（分析化学专业论文）酶催化荧光法在药物分析中的应用及研究.pdf

山东师范大学硕士学位论文 摘要 产品质量的好坏，尤其是药品质量的优劣，直接关系到人们的身体健康， 甚至生命安全。因此在药品的研制、生产以及临床使用过程中都应该执行严格的 科学管理制度。对各个环节进行全面的监控，并采用各种有效的分析方法，对药 品进行严格的分析检测，从而保证药品质量。 药物的仪器分析方法很多，主要有高效液相色谱法，电化学法，光度法等。 光度法因其设备简单、操作方便、适用性广、准确度高、精密度好、用量少、易 于普及等特点，在药物分析应用上发展迅速并被广泛应用。荧光分析法具有高灵 敏度、高选择性、方法简便等优点，因而成为药物鉴定和测定药物的重要手段之 一，在药物分析领域中具有良好的发展前景。 本文主要以荧光分子光谱作为研究手段，对槲皮素、曲克芦丁、姜黄素等黄 酮类药物；盐酸小檗碱等生物碱；土霉素等抗生素类药物，在药物分析方法、相 互作用机理等方面开展了一系列的研究工作。 本论文共分四章。 第一章，综述了荧光光度法在分析化学中的应用，辣根过氧化物酶的性质及 其应用。 第二章，酪氨酸在辣根过氧化物酶催化下被h 2 0 2 氧化为强荧光物质s ，槲 皮素、曲克芦丁、姜黄素等黄酮类药物对其荧光产生猝灭作用，依据荧光猝灭原 则建立了测定槲皮素、曲克芦丁、姜黄素等黄酮类药物的测定方法。根据 s t e m v o l m e r 方程和荧光寿命法研究了槲皮素、曲克芦丁、姜黄素等黄酮类药物 对产物s 的猝灭机理为静态猝灭。实验得到上述各物质与强荧光物质s 的形成常 数，结合点数，反应各热力学参数等。同时探究了各物质与强荧光物质s 的反应 机理。 第三章，酪氨酸在辣根过氧化物酶催化下被h 2 0 2 氧化为强荧光物质s ，盐 酸小檗碱等生物碱类药物对其荧光产生猝灭作用，依据荧光猝灭原则建立了用荧 光猝灭法测定盐酸小檗碱的分析方法。根据s t e m v o l m e r 方程和荧光寿命法研究 了盐酸小檗碱对产物s 的猝灭机理为静态猝灭。实验得到盐酸小檗碱与强荧光物 质s 的形成常数，结合点数，反应各热力学参数等。 第四章，酩氨酸在辣根过氧化物酶催化下被h 2 0 2 氧化为强荧光物质s ，土 山东师范大学硕士学位论文 霉素等抗生素类药物对其荧光产生猝灭作用，依据荧光猝灭原则建立了用荧光猝 灭法测定土霉素的分析方法。根据s t e m v o l m e r 方程和荧光寿命法研究了土霉素 对产物s 的猝灭机理为静态猝灭。实验得到土霉素与强荧光物质s 的形成常数， 结合点数，反应各热力学参数等。 关键词：药物，酶催化，荧光猝灭，槲皮素，曲克芦丁，姜黄素，盐酸小檗 碱，土霉素 分类号：0 6 5 7 3 2 山东师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h eq u a l i t yo ft h ed r u g g e r ya f f e c t sp e o p l e sh e a l t ha n ds a f e t yd i r e c t l y t h e r e f o r e t h ew h o l eq u a l i t yc o n t r o lo fd r u g g e r yp l a y sa l li m p o r t a n tr o l ei nt h ec l i n i ca n dm e s c a l h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc 1 1 r o m m o g r a p h ym e t h o d s p e c t r o p h o t o m e t r ym e t h o d a n d e l e c t r o c h e m i s t r ym e t h o d ，雒t h em o s te s s e n t i a lm e t h o & i nt h ed r u g g e r y m e a s u r e m e n t s ，h a v eb e e nw i d e l yu s e di nt h ed e t e r m i n a t i o no fp h a r m i cp r o d u c t s i n r e c e n t y e a r s ，s p e c t r o p h o t o f l u o r i m e t r y i s d e v e l o p i n g i nt h e s t u d yo fd r u g g e r y m e a s u r e m e n t s ，d u et oi t sh i g h l ys e n s i t i v i t y , g o o ds e l e c t i v i t y , s i m p l ep r o c e d u r ea n d l e s ss a m p l i n g o b v i o u s l y , s p e c t r o p h o t o f l u o r