（化学工程专业论文）新型毛细管电泳光学检测器的研制及应用研究.pdf

摘要新型毛细管电泳光学检测器的研制及应用研究专业：化学工程研究生：赵书林指导教师：肖丹( 教授)摘要高效毛细管电泳( c e ) 是近年来发展最快的分离分析技术之一，由于该技术具有简单、高效、快速、微量、经济、清洁、易于自动化和环境污染少等优点，目前已在生命科学、生物医学和环境检测等领域中得到了广泛应用。由于c e 溶质区带的超小体积导致光程太短，需要高灵敏度的检测器与之匹配，因此检测器的研制一直是c e 技术发展的关键问题。目前已采用的检测器主要有：紫外可见光吸收、激光诱导荧光、化学发光( c l ) 、质谱、核磁共振和电化学检测器等，其中激光诱导荧光和c l 是最灵敏的两种检测器。但常规的激光诱导荧光检测器，必须采用激光器作为激发光源，例如氩离了激光器和氦一镉激光器，这些激光器不仅可供选择的激发波长有限，而且价格昂贵、体积庞大，使用寿命短，因而大大限制y c e 激光诱导荧光检测法的应用。而对于c e c l 检测，尽管已发展了多种类型的检测器，但目前的高灵敏检测主要集中在无机离子的检测方面，而用于检测生物活性分子，其灵敏度一般都不高，在生物样品分析中的应用也较少。因此，研制通用性的高灵敏光学检测器，建立高灵敏c e 分离分析方法，并应用于生物样品分析，对于推动生命科学和生物医学研究的发展，具有重要的意义。本研究工作旨在发展一些新的c e 光学检测器，建立生物体内一些重要生物新型c e 光学榆删器的研制及应用研究活性分子的高灵敏检测方法，并应用于实际样品分析，从而获取些有重要价值和理论意义的数据和新发现。为此主要开展了以下三个方面的工作。1 设计组装了c e 光导纤维发光二极管( l e d ) 诱导荧光检测器，并建立相应的c e 分析系统。该系统以非常便宜的l e d 作为激发光源，用光导纤维将光直接导入毛细管内，在溶液中激发被测物质产生荧光，避免了毛细管壁的散射和反射现象，因而具有较高的灵敏度。以萘二甲醛( n d a ) 标记的氨基酸和荧光素异硫氰酸酯( f i t c ) 标记的氨基酸混合物为试验化合物，考察了该系统的分离和测试性能。实验结果表明该系统具有良好分离效果，高的灵敏度，检测限在1 0 一1 0 一t 0 0 1 l 。1 之间，各种性能接近c e 激光诱导荧光检测系统。另外，由于在紫外和可见光范围内，各个波长段均可得到相应的l e d ，因而与c e 激光诱导荧光检测系统相比，该检测系统具有更加广泛的应用前景。利用该系统，已分别建立了牛物样品中胍基丁胺和d 天冬氨酸，d 谷氨酸的c e 分析方法。并对大鼠大脑、大鼠胃及人血清、人尿液中的胍基丁胺的含量进行了测定，首次测得人尿液中含有3 0 6 0n g m l 的胍基丁胺。应用于小鼠大脑中d 一天冬氨酸和d 一谷氨酸的含量测定时，对其注射神经毒素1 甲基。4 一苯基1 2 _ 3 6 四氢吡啶( m p t p ) ，使其发生了帕金森疾病症状后的小鼠大脑组织中，对d a s p 和d g l u含量的变化情况进行了考察。发现随m p t p 用药时间的增长，帕金森疾病的症状愈来愈明显，其d a s p 和d g l u 含量亦明显增高，用药5 天后含量达最大值。为生物医学研究提供了有重要参考价值和理论意义的数据。2 设计组装了一套新的c e c l 检测系统。该系统采用四通式接口和套管式在线活动检测窗口，光电倍增管紧贴反应毛细管的检测窗，并在检测窗口f放鹭一面反光镜。因此检测池密闭性能好，收集c l 的效率高。与现有大多数c l 检测器相比，测定氨基酸时的灵敏度提高了一个数量级。利用该系统，分别建立了生物样品中1 1 - + 酸，氨基酸和对乙酰氨基酚等物质的测定方法，并已分别应用于叶酸片剂、果汁和人尿液中叶酸含量的测定，人血清中】4 种氨基酸含量的测定，以及人尿液中对乙酰氨基酚含量的测定，并对对乙酰氨基酚的人体内药代动力学进行了研究。采用c e c l 检测技术测定上述物质，灵敏度高，i i摘要选择性好，国内外均未见有同类工作报道。3 组装了一套c e 激光诱导荧光检测系统，利用该系统建立了大鼠大脑中d 丝氨酸含量的c e 激光诱导荧光检测方法。该方法以4 氟一7 一硝基2 ，1 ，3 苯并嗯二唑( n b d f ) 为衍生试剂，羟丙基一b 环糊精为手性选择剂，对d l 一丝氨酸对映体的n b d f 衍生物，进行了手性拆分研究，并对大鼠大脑中d 一丝氨酸的含量进行了检测。测得大鼠大脑中d 丝氨酸含量在9 5 1 4 0n m o l g 之间。另外，利用该系统建立了大鼠大脑中d l 一天冬氨酸含量的测定方法，并测定了在正常和脑缺血情况f ，大鼠大脑皮质中d l 一天冬氨酸的含量。结果发现，在正常情况下每克湿的大脑皮质组织中含1 4 2 1 8n m o ll 天冬氨酸和4 9 1n m o ld 一天冬氨酸，但在脑缺血情况下，l 天冬氨酸的含量快速升高，而d 一天冬氨酸的含量反而降低。脑缺血3 0r a i n 时，l 天冬氨酸的含量为2 4 1 2n m o l ，升高了6 8 9 ，d 一天冬氨酸的含量为3 1 3n m o l ，降低了3 6 3 。这一结果表明，生理学中的兴奋性氨基酸可能仪指l 一氨基酸，而不包括它们的d 对映体。