（化学工程专业论文）固定化脂肪酶在有机相中催化反应.pdf

中文摘要 固定化脂肪酶催化有机介质中的反应是近年来酶工程领域的新技术。本文对 来源于仍出幽r u g o s a 的脂肪酶进行了固定化，优化了固定化的条件，研究了 固定化酶的活性和稳定性以及催化酯化反应的动力学。 采用吸附法，对八种树脂载体进行筛选，酶活实验结果表明，大孔吸附树脂 a b 8 性能最优。脂肪酶固定化的实验结果表明，缓冲液最佳p h 为7 2 ，最适 温度为3 0 ，最佳固定化时间为l h ，载体：酶= 1 0 ：1 ，即0 3 9 树脂固定3 0 m g 酶 粉。 以月桂酸与月桂醇的酯化为模型反应，考查了固定化酶催化反应的影响因 素。结果表明，异辛烷为最适有机溶剂，最佳含水量为5 0ul ，最优反应温度为 3 0 ，在1 8 0 r p m ，反应时间2 4 小时，月桂酸的转化率达到8 1 。考查了固定化 酶的稳定性。结果表明，酶固定化后，热稳定性显著提高，在6 0 下，固定化 酶的残余活性为6 8 ，而游离酶仅为3 2 。固定化酶的重复利用性良好，在重 复使用1 0 次后，酶活仍保持5 0 8 。将固定化酶分别在4 ，3 0 ，4 0 。c 下放 置3 5 天，保留的活力分别是原来的7 4 3 ，5 1 6 和4 3 o ，4 。c 下保存较好。 以异辛烷中月桂酸与月桂醇的酯化为模型反应，研究了固定化酶催化酯化反 应的动力学。结果表明，固定化酶催化的酯化反应符合单底物醇抑制的乒乓b i b i 机制。在最适条件下的动力学参数为：最大反应速率v m a x o 0 8 9m m 0 1 m i n d g - 1 ， 月桂酸和月桂醇的米氏常数k m 。l a ，、k m 。d l ，分别为2 1 4 m m 和5 9 6 m m 。 关键词：脂肪酶，固定化，酯化，有机溶剂，稳定性，动力学 a b s t r a c t i m m o b i l i z a t i o no fl i p a s ef o rc a t a l y z i n gi no r g a n i cs o l v e n t si san o v e lt e c h n i q u e r a p i d l yd e v e l o p e di nr e c e n ty e a r s t h es t a b i l i t yo ft h ee n z y m ew a ss i g n i f i c a n t l y i m p r o v e da f t e ri m m o b i l i z a t i o n i nt h i st h e s i s ，t h el i p a s ef r o mc a n d i d ar u g o s aw a s i m m o b i l i z e di n o r g a n i cs o l v e n t ，o p t i m i z e dc o n d i t i o na n d p r e p a r a t i o n f o r i m m o b i l i z a t i o n ，a c t i v i t ya n ds t a b i l i t yo ft h ei m m o b i l i z e dl i p a s ea n dk i n e t i c so f e n z y m a t i cr e a c t i o n sw e r es t u d i e d t h ee x p e r i m e n tf i r s tf i l t e r e d e i g h tk i n d so fc a r r i e r s ，s e l e c t e dm a e r o p o r o u s a d s o r p t i v er e s i na b - 8a st h ec a r r i e ri m m o b i l i z i n gl i p a s e t h ei m m o b i l i z a t i o nm e t h o d s ， c a r r i e r sa n dc o n d i t i o n sw e r es t u d i e d t h es t u d i e so ni m m o b i l i z a t i o nc o n d i t i o n s s h o w e dt h a tt h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o no fb u f f e rw a s7 2 ，t h eb e s tt e m p e r a t u r ew a s 3 0 c ，t h et h eo p t i m a lr e a c t i o nt i m ea n dr a t i oo fc a r r i e rt ol i p a s e w e r el ha n d1 0 ：1 r e s p e c t i v e l y t h ee f f e c t so fv a r i o u sc o n d i t i o n so na c t i v i t yo ft h ei m m o b i l i z e dl i p a s ew e r e i n v e s t