5 株系中淀 粉含量升高1 0 5 。转反义基因的植株与野生型相比，无论在果实内含物、 果实发育期或叶片淀粉含量都没有明显变化。 关键词：平邑甜茶；硝态氮；p e g ；蔗糖非发酵1 型相关蛋白激酶 1 ；基因表达：转基因 2 山东农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t s n r k1c o m p l e xp l a y sak e yr o l ei nc a r b o na n dn i t r o g e nm e t a b o l i s m so f m o d l ep l a n t s u n d e rw a t e rc u l t u r ec o n d i t i o n ，w eh a v ec l o n e dt w os u b u n i t so f s n r k ic o m p l e xf r o mp i n g y i t i a n c h as e e d l i n g s t h ea i mo ft h i ss t u d yw a st o o b t a i nab e t t e ri n s i g h ti n t ot h ec h a r a c t e ro ft h es n r k lc o m p l e xs u b u n i t s e n c o d i n gg e n e s i n r e s p o n d t oe n v i r o n m e n t a l s i g n a l s a n di nc a r b o n m e t a b o l i s m si nf r u i tt r e e s t h e e x p r e s s i o np a t t e r n s o fm h s n r k la n d m h a k i n f l yi n d i f f e r e n tt i s s u e sa td i f f e r e n tc o n d i t i o n sw e r ea n a l y z e db y q u a n t i t a t i v er e a l - t i m ep c r 1 1 1 em h s n r k lg e n ed e r i v e df r o mp i n g y i t i a n c h a w a sh e t e r o l o g o u s l ye x p r e s s e di nt o m a t op l a n t st os t u d yt h eb i o l o g i c a lf u n c t i o n o f t h es i 脚( 1 1 i na na t t e m p tt oi s o l a t em h s n r k lg e n e ，t w oe s ts e q u e n c e sw e r eu s e d t od e s i g ng s p sf o r5 - r a c ea n d3 - r a c ei s o l a t i o no fm h s n r k l ；o n ee s t s e q u e n c ew a s4 3 3 - b p ( c n 4 4 5 6 4 8 ) a n dt h eo t h e rw a s4 6 6 - b p ( c x 0 2 4 4 0 5 ) a n a l y s i sr e v e a l e da2 0 6 3b ps e q u e n c eo b t a i n e db yr a c e w a st h ef u l l - l e n g t h c d n ao ft h em 幅n r k l ( m a l u sh u p e h e n s i sr e h d s n r k l ，e f 6 9 0 3 6 2 、g e n e t h en u c l e o t i d es e q u e n c eo f m h s n r k lc o n t a i n sa16 6 - b p5 - u n t r a n s l a t e dr e g i o n , a15 4 8 一b po p e nr e a d i n gf r a m ee n c o d i n gap r o t e i no f515a m i n oa c i d s 、析t l la m a s so f5 8 7k d a , a n da3 4 8 一b p3 - u n t r a n s l a t e dr e g i o n t h ed e d u c e da m i n o a c i ds e q u e n c eo fm h s n r k ls h o w e d8 2 3 4 ，8 7 5 7 ，8 6 0 2 ，8 4 0 8a n d8 2 1 4 i d e n t i t yt ot h ea r a b i d o p s i sa k i n io ，t o m a t ol e s n f l ，p o t a t os t s n f l ，t o b a c c o n p k 5a n dp e a ，b u ti te x h i b i t e do n l y6 6 