（水产养殖专业论文）草鱼成纤维细胞生长因子8（FGF8）的cDNA克隆与序列分析.pdf

摘要 草鱼成纤维细胞成长因子一8 ( f g f 8 ) 的e d n a 克 隆与序列分析 水产养殖专业硕士研究生孙翰昌 指导老师丁诗华教授 摘要 成纤维细胞生长因子8 ( f l b r o b l a s t 鄹恤自c t o f8 ，f g f s ) 是最初从一种小鼠雄激素依赖性 乳腺癌细胞系s c - 3 的培养液中分离出来的成纤维细胞生长因子家族的成员，与f g f l 8 和 f g f l 7 属于同一个亚家族。研究证实f g f 8 是一种组织发育过程中的重要分泌性信号分子，参 与多种组织的发育，尤其在脑等外胚层器官的发育过程中起了重要作用。此外，f g f 8 能有效 促进组织损伤的修复，在神经干细胞培养过程也起重要的诱导作用。 本研究以草鱼为实验对象，运用了逆转录p c r 结合r a c e 方法克隆草鱼f g f 8e d n a 序 列，并运用生物信息学手段对其进行分析，旨在揭示鱼类疾病的病理机制、了解草鱼胚胎发 育过程中的细胞生长、组织形成的生理调控机理。经p c r 条件的优化，最终克隆出了草鱼成 纤维细胞生长因子- 8 ( t u f a ) 的c d n a 序列，并对其进行深入的分析。 1 从草鱼脑中提取总r n a 。以总r n a 为模板，利用a m v 反转录酶和试剂盒自带的o l i g o d t - 3s i t e s a d a p t o r p r i m e r 为引物，合成第一链e d n a 。接下来的p c r 反应中，以第一链c d n a 为模板，人工合成的寡聚核苷酸引物为引物，用t a qd n a 聚合酶进行扩增反应。反应条件为 9 4 变性6 0s ，4 8 退火6 0s e e ，7 2 延伸9 0s ，反应4 0 循环。p c r 扩增产物转化进大 肠杆菌( d h s a ) 中。用于测序。结果显示，草鱼成纤维细胞生长因子8 c d n a 序列长度为8 8 7 b p ， 包括一个长度为1 0 0 个核苷酸的5 非编码区序列( 5 i y i r ) ，起始密码子( a t g ) 、编码2 1 0 个氨 基酸的开放阅读框( o r f ) 、终止密码子( r o a ) 和一个包括加尾信号( a a t a a a ) 、p o l y ( a ) 信号的3 非编码区序列( 3 u t r ) ，3 非编码区长度为9 r 7 个核苷酸。编码区核苷酸长度为6 8 7 b p 。 经同源性比较分析，可以确定实验结果为f g f 8e d n a 序列。 2 草鱼f g f 8 编码的氨基酸多肽链全长2 1 0 个氨基酸，包含4 0 个碱性氨基酸、1 6 个酸性 氨基酸。草鱼f g f 8 蛋白质的n 端区域包含一个氨基酸序列为m r u p s r l s y if i h i f a f ( y 协 的信号肽，切割位点在a l a 2 2 和g l n 2 3 之问。蛋白质n - 末端的信号肽被认为是分泌蛋白的明 显特征，提示草鱼f g f 8 蛋白是分泌蛋白。氨基酸的一级结构中在a s h 3 7 和a s n l 3 6 氨基酸位 点出现n 糖基化结构，分别为a s n - p h e - t h r 和a s n - t y r - t h r 。草鱼f g f 8 推导蛋白的分子量 m w = 2 4 6 8k d a ，等电点p l = l o 9 3 。其二级结构包含a 一螺旋、b 转角、b 折叠、随机卷曲等结 构形式。从分析图中可以看出，1 3 折叠的比例比较高，其次是o 螺旋，1 3 转角、随机卷曲含 量最少。 西南大学硕士学位论文 3 系统发育进化树分析显示，鲤科鱼类的f g f 8 蛋白很相似，斑马鱼、墨西哥脂鲤两种 鲤科鱼类的f g f 8 蛋白均含有2 1 0 个氨基酸，同源性9 7 1 。本实验克隆的草鱼f g f 8 蛋白也 具有2 1 0 个氨基酸，与上述两个鲤科鱼类的f g f 8 氨基酸序列同源性达到9 7 以上。此外，草 鱼f g f 8 蛋白与其他物种也有很高的同源性，如与鸡、斑点火蜥蜴、热带巨蜥、蝾螈的f g f 8 氨基酸序列的同源性较高，分别为8 2 4 、8 6 1 、8 2 9 、8 1 o ，与被囊动物海鞘f g f 8 氨 基酸序列的同源性最低，只有2 8 2 。