i g a t e dt a k i n gt h ee s t e r i f i c a t i o no fl a u r i ea c i da n dl a u r y la l c o h o li no r g a n i c s o l v e n t sa sam o d e lr e a c t i o n i tw a sf o u n dt h a ti s o o c t a n ew a st h eb e s ts o l v e n t t h e o p t i m a lp hf o rp r e p a r a t i o no ft h ei m m o b i l i z e dl i p a s ew a s7 2 a n dt h eo p t i m a l r e a c t i o nr o t a t ew a s18 0 r p m ，i n i t i a lw a t e rc o n t e n tw a s 5 0 l a l t h er e a c t i o nw a ss t i r r e d w i t hf o r2 4 ha t3 0 c ，e s t e r i f i c a t i o nr a t eo fl a u r i ea c i dw a s8 1 t h ec h a l a c t e r i s t i c so f i m m o b i l i z e dl i p a s ew a si n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e di tw a sm o r es t a b l et h a nf r e e l i p a s ei nh i g ht e m p e r a t u r e ，t h er e s i d u a la c t i v i t yo fi m m o b i l i z e dl i p a s ea n df r e el i p a s e w e r e6 8 a n d3 2 r e s p e c t i v e l y a f t e rb e i n gr e u s e df o r10c y c l e s ，t h er e m a i n i n g a c t i v i t yo fi m m o b i l i z e dl i p a s ew a sa b o u t5 0 8 a f t e r3 5d a y sr e s e r v e di n4 ，3 0 c ， a n d4 0 。c ，t h er e s i d u a la c t i v i t i e so fi m m o b i l i z e dl i p a s ew e r e7 4 3 。51 6 和4 3 0 r e s p e c t i v e l y t h ek i n e t i c so fe s t e r i f i c a t i o no fl a u r i ea c i da n dl a u r y la l c o h o lc a t a l y z e db vt h e i m m o b i l i z e dl i p a s ei ni s o o c t a n ew a si n v e s t i g a t e d t h er e a c t i o nw a sf o u n dt of o l l o w t h e p i n g - p a n gb i b im e c h a n i s mw i t ha ni n h i b i t i o nb ya l c o h 0 1 t h ek i n e t i cp a r a m e t e r s u n d e rt h eo p t i m a lr e a c t i o nc o n d i t i o n sw e r eo b t a i n e d t h em a x i m u m r a t e ( v i m ) w a s 0 0 8 9m m 0 1 m i n 9 1 t h em i c h a e l i sc o n s t a n t so fl a u r i ea c i d ( k m ( l a ) ) a n d l a u r y la l c o h o l ( k m ( d l ) ) w e t e2 1 4 m l v la n d5 9 6 m m ，r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：l i p a s e ，i m m o b i l i z a t i o n ，e s t e r i f i c a t i o n ，o r g a n i cs o l v e n t ，s t a b i l i t y , k i n e t i c s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得苤鲞盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 果翻 签字日期： 矽吖年月二甲日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤鲞盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权墨鲞盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 采丽 导师签名： 夕 、 ， 名复鸣 签字日期：砷年f 月二中日签字日期：叼年f 月中日 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 第一章文献综述 酶是一类由生物细胞产生的具有促化功能的蛋白质，作为一种生物催化剂， 酶参与生物体内的各种代谢反应，而反应后其数量和性质不发生变化。