关键词：毛细管电泳；检测器；生物分析；化学发光；发光j 极管i i ia b s t r a c ts t u d yo nt h en o v e lo p t i c a ld e t e c t o rf o rc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s e sa n di t sa p p l i c a t i o nm a j o r ：c h e m i c a le n g i n e e r i n gp h d s t u d e n t ：z h a os h u - l i ns u p e r v i s o r ：p r o f x i a od a na b s t r a c th i g hp e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( h p c e ) h a sr e c e i v e dag r e a ta m o u n to fa t t e n t i o na sa na t t r a c t i v es e p a r a t i o nt e c h n i q u ei nr e c e n ty e a r sd u et ot h ef o l l o w i n gc h a r a c t e r i s t i c s ：s i m p l i c i t y ，h i g he f f i c i e n c y ，l o wc o s ta n ds h o r ta n a l y s i st i m e a tp r e s e n t ，h p c eh a sb e e na p p l i e di nd i v e r s ef i e l d s ，s u c ha sl i f es c i e n c e s ，b i o m e d i c i n ea n de n v i r o n m e n td e t e c t i o n h o w e v e r ，t h ee x c e p t i o n a l l ys m a l ls o l u t es e c t i o ni nt h ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sr e s u l t e di nt h es h o r tl i g h tp a t h ，c es e p a r a t i o n sc o u p l e dw i t hh i g h l ys e n s i t i v ed e t e c t o rh a db e c o m em o r ea n dm o r en e c e s s a r y ，s o ，t h er e s e a r c ho fd e t e c t o rw a sv e r yi m p o r t a n tf o rd e v e l o p i n gt h ec em e t h o d o l o g y t od a t e ，s o m ee m p l o y e dc ed e t e c t o r sw e r ef o l l o w i n g ：u l t r a v i o l e tv i s i b l e ，l a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c e ，c h e m i l u m i n e s c e n c e ，m a s ss p e c t r u m ，n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c ea n de l e c t r o c h e m i s t r yd e t e c t o r t h el a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c ea n dc h e m i s t r yl u m i n e s c e n c ew e r et h em o s ts e n s i t i v ed e t e c t o ra m o n gt h ea b o v ed e t e c t o r s b u t ，t h ec o n v e n t i o n a ll a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c ed e t e c t o rm u s tm a k eu s eo fl a s e ra st h ee x c i t a t i o ns o u r c e ，s u c ha sa r g o ni o na n dh e l i u m - c a d m i u ml a s e r t h e s el a s e r ss u f f e r e df r o ml i m i to fa l t e r n a t i v ee x c i t a t i o nw a v e l e n g t h ，e x p e n s i v ec o s t ，b u l k yv o l u m e ，s h o r tl i f