这些结果说明鲤科鱼类f g f 8 在进化过程中保持高度保 守性 h 关键词：草鱼成纤维细胞生长因子8 克隆序列分析 a b s t r a c t c l o n i n ga n ds e q u e n c ea n a l y s i so f f i b r o b l a s t g r o w t hf a c t o r8e d n af r o mg r a s sc a r p ( c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l u s ) m a s t e rc a n d i d a t e h a n - c h a n g ，s u n s u p e r v i s o rp r o f s h i h u a ，d i n g a b s t r a c t f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r8 ( f g 聊i sam e m b e ro ff g f sf a m i l y , w h i c hw a sp u r i f i e df r o ma c o n d i t i o n e dm e d i u mo fs c - 3c e l l ss t i m u l a t e dw i t ht e s t o s t e r o n e s e q u e n c ec o m p a r i s o ni n d i c a t e st h a t f g f 8i sh i g h l yc o n s e r v e db e t w e e nh u m a n sa n dm i c ea n di sm o s th o m o l o g o u st of g f l 8a n df g f l 7 a m o n gt h ef g ff a m i l ym e m b e r s i ti sau n i q u es e c r e t e ds i g n a l i n gm o l e c u l ei ns e v e r a la d u ha n d d e v e l o p i n gt i s s u e sa n dp l a y sac r u c i a lr o l ei nd e v e l o p m e n to fs o m ee c t o d e r m a lo r g a n sl i k em i d b r a i n f u r t h e r m o r e ，t h ef g f 8i sa l s oe f f i c i e n ti nh e a l i n go r g a n i cw o u n d ，c u l t u r i n gt h en e u r a ls t e mc e l l sa n d i n d u c t i o no fd o p a m i n e r g i en e a r o l b i nt h i ss t u d y , af u l ll e n g t he d n ao fg r a s sc a r pf g f 8w a sc l o n e da n dc h a r a c t e d z e df r o mt o t a l r n ao fg r a s s i pb r a i nb yr t - p c ra n dr a c em e t h o d s , a n da n a l y z e db yb i o i n f o n n a t i c s t h e f i n d i n gm a yb eh e l p f u lt o r e v e a lt h ep a t h o l o g ym e c h a n i s mo fs e r i o u sd i s e a s ei nf i s h a n d u n d e r s t a n dp h y s i o l o g i c a lm e c h a n i s mo fc e l l sg r o w t ha n dt i s s u ed e v e l o p m e n td u r i n ge m b r y o n i c d e v e l o p m e n to f c t e n o _ p h a r y n g o d o n d e l u s 1 t o t a l r n a w a s i s o l a t e d f r o m g r a s s c a r p b r a i n t h e f i r s ts t r a n dc d n a w a ss y n t h e s i z e d i n t h e c a t a l y s i s o f a m vr e v e r s e t r a n s c r i p t a s e u s i n g o l i g o d t - 3s i t e sa d a p t o r p r i m e r a sa p r i m e r a n d t h e t o t a l r n a a s a t e m p l a t e t h e n t h e p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ( p o t ) w a s p e r f o r m e d i n t h e c a t a l y s i s o f t a q d n ap o l y m e r a s eu s i n gt h ef i r s ts t