同一般化 学催化剂相比具有催化效率高、专一性强和反应条件温和等优点，已在食品、轻 工、化工、医药、环保、能源和科研等各个领域得以广泛应用。 虽然酶在生物体内能够催化许多化学反应，但用作工业催化剂仍存在缺陷。 因为酶是由蛋白质组成，其高级结构对所处的环境十分敏感。一般情况下，对热， 强酸，强碱，有机溶剂等均不稳定，在反应中容易失活。而且酶中常有杂蛋白及 有色物质，造成产物分离提纯困难，限制了酶促反应的广泛应用。本世纪六十年 代发展起来的酶固定化技术既克服了上述不足，又在一定程度一k 保持了酶特有的 催化活性，从而成为生物技术中最为活跃的研究领域之一【l 】。 酶的固定化，是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有 的催化反应，并可回收及重复使用的一类技术。大多数酶在固定化后稳定性增强， 表现在对变性剂和抑制剂的抵抗力及热稳定性增加，从而减轻了对酶的破坏作 用。1 9 5 3 年m b h o f e r 和s o h l e i t h 首先将羧肽酶、淀粉和糖化酶、胃蛋白酶和核糖 酸酶等用重氮化聚氨基聚苯乙烯树脂进行固定，从2 0 世纪6 0 年代起，固定化酶 的研究迅速发展，现在此项技术已由原来的单一固定化酶、固定化微生物细胞发 展到动植物细胞、组织器官、微生物孢子【2 】、细胞与酶【3 】、好氧微生物细胞与厌 氧微生物【4 】的混合固定化。 固定化酶与游离酶相比，具有下列优剧5 j ： ( 1 ) 固定化酶可重复使用，酶的使用效率得到提高，使用成本降低，尤其适 合使用贵重酶的情况； ( 2 ) 固定化酶极易与反应体系分离，可获得不被酶污染的、纯度较高的生成 物，简化了提纯工艺，产率较高，产品质量较好； ( 3 ) 在多数情况下，酶在固定化后稳定性得到较大提高，可较长时间地使用 储藏： ( 4 ) 固定化酶具有一定的机械强度，可以搅拌或装柱的方式作用于底物溶 液，使反应过程能够管道化、连续化和自动化； ( 5 ) 酶的催化反应过程更易控制。例如，当使用填充式反应器时，底物不与 酶接触，即可使酶反应中止； 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 ( 6 ) 比溶液酶更适合于多酶体系的使用，不仅可利用多酶体系中的协调效应 使酶催化反应速度大大提高，而且还可以控制反应按一定顺序进行； ( 7 ) 辅酶固定化和辅酶再生技术，将使固定化酶和能量再生技术或氧化还原 体系合并使用，从而扩大其应用范围。 1 1 固定化酶研究进展 1 1 1 固定化酶制备 固定化酶的应用目的、应用环境各不相同，而且可用于酶固定化制各的物理、 化学手段、材料等多种多样。制备固定化酶要根据不同情况来选择不同的方法， 但是无论如何选择，确定什么样的方法，都要遵循以下几个基本原则 6 1 ： ( 1 ) 必须注意维持酶的催化活性及专一性。酶蛋白分子的活性中心是酶的催 化功能所必需的，酶蛋白分子的空问构象与酶活力密切相关，因此在酶的固定化 过程中，必须注意酶活性中心的氨基酸残基不发生变化。而且要尽量避免那些可 能导致酶蛋白高级结构破坏的条件，如高温、强酸、强碱、有机溶剂等处理酶。 由于酶蛋白的高级结构是凭借氢键、疏水键和离子键等弱共价键维持，所以固定 化时要采取尽量温和的条件，尽可能保护好酶蛋白的活性基团； ( 2 ) 固定化应该有利于生产自动化、连续化。为此，用于固定化的载体必须 有一定的机械强度，不能因机械搅拌而破碎或脱落； ( 3 ) 固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不防碍酶与底物的接近，以提高 产品的产量； ( 4 ) 酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收储藏，利于反复使用； ( 5 ) 固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、产物或反应液发生化 学反应： ( 6 ) 固定化酶成本要低，以利于工业使用。 1 1 2 固定化方法 1 1 2 1 吸附法( a d s o r p t i o n 、) 吸附法是利用离子键、物理吸附等方法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖 类或多孑l 玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。