e t i m ea n dh i g hp o w e rc o n s u m p t i o n ，w h i c hl i m i t e dt h ea p p l i c a t i o no fc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sl a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c ed e t e c t i o nm e t h o d o l o g y f o rt h ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sc h e m i l u m i n e s c e n c ed e t e c t i o n ，m a n yd e t e c t o r sh a db e e nd e v e l o p e d h o w e v e r , t h eh i g h l ys e n s i t i v i t yd e t e c t i o nw a sf o c u s e do nt h ei n o r g a n i c新型c e 光学检测器的研制强娅川研究i o nd e t e c t i o n ，t h ed e t e c t i o ni nb i o l o g ys a m p l eh a dl e s sa p p l i c a t i o nf o rt h el o ws e n s i t i v i t yo fd e t e c t i o ni nb i o l o g ya c t i v em o l e c u l a r c o n s e q u e n t l y , t h er e s e a r c ho i lt h eh i g h l ys e n s i t i v eo p t i c a ld e t e c t o r sa n dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i ss e p a r a t i o na n a l y s i sm e t h o df o rd e t e c t i o no fb i o l o g ys a m p l e sh a dc r u c i a ls i g n i f i c a n c ef o rp r o m o t i n gt h ed e v e l o p m e n to fl i f es c i e n c e sa n db i o m e d i c i n er e s e a r c h t h ea i mo ft h i sw o r kw a st od e v e l o ps o m en e wc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i so p t i c a ld e t e c t o ra n de s t a b l i s ht h eh i g h l ys e n s i t i v ed e t e c t i o nm e t h o df o rt h ea n a l y s i so fb i o l o g i c a la c t i v em o l e c u l a ri no r g a n i s ma n da p p l yt h em e t h o di nr e a ls a m p l ea n a l y s i s a n ds o m ed a t aa n dn e wd i s c o v e r yw i t hi m p o r t a n tv a l u ea n dt h e o r e t i ci m p o r t a n c eh a v e b e e no b t a i n e d i nt h i sw o r k ，t h r e ep a r t sa sf o l l o ww e r ea c c o m p l i s h e d 1 ah i g h l ys e n s i t i v eo p t i c a lf i b e rl i g h t e m i t t i n gd i o d e ( l e d ) 一i n d u c e df l u o r e s c e n c ed e t e c t o rf o rc eh a sb e e nc o n s t r u c t e da n de v a l u a t e d i nt h i sd e t e c t o r , av e r yc h e a pl e dw a su s e da st h ee x c i t a t i o ns o u r c ea n da no p t i c a lf i b e rw a su s e dt ot r a n s m i tt h ee x c i t a t i o nl i g h t t h eu p p e re n do ft h e f i b e rw a si n s e r t e di