r a n dc d n aa sat e m p l a t ea n dt h es y n t h e t i co l i g o n u c l e o t i d e s p r i m e r sa sp r i e r ( 9 4d e g r e e sc ，6 0s ；4 8d e g r e e sc 6 0s ；7 2d e g r e e sc ，9 0s ；4 0c y c l e s ) a f t e rp c r a m p l i f i c a t i o n t h ep r o d u c t sw e r ec l o n e di n t oa ne c o l ie x p r e s s i o nv e c t o r ( d h 5 a ) t h er e s u l ts h o w e d t h a t t h e c d n a o f g r a s s c a r p f g f 8 i s 8 8 7 b p ，w h i c h i n c l u d e sa 5 - u n t r a n s l a t e dr e g i o n ( 5 u t r ，1 0 0 b p ) ， t h es t a r tc o d o n ( a t o ) t h es t e pc o d o no r 3 a ) ，a n d3 - u n t r a n s l a t e dr e g i o n ( 3 u t r ，9 7b p ) t h ee d n a s e q u e n c ea n a l y s i sr e v e a l e da no p e nr e a d i n g f r a m eo f6 8 7b pc o d i n gf o rap r o t e i no f2 1 0a m i n oa c i d s i n c l u d i n g2 2a m i n oa c i d so ft h es i g n a lp e p t i d ea n d 1 8 8a l i l i n oa c i d so ft h en a t u r ep e p t i d e a p o l y a d e n y l a t i o ns i g n a l a a t a a aw a sa l s op r e s e n t 2 9 b a s eu p s t r e a mf r o mt h ep o l yat a n c o m p a r e dw i t hz e b r a f i s ha n dm e x i c a nt e t r a , t h eh o m o l o g yo fn u c l e o t i d es e q u e n c ef o rg r a s sc a r p f g f 8e d n ai s9 6 7 a n d9 0 o ，r e s p e c t i v e l y , i nt h ec o d e dr e g i o n ，i n d i c a t i n gt h a tt h ee x p e r i m e n t a l m 西南大学硕十学位论文 r e s u l ti ss l l r e 2 t h ef u l l - l e n g t hg r a s sc a r pf g f 8p r o - p o l y p e p t i d eo f2 1 0a m i n oa c i d si n c l u d i n g4 0b a s i c a m i n oa d d sa n d1 6a c i d i ca m i n oa c i d s t h e s i g n a l p e p f i d es e q u e n c e i s m r l i p s r l s y l f l h l f a f c y y a , a n di t sc l e a v a g es i t ei sl o c a t e db e t w e e na l a 2 2a n dg i n 2 3 g r a s sc a r pf g f 8 p r o t e i ni sas e c r e t e dp r o t e i ns i n c et h et y p i c a lc h a r a c t e ro f s e c r e t e dp r o t e i ni st h a ti t s n - d o m a i nc o n t a i n sas i g n a lp e p f i d e t h e r ea r et w on - g l y c e s y l a t i o ni nt h es i t e so fa s n 3 7a n d a s n l 3 6 , r e s p e c t i v e l y , w h i c hw e r ea s n - p h e - t h ra n