i m e t r yi so n eo ft h em e t h o & i nt h e q u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o no fd r u g si nm o d e mi n s t r u m e n t a la n a l y s i s i nt h i sp a p e r , u s i n gm o l e c u l ef l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y 嬲r e s e a r c hm e t h o d ， s o m en o v e la n ds i m p l em e t h o d sf o rt h ea s s a yo fd r u g sh a v eb e e ne s t a b l i s h e d t h e r e a r ef o u rc h a p t e r si nt h i sp a p e r t h ef i r s tc h a p t e ro ft h i sp a p e r , t h ea p p l i c a t i o na n dp r o s p e c to fs p e c t r o p h o t o m e t r y , t h ed e v e l o p m e n to fh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) a n di t s a p p l i c a t i o n ，i nd r u g a n a l y s i si nr e c e n ty e a r sw e r ed i s c u s s e d t h es e c o n dc h a p t e r , w es e l e c t e dh r pa se n z y m e b e c a u s eo fc a t a l y s i so fh r p ， t h et y r o s i n er e a c t e dw i t hh 2 0 2t of o r mt h ep r o d u c tsw h i c hw a sas t r o n gf l u o r e s c e n c e s u b s t a n c e t ot h ep r o d u c ts ，t h ec o m p o u n d s ( q u e r c e t i n ，t r o x e r u t i n ，c u r c u m i n ) w h i c h c a l l e dt h ef l a v o n o i d sq u e n c h e dt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fp r o d u c ts t h er e a c t i o n m e c h a n i s mw h i c hw a st h es t a t i cq u e n c h i n gp r o c e s sb e t w e e nt h ep r o d u c tsa n dt h e f l a v o n o i d sc o m p o u n d s an e wm e t h o df o rd e t e r m i n i n gt h ef l a v o n o i d sh a sb e e n e s t a b l i s h e db a s e do nt h ep r i n c i p l eo ff l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g t h ef l u o r e s c e n c e q u e n c h i n gm e c h a n i s mw a ss t u d i e db yt h em e a s u r e m e n t so ff l u o r e s c e n c el i f e t i m ea n d t h es t e m - v o l m e rp l o t t h et l l i r dc h a p t e r , w es t u d i e dt h er e a c t i o nb e t w e e np r o d u c tsa n db e r b e r i n e t h e t y r o s i n er e a c t sw i t hh 2 0 2t of o r mp r o d u c tsw h i c hi sas t r o n gf l u o r e s c e n c es u b s t a n c e i nt h ep r e s e n c eo fh r p t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fp