n t ot h es e p a r a t i o nc a p i l l a r ya n dw a ss i t u a t e dr i g h ta tt h ed e t e c t i o nw i n d o w t h ee x c i t a t i o nl i g h tw a st a k e nd i r e c t l yi n t ot h es e p a r a f t o nc a p i l l a r yt oe x c i t et h ea n a l y t ei nt h ed e t e c t i o nw i n d o w ，w h i c ha v o i d st h el i g h tr e f l e c t a n c ea n ds c a t t e r i n go nc a p i l l a r ys u r f a c ea n dr e s u l t si nl e s sn o i s e t h i si m p l i e sp r o v i d i n gi n c r e a s e df l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y s o ，t h ed e t e c t o rp r e s e n t e di nt h i sw o r kh a sh i g h e rs e n s i t i v i t y t h eu t i l i t yo ft h i sd e t e c t i o ns y s t e mw a ss u c c e s s f u l l yd e m o n s t r a t e db yt h es e p a r a t i o na n dd e t e c t i o no fa m i n oa c i d s ( a a s ) l a b e l e dw i t hn a p h t h a l e n e - 2 ，3 一d i c a r b o x a l d e h 3 ，d e( n d a ) a n df i t c l o wd e t e c t i o nl i m i t sw e r eo b t a i n e dr a n g i n gf r o m17t o2 3n m o l l - 1 f o rn d a t a g g e da a sa n d8t o1 2nn m o l l 一f o rf i t cl a b e l e da a sr s n =3 ) b yv i r t u eo fs u c hv a l u a b l ef e a t u r e sa sl o wc o s t ，c o n v e n i e n c e ，a n dm i n i a t u r i z a t i o n ，t h ep r e s e n t e dd e t e c t i o ns c h e m ew a sp r o v e nt ob ea t t r a c t i v ef o rs e n s i t i v ef l u o r e s c e n c ed e t e c t i o ni nc eu t i l i z i n gp r e s e n t e dt h ec e l e dd e t e c t i o ns y s t c m ，s e v e r a lm e t h o d sf o rd e t e r m i n a t i o no fa g m a t i n e ，d - a s p a r t i ca c i da n dd g l u t a m i ca c i dh a v eb e e ne s t a b l i s h e d ，a n dh a sb e e na p p l i e dt od e t e c ta g m a t i n ei nr a tb r a i nt i s s u e 、r a ts t o m a c ht i s s u e ，h u m a ns e r u ma n dh u m a nu r i n et h el e v e lo fa b s t r a c 丁a g m a t i n ei nh u m a nu r i n ew a sq u a n t i f i e db yc ef o rt h ef i r s tt i m ea n df o u n dt ob ei nt h er a n g e3 0 6 0n g m l w h e nt h em e t h o dw a sa p p l i e dt ot h ed e t e c t i o no fd a s p a r t i ca c i da n dd - g l u t a m i ca c i di nm o u s eb r a i n ，w h i c hw a si n j e c t e dw i t h1 - m e t h y l 一4 - p h e n y l 1 , 2 ，3 ，6 一t e t r a h y r o p y r i d i n e ( m p t