6 7a n d6 6 2 2 i d e n t i t yt ot h eb a r l e y b k i n l 2a n dr y er k i n l n l ep h y l o g e n e t i ct r e es h o w e da 锄锄r k ，b e l o n g st o t h et y p e1 ( s n r k 1 ) s u b f a m i l yo ft h es n f l - r e l a t e dk i n a s e s ( e x e m p l i f i e db y a r a b i d o p s i sa k i n lo ) r a t h e rt h a nt h es n r k 2s u b f a m i l y ( e x e m p l i f i e db y a r a b i d o p s i sa s k l ) o rt h es n r k 3s u b f a m i l y ( e x e m p l i f i e db yw h e a tw p k 4 ) w ea l s op r o d u c eap a r t i a lp 丫s u b u n i t ( m h a k i n f l y ) 谢t h3 - r a c e a f t e ra 10 0 - f o l dd i l u t i o no ft h ef a s tp c rp r o d u c t ，t h ep r o d u c tw a su s e df o ras e c o n d p c rw i t ht h ep r i m e ro fs n 3 2 ，f r o mw h i c hay - r a c e1112 一b pf r a g m e n tw a s o b t a i n e d a n a l y s i so ft h i sf r a g m e n ts h o w e di t sn u c l e o t i d es e q u e n c ew a sh i g h l y 3 平邑舌计茶s n r k l 基因的克隆、表达及其功能的研究 c o n s e r v e d w i t ht h o s ei no t h e rp l a n ts p e c i e s ( i n c l u d i n gf r a g m e n t so fa p p l e ， m a i z ea n dm e d i c a g ot r u n c a t u l a ) t h e r e f o r e ，t h i sf r a g m e n tw a sc o n s i d e r e da p i n g y i t i a n c h aa k i n f l yh o m o l o g u ea n dw a sd e s i g n a t e da sm h a k i n f l y 2 e x p r e s s i o no fm h s n r k a n dm h a k i n f l yg e n e sw a ss t u d i e di nl e a v e s ， s t e m sa n dr o o t so ft w o - w e e k - - o l dp i n g y i t i a n c h as e e d l i n g sb yq u a n t i t a t i v e r e a l t i m ep c ra n a l y s i su s i n gs u b u n i t - s p e c i f i cp r o b e s a nr l8 sg e n ew a su s e d a sa ni n t e r n a ls t a n d a r d n er e s u l t sr e v e a l e dt h a tt r a n s c r i p t so fm h s n r k a n d m h a k i n f l ? w e r ed e t e c t e di na l lt i s s u e sa n a l y s e d ，b u tt h et w og e n e se x p r e s s i o n d i f f e r e da m o n gr o o t ，s t e ma n dl e a ft i s s u e s h i g h e rl e v e l so fm h s n r k l t r a n s c r i p t sw e r ee x p r e s s e di nl e a ft i s s u er e l a t i v et ot h er o o ta n ds t e m s i m i l a r e x p r e s s i o np a t t e r n s w e r eo b s e r v e df r o mm h a k i n f l ? ，晰mt h eh i g h e s t t r a n s c r i p t i o n a ll e v e la l s oo c c u r r i n gi nl e a ft i s s u e t ou n d e r s t a n dt h es h o r t - t e r m e f f e c t so fn i t r o g e na n do s m o t i cs t r e s so ne x p r e s s i o no fm h s n r k lo r m h a k n f l y ，t r a n s c r i p t i o n a ll e v e l si nd i f f e r e n tp l a n tt i s s u e sw e r em o n i t o r e db y q u a n t i t a t i v er e a l t i m ep c ra n a l y s i sd u r i n gi n d u c t i o nb yn 0 3 。