da s h - 3 睁r - t h r t h cm o l e c u l a rw e i g h t0 u w ) o f g r a s sc a r pf g f 8p r o t e i ni s2 4 6 8k d a i t si s o e l e c t n i cp 0 缸0 di sl o 9 3 1 1 l cp r o t e i nc o n t a i n sf o u r m a i ns e c o n d a r ys t r u c t u r e s ：a - h e l i x b s h e e t , b - t u r na n dr a n d o mc o i l 3 a n a l y s i so f p h y l o g e n e t i ct r e es h o w e dt h a tc y p r i n i d a ef i s h e sf g f 8p r o t e i n sa l eh i g h l ys i m i l a r t h e s ef g f 8p r o t e i n sh a v e2 1 0a m i n oa c i d sa n de x h i b i th i g hh o m o l o g ym o r et h a n9 7 1 s i m i l a r l y , t h eg r a s sc a r pf g f 8p r o t e i na l s oh a s2 1 0a m i n oa c i d sa n ds h a r e s9 7 h o m o l o g yw i t hz e b r a f i s ha n d m e x i c a nt e t r a f u r t h e r m o r e ，a m i n oa c i ds e q u e n c eo fg r a s sc a r pf g f 8p r o t e i na l s oh a sh i g h e r h o m o l o g yw i t ho t h e ro r g a n i s m , s u c ha sc h i c k e n , s p o t t e ds a l a m a n d e r , s i l u r a n at r o p i c a f i s a n da x o l o t l ( 8 2 4 、8 6 1 、8 2 9 、8 1 o a m i n oa c i dh o m o l o g y , r e s p e c t i v e l y ) b u tt h e r ei sl o w e s th o m o l o g y w i t hc i o n ai n t e s t i n a l i s ( o n l y2 8 2 铆a l lo fr e s u l t ss u g g e s t e dt h a tc y p r i n i d s ef i s h e sf g f 8i sh i g h l y c o n s e r v a t e di nt h ee v o l u f i o n a lp r o c e s s k e yw o r d s ：c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l u s ，f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r8 ，c l o n i n g , s e q u e n c ea n a l y s i s i v 独创性声明 学位论文题目： 堇鱼盛红丝垫胞盛量国王二! l 里鲤盟鲤鱼旦丛壶隆生庄 列佥盘 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 r 1厶， 学位论文作者：钿，雳镝易签字日期：办髓7 年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 学位论文作者签名：铂、妊 签字日期：7 帕7 年厂月6 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： b 导师签名： 签字日期： jj 翰 研年舌月7 日 邮编： 第一章文献综述 第一章文献综述 成纤维细胞生长因子( f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r ，m f ) 是一类结构相似的能促进成纤维细胞 生长的多肽家族，它是t r o w e l l 和h o f f m a n 等首次发现并命名的，后来研究发现它与肝素有很 高的亲和力，也称为肝素结合生长因子0 e p a 血b i n d i n gg r o w t hf a c t o r ) 【1 , 2 1 。