它是最早的酶固定化方法， 世界上第一个工业化的固定化酶即是d e a e - - s e p h a d e x - - a 2 5 吸附的氨基酰化 酶，工艺简便及条件温和是其显著特点，其载体选择范围很大，涉及天然或合成 的无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶失活后可重新 天津大学硕士学位论文 第一章文献综述 活化，载体可以再生。国内科研人员选择不同的载体，进行了很多研究。k a m a t a 【7 】等在恒温3 0 c 、2 4 h 条件下的水溶液中，将胰蛋白酶和口淀粉酶固定在珠状糖 基蛋白上，实验过程无任何化学改性，所获得的固定化酶相对于固定在阴离子交 换剂( 器) 或脱乙酰几丁质上的酶，有较长的生命周期。 吸附法也有许多不足，如酶量的选择全凭经验，p h 值、离子强度、温度、 时间的选择对每一种酶和载体都不同，酶和载体之间结合力不强易导致催化活力 的丧失和玷污反应产物等。因此，其应用受到限制。为提高其使用性能，一部分 科研人员将此法与其他方法联用。 岳振峰等【8 】以粉末状壳聚糖为载体，采用先吸附后交联的固定法固定口葡萄 糖氧化酶，酶活力为1 4 3 0 0 u ，酶活力回收率为5 9 6 ，效果较好，其酸碱稳定 性及热稳定性好。 1 1 2 2 交联法( c r o s s l i n k i n g ) 交联法是用多功能试剂进行酶蛋白之间的交联，是酶分子和多功能试剂之间 形成共价键，得到三向的交联网架结构，除了酶分子之间发生交联外，还存在着 一定的分子内交联。根据使用条件和添加材料的不同，还能够产生不同物理性质 的固定化酶。常用交联试剂有戊二醛、双重氮联苯胺2 ，27 二磺酸、己二酰亚 胺酸二甲酯等。 q u i n n 等【9 】用戊二醛作交联剂，将由乳酸制得的乳糖苷酶固定在石墨表 面，在石墨特有活性区域1 7 1 0 0 和2 5 1 0 0 时，固载量分别为1 8 u e r a 2 和1 1u c m 2 时，活性随酶固载量的增加而增加，固定酶的k m 值约为游离酶的5 倍。用此固 定酶( 质量分数5 ) 水解乳糖，在3 7 * ( 2 、3 5h 以上乳糖水解接7 0 。实验证明， 该固定酶有很好的贮存稳定性和可操作性。 交联剂一般价格昂贵，此法也很少单独使用，一般都将其作为其他固定化方 法的辅助手段，以达到更好的固定化效果。 1 1 2 3 包埋法( e n t r a p m e n t 、) 包埋法可分为网格型和微囊型两种。前者是将酶包埋于高分子凝胶细微网格 内；而后者是将酶包埋在高分子半透膜中制备成微囊型。 包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，很少改变酶的空间 构象，酶活回收率较高，因此可以应用于许多酶的固定化，但是在发生化学反应 时，酶容易失活，必须巧妙设计反应条件。包埋法只适合作用于小分子底物和产 物的酶，对于那些作用于大分子底物和产物的酶是不适合的，因为只有小分子可 以通过高分子凝胶的网格扩散，并且这种扩散阻力还会导致固定化酶动力学行为 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 的改变，降低酶活力。 包埋法主要包括：聚丙烯酰胺凝胶包埋法、辐射包埋法【l o 】、卡拉胶包埋法、 微囊法 1 1 - 1 2 】、辅因子微囊法。 1 1 2 4 共价结合法( c o v a l e n tb i n d i n g ) 共价结合法借助共价键将酶的侧链基团和载体的功能基团进行共价偶联而 制备固定化酶的方法。它是目前研究和应用较多的一类方法。酶分子上用于偶联 的官能团有氨基、羧基、酚基、咪唑基、吲哚基等；载体上的官能团有芳香氨基、 羟基、羧基、羟甲基和氨基等。此法的优点是，酶与载体的结合较为牢固，酶不 易脱落，但因反应条件较为剧烈，酶活性损失更加严重，且载体不易再生。 根据载体的反应活性基团与酶的侧链基团共价结合反应的性质，可将共价结 合法分为以下几类：重氮化法i n 】、烷基化和芳基化法f 1 4 】、戊二醛处理法、钛螯 合法、硫醇一二硫化物互换反应法【1 5 】、四组分缩合反应法【1 6 1 。 w a n g 17 】等将由绿脓杆菌制备的壳多糖酶固定在聚合物载体羟丙甲基纤维素 乙酸琥珀酸盐上，d e s s o u k i t l 8 】等将支链淀粉酶分别固定在由环氧氯丙烷活化的 琼脂糖和由环氧氯丙烷活化的三氯三嗪酪蛋白上，z a i t a 1 9 】等将由黑曲霉制得的 胞外内切菊粉酶固定在溴乙酰纤维素( b a c ) 、纤维素碳酸盐( c c ) 和溴化氰活 化的琼脂糖( c a s ) 上，都是采用的共价结合法。 综上所述，不同的固定化方法，因它们的固定化机理不同，固定化的难易程 度和效果大不相同。利用吸附法固定化酶虽然酶易于脱落，但吸附量大，吸附过 程同时达到了纯化的作用，不仅操作简单，易于推广，而且载体选择范围广。共 价法固定化酶的稳定性较高，但载体的活化过程成本提高，操作复杂，反应条件 较为激烈。交联法固定化酶的稳定性较高，所用的多功能试剂价格低廉，固定化 成本较低，但其操作过程复杂。包埋法固定化酶不改变酶的结构和性质，固定化 过程中酶不受保护剂和稳定剂的影响，但该方法也有一定的局限性，因为只有小 分子底物和产物才可以通过高聚物网架扩散，对那些底物和产物是大分子的酶不 适用。由此可见这四种固定化酶的方法各有优缺点，因此应结合实际情况因地制 宜地确定所需的固定化方法。表l l 对几种固定化方法的特性进行了比较。 