a n dp e g w a t e r s t r e s s c o n t r o lp l a n t st r e a t e dw i t hk c lo rg r o w ni nn o r m a ln u t r i e n t se x h i b i t e d n e a r l yc o n s i s t e n tl e v e l so f 砌砌r 肼o rm h a k i n f l yf r o m0t o4 8h ，n l en 0 3 。 d o e sn o ta f f e c t 施岛龌k ，e x p r e s s i o na se a r l yi nl e a r , y e ti ti n h i b i t s 胁s h 足朋 e x p r e s s i o na f t e r4 8h m e a n w h i l e ，n 0 3 f e e d i n gr e d u c e sm h s n r k ie x p r e s s i o n 5 - f o l di nr o o tw i t h i n2 4h ，b u tt h et r a n s c r i p tl e v e l sr a i s et oc o n t r o ll e v e l sa f t e r 4 8h u n d e rp e gw a t e rs t r e s s ，a 彻跏尼豳m r n al e v e l si n c r e a s e di nr o o t s w i t h i n2 4hb u tt h e nd e c l i n e dt ot h el e v e l so fc o n t r 0 1a f t e r4 8 h i nl e a v e s ， m h s n r k le x p r e s s i o nd e c r e a s e da se a r l y , a n dt h e ni n c r e a s e da f t e r4 8h i n t e r e s t i n g l y , m h a k n f l ? e x h i b i t sas i m i l a re x p r e s s i o np a t t e r na sm h s n r k l d u r i n gt h en 0 3 a n dp e gt r e a t m e n t w h e nk n 0 3w a sr e s u p p l i e d ，p m m k i n f l y t r a n s c r i p t s ，d e c r e a s e3 f o l di nr o o tw i t h i n2 41 la n dl o wi nl e a fa f t e r4 8h c o m p a r e d 、航t l lt h ec o n t r 0 1 a13 - f o l di n d u c t i o no f p m m k i n f l ? e x p r e s s i o nw a s d e t e c t e da f t e rp e gt r e a t m e n tf o r2 4hi nr o o t a n dt h e nt h et r a n s c r i p tl e v e l s d e c l i n e dt ot h el e v e l so fc o n t r o la f t e r4 8 h m h a k i n f l yt r a n s c r i p t si nl e a r d e c r e a s e d1o f o i dw i t h i n2 4 hc o m p a r e dw i t ht h ec o n t r 0 1 4 山东农业大学硕士学位论文 3 i no r d e rt od e t e r m i n e d e v e l o p m e n to fp l a n t sc e l l ， m h s n r k i g e n e i ns e n s e t h ef u n c t i o no fm h s n r k li ng r o w t ha n d ac o n s t r u c tc o n t a i n i n gf u l l l e n g t he d n ao f a n da t i s e n s eo r i e n t a t i o nd r i v e n b y t