f g f 家族成员分布 在脑神经、肾、卵巢、胎盘、肝脏，骨肌、睾丸、胸腺、心肌、骨细胞、血管内皮细胞、角 膜内皮细胞、晶状体上皮细胞、成纤维细胞、肾上腺皮质、粒细胞和巨噬细胞等组织和细胞 3 1 ， 通过与细胞膜特异受体结合发挥其生物学功能作为f g f 家族成员的f g f 8 具有很重要的生 理作用，特别在胚胎发育过程中起着重要的作用，并且在脊椎动物发育过程中的多个组织里 出现f g f 8 的表达1 4 j 。 1 1 成纤维细胞生长因子( f o f ) 家族成员及其生物学功能 1 1 1 成纤维细胞生长因子家族成员 成纤维细胞生长因子( f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r s 。m f s ) 是一个多基因家族，到目前为止，f g f 家族至少拥有2 3 个成员。广泛存在于从线虫到人类等生物体内嘲，分子量从1 7k d a 到3 8k d a 之间嘲，氨基酸多肽链长度也从6 0 个氨基酸( f g f - 1 的一种可变剪接) 到2 8 8 个氨基酸( f g f - 2 ) 不等，每一个成员都包含一个保守的1 2 0 个氨基酸核心区，这个核心区其中包括六个同样的 氨基酸序列 7 , 8 1 。这些氨基酸由三个外显子编码，所有编码区都是以a u g ( 甲硫氨酸1 为始起密 码子。以人类的f g f 家族成员为例，进行系统发育进化树分析，各成员具有一定的序列同源 性和结构相似性，如图1 。f g f 家族成员多数都具有一个n 端信号肽，属于典型的分泌型生 长因子，可被细胞分泌到胞外。以自分泌或者旁分泌形式发挥调控作用 g a 0 1 西南大学硕+ 学位论文 图1 f g f 家族的亚家族( 姜永，2 0 0 6 ) 1 1 2 成纤维细胞生长因子的生物学功能 f g f s 家族成员具有多种生理学功能，不仅能够诱导成纤维细胞和内皮细胞、软骨细胞、 平滑肌细胞以及黑色素细胞等细胞的增殖，而且还能促进脂肪细胞的分化，诱导巨噬细胞和 成纤维细胞产生白介素6 ( n - 6 ) ，刺激性星型胶质细胞的迁移，以及延长神经细胞的存活i n 1 2 1 此外，f g f 家族在促进胚胎发育、组织形成与修复、炎症、血栓形成、肿瘤发生等生理及病 理过程中起重要作用，同时也能促进纤维蛋白溶解酶原及胶原酶激活物质的分泌参与肿瘤的 侵袭与转移【卅。 1 2f g f 8 的发现及其蛋白质结构 1 9 9 2 年，t a n a k a 等【1 4 】用雄性激素( d 嘴印) 刺激老鼠乳腺癌细胞( “m m a r yc a r c i n o m ac e l l l i n e ，s c - 3 ) 诱导分泌一种类f g f 生长因子，并在睾丸素( t e s t o s t e r o n e ) 刺激下提取了出来，当时命 名为雄激素诱导的生长因子( a n d r o g e n i n d u c e d g m w t h f a c t o r , a i g f ) 。a 1 g f 序列分析发现，它 编码一个具有信号肽的2 1 5 个氨基酸的蛋白质，与己知的f g f 家族有3 0 - 4 0 的同源性。 l o r e n z i 等【1 5 l 也从老鼠的睾丸中分离了a i g f ，并确定它为f g f 家族的第8 个成员f 8 ) 。当 时认为f g f 8 只在睾丸组织中存在，因为在其他成熟组织都没有提取到。直到2 0 0 2 年，z a m m i t 等【1 6 1 研究发现，在结肠、乳房，输卵管，子宫等增生的上皮细胞中都能检测f g f 8 的存在，人 2 第一章文献综述 类乳癌组织及正在泌乳的乳腺中出现f g f 8 的高水平表达。g e m e l 等【1 1 分离的人类f g f 8 c d n a 序列长度约为6 0k b ，包含6 个外显子( 1 a 、i b 、i c 、1 d ，2 、3 ) ，其中外显子2 、3 编 码与鼠科动物的完全一致，1 c 和鼠相差4 个氨基酸，1 b 则和鼠差异显著，仅前1 2 个氨 基酸的密码子与鼠一致，1 b 存在两个终止密码，可能是导致人类f g f 8 没有c 、d 、g 、h 亚 型的原因。f g f 8 与f g f r 2 处于同一染色体区域，已被证明其为f g f r 2 的配体 1 8 1 。 1 3f g f 的作用机制 f g f 只有与受体相结合才能发挥其生物学特性。f g f 信号传导需要f o f 和它的受体酪 氨酸激酶和乙酰肝素硫酸盐蛋白多糖( h s p g ) 在细胞表面的特异性联合作用【1 9 1 。f g f 信号中心 的低聚物交互作用及它与高亲和力细胞表面受体结合作用，均受着肝磷脂类多糖调控【1 9 , 2 0 1 f g f 与受体结合形成三重联合体的过程中f g f - f g f r - h s p g 是逐步结合的。以f g f 2 为例， f g f 2 释放出胞外后，f g f 2 单体优先自我联合，出现f g f 2 二聚体和更高形式低聚物形式， 肝磷脂使它稳定，并调控f g f 2 诱导受体二聚化和激活受体鲫。