p ) w e r ea n a l y z e d t h ec o n t e n t so fd - a s p a r t i ca c i da n dd g l u t a m i ca c i di nm o u s eb r a i nr a i s e dw i t ht h ep r o l o n g a t i o no ft h et i m eo fi n j e c t i o nm p t p t h er e s u l t sa r ew i t hi m p o r t a n tv a l u ea n dt h e o r e t i ci m p o r t a n c ef o rb i o m e d i c i n er e s e a r c h 2 ac ec h e m i l u m i n e s c e n c ed e t e c t i o ns y s t e mh a sb e e nc o n s t r u c t e da n de v a l u a t e di nt h i ss y s t e m ，af o u r w a yp l e x i g l a si n t e r f a c ea n da no n l i n ed e t e c t i o nw i n d o wa c t i v e l yw e r eu s e d t h ed e t e c t i o nw i n d o ww a sp l a c e di nf r o n to ft h ep h o t o m u l t i p l i e rt u b ea n dam i r r o rw a sp l a c e du n d e rt h ed e t e c t i o nw i n d o w s o ，t h ed e t e c t o rp r e s e n t e di nt h i sw o r kh a sh i g h e rs e n s i t i v i t yb e c a u s eo ft h eh e r m e t i cd e t e c t i o nc e l la n dh i g h e re f f i c i e n c yf o rl i g h tc o l l e c t i o n c o m p a r i n gt oo t h e rc ld e t e c t o r ，t h i sc e - c ls c h e m ep r o v i d e sb e t t e rs e n s i t i v i t yf o r t h ed e t e r m i n a t i o no fa m i n oa c i d s u t i l i z i n gp r e s e n t e dt h ec e c ld e t e c t i o ns y s t e m ，s e v e r a lm e t h o d sf o rd e t e r m i n a t i o no f f o l i ca c i d ，a m i n oa c i d sa n dp a r a c e t a m o lh a v eb e e ne s t a b l i s h e d ，a n dh a sb e e na p p l i e dt od e t e c tf o l i ca c i di nc o m m e r c i a lp h a r m a c e u t i c a lt a b l e t s ，a p p l ej u i c e sa n dh u m a nu r i n e ，p a r a c e t a m o li nt a b l e t sa n dh u m a nu r i n e ，a n da m i n oa c i d si nh u m a np l a s m a ，t h ep r e s e n t e dm e t h o dh a sa l s ob e e na p p l i e df o rt h es t u d yo nt h ep h a r m a c o k i n e t i cp r o c e s so fp a r a c e t a m o li nv i v o t h ep r e s e n t e dc e d i r e c tc ld e t e c t i o nm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no ff o l i ca c i d ，a m i n oa c i d sa n dp a r a c e t a m o li nb i o l o g i c a ls a m p l e si ss i m p l e ，s e n s i t i v e ，a n dn oo t h e rr e p o r t sa r ef o u n di nt h el i t e r a t u r e s 3 ac el a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c