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 1 1 3 固定化载体 自固定化技术兴起以来，其载体的研究就广受关注，也取得了不少成就，但 在实际应用中还有许多问题需要解决，如使用寿命较短，操作半衰期不够长；载 体价格较高，而且对底物和产物存在扩散阻力，所以许多学者仍一直在致力于新 载体的研制和应用。固定化技术中所使用的载体可分为有机高分子载体、无机载 体和复合载体【2 0 1 。 1 1 3 1 有机高分子载体材料 l 、天然高分子凝胶载体 此类载体材料一般无毒性，传质性能好，但强度较低，在厌氧条件下易被微 生物分解，寿命短。常见的有琼脂、海藻酸钠等，近来研究的比较热门的新载体 是甲壳素和壳聚糖 2 j 】。甲壳素和壳聚糖分子中存在氨基，既易于与酶和蛋白质共 价结合，又可螯合金属离子，使酶免受金属离子的抑制，又易于接枝改性。对蛋 白质有较好的亲合性和较高的固定化效率。 此外，丝素膜也是一种性能很好的天然凝胶载体，宛晓春【2 2 】采用共价法和包 埋法将葡萄糖苷酶固定在丝素蛋白膜上，此法操作简便易行，酶膜稳定，机 械性能好，热稳定性高，7 0 保存l 小时活力几乎不降低。 2 、合成有机高分子载体材料 合成高分子凝胶载体一般强度较大，但传质性能较差，在进行细胞固定时对 细胞活性有影响。常见的载体有聚丙烯酰胺( a c a m ) 、聚乙烯( p v a ) 等。近年 来，人们又合成出许多具有优良性能的新载体，如：聚乙烯醇冷冻胶p o l y ( v i n y l 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 a l c o h 0 1 ) c r y o g e l s 2 3 1 、聚乙烯氧化物( p o l y e t h y l e n e o x i d e ) 载体【2 4 1 、无孔聚苯乙烯 聚苯乙烯磺酸钠p s p n a s s 微球载体【2 5 】，p f 凝胶载体( 对苯二酚和甲醛聚合物) 2 6 1 ，球状纤维素单宁树脂【2 7 1 ，多孔醋酸纤维素球形载体等已成功地用于酶的固 定化上。 1 1 - 3 2 无机载体 以无机材料为固定化载体具有一些有机材料不具备的优点，如稳定性好，机 械强度高，对微生物无毒性、不易被微生物分解、耐酸碱、成本低、寿命长等特 性。目前，无机载体加以修饰使之与酶和细胞结合的技术取得了重大突破。常用 的载体有硅胶、氧化铝、多孔二氧化硅、陶瓷等。 1 1 3 3 复合载体材料 将有机材料和无机材料复合组成新的载体材料，以改进材料的性能。磁性高 分子微球是近年来研究的较多的一类复合载体材料。 磁性高分子微球1 2 引是指内部含有磁性金属或金属氧化物( 如铁、钴、镍及其 氧化物) 的超细粉末而具有磁响应性的高分子微球。它是近二十年来发展起来的 一种新型功能高分子材料。磁性高分子微球既可以通过共聚、表面改性等化学反 应在微球表面引入多种反应性功能基团，也可通过共价键来结合酶、细胞、抗体 等生物活性物质，在外加磁场的作用下，进行快速运动或分离，因而在生物工程、 生物医学及细胞学等领域有着广泛的应用前景。 1 1 4 固定化酶性质 从溶液酶的游离状态，到固定化酶的“局限”状态，是一个很大的转变。酶 分子本身及酶反应的环境有所不同。因而，固定化酶的性质和游离酶有很大不同。 固定化酶性质的研究，不仅对于固定化酶的应用很重要，而且对于阐明酶蛋白的 结构和酶活力的关系以及酶的作用机理也很有价值。 1 1 4 1 固定化对酶的影响 固定化对酶带来的影响可概括为如下三个方面： ( 1 ) 构象改变、立体屏障 酶在固定化过程中，由于酶和载体之间相互作用，引起酶分子构象发生某种 扭曲，从而导致酶和底物的结合能力或催化底物转化能力发生改变，在大多数情 况下，固定化致使酶活性发生不同程度下降。在共价结合法和吸附法制备固定化 酶时，表现尤为突出。立体屏障是指酶被固定化后，由于载体空隙太小，或固定 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 化的结合方式不对，使酶活性中心或调节部位造成某种空间障碍，使效应物或底 物与酶的邻近或接触受到干扰。因而，选择载体的孔径不可忽视。采用载体加“臂” 的方法，能改善这种立体屏障的不利影响。 ( 2 ) 分配效应和扩散限制 这两种效应都与微环境密切相关。所谓微环境是指紧邻固定化酶的环境区 域，主要是载体的疏水、亲水及电荷性质带来的影响。 分配效应是由于载体性质造成的酶的底物或其它效应物在微观环境和宏观 体系之间的不等性分配，从而影响酶促反应速度的一种效应。扩散限制效应是指 底物、产物和其它效应物在微环境中的迁移运转速度受到的限制作用，有外扩散 限制和内扩散限制两种类型。前者是指物质从宏观体系穿过包围在固定化酶颗粒 周围近乎停滞的液膜层( 又称n e m s t 层) 达到微粒表面时所受到的限制。内扩散 限制是指上述物质进一步向微粒内部酶所在点扩散所受到的限制。 ( 3 ) 微扰 由于载体的亲水、疏水作用和余质的介电常数等性质，直接影响酶的催化能 力或酶对效应物作出反应的能力，这种效应称为微扰。 以上效应将具体表现在酶的底物专一性、酶促反应最佳p h 、最佳温度、酶 的动力学性质以及酶的稳定性等方面。 1 1 4 2 酶固定化后性质的变化 ( 1 ) 酶活力降低 酶经固定化后，一般而言，其活力都会有所下降。