然后，f g f 2 二聚体再与乙酰 肝素硫酸盐蛋白多糖饵s p g ) 结合，移至细胞表面，接着与f g f 受体( f g f r ) 快速结合，经二聚 化作用后进而形成f g f - f g f r h s p g 三重联合体。f g f - f g f r h s p g 三重联合体模型逐步结合 的过程中f g f r l 和肝磷脂交互作用的相互引力比较弱，f g f 2 能显著增强f g f r l 和肝磷脂的 联合作用，但f g f 配体缺失时f g f r l 和h s p g 无法粘合口”。p a n t o l i a n o 等吲研究认为，f o f 与其受体结合是由一个有足够长度的肝素分子与f g f 和f g f r 以1 ：1 ：l 的比例结合，形成 的不稳定的中间体，然后再与另一个f g b - r 结合，形成一个稳定的构象，使f g f r 二聚化， 引起f g f 的生物活性。i - i s u 等 2 3 1 对k f g 、肝素和k g f r 的结合进行了研究，也得出了肝素： 珏：k f g r 为1 ：1 ：2 的结论。 i c o n 等1 2 4 1 和m o y 等瞵1 的研究结果认为，f g f 与受体结合的机理是单一的乙酰肝素硫酸 盐分子结合在f g f 受体i g i i 的肝素结合区，使相邻近的两个f g f 受体连接，形成松散的受体 二聚体构象。因为f g f 受体的两个免疫球蛋白结构域( i g l i 、l g i i i ) 存在空间位阻，使得两个f g f 受体的胞浆近膜区和膜内的两个酪氨酸激酶区无法相互靠近，而使f g f 受体失活。当f g f 与 肝素和f g f r 结合形成f g f - f g f r h s p g 三重联合体后，改变了f g f r 的k 和i g m 的空问 构象，进而使f g f r 胞内的酪氨酸激酶区相互靠近而自身磷酸化，从而启动f g f 信号传导过 程。s p i v a k - k r o i z m a n 等闭对a f g f 和f g f r 2 的胞外结构域进行研究发现了f g f 与受体结合 的成分比例，f g f - f g f r 复合物是f g f 与f g f r 以1 ：1 的比例结合而成的，在肝素的介导下 形成2 ：2 的复合物，从而引起f g f r 的二聚化，激活f g f r 的活性。h e r r 等吲则提出单一 的蔗糖- 8 - 硫酸能引起f g f 分子形成二聚体，至少八个糖分子以上的肝素分子能促使f g f 形成 二聚体，进而形成四聚体。 3 两南大学硕十学t 7 ：论文 1 4f g f 8 在脊椎动物胚胎发育中的作用 1 4 1f g f 8 对脊椎动物神经系统发育的促进作用 f g f 8 在神经系统的发生与发育过程中起了重要的作用。脑组织一直被认为是神经系统 的调控中心：而f g f 8 具有能改变中脑到小脑的命运，并能促进中脑发育的作用剐。不过， 胚胎囊胚期原始细胞的发生及脑部各部分组织的分化很大程度上依赖于中脑- 后脑边界( 姗) 或峡部( i s o x m i c ) 组织齿状基因e n 9 2 e n 9 3 和f g f 8 具有维持中脑特异性在神经板上，并决定 前脑坤脑分界m b 啦置的功能【3 1 1 。如果前脑原始细胞的e n 9 3 不表达，导致发育调控基因 p a x 6 1 的调控作用降低，前脑细胞及中脑细胞的命运就会被改变，但是胚胎中敲除e n 9 2 和 e n 9 3 ，d m b 也会将其尾部移进中脑领域，不过胚胎中中脑组织的一些片段依然处于前脑和后 脑原始细胞之间。而f g f 8 能够提供一种信号，压制p a x 6 1 ，从而改变原先d m b 对e n g e 厘n 9 3 表达水平的依赖性，使脑组织正常发育。若e n 9 2 e n 9 3 和f g f 8 的缺失，将导致中脑的完全 特异性丢失，前脑和后脑原始细胞溶解。 峡部分泌的f g f 8 调控小脑从后脑的喙状菱形唇发育而来。f g f 8 信号和有丝分裂激活蛋 白畔烤酶通过磷酸化作用调节同源异型基因i r 斌i r o q u o i sh o m e o b o x 2 ，u x 2 ) 的活性，从而促 进小脑的发育p 习。此外，中脑四迭体( r e c t u m ) 的划分也受到f g f 8 信号分子的调控刚。 m a t s u m o t o 等旧研究表明，o t x 2 ( o r t h o d e n t i c l eh o m e o b o x ，o t x 2 池是中脑产生的关键分子，当 鸡胚胎中的i r x 2 和f g f s a 不表达时，中脑的发育与o t x 2 和g b 蛇( g a s t n d a t i o nb r a i n h o m e o b o x , g b x 2 ) 苇f 关。但是f g f s a 的表达没有影响o t x 2 , g b x 2 的表达模式，只是通过增强 e n 2 的表达来促进间脑向中脑的转变。而f g f 8 b 则刚好相反，它抑制o t x 2 的表达，却增强 g b x 2 和l r x 2 的表达，从而改变中脑翼板转变成小脑的命运。 