e ( l i f ) d e t e c t i o ns y s t e mh a s b e e nc o n s t r u c t e d u t i l i z i n gp r e s e n t e dt h ec e l i fd e t e c t i o ns y s t e m ，ac e - l 1 fm e t h o df o rd e t e r m i n a t i o no fd s e r i n ei nr a tb r a i nw a se s t a b l i s h e d i nt h i sm e t l l o d 4 - f l u o r o - 7 一n i t r o - 2 ，1 ，3 - b e n z o x a d i a z o l e ( n b d f ) w a su s e da sd e r i v a t i z a t i o nr e a g e n ta n dh y d r o x y p r o p y l 1 3 - c y c l o d e x t r i n ( h p 一1 3 - c d ) a sc h i r a ls e l e c t o r a n dt h ee n a n t i o m e r i cs e p a r a t i o no fn b d d l - s e r i n ew a si n v e s t i g a t e d t h eo p t i m i z e de l e c t r o p h o r e t i cc o n d i t i o n sw e r es u b s e q u e n t l ya p p l i e dt ot h ea n a l y s i so fd - s e r i n ei n新型c e 光学检测器昀刊i 制及麻用矿究r a tb r a i n ，a n df o u n dt h a tt h ec o n t e n t sa r ei nt h er a n g eo f9 5 1 4 0n m o l g o nt h eo t h e rh a n d ，am e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fd l a s p a r t i ca c i di nr a tb r a i nh a sb e e na l s od e v e l o p e da n da p p l i e dt ot h ed e t e c t i o no fd l a s p a r t i ca c i di nt h er a tc e r e b r a lc o d e xu n d e rb r a i ni s c h e m i a i ti st h ef i r s tt i m et h a tt h es i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nt h et w ob r a i n sw a so b t a i n e d i nn o r m a lb r a i n ，l a n dd - a s pc o n t e n tw e r e14 2 8a n d4 9 1n m o lg o fw e tt i s s u e r e s p e c t i v e l y , a n dt h er a t i o no fd - i s o m e rt ol i s o m e r( d l ) w a so 3 4 i nb r a i na f t e ri s o c h e m i a3 0m i n ，t h ec o n t e n tw e r e2 4 16a n d31 3n m o lg o f w e tt i s s u e ，r e s p e c t i v e l y , a n dt h ed i r a t i ow a s01 3 l - a s pc o n t e n tw a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e df r o m1 4 2 8t o2 4 1 ，6n m 0 1 茁o fw e tt i s s u e ，w h i l ed a s pc o n t e n td e c r e a s e df r o m4 9 1t o31 3n m 0 1 g 。1o fw e tt i s s u ed u r i n gb r a i ni s c h e m i a3 0m i n t h e s er e s u l t ss u g g e s t e dt h a te x c i t a t o r ya m i n oa c i di nt h ep h y s i o l o g yi so n l yi n d i c a t i n gl - a s pa n dn o ti n c l u d i n gi t sd - - i s o m e r k e y w o r d s ：c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s d e t e c t o r 、b i o l o g i c a la n a l y s i sc h e m i l u m i n e s c e n c e ，l i g h t e m i t t i n gd i o d e第一章文献综述1 1 引言第一章文献综述毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 又称高效毛细管电泳( h p c e ) ，是2 0 世纪8 0 年代初问世的一种高效分离技术，是经典电泳技术和现代微柱分离技术相结合的产物。