r o d u c tsd e c r e a s e di nt h e 3 山东师范大学硕士学位论文 p r e s e n c eo fb e r b e r i n e ，w h i c hs h o w e df l u o r e s c e n c eq u e n c h i n go c c u r r e d t h er e a c t i o n m e c h a n i s mw h i c hw a st h es t a t i c q u e n c h i n gp r o c e s sb e t w e e np r o d u c ts a n d b e r b e r i n e an e w , s e l e c t i v ea n ds e n s i t i v em e t h o df o rd e t e r m i n i n gb e r b e f i n eh a sb e e n e s t a b l i s h e db a s e do nt h ep r i n c i p l eo ff l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g t h ef l u o r e s c e n c e q u e n c h i n gm e c h a n i s mw a ss t u d i e db yt h em e a s u r e m e n t so ff l u o r e s c e n c el i f e t i m ea n d t h es t e m - v o l m e rp l o t t h ef o u r t hc h a p t e r , as i m p l ea n dc o n v e n i e n tm e t h o dw a si n t r o d u c e df o rt h e d e t e r m i n a t i o no ft e r r a m y c i nb a s e do nt h ep r i n c i p l eo ff l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g a n o x i d a t i o nr e a c t i o no ft y r o s i n ew i t hh 2 0 2c a t a l y z e db yh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s ew a s s t u d i e d , a n dp r o d u c tsw a st h eo x i d a t i o np r o d u c tw i t has t r o n gf l u o r e s c e n c e t e r r a m y c i nq u e n c h e dt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fp r o d u c ts t h es t a t i cq u e n c h i n g p r o c e s sw a sc o n f n r n e db yt h em e a s u r e m e n to ff l u o r c s c e n c el i f e t i m eo nt h eb a s i so f s t e m - v o l m e rp l o t t h er e a c t i o nm e c h a n i s mw h i c hw a st h es t a t i cq u e n c h i n gp r o c e s s b e t w e e np r o d u c tsa n dt e r r a m y c i n t h ee n t h a l p yc h a n g e ，e n t r o p yc h a n g ea n df r e e e n e r yc h a n g ew e r ec a l c u l a t e d k e y w o r d s ：d r u g ，c a t a l y z e d ，f l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g ，q u e r c e t i n ，t r o x e r u t i n , c u r c u m i n ，b e r b e r i n e ，t e r r a m y c i n 4 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名：珈编 导师签字： 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权堂撞可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：缸荡 导师签字： 签字日期2 0 0 7 年f 月名日1 秒纽 答字日叩。