具体变化情况根据底物分 子大小不同一般有以下两种情况：( 1 ) 当酶的底物为大分子化合物时， 由于酶经 固定化后立体障碍显著增加，大分子底物与酶分子的接触受到障碍，酶的催化活 力难于发挥出来，催化活性大大下降。例如，糖化酶用c m 一纤维素经化学法共 价固定化后，对分子量为8 0 0 0 的直链淀粉的催化活性下降2 3 ，而对分子量 为5 0 0 0 0 0 的直链淀粉的催化活性下降了8 5 8 7 ；( 2 ) 当酶的底物为小分子 化合物时，酶经固定化后，载体与底物之间的立体障碍较小，酶分子与小分子底 物的接触较容易，在大多数情况下，底物的专一性不发生变化，由固定化链霉蛋 白酶的活力与底物分子量的关系，可以看出，随着底物分子量的增大，固定化酶 的活力下降。 ( 2 ) 酶的最适p h 变化 酶的催化活性受p h 值影响较大，在大多数情况下，酶催化反应在一定p h 值条件下具有最大的反应速度，高于或低于此p h 值，反应速度都会下降，通 常称此p h 为酶的最佳反应p h 值。酶的最佳反应p h 值并不是一个常数，它 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 会因酶的底物种类、底物浓度、温度以及其它反应条件的变化而变化。许多实验 证明，酶固定化后的最佳反应p h 值会发生不同程度的变化。原因可能有以下 三个方面：一是酶本身电荷在固定化前后会发生变化；二是由于载体电荷性质的 影响致使固定化酶分子内外层的氢离子浓度产生差异；三是由于酶催化反应导致 固定化酶分子内部形成带电荷微环境。 ( 3 ) 酶的最适温度升高 酶是一类蛋白质，温度对酶催化反应速度影响较大：一方面，当温度升高时， 反应速度加快；另一方面，随着温度的升高，酶蛋白分子逐步变性，酶的活力降 低而使反应速度变慢。这两方面作用的结果，使酶催化反应都存在一个最佳反应 温度。在此温度下进行酶的催化反应，反应速度最快，高于或低于此温度，反应 速度都会有所降低。酶的最佳反应温度不是酶的特征物理常数，随着酶的作用时 间的长短不同，最佳反应温度也不同。酶经固定化后，大多数情况下其最佳反应 温度会提高。这是因为酶分子被固定化后，其热稳定性增强。随着温度的升高， 酶的活力较溶液酶的活力降低的缓慢，因而可在较高的温度下获得最快的反应速 度。 ( 4 ) 酶的动力学常数k m 酶催化反应动力学研究不仅具有重要的理论价值，而且具有很大的实际意 义。在研究酶的结构、功能及作用机理时，酶催化反应动力学常数不仅有利于最 大限度地发挥酶的催化作用，而且有利于了解酶的催化作用及其机理。酶与底物 的亲和性用米氏常数( k m ) 来表示。k m 值是指当酶反应速度达到最大反应速度一 半时的底物浓度。 y ：垡幽( 1 1 1 s + k 。 、 米氏常数是酶的特征常数之一，它仅与酶的性质有关，而与酶的浓度无关。 k m 值越小，表示酶与底物的亲和力越大。同一种酶有几种底物就有几个k m 值， 其中k m 值最小的底物称为酶的最佳底物或天然底物。酶经固定化后。酶蛋白分 子的高级结构的变化以及由于载体电荷的影响导致底物和酶的亲和力的变化，大 多数情况下都会使酶的k m 值发生改变。k m 值的变化与载体和底物之间的静电 作用也有关系，当两者所带电荷相反时，载体和底物之间的吸引力增加，使固定 化酶周围的底物浓度增大，从而使酶的k 。值减小：而当两种所带电荷相同时， 载体与底物之间互相排斥，固定化酶的k m 值比溶液酶的k 弼值增大。另外， k 。值还与载体颗粒大小有关，一般而言，载体的颗粒越小，k 。值在固定化前 后的变化越小。 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 总的来说，酶在固定化以后，一般都表现为k m 值增大。不同载体，不同固 定化方法，可以使米氏常数发生不同程度的变化；不同酶用相同的载体、相同的 固定化方法固定后，米氏常数也有不同的变化。 ( 5 ) 酶的稳定性增强 固定化酶的稳定性：酶的稳定性包括酶对各种试剂的稳定性( 包括蛋白质变 性剂、抑制剂等) 、对蛋白分解酶的稳定性、对热的稳定性、储存稳定性、重复 使用稳定性等。固定化酶的稳定性一般都比溶液酶好。固定化酶的稳定性的提高 在实际应用中是非常有利的，尤其是酶的热稳定性，因为酶的热失活，是酶失活 的最主要原因。大多数酶在固定化之后，其热稳定性都有所提高，使用寿命延长。 这主要是由于酶分子在固定化前，进行热处理时构象的变化。随着温度的升高， 维持酶蛋白分子稳定结构的作用力( 疏水相互作用、氢键、离子相互作用以及范 德华等作用力) 会逐渐减弱，这就造成了酶蛋白分子的展开酶蛋白分子的展开， 直接影响了活性中心的特定结构，进而造成酶的失活。而酶经固定化后尤其是当 酶固定在无机载体上时，其刚性得到很大提高，酶蛋白分子的展开受到障碍，酶 的活性中心的破坏也就大为减少，其稳定性得到了提高。 1 1 5 固定化酶的应用及发展趋势 随着酶固定化技术的发展，其应用范围不断扩大。固定化酶的应用主要有以 下几个方面： ( 1 ) 工业生产中的应用 固定化酰化氨基酸水解酶是最早应用的工业化酶，将酰化氨基酸水解酶固定 于d e a e 一葡聚糖凝胶上用来连续生产l 氨基酸，不仅降低了酶的消耗量，而且 减少了产品后处理的费用。 