它一出现就引起分离科学界极大的关注，目前已成为能与2 0 世纪5 0 年代末出现的气相色谱( g c ) 和2 0 世纪7 0 年代初出现的高效液相色谱( h p l c ) 十n 媲荚的一种分离分析技术，并被认为是当代分析科学最具活力的前沿研究课题。c e 分离技术，是通过施加1 0 3 0k v 的高电压于充有电解质溶液的极细毛细管( 内径2 5 1 0 0p m ) 两端，对进入毛细管的试样中的离予、分予或荷电粒予进行高效、快速的分离。与传统的分离方法相比，c e 具有简单、高效、快速、微量、经济、清洁、易于自动化、一机多用和环境污染少等特点。因此，在过去的2 0 多年里，c e 已迅速发展成为一种极为有效的分离技术，并已被应用于多种化合物，如：氨基酸、糖类、维生素、杀虫剂、有机酸、无机离予、染料、表面活性剂、药物、多肽、蛋白质、神经递质、低聚核苷酸( r n a ) i id n a片段等的分离和测定。在手性化合物分离、药物分析和环境分析等领域得到了越来越广泛的应用。特别是在质量有限的生物样品分析中，c e 具有更加广阔的应用前景。c e 分离分析技术，一般采用在柱检测方式，使用内径小于1 0 0l i m 的弹性石英毛细管为分离通道。由于受光程和进样量的限制，使得这种技术的发展受到检测器的极大限制，因此检测器的开发和检测方法的研究一直是c e 技术中最活跃的研究领域之一。新型c e 光学检测器的研制及应用研究1 2 毛细管电泳检测器由于c e 中溶质区带体积极小，使检测器成为c e 技术发展的关键，作为c e 检测器必须具备灵敏、高分辨、响应快等特点。目前己采用c e 的检测器主要有：紫外可见光吸收( u v v i s ) 、激光诱导荧光( l 1 f ) 、化学发光( c l ) 、质谱( ms ) 、核磁共振( n m r ) 、电化学和发光二极管诱导荧光( l e d i f ) 等，但己商品化的只有u v v i s 、l i f 和m s 检测器。1 2 1u v - v i s 光吸收检测器u v v i s 光吸收检测器是c e 中应用最广泛的一种检测器，是目前绝大多数商品仪器的主力检测器。石英毛细管可透过2 0 0n m 波长以上的紫外光，因此允许从紫外到可见光这一波长范围内对样品组分进行检测。而且由于透光窗口直接开在毛细管上，所以检测器本身不存在死体积及由此而造成的组分混合所产生的样品区带展宽现象。但为了获得高的分离效率，检测区的宽度应小于样品组分的区带宽度，也就是说透光窗口应足够的小。c e 的峰宽一般在2 5m m之间，所以透光窗的尺寸应控制在峰宽的1 3 以内。u v v i s 光吸收检测器的主要缺点是灵敏度不高，检测限一般在1o 。5 l0 m o l l ，这主要是光程太短所造成的。为了提高检测灵敏度，已有多种经过特殊设计的检测器，如：采用z 形池，泡形池，矩形毛细管和轴向多反射池已经被提出 1 1 2 。这些检测池通过增加光程来提高灵敏度，一般可提高一个数量级。在这些工作中，较有特色的工作是c h e r v e t 【2 和m o r i n gf1 0 】提出的用z 型池代替原来直接在毛细管上开窗检测的新型紫外吸收检测器。他们首先改平行入射光为聚焦入射光，用一个4m m 直径的石英球为透镜，使吸收光程增加。其次，他们把毛细管接近出口端的一部分弯成z 型，进一步扩大光程，在这种结构中，光线进入毛细管的弯曲部分后在管内多次反射折射，并从球型透镜的光束中获得从其轴向进入的补偿光束，通过池体构型的改造进一步增加了光程，使检测灵敏度有很大提高。与同样内径的普通毛细管相比，含4m m 石英球透镜的z 型池紫外检测器可提第一章文献综述高灵敏度2 3 个数量级，球型透镜还可降低器噪声8 1 0 倍。并且同样具有1 0 4数量级的线性范围。除了z 型池外，还有其他一些装置可用于提高灵敏度，如t s u d a t 等提出的矩形毛细管柱 11 ，1 2 。由于普通毛细管的管径较大时其焦耳热将十分明显，管径细又因管壁曲率而引起信号失真，矩形毛细管( 1 6 x 1 9 5 或5 0 x 1 0 0 0l a m ) 正好能解决这一问题。当光从矩形的长边进入时，极大地增长了吸收光程，使检测灵敏度有很大提高，其较大的高宽比和面积体积比导致散热性能良好，使焦耳热的影响大大降低，同时明显增大的光程能有效地提高灵敏度。只是矩形毛细管的形状特殊，制作成本较高，使它的推广受到了一定的影响。1 2 2l i f 检测器激光诱导荧光( l i f ) 作为使用高强度激光光源的荧光检测方法，是c e 中灵敏度最高的检测方法之一。