7 衬月于 山东师范大学硕士学位论文 第一章绪论 l 荧光分析法的应用 光化学分析、法【l 】包括红外分光光度法、紫外一可见分光光度法、荧光光谱法、 化学发光法、磷光分析法、原子吸收光谱法、质谱法、共振光散射等。荧光法因 灵敏度高、选择性好、操作简便等优点受到分析工作者的青睐。将荧光光谱分析 法应用于药物分析，已在药物有效成分分析鉴定、药物代谢动力学研究、临床药 理与药效分析等方面取得一定发剧2 。】，并广泛应用于生化分析、生物医学、临 床分析等领域的痕量分析【4 。 常规荧光分析法最早被应用于分析抗疟疾药物奎宁。随着荧光分析法的发 展，其应用范围日益扩大，被广泛用于抗菌素药物、止痛药、镇静剂、止血药等 的分析【8 】，涉及合成药物、生物药物和天然药物。由于自身具有发射荧光特性的 物质相对较少，并且受到拉曼峰和散射光等背景的干扰，常规荧光分析法在药物 分析中的应用受到限制。 为使荧光分析法的应用更加广泛，发展了各类荧光分析方法，如对不发荧光 的物质可通过某类化学反应使其转变为适合测定的荧光物质【9 】，对荧光较弱的物 质可采取荧光增敏分析法【1 0 。1 1 。近年来，还发展了各种新型荧光分析技术，如激 光诱导荧光、法【1 2 1 、同步荧光法、导数荧光法【13 1 、荧光探针法t 1 4 1 、光化学荧光法【1 5 】、 时间分辨荧光法【l6 】、三维荧光法【1 7 1 、偏振荧光法【1 8 】、荧光免疫测定法【1 9 】、荧光 成像技术【2 0 1 、荧光光纤传感器【2 l 】等。这些技术的应用加速了各种新型荧光分析 仪器的研制，使荧光分析不断朝着高效、痕量、微观和自动化方向发展。 直接荧光分析法适用于自身能产生荧光的药物。因荧光性质与溶液的p h 值 有关，故荧光强度的测定需在适宜的p h 缓冲溶液中进行。对于成分复杂的生物 供试品，为了防止干扰，有时需利用萃取、沉淀、色谱分离等方法除去干扰物， 以降低荧光空白本底，提高分析灵敏度。已用于直接荧光分析法的药物有盐酸洛 哌丁胺、双水杨酯、左旋溶肉瘤素、叶酸等【2 2 2 5 1 。 有些药物可利用其对某一特定体系的荧光猝灭作用而进行定量测定。庞志功 等1 2 6 j 利用苦参碱和氧化苦参碱对荧光试剂乙酸乙烯酯的定量猝灭作用，建立了测 定苦参碱和氧化苦参碱的荧光分析方法。杜黎明等【2 刀研究了氯苯胺酸与洛美沙 5 山东师范大学硕士学位论文 星、环丙沙星、诺氟沙星发生的荷移反应，并对这4 种药物进行了定量分析。此 外，荧光猝灭法还用于分析万古霉烈2 8 1 、多巴胺【2 9 】等药物的含量。 2 辣根过氧化酶的性质与应用 辣根过氧化酶( h l 冲) 是商品化较早、应用最广泛的一种酶制剂。早在1 8 4 5 年，o s a n n 3 0 】即利用h r p 对过氧化物进行了测定。本世纪六十年代初，g u i l b a u l t 小组【3 】对h r p 进行了深入研究，并利用其催化反应体系，测定了临床化学中的 重要物质h 2 0 2 ，进而与多种氧化酶联用，测定了葡萄糖、胆固醇、尿酸等多种 人体内重要的有机物质和无机物质，开始了h r p 在分析化学中的应用时期【3 2 1 。 h r p 作为抗原和抗体的标记物，被应用于酶免疫分析中，使其日益成为一种重 要的分析试剂，广泛应用于临床化学，环境化学和食品工业等领域。关于h r p 在分析化学中的应用已有若干文章报道【3 3 。6 】。 h r p 是一种对氢受体有特异性，对氢供体缺乏特异性的酶。利用h r p 的催化 体系测定h 2 0 2 ，是一种既灵敏又专一的方法。对h 2 0 2 的测定是很多能产生h 2 0 2 的物质的测定基础。一些本身没有荧光的物质，在h r p h 2 0 2 体系催化氧化下， 产生二聚体而形成具有强荧光的物质。高香草酸是最早发现的具有此性质的底 物，其后在其衍生物和类似物中，又发现了对羟基苯乙酸，对羟基苯丙酸等更经 济的高香草酸替代物【3 7 1 。一些分析工作者开展了h r p 法对氢供体底物测定的研 究。除对氢供体底物酪氨酬3 8 1 ，高香草酸等的测定外，直接法【加】和抑制法【4 1 】 还可对h r p 另一底物抗坏血酸进行测定。并从反应产物出发，研究了一系列底物 的结构效应，揭示了酶反应的实质【4 2 喇】。本论文以酪氨酸为底物进行荧光研究。 h r p 的测定对免疫学和组织化学的研究及临床疾病的诊断具有重大意义【4 5 1 ，应用 h r p 的催化作用，进行了h r p 的测定【州引。 目前，酶促反应已经成为合成聚合物的新方法，它不仅具有反应条件容易控 制的优点，还能够制备传统的有机反应无法合成的物质，h r p 及其多种过氧化 物酶已被广泛地应用于合成功能聚合物和其它具有特殊结构的化合物【4 9 巧5 】。 s h e k h o v t s o v a 小组一直致力于h r p 酶抑制干扰法测定环境毒物h 9 2 + 和苯酚的研 究【5 6 - 5 7 1 ，t h o m s o n 则利用抗坏血酸对h r p 的干扰，建立了流动注射体系酶法分 析抗坏血酸【5 8 】。