此外还有一些应用较为广泛的固定化酶：固定化碱性蛋白酶可以高效去除丝 织品和棉织品纤维上的多余蛋白，使织物更加柔软光滑；固定化的酸性蛋白酶还 可以将废胶卷上的明胶溶解，回收上面的银颗粒；固定化脂肪酶既可以用来分解 动植物油脂，使乳脂中的芳香族脂肪酸游离而增d r i l l 品的风味，也可用在工业上 分解油脂生产脂肪酸和甘油，固定化纤维素酶作为一种全新的技术在提高纤维素 酶的效能上找到了一个很好的突破口，经过固定化处理的纤维素酶，不但其稳定 性有极大提高，而且可以重复利用，易于回收。 ( 2 ) 临床医疗领域中的应用 固定化酶在医疗领域中的应用越来越广泛【2 9 1 。用于治疗目的的酶，本身是一 种蛋白质，进入人体后，不仅会引起人体的免疫反应，而且还由于酶本身不稳定 易被人体内的蛋白酶水解失活，从而失去治疗作用。此外，药物酶还容易被排出 天津大学硕士学位论文 第一章文献综述 体外。如果用微囊包埋法将酶制成固定化酶再注入人体，则可以大大地增加酶的 稳定性，并且还可以避免酶与体液接触而产生抗体。需要说明的是，用于体内治 疗的固定化载体或胶囊，都应具有良好的生物相容性或容易为生物所降解，以避 免在人体内长期存留而给人体带来的不良影响。 ( 3 ) 分析测试领域中的应用 酶的专一性可以使酶很好地应用于分析测试领域中【3 0 】，但是由于纯酶稳定性 差，价格昂贵，因而限制了其应用范围。但随着固定化酶技术的出现与发展，酶 在分析测试领域内的应用也越来越广泛。固定化酶不仅可以使分析测试费用大幅 度地降低，而且还可使分析测试的自动化程度大大提高。此外，根据固定化酶的 特点，还可以制成生物传感器，这个领域从上世纪七、八十年代就开始迅速发展 【3 。随着固定化酶技术的不断发展和完善，各式各样的生物传感器系统也会大量 出现。 ( 4 ) 环境保护领域中的应用 固定化酶在环境领域中的应用包括两个方面：一是环境监测，二是污染物处 理。如利用固定化多酚氧化酶柱与氧电极结合，可以测出水中2 0 p p m 的酚类物： 固定化硫氰酸酶，可用于检测氰化物的存在。 ( 5 ) 基础理论研究中的应用 固定化酶催化的反应可操作性强，因此可用于酶的作用机制的研究以及酶系 统的组装、定位及代谢途径的研究等【3 2 1 。如用连续的固相酶柱进行d n a 序列 分析。 ( 6 ) 在薪能源开发中的应用 如生产氢气，微生物细胞经固定化后，其氢化酶系统的稳定性提高，能够连 续产生氢气。此外，利用固定化酶将化学能转化为电能，可用于燃料电池或化学 电。池。 1 2 酶在有机相中的催化反应影响因素 长期以来，人们一直认为酶只有在水中才能发挥催化作用，水溶液是酶存在 及作用的天然介质，这种思想极大地限制了人们对有机相酶催化反应的研究。八 十年代初，z a k s 和k l i b a n o v 3 3 1 报道了脂肪酶在有机溶剂中具有极高的热稳定性 和较高的催化活性，并阐明水对维持酶的活性结构是必不可少的，但只要保证酶 分子表面的一小部分必需水，其它大部分水完全可以被有机溶剂取代而不影响酶 的活性。近几十年来，酶在有机介质中的催化作用的研究取得了突破性进展，使 得传统酶学领域迅速生长出一个新的分支一非水酶学【3 4 - 3 7 】。 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 研究在非水介质酶的催化行为，使人们可以充分利用生物催化剂独有选择性 好、反应条件温和以及催化效率高等优点来取代常规催化剂完成许多有价值的有 机合成反应，或者催化许多动力学上很难进行的反应。大量研究表明，有机溶剂 中的酶至少活性部位的结构与在水溶液中是一致的，但在有机溶剂中酶分子间的 氢键极少，而分子内部集团间的氢键占有主导地位，所以，蛋白质结构变得更“刚 性 ，提高了酶的热稳定性。1 9 8 4 年，美国麻省理工学院科学家k l i b a n o v t 3 3 】成 功地实现了猪胰脂肪酶在9 9 的有机溶剂中催化三丁酸甘油酯与醇之间的转 酯反应，并证实了酶在1 0 0 高温下，不仅能够在有机溶剂中保持稳定，而且 还显示出很高的催化活性。这些说明非水酶学不但具有显而易见的应用价值，而 且具有极高的理论价值。 2 0 多年来的研究表明，在有机介质中酶催化反应可以获得许多常规条件下 所不具有的新特征和优势f 3 8 】：( 1 ) 可进行水不溶性化合物催化转化，使酶作用底 物的范围大大拓宽；( 2 ) 改变反应的平衡剧3 9 1 ，使水溶液中不能发生的反应向所 期望的方向进行，催化水解反应的酶可催化合成反应的进行，如转酯、酯化、胺 解、酯基交换和转硫酯等；( 3 ) 由于酶在有机溶剂中结构上“刚性”的增加，对 底物的专一性，包括区域专一性和对映体专一性均大大提高，从而使实现对酶催 化选择性的有目的的调控成为可能；( 4 ) 酶的热稳定性和贮藏稳定性大大提高； ( 5 ) 由于酶不溶于大多数有机溶剂，反应后易于回收和重复利用；( 6 ) 可避免长 期反应中微生物的污染；( 7 ) 减少或防止由水引起的副反应；( 8 ) 可方便地利用 对水分敏感的底物进行反应，如酸酐；( 9 ) 当使用挥发性溶剂作介质时，反应后 的分离过程能耗降低。 1 2 1 必需水 对于酶的催化作用来说，水是必需的，因为水直接或间接地参与了酶天然构 象中所有的非共价键相互作用一氢键、静电作用、疏水作用和范德华力。在无水 条件下，酶分子的带电基团和极性基团之间相互作用，形成一种非活性封闭结构， 水的加入可削弱这种相互作用，使非活性封闭结构“疏松”，即水充当酶结构的 “润滑剂”，使酶分子的柔性增大，并通过非共价作用力来维持酶的催化活性。 