h e c o n s t i t u t i v e c a u l i f l o w e rm o s a i cv i r u s3 5 sp r o m o t e rw a sa s s e m b l e da n d i n 仃o d u c e di n t ot o m a t o t h eq u a l i t yo ft h et r a n s g e n i ct o m a t of r u i t sw a sa l s o a n a l y s i s - c o m p a r e dw i t ht h ew i l d t y p e t 1 1 es o l u b l es u g a ra n ds t a r c hl e v e l so f t h et r a n s g e n i cp l a n tf r u i tw e r ei n c r e a s e db ya p p r o x i m a t e l y2 0 3 0 a n d 4 4 一5 6 。r e s p e c t i v e l y o r g a n i ca c i da n dt o t a ls o l u b l ep r o t e i nw e r e4 4 8 8 a n d55 - 7 6 o ft h ec o n t r o lc o n c e n t r a t i o n s r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t si n d i c a t e m h s n r k lh a so b v i o u se f f e c t so nt h eq u a l i t yo ft h et o m a t o o u rr e s e a r c ha l s o s h o w e dt h a tt h ef i u i td i a m e t e ro ft h et r a n s g e n i cp l a n t sw a sm u c ht h i c k e ra tt h e e a r l ys t a g e so ff r u i td e v e l o p m e n tt h a nt h ew i l dt y p e ，b u tw e r es i m i l a ra tl a t e r s t a g e s ；t h et r a n s g e n i cf r u i tr i p e n e dt e nd a y se a r l i e rt h a nw i l dt y p ef r u i t t h e s t a r c hc o n t e n to ft h el e a ff r o mt r a n s f o t r u a n t sw a sa s s a y e d w ef o u n dt h a tt h e s t a r c hc o n t e n ti nt r a n s g e n i cl i n e sw a sh i g h e rt l l a nw i d et y p ei nl e a fa tt h ee n d o ft h ed a y ，f o re x a m p l e ，t h es t a r c hc o n t e n ti nt 2 5t r a n s g e n i cl i n ew a s i n c r e a s e db v10 5 c o m p a r e dw i t ht h a ti nt h ew i d e t y p e k e y w o r d s ：m a l u sh u p e h e n s i sr e h d ；n i t r a t e ；p e g ；s n r k lc o m p l e x ；g e n e e x p r e s s i o n ；t r a n s g e n e 英文缩写符号及其中英文对照表 英文缩写英文名称 中文名称 a m p a m p i c i l l i n 氨苄青霉素 c a m v 3 5 s 3 5 sp r o m o t e ro fc a u l i f l o w e rm o s o i c 花椰菜花椰病毒 v i r u s3 5 s 启动子 b p e d n a c t a b d d h 2 0 d e p c d n a d n t p d t t e c o l i e b e d l a k a n l b m o p s m r n a m s n a 3 p 0 4 n a o a c p b s p v p 鼬f r n a r n a s e a r p m r r - p c r s d s s t e t b a s ep a i r碱基对 c o m p l e m e n t a r yd n a c e t y l t r i m e t h y l a m m o l l o n i u m b r o m i d e d i s t i l l e d a n td e i o n i z e dw a t e r d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d e o x y 曲o