还可利用左旋多巴对h r p 催化对氯苯酚_ 4 氨基安替比林( 4 a a p ) 偶联反应体系的干扰程度与左旋多巴的浓度有相关性，来测定左旋多巴【5 9 】。 6 山东师范大学硕士学位论文 3 展望 随着现代分子生物学和分子生物技术的发展，关于药物的研究以及蛋白质水 解产物氨基酸与各类物质相互作用的化学机理研究已经成为生物化学的一个重 要领域，因此必须运用和发展更适当的分析方法来满足分析的要求。h r p 作为 一种重要的分析试剂，其应用日益广泛。随着科学的发展，酶法分析的应用范围 不断扩大，在新底物的开发合成，目标物质的分析研究，药物测定，药物动力学 研究及在不同介质中的应用方面有广阔的前景。 今后的发展方向是：探索并提出荧光分析新方法；与计算机技术紧密结合， 研制出自动化程度高、获得和处理信息速度快的荧光分析仪器；发现和合成选择 性优良的荧光试剂：与其他现代化分析仪器和方法联合使用，以更准确、更灵敏、 更专一和更低检测限测定药物成分，获得药物与各类物质相互作用的有关信息。 7 山东师范大学硕士学位论文 参考文献 【1 】仪器分析【m 】，高等教育出版社，2 0 0 1 ，p 3 8 ，1 1 3 2 】k a n d a g a lpb ，k a l a n u rss ，m a n j u n a t h adh ，e t a l j j o u m a lo f p h a r m a c e u t i c a l a n db i o m e d i c a la n a l y s i s ，2 0 0 8 ，( 4 7 ) ：2 6 0 - 2 6 7 3 】t e j e d o r amg h e m a n d opf a l e g r i aj sd j a n a l y t i c ac h i m i c aa c t a ，2 0 0 7 ，5 9 1 ( 1 ) ：1 1 2 - 1 1 5 【4 】q izd ，z h a n gy ，l i a ofl ，e t a l j j o u r n a lo fp h a r m a c e u t i c a la n db i o m e d i c a l a n a l y s i s ，2 0 0 8 ，4 6 ( 4 ) ：6 9 9 7 0 6 5 】c a c e r e sm ir ，d u r a nmi ，n a n c yeos ，e t a l j t a l a n t a , 2 0 0 8 ，7 4 ( 5 ) ：1 4 8 4 - 1 4 9 1 【6 】w a n gf h u a n gw w a n gyw j j o u m a lo f l u m i n e s c e n c e ，2 0 0 8 ，1 2 8 ( 1 ) ：1 1 0 - 1 1 6 【7 c o r i n n am ，s p a n g l e r , c h r i s t i a ns ，e t a l j a n a l y t i c a lb i o c h e m i s t r y , 2 0 0 8 ， 3 8 1 ( 11 ) ：8 6 - 9 3 【8 】马广慈药物分析方法与应用 m 】北京：科学出版社，2 0 0 0 9 】许金钩，王尊本荧光分析法( 第三版) m 北京科学出版社，2 0 0 6 ，1 3 1 1 3 3 【10 】y ufs ，d i n g yb ，g a oyw ，e t a l j a n a l y t i c ac h i m i c a a c t a ，2 0 0 8 ，6 2 5 ( 2 ) ：19 5 2 0 0 【1 l 】张明翠，汪乐余，李玲，等王伦分析化学，2 0 0 4 ，3 2 ( 3 ) ：3 4 2 - 3 4 4 1 2 】n a g a r a js ，r a h a v e n d r a n as vk a r n e sht j 】j o u r n a lo fp h a r m a c e u t i c a la n d b i o m e d i c a la n a l y s i s ，1 9 9 8 ，1 8 ( 3 ) ：4 11 - - 4 2 0 【1 3 】w a n gh y ，l i uld ，s u ny ，e t a l j t a l a n t a ，2 0 0 0 ，5 2 ( 2 ) ：2 0 1 - 2 0 9 【1 4 】h e m d a n ov ，z h o ujy ，n o u a i l l eb ，e t a l j j o u m a lo fp h a r m a c e u t i c a la n d b i o m e d i c a la n a l y s i s ，2 0 0 1 ，2 6 ( 3 ) ：4 8 7 - 4 9 3 【15 】h u a n gh a o - b i a o ，h eq i a o h o n g ，c h e nh e n g - w u j j o u l n a lo fp