自1 9 8 5 年g a s s m a n n 等【1 3 】将其引入c e 以来，c e 激光诱导荧光( c e l i f ) 方法获得了长足的发展，已有多篇有关l 1 f 和c e l i f的综述发表 1 4 2 5 。一般情况下l i f 的检测限在1 0 。t o o l l 左右，比常规紫外吸收检测法低3 4 个数量级。近年来的研究结果显示其在优化条件下的检测限可达到单个分予检测水平。激光光源一般使用氩离予激光器( 4 8 8n m ) 年l l 氦氖激光器( 5 9 4n m ) ，而氦一镉激光器( 3 2 5n m ) 因寿命较短使用较少。c e l i f 中一般通过透镜将激光束在毛细管中聚焦成很小的光斑，从而大大提高了它的峰值功率密度。使用通常的氩离子、氦氖激光器的l i f 在方法学上已取得很大成就，在d n a 测序方面的成功应用，推动了人类基因组计划的提前完成，并已被应用于单细胞分析 2 6 ，单个囊泡分析 2 7 和单分予检测 2 8 3 2 。但由于激光器本身的限制，目前c e l i f 的实际应用还不够广泛。l i f 可采用柱上和柱后两种检测方式。柱上检测方式按入射激光，毛细管和荧光采集方向的相对位置，又可分为正交型和共线性两种。因此，目前已采用的c e l 1 f 检测器可分为正交型激光诱导荧光检测器，共线型激光诱导荧光检测器和柱后鞘流池激光诱导荧光检测器等类型。新型c e 光学榆测器的研制及应用研究1 2 2 1 正交型激光诱导荧光检测器在该类检测器中，荧光采集物镜应与激光束成9 0 度角，垂直于毛细管和入射激光所构成的平面( 见图1 1 ) 。为了减少毛细管壁的反射干扰，要把激光准确聚焦到毛细管的中心，或让入射光与毛细管夹角保持在3 0 度左右。该类检测器因结构易于设计和制作，早期使用较多。常规l i f t 3 3 1 可利用收集荧光的显微镜头( 集光透镜) 观察前后毛细管壁及溶质的成像，通过控制镜头的位置减少管壁荧光的干扰，这在使用近紫外波段的激光时非常有用。a n a z a w a 等 3 4 通过分析光路证明此结构可用于使用多根毛细管的毛细管阵列电泳。正交型结构需要两套光学体系( 激发光路与发射光路) ，结构相对复杂。另外由于空间位阻，不利于使用较大数值孔径的透镜，影响了荧光收集效率的提高。图1 1 正交型激光诱导荧光检测器结构示意图f i g u r e1 1s c h e m a t i cd i a g r a mo ft h eo a h o g o n a ll a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c e1 1 a s e r ：2 f i l t e r ；3 1 e n s ：4 c a p i l l a r y ；5 m i c r o s c o p eo b j e c t i v e ：6 s p a t i a lf i l t e r7 p m t1 2 2 2 共线型激光诱导荧光检测器在该类检测器中，光源、聚焦光和荧光共平面，且入射光和发射荧光采用同一透镜聚焦，激发光路和发射光路相互成1 8 0 。，激光聚焦光斑和光阑分别处第一章文献综述于透镜的两个共扼焦点上。它仅需一套光学体系，结构简单，可使用大口径显微镜头，提高荧光收集效率 3 5 。因此它在荧光收集效率及降低背景噪声等方面均达到较高水平，是目前c e l i f 中应用最广泛的检测器。图12 共线型激光诱导荧光检测器结构示意图f i g u r e 】2s c h e m a t i cd i a g r a mo f t h ec o l l i n e a rl a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c el a s e r ；2f i l t e r ；3c a p i l l a r y ；4 m i c r o s c o p eo b j e c t i v e ：5 d i c h r o i cm i r r o r6 s p a t i a lf i l t e r ；7 p m t1 2 2 - 3 柱后鞘流池激光诱导荧光检测器柱后鞘流检测池是根据层流流动原理设计的。该检测池使柱流出物限制在中心通道，溶剂自两侧通过。调整溶剂流速使其与柱流出物形成层流，在此条件下，样品流与溶剂流不相混合。溶剂在此起到保护鞘的作用( 见图1 3 ) 。该池的特点是：( 1 ) 有效检测池体积小。可通过调节溶剂和流出物的相对流速调整池体积，池体积般为6n l 1 5 0n l 。( 2 ) 散射光的影响小。石英空气或石英溶剂之间的折射率差别较大，这些界面是光散射的主要来源。由于石英窗与样品流距离较远，而溶剂流样品流的折射率差别较小，因而石英窗上的散射光影响很小。( 3 ) 避免了样品污染石英窗 3 6 1 。正是基于这些优点，该类检测池已成为l i f 最有效的一种柱后检测池。无论在灵敏度还是在降低检测限方面都优于其他类型的检测池。另外，它也很好地保持了色谱分离结果而没有明显新型c e 光学检测器的研制发心用研究的柱效损失。其缺点是结构复杂，制造成本高。白 斟8 一口图1 3 柱后鞘流池激光诱导荧光检测器结构示意图f i g u r e1 3s c h e m a t i cd i a g r a mo f t h el a s e ri n d u c e df l u o r e