就酶本身而言，当酶周围含有足够的水分子来维持其天然构象时，这些“必 需水以外是什么介质无关紧要。也就是说，只要酶吸附了足够的“必需水”， 在有机溶剂中也应显示其催化活力。对于不同的酶，在溶剂中催化反应所必需的 水量有很大的差别。其中，一个脂肪酶分子只结合几个水分子就可显示活性。实 验表明，加入适嚣的水能使酶活性中心的极性和柔性提高，从而使酶活性急剧升 高，然而过量的水会引起酶活性中心内部水簇的生成，改变酶活性中心的结构， 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 导致酶活力降低【4 们。因此，掌握最佳水量可以使酶在溶剂体系中达到最佳的活性 表达。 有机溶剂体系中，酶催化活性的高低与酶分子结合水的多少直接相关，而与 体系中总的水含量及所用溶剂无关，因此要以水活度( a w ) 为研究参数【4 1 琅p 在一 定温度和压力下，反应体系中水与纯水逸度之比，水的逸度在理想条件下可以用 水的蒸汽压代替，因此a w 可以用体系中的水的蒸汽压与同样条件下纯水的蒸汽 压之比来表示。水活度的大小直接反映出酶分子上水分的多少，与体系的其他因 素无关，且各相的水活度相等【4 2 1 。 1 2 2 溶剂的影响 在一般的非水相酶催化过程中都要添加有机溶剂，在使用不同的酶或者在不 同的反应体系中，最适于使用的有机溶剂也是不同的。一般选用的有机溶剂为饱 和烷烃或芳香烃，如苯、甲苯、己烷、异辛烷等。 有机溶剂影响酶催化的途径主要有：( 1 ) 有机溶剂与酶分子直接发生作用， 通过干扰酶分子中的氢键和疏水键等改变酶的构象，从而导致酶的活性被抑制或 酶的失活；( 2 ) 有机溶剂还可直接和酶分子周围的水相互作用，通过影响水在有 机溶剂相和催化剂相之间的分配来影响酶的催化活性；( 3 ) 有机溶剂还和能扩散 的底物或反应产物相互作用，对酶催化反应的动力学参数产生影响；( 4 ) 有机溶 剂与反应体系其它成分之间所形成的相界面也会对酶的催化活力产生影响。 在非水相酶催化反应体系中，添加亲水性或与水互溶的有机溶剂对酶的催化 活性不利，因为它们会夺去酶表面微环境中的水从而使酶失活。一般认为所选择 的有机溶剂应该是与水不互溶的、非极性的、疏水性强的物质。有机溶剂疏水性 的强弱，通常用该有机溶剂在辛醇和水中的分配系数p 表示【4 3 】。l a a n e 等【删认 为，酶在1 9 p 4 的溶剂中具有较高活性。 m e s t r i 等【4 5 】人用脂肪酶催化香叶醇酯化过程中，在庚烷( 1 9 p ：4 o ) 中反应速度最 快，其次是正己烷( 1 9 p = 3 5 ) 、环己烷( 1 9 p = 3 2 ) 。 1 2 3 载体影响 酶的催化功能所需的结构与构象必需既“紧密”又有“柔性”。“紧密”状态 主要取决于蛋白质分子内的氢键，“柔性”状态则取决于水分子与蛋白质分子的 功能团形成的分子间氢键。这两种状态处于一种动态平衡中，表现出一定的弹性， 对于固定化酶来说，亲水性强的载体，与水形成氢键的能力强，使酶分子变得更 紧密，如罩子一样将酶的活性中心罩在里边，酶活下降甚至失活。疏水性载体则 相反，它可以很好地保持这种平衡，使酶在非水相中表现出较高的活性【4 6 1 。 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 1 2 4p h 影响 在有机介质中进行酶催化反应与在水介质中一样强烈地依赖于酶分子周围 “必需水”的p h 值。酶分子活性中心周围的离子基团需要在特定的p h 条件 下才能取得酶催化反应所需的最佳离子状态。p h 值影响酶的离子化，从而决定 了酶的构象，最终影响了酶的活性和选择性【47 1 。k l i b a n o v 4 8 】等研究发现冻干的酶 蛋白质具有“p h 记忆”( p nm e m o 拶) ，即悬浮于有机溶剂中的冻干酶的最适作 用p h 与冻干前相应的水溶液的p h 相当。酶蛋白中的可电离基团在有机溶剂 中不能电离，因此在使用前必须进行预处理。酶在有机溶剂中反应前，先溶解于 少量最适p h 值缓冲溶液中直接冻干，也可以从最适p h 值缓冲溶液中沉淀。 这样获得的酶就“记住”了暴露在最后水溶液中的p h 值，即对溶液中p h 值 具有记忆性。用冷冻干燥或沉淀制备的酶，当其处在有机溶剂中时，必需水仍可 保持最后所处溶液的p h 值。 1 2 5 酶使用形式 传统的水溶液酶催化反应体系中，由于酶是水溶性的，酶的使用多为直接将 天然酶溶入水中。然而，对于非水酶催化反应体系，有机溶剂的出现使得酶的应 用形式富于多样化。主要有：酶粉直接分散 4 9 - 5 0 1 、酶固定化【5 l 】、酶化学修饰【5 2 - 5 3 1 、 表面活性剂包衣酶黔5 6 1 、酶溶入反胶团f 5 7 - 5 钟等形式。 1 2 5 1 酶粉直接分散 酶在有机溶剂中最简单、方便的应用方式是将酶粉直接悬浮在有机溶剂中， k l i b a n o v 等 4 9 】首先报道了酶粉直接扩散法在有机溶剂中的催化活性，并指出，在 有机溶剂介质中，酶的热稳定性和底物选择性都有显著的提高。他们以三丁酸甘 油酯与庚醇在己烷中的酯交换为模型反应，用猪胰蛋白酶( p o r c i n ep a n c r e a t i c l i p a s e ) 催化反应，通