h a r m a c e u t i c a l a n db i o m e d i c a la n a l y s i s ，2 0 0 2 ，3 0 ( 1 ) ：5 9 6 5 【1 6 】唐棣，王永成，常文保，等 j 】分析化学，1 9 9 9 ，2 7 ( 8 ) ：8 9 9 - 9 0 3 【1 7 】杨一心，赵天成，白晋涛，等 j 】光子学报，2 0 0 2 ，3 1 ( 9 ) ：l1 6 5 - 11 6 8 【1 8 】蔡晓坤，徐顺清，张志仁，等【j 】分析化学，2 0 0 2 ，3 0 ( 3 ) ：3 5 2 3 5 4 【1 9 】闫峰，惠延年，郭长梅【j 眼科研究，2 0 0 3 ，2 1 ( 5 ) - 4 8 2 _ 4 8 4 【2 0 】谢树森，李步洪，周川钊，等 j 】中国激光医学杂志，2 0 0 2 ，1 1 ( 4 ) - 2 4 9 【2 1 】唐江宏，胡娟，刘万卉【j 】分析化学，2 0 0 2 ，3 0 ( 11 ) ：1 3 8 3 - 1 3 8 6 【2 2 h e w a l ai 【j j o u r n a lo fp h a r m a c e u t i c a la n db i o m e d i c a la n a l y s i s ，19 9 5 ，l3 ( 6 ) ： r 山东师范大学硕士学位论文 7 6 l - 7 6 7 【2 3 】j o s ea mp ，l u i s afg b j t a l a n t a ，2 0 0 0 ，51 ( 1 ) ：8 9 9 8 【2 4 】e k r a mmh 【j j o u m a lo fp h a r m a c e u t i c a la n db i o m e d i c a la n a l y s i s ，2 0 0 2 ，2 7 ( 5 ) ：7 7 1 7 7 7 【2 5 】刘欣，黄汉国 j 分析化学，2 0 0 0 ，2 8 ( 11 ) - 1 4 0 6 1 4 0 9 2 6 】庞志功，汪宝琪，王翔，等 j 药物分析杂志，1 9 9 8 ，1 8 ( 6 ) ：3 7 8 3 8 0 【2 7 】d ul i - m i n g ，x uq i n g - q i n ，y u a nj i a n m e i j j o u m a lo fp h a r m a c e u t i c a la n d b i o m e d i c a la n a l y s i s ，2 0 0 3 ，3 3 ( 4 ) ：6 9 3 6 9 8 【2 8 】冯霞光，赵虎，王怀友，等 j 高等学校化学学报，2 0 0 7 ，7 ( 2 8 ) ：1 2 7 0 1 2 7 2 2 9 w a n gh u a i y o u ，f e n gx i a g u a n g ，z h a n gm i n e ta 1 j a n a l y t i c a ls c i e n c e ，2 0 0 7 ， 2 3 ( 11 1 ：1 2 9 7 1 3 0 0 【3 0 o s a n ng j p o g g e n d o r f sa n n ，18 4 5 ：6 7 31 】g u i l b a u tgg h a n d b o o ko fe n z y ma t i cm e t h o d so fa n a l y s i s m ，n e wy 0 r ka n d b a s e l ：m a r c e ld e k k e r , i n c ，19 7 6 3 2 】朱敏，黄雪梅，沈含熙 j 】分析科学学报，1 9 9 9 ，1 5 ( 5 ) ：4 2 0 【3 3 】s a n zv m a r c o ss ，c a s t i l l ojr ，g a l b a nj j j o u r n a lo ft h ea m e r i c a nc h e m i c a l s o c i e t y ，2 0 0 5 ，1 2 7 ( 3 ) ：1 0 3 8 - 1 0 4 8 【3 4 】n i g e lcv j p h y t o c h e m i s t r y , 2 0 0 4 ，6 5 ( 3 ) ：2 4 9 - 2 5 9 3 5 】m r z o g u c h im ，i s h i y a m am ，s h i g am ，e t a l 【j 】b u n s e k ik a g a k u l 9 9 6 ，4 5 ：1 l l - 1 2 4 【3 6 r u z g a st ，c s o e r g ie ，e m m n e u sj ，e t a l j a n a l y t i c a lc h i m i c aa c t a , 19 9 6 ， 3 3 0 ( 2 3 1 ：1 2 3 1 3 8 3 7 】朱敏，黄雪梅，沈含熙 j 分析科学学报，1 9 9 9 ，1 5 ( 5 ) ：4 1 8 3 8 慈云祥，陈列，魏珊【j 