n u c l e i ca c i d d e o c y f i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e d i e t h i o t h r e i t 0 1 e s c h e r i c h i ac o l i e t l l i d i u mb r o m i d e e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d k a n a m y c i n l u r i a - b e r t a n im e d i u n l 3 - ( n - m o r p h p l i n o ) p r o p a n e s u l f o n i c m e s s a g er n a m u r a s h i g ea n ds k o o gm e d i a s o d i u mp h o s p h a t e s o d i u ma c e t a t e p h o s p h a t eb u f f e r p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e r i f a m p i c i n p d b o n u c l e i ca c i d r i b o n u c l e a s ea r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e r e v e r s et r a n s c r i p t a t i v ep c r s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s o d i u mc h l o r i d e ，t r i s h c l ，e d t ab u f f e r 互补d n a 十六烷基三乙基 溴化铵 重蒸水 焦碳酸二乙酯 脱氧核糖核酸 脱氧核糖核苷三 磷酸 二硫苏糖醇 大肠杆菌 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 卡那霉素 l b 培养基 3 - n 吗啉代丙磺 酸 信使r n a m s 培养基 磷酸钠 醋酸钠 磷酸缓冲液 聚乙烯毗咯烷酮 利福平 核糖核酸 核糖核酸酶a 转分钟 反转录p c r 十二烷基硫酸钠 n a c l ，t r i s h c l e d j 力 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所 取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个 人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同 意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术 信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并向 社会公众提供信息服务。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：燮 导师签名：召盔妇 日 期：挚丛 平邑甜茶s n r k l 基因的克隆、表达及其功能的研究 l 前言 植物感受糖信号及调控碳代谢的相关机制是比较复杂的。已有研究发 现蔗糖非发酵一1 一型相关蛋白激酶一1 ( s n r k l ) 在植物糖信号转导和代谢途 径中可能发挥着关键性开关的作用( h a l f o r d 等，2 0 0 3 ；l u 等，2 0 0 7 ) ， s n r k l 可直接在转录水平上调控蔗糖合成酶( s s ) 基因的表达而控制碳 水化合物代谢( p u r c e l l 等，19 9 8 ) ，而且还可通过磷酸化作用调节一些重 要的代谢酶活性，如3 一羟基一3 甲基戊二酰一辅酶a 还原酶( h m g c o a 还原酶) 、磷酸蔗糖合成酶( s p s ) 和硝酸还原酶( n r ) ( s u g d e n 等，1 9 9 9 ； h a l f o r d 等，2 0 0 4 ) 。目前已先后在拟南芥、马铃薯、苜蓿、烟草、番茄等 植物中克隆到了s n r k l 基因或片断。研究发现，马铃薯s n r k l 基因超表 达后，结果转基因植株块茎中a d p 葡萄糖焦磷酸化酶( a g p a s e ) 和蔗糖 合成酶( s s ) 活性显著提高；淀粉含量显著增加( m c l d b b i n 等，2 0 0 6 ) 。 苜蓿s n r k l 亚基编码基因被敲除后，植物不能适应正常的光暗周期，这 是因为该基因被敲除后，植物合成淀粉能力下降的缘故( t h e l a n d e r 等， 2 0 0 4 ) 。蛋白激酶s n r k l 对上述几种具有重要生理效应的底物酶活性均有 调节作用，这为人们协同调控糖、氮化合物及多种次生代谢物的代谢提供 了新的思路。 1 1 酵母中蔗糖非发酵蛋白激酶及动物中的同源基因 诱导酵母菌( s a c c h a r o m v c e sc e r e v i s i n e ) 反应最有效的糖是葡萄糖，当 葡萄糖水平达到一定浓度时，很多基因表达关闭；缺乏葡萄糖时，这些基 因表达又开启。