高等学校化学学报，1 9 9 0 ，1 1 ：8 1 8 3 【3 9 叶率官，金广通【j 】化学试剂，1 9 8 9 ，1 l ( 6 ) ：3 3 6 3 3 8 【4 0 】c a s e l l al ，g u l l o t t im ，m a r c h e s i na ，p e t r a r u l om j j o u m a lo ff o o ds c i e n c e ， 1 9 8 9 ，5 4 ( 4 ) ：3 7 4 【4 1 】t h o m p s o nrq 【j a n a l y t i c a lc h e m i s t r y , 1 9 8 7 ，5 9 ( 8 ) ：1 1 1 9 - 1 1 2 1 【4 2 】陈列，常文保，慈云祥【j 】高等学校化学学报，1 9 9 5 ，1 6 ( 5 ) ，6 8 3 6 8 7 【4 3 】g u i b a u l tggb r i g n a cpj ，j u n e a um j a n a l y t i c a lc h e m i s t r y , 19 6 8 ，4 0 ( 8 ) ：12 5 6 4 4 g u i b a u l tggb r i g n a cpj ，z i m m e rm 【j a n a l y t i c a lc h e m i s t r y , 19 6 8 ，4 0 ( 1 ) ：19 0 o 山东师范大学硕士学位论文 【4 5 】l e w i sgp j j o u m a lo fc l i n i c a lp a t h o l o g yi n c o r p o r a t i n gm o l e c u l a rp a t h o l o g y ， 1 9 6 5 ，1 8 ( 2 ) ：2 3 5 4 6 】张书圣，焦奎，季先锋【j 】青岛化工学院学报，1 9 9 7 ，1 8 ( 4 ) ：3 4 3 3 4 6 【4 7 】魏永峰，闰宏涛 j 】分析化学， 2 0 0 0 ，2 8 ( 1 ) ：9 9 - 1 0 1 4 8 】魏永峰，闰宏涛【j 光谱学与光谱分析，2 0 0 1 ，2 1 ( 5 ) ：7 0 4 - 7 0 6 4 9 u y a m ah ，t a k e y ak h o s h in ，e ta 1 【j 】m a e r a m o l e c u l e s ，19 9 5 ，2 8 ( 2 1 ) ： 7 0 4 6 7 0 5 0 【5 0 】b r u n off ，a k k a r aja ，s a m u e l s o nla ，e ta 1 j l a n g m u i r , 19 9 5 ，1 1 ( 3 ) ：8 8 9 - 8 9 2 5 1 a y y a g a r ims ，m a r xka ，t r i p a t h ysk e ta 1 j m a c r a m o l e c u l e s ，1 9 9 5 ( 1 5 ) ，2 8 ： 5 1 9 2 5 1 9 7 【5 2 】i k e d aru y a m ah ，k o b a y a s h is j m a c r a m o l e c u l e s ，19 9 6 ，2 9 ( 8 ) ：3 0 5 3 - 3 0 5 4 【5 3 】a l v aks ，l e ets ，k u m a rj ，e ta 1 j c h e mm a t e r , 1 9 9 8 ，l o ( 5 ) ：1 2 7 0 1 2 7 5 【5 4 】苏丽红，卢然，姜月顺，等【j 】吉林大学学报，2 0 0 3 ，1 4 1 ( 2 ) ：2 3 8 - 2 4 0 【5 5 】姜远良，冯春梁【j 】光谱实验室，2 0 0 1 ，1 8 ( 1 ) ：1 1 2 【5 6 s h e k h o v t s o v atn ，c h e m e t s k a y asv 【j a n a l y t i c a ll e t t e r s ，19 9 4 ，2 7 ( 15 ) ：2 8 8 3 5 7 】g a z a r y a nigl o g i n o vd bl ，l i a l u l i na l ，e t a l j a n a j y t i c a ll e t t e r s ，1 9 9 4 ， 2 7 ( 1 5 ) ：2 9 1 7 【5 8 】t h o m p s o nrq j a n a l y t i c a ll e t t e r s ，19 8 7 ，5 9 ：1 l l9 【5 9 】朱敏，黄雪梅，李洁，等【j 】分析化学，2 0 0 0 ，l2 5 ( 8 ) ：9 3 0 9 3 3 1 0 山东师范大学硕士学位论文 第二章黄酮类药物对酶催化产物的荧光猝灭机理研究及测定 第一节槲皮素对酶催化产物的荧光猝灭机理研究及其测定 摘要酪氨酸在辣根过氧化物酶催化下被h 2 0 2 氧化为强荧光物质s ，槲皮素对 其荧光产生猝灭作用，本文根据s t e r n v o l m e r 方程和荧光寿命法研究了槲皮素对 产物s 的猝灭为静态猝灭。