一种称为蔗糖非发酵的蛋白激酶( 源于缺乏它的酵母细胞 不能利用蔗糖而首先分离出来，简称s n f l ) ，其活性在有葡萄糖时受抑制， 并对所有已知的葡萄糖依赖性抑制效应起调控作用，且是这一途径的关键 性开关( c e l e n z aa n dc a r l s o n ，19 8 6 ) 。s n f l 不仅有调节编码碳水化合物 代谢酶基因表达的功能，还能调节大量代谢酶，如乙酰辅酶a 羧化酶( a c c ) 和糖原合成酶等活性。在动物中已鉴定出与s n f l 相似的蛋白激酶，称为 a m p 一活性蛋白激酶( a m p k ) 。实际上，这两种蛋白激酶是种三聚复 合体，而s n f l 和a m p k 只是该三聚复合体中起相关催化作用的亚基。 在酵母菌中，该三聚复合体的第二个亚基为s n f 4 ，起全能调控作用 山东农业大学硕士学位论文 ( c e l e n z a 等，1 9 8 9 ) 。葡萄糖可以调控s n f l 和s n f 4 之间的相互关系 ( j i a n ga n dc a r l s o r t ，1 9 9 6 ) ( 图11 ) 。该三聚复合体的第三个亚基为一 组蛋白，包括有s i p i 、s i p 2 和g a l 8 3 ，这三个蛋白可以在三聚复合体中 相互替换主要作用是为该三聚复合体寻找合适的底物( y a n g 等，1 9 9 4 ) 。 这三个蛋白都含有两个保守的区域，一个是a s c ( s n f l 三聚复合体联系 区) 区域，主要与三聚复合体相结合；另一个是k i s ( 激酶作用序列) 区 域，主要与激酶的作用底物相结合( y a n g 等，1 9 9 4 ) 。在动物中这三个 亚基有一组非常有顺序的名字，a m p k ，h m v r ：p 和a m p k v ，其中a 亚 基与s n f l 作用相似，b 亚基与s i p i 、s i p 2 和g a l 8 3 作用相似，t 亚基 与s n f 4 作用相似( w o o d s 等，1 9 9 6 ) 。动物中的a m p 活性蛋白激酶可 被a m p 所磷酸化，也可被上游因子所激活，由a m p 控制的a m p k 的活 性被高浓度a t p 和高水平的a m p ：a t p 比例( 这是细胞低水平能量的症状) 所调节。正因如此，a m p k 被看作细胞动力的标尺( w o o d s 等。1 9 9 6 ) 。 图1 1 酵母中s n f i 三聚复合体各亚基在不同葡萄糖水平下的相互作用 ( h a l f o r d 等，2 0 0 3 ) f i g1 1t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ns u b u n i t so f y e a s ts n f ic o m p l e x e si n c o l 2 d i t i o n so f h i g ha n d l o w g l u c o s e 1 2 植物中蔗糖非发酵蛋白激酶的同源基因 植物中已鉴定出与s n f l 和a m p k a 相似的蛋白激酶，称为s n r k 甲邑甜茶s n r k l 基因的克隆、表达及其功能的研究 ( s n f l 相关蛋白激酶) 。s n r k 蛋白激酶可分为3 个亚族( s n r k l 、2 、 3 ) ，其中s n r k l 与s n f l 在结构功能上的亲缘关系最近。s n r _ k 2 和s n r k 3 亚族只在植物中存在而且保守性不强。小麦中s n r k 2 亚族包括p k a b a i 基因，该基因参与了a b a 诱导的基因表达( g o m e z c a d e n a s 等，1 9 9 9 ) 。 拟南芥中s n r k 3 亚族包括有s o s 2 基因，该基因参与了拟南芥的抗盐作 用( h a i r i e r 等，2 0 0 0 ；l i u 等，2 0 0 0 ) 。 1 9 9 1 年，植物中第一个s n r k i 基因从黑麦中分离得到( a l d e r s o n 等， 1 9 9 1 ) ，它编码一个相对分子量为5 7 7 k d a 含5 0 2 个氨基酸的多肽链，与 酵母和动物中的同源基因s n f l 和a m p k a 有4 2 4 5 的同源性。目前， s n r k l 亚族的一些成员已在多种模式植物拟南芥和黑麦、大麦、马铃薯、 甜菜、小麦及烟草等一些重要的作物中相继被发现，并且可能存在于所有 植物中( h a i f o r da n dh a r d i e ，19 9 8 ；h a l f o r d 等，2 0 0 3 ) 。禾本科植物中，s n r k l 亚族氨基酸序列的相似性和表达模式的差异又可分为两组：s n r k l a 和 s n r k l b 。s n r k l a 在植物整个发育期中都有表达，与双子叶植物中s n r k l 很相似；s n r j ( 1 b 在种子中表达水平很高，但在植株其他部位表达水平相 对较低，而且该基因只在单子叶植物中存在( h a l f o r da n dh a r d i e ，1 9 9 8 ) 。 植物中与s n f 4 和a m p k r 相关的同源基因，利用s n f 4 突变体功能 互补法已在拟南芥中得到( k l e i n o w 等，2 0 0 0 ) 。