实验得到槲皮素与强荧光物质s 的形成常数 k = 4 0 3 x 1 0 5 l m o l ，结合点数1 1 = 1 0 8 。探究了强荧光物质s 与槲皮素的反应机理。 该反应的热力学参数a g = t - 31 5 8k j t o o l ，a l l - - 7 5 6 8k j t o o l ，a s - - 1 4 7 9j k m o l ， 说明该反应是自发进行的放热过程；槲皮素与产物s 之间的作用力主要是氢键和 范德华力。同时依据荧光猝灭原则建立了测定槲皮素的新方法。槲皮素浓度在 0 7 0 - 1 0 0 p g m l 范围内与f o f 成线性关系，线性相关系数0 9 9 9 2 。检出限0 1 9 g g m l ，相对标准偏差1 2 9 。同时对p h 值，反应各物质的量，反应时间，干 扰离子等对测定的影响进行了研究。此法可用于药物中槲皮素的测定。 关键词酶催化；荧光猝灭；荧光寿命；槲皮素 l 引言 近年来，酶体系因其高灵敏性被广泛应用于生物化学领域。辣根过氧化物 酶( h r p ) 是从植物中提取的一种重要的酶制剂1 1 ，已广泛应用于生物工艺技术 2 3 1 ，生物传感裂4 ，5 1 ，有机合成旧等领域。酪氨酸在辣根过氧化物酶催化下被h 2 0 2 氧化为强荧光物质( 产物s ) 已有报划7 ，8 1 ，反应如下： 9 心 9 h 刊心 i c o o h o ho h 午心 i n 屹广9 h c o o h 9 心 l h 9 一n 心 c o o h 4 - 2 产物s 槲皮素，一种具有广泛生理作用的，存在于植物，水果，蔬菜中的天然黄酮 类化合物。它能够补充人体维生素，具有较强的抗氧化【9 , 1 0 、抗炎【l l 】、保护人体 细胞【1 刁等作用。以往的研究结果表明，槲皮素可抑制多种肿瘤细胞的生长，加强 洲入y 2 山东师范大学硕士学位论文 抗癌药物的抗癌作用【1 3 , 1 4 】，对白血病细胞d n a 的合成有抑制作用。因此，槲皮 素被认为是颇具应用前景的抗癌药物。槲皮素对提高人体免疫力，增强心脏血管 系统也具有一定的作用。近年来槲皮素对肝病的疗效也日益受到关注【l 纠。 文献报道，测定槲皮素的主要方法有分光光度法【1 6 1 ，伏安、法【1 7 , 1 8 ，高效液相 色谱法【1 9 洲，荧光光度法 2 1 2 2 】等。高效液相色谱法测定的线性范围相对较窄；紫 外可见分光光度法灵敏度较低，检测限较高，易受其他物质的干扰。而荧光分析 法因其灵敏度高，选择性好等优点被广泛应用于化学、药学、生命科学等领域。 o h h 图l 槲皮素结构式 实验表明槲皮素对产物s 的荧光具有猝灭作用，根据s t e m v o l m e r 方程和荧 光寿命法研究了槲皮素对产物s 的荧光猝灭机理。根据荧光猝灭原则建立了测定 槲皮素的新方法，成功应用于药物中槲皮素的测定。 2 实验部分 2 1 试剂与仪器 l s 5 0 荧光分光光度计( p e r k i n e l m e r ，美国) ；f l s 9 2 0 荧光分光光度计 ( e d i n b u r g h ，英国) ；l c 2 0 a 液相色谱仪( 岛津，日本) ；p h s - 3 c 型酸度计( 上 海雷磁仪器厂，中国) ；d i r e c t q 3 ( m i l l i p o r e ，美国) 超纯水系统：y x c s 型超 级数显恒温器( 山东鄄城永兴仪器厂，中国) 。 槲皮素( 化学对照品，中国药品生物制品检定所制造) ；l 酪氨酸( 生化试 剂，上海试剂厂) ；辣根过氧化物酶( h r p ，酶活性：2 5 0 3 3 0 u m g ，r z = 3 o ) ； 热淋清胶囊样品( 贵州弘康药业有限公司) ；其他所用试剂均为分析纯。 槲皮素标准储备液( 4 0 0 9 9 m l ) 准确称取0 0 4 0 0 9 槲皮素标准品，用甲醇溶 解，转移至1 0 0 m l 容量瓶，用甲醇定容至刻度，混匀，4 。c 下避光保存，用时稀 释至5 0 叩g m e 。 h r p 溶液( 1 0 0 p g m l ) - 准确称取h r p0 0 1 0 0 9 ，用水溶解，转移到1 0 0 m l 容量瓶，4 。c 下避光保存，用时稀释至5 0 叩g m e 。 l 酪氨酸标准溶液( 4 0 0 9 9 m l ) - 准确称取l 一酪氨酸0 4 0 0 0 9 ，用水溶解， 1 2 山东师范大学硕士学位论文 转移到1 0 0 m l 容量瓶中，定容混匀。用时稀释至1 0 0 j t g m l ，4 c 下避光保存。 h 2 0 2 溶液( 0 0 0 3 ，体积比) 现用现配。 三羟甲基胺基甲烷( t r i s ) - h c l 缓冲溶液( p h = 8 8 0 ) ，取0 1 0 m o l l i r i s 溶 液2 5 0 r n l ，用0 1 0 m o l lh c i 调节溶液p h = 8 8 0 。 热淋清胶囊溶液制备： ( 1 ) 热淋清胶囊水解溶液：取本品6 粒，内容物研细，