植物中还至少含有两个 与s n f 4 和a m p k y 相似的蛋白家族( p v 4 2 家族和s n i p l 家族) ( h a l f o r d 等，2 0 0 3 ) ，这两个蛋白家族只在植物中存在，但是其具体功能目前并未知 晓。目前玉米中发现一种与s n f 4 和a m p k 丫相关的同源基因，该基因被 命名为a g 斟l h ( 图1 2 ) 。a i c i n l h , 与s n f 4 a m p k 7 蛋白很相似，但是 却含有与s i p l s i p 2 g a l 8 3 a m p k l 3 中的k i s 域很相似的但是n 末端被延 伸了的区域，而在c 末端却含有与s n f 4 和a m p k t 相似的结构，功能分 析显示出a k i n b y 保留了许多保守性的功能，例如均有可以弥补酵母菌 s n f 4 突变体中s n f 4 的能力。 用n o r t h e m 技术分析玉米z ma k i n p 丫1 和一2 基因的表达情况，结果 显示：在根茎叶中有相似的强度表达，用r t - p c r 试验分析也显示出z m a k r n p r - i 和z ma k i n 所2 基因的表达是处于相似水平的。研究发现z m a k i n p 丫的表达主要集中在胚胎发生期，在幼胚表达也很高，而在成熟晚 山东农业大学硕士学位论文 期表达相当低。也有报道研究了不同环境刺激素对z m a r d n 3 丫表达的影 响，但是没有一项试验( 热胁迫，冷胁迫，水胁迫和盐胁迫) 可以显著诱 导z ma k i n p r 的转录水平的增加，因此，可能z ma k i n p 丫1 和2 主要功 能是起控制作用，就像酵母菌中s n f 4 和动物中a m p 研一样，由s n f 4 和a m p k 7 复合物来对压力做出调制，而非自身通过转录来调控相关基因 ( k l e i n o w 等，2 0 0 0 ) 。有研究验证z ma k i n 阮, 1 和2 蛋白功能具有较高保 守性，在酵母上作了一个互补试验，用来检测z m a r d n 融, 1 和2 修补葡 萄糖依赖型a s n f 4 2 突变体细胞的能力。a s n f 4 2 细胞中分别含有 z ma k i n p 7 - 1 和2 和全长a t s n f 4 ，在3 0 度条件下在含有葡萄糖或甘油 的培养基中同时健康的生长，它们可控制细胞只能在含有葡萄糖的培养基 中生存，因此，a _ v d n l 3 丫和s n f 4 有极其的相似性，以代替s n f 4 来维持 葡萄糖饥饿下的酵母菌细胞。这主要是由于z m a k i n 阶1 和2 中含有与 s n f 4 相似的序列，如果删除其k i s 域，z m a k n l 3 丫1 和2 依旧可拯救 a s n f 4 2 突变体的生存( k l e i n o w 等，2 0 0 0 ) 。 a c t i v e il o wr l u c o s e s i p l ，s i p 2 ，g a l 8 3 圆圆 s 图1 2 酵a i 和t i , 米中三聚复合体亚基相互作用比较模型( k l e i n o w 等，2 0 0 0 ) f i g 1 2c o m p a r a t i v em o d e l sf o rs u b u n i t si n t e r a c t i o ni nt h es n f 1c o m p l e xi n y e a s ta n dm a i z e 植物中s i p l s i p 2 o a l 8 3 a m p k l 3 的同源基因也已经在拟南芥( a k n f l l 9 平, g n t 茶s n r k l 基因的克隆、表达及其功能的研究 和a k i n j 3 2 ) 和马铃薯( s t u b g a l 8 3 ) 中克隆得到( b o u l y 等，1 9 9 9 ；l a k a t o s 等，1 9 9 9 ) 。a k i n l 3 1 和a k i n 3 2 在双杂交中可与植物中s n r k l 相互作用， 也可与酵母s n f l 和s n f 4 相互作用( b o u l y 等，1 9 9 9 ) 。 1 3 植物蔗糖非发酵1 型相关蛋白激酶- 1 ( s n i 1 ) 作用底物及活性调控 第一个作为s n r k l 基因底物而被确认的植物蛋白是拟南芥中的 h m g 辅酶a 还原酶( h m g c o a ) ( d a l e 等，1 9 9 5 ) 。在拟南芥h m g 辅酶 a 还原酶中h m g l 的磷酸化作用位点位于丝氨酸5 7 7 位置处，磷酸化可 导致该酶的失活。另外两种重要的酶蔗糖磷酸化酶( s p s ) 和硝酸还 原酶( n r ) ( b a c h m a n n 等，1 9 9 6 ；d o u g l a s 等，1 9 9 5 ；s u 等，1 9 9 6 ) 在体外环 境中已确认是s n r k l 的底物。像h m g 辅酶a 还原酶一样，磷酸化作用 也导致了这两种酶的失活，但是硝酸还原酶的失活需要1 4 3 3 蛋白质结 合于磷酸化位置才可起作用( b a c h m a n n 等，1 9 9 6 ；m o o r h e a d 等，1 9 9 6 ) 。这 三种代谢酶经过s n r k l 磷酸化后影响自身的