f g f 8 在e 1 0 5d 胚胎期开始表达。调控此期的胚胎中枢神经系统的边缘带和神经中枢的 后根( d r g ) 神经细胞免疫组织的发生，定位胚胎后期和成熟期的中枢神经与外围神经，d r g ， 大动脉交感神经p 4 1 ，决定大脑皮层的神经分布嘲，控制大脑新皮层和丘脑的发育过程中细胞 的分化及各种因子的生理梯度闻。 1 4 2f 6 f 8 对脊椎动物肢体发育的调控作用 所有生物体的生长和不同器官的形成都与发育过程中信号调控有很紧密地关系。f g f 8 是 正常四肢发育过程所必需的信号分子 y q 。若外胚层肢翼发育早期f g f 8 失活，将会导致肢芽尺 寸的实质性减少，形态发育基因s h h ( s o n i ch e d g e h o g , s h h ) 表达的迟滞，f g f 4 表达失调，骨髂 基础的细胞减少和发育不全p s i 。f g f 4 对肌腱连接分子( t e n d o n - a s s o c i a t e dm o l e c u l e ) 也具有调控 作用，f g f 4 缺失时肌肉和四肢的神经系统发育不健全，作为肌腱存在标志的碱性螺旋一环- 螺 旋转录因子( s c l e r a x i s ) 、胞外基质蛋白( t e n a s c i n 肼) 和f g f 8 的表达也会下降。s u n 等1 4 0 采 用在老鼠四肢发育的不同阶段或者外胚层性顼堤( a p i c a le c t o d e n n a lr i d g e ，a e r ) 细胞中使 f g f 4 和f g f 8 失活的方法研究a e r 的f g f 信号作用，也证明了f g f 8 能调控初生肢芽的细 4 第一章文献综述 胞数量，且是远离a e r 的细胞生存必需的信号。f g f 8 和f g f 4 的功能是保证充足的原始细胞 去形成正常的骨骼基础或其他肢翼组织，若f g f 8 和f g f 4 完全缺失则肢翼无法发生。但是， 只有f g f 4 缺失时，a e r 依然存在正常肢体；而肢体末梢发育需要的f g p 8 缺失时，f g f 4 会 补充上来，可见在肢体骨骼发育过程中f g f 4 和f g 礴功能能够相互替换【4 ”。l n 等【4 2 l 运用基 因替换法研究f g f 4 和f g p 8 的功能时也得到相同的结论。 脊椎动物的四肢发育还依赖于外胚层性顶堤( a e r 憔导的信号。研究表明，切除a e r 会 导致小鸡骨骼基础末梢缺少分支；而在老鼠肢芽内部区域有四个f g f s ( f g f 4 ，f g f 8 ，f g f 9 ， f g f l 7 ) 调控a e r 特异活性，但只有f g f 8 能够穿过a e r ，在肢体早期发育行使独特的功能p s i 。 胚胎肢体发生以后，其生长末梢需要间叶细胞的f g f l 0 继续激活a e r 的f g f 8 来促进问叶细 胞的派生，并通过正常调控间叶细胞的生长阻滞特异蛋白1 ( o a s l ) 来促使间叶细胞顶端f g f l 0 的高水平表达。保证a e r 的f g f 8 表达1 4 3 】。此外，肢体的正常发育还需要a e r 上的f g f 4 促 进间叶细胞中促有丝分裂和成形素信号的分泌来调控l 。 除了f g f s 外，还有很多基因在脊椎动物肢体发育过程中发挥作用。骨骼形成的早期， t w i s t 蛋白对成骨细胞的分化具有暂时的抑制效应咿j 。尽管成骨细胞在分化早期核心结合因子 ( c b f a l ) 出现表达，但只有t w i s t 的表达出现下调时，成骨特异性的基因才能开始表达。因 为t w i s t l 蛋白能通过t w i s t 盒g 、j v i s tb o x ) 的结构域与c b f a l 的d n a 结合域相结合而发挥对成 骨细胞分化的负调控作用，所以，过量表达t w i s t l 蛋白可以抑制成骨细胞分化。o r o u r k e 等 州研究表明，i s t ( - - ) 胚胎前肢芽的f g f l 0 表达减少，f g f 4 不表达，f g f 8 和f o f 2 的表达 也发生改变。伴随肢芽间叶细胞s h h 信号相关基因( s h h 、g i l l 、g l i 2 、g i d 、p t c h ) 的表达中断， 间叶细胞的a l x 3 、a l x 4 、p a x l 及p a x 3 活性缺乏，肢芽组织向成骨质和肌浆蛋白组织分化的 能力减弱。同样，t w i s t ( _ - ) 胚胎中后肢胚芽的发育也迟缓，s h h 相关的所有基因活性都减少， f g f 4 和f g f 8 表达减少甚至丧失，但是与f g f 信号相关的f g f l 0 、f g f r 2 表达正常。此外， f i s c h e r 等即l 研究表明，f g f 8 能激活w n t 2 b ，促使转录因子t b x 5 在中胚叶侧板附近表达，进 而诱发前肢形成，进一步揭示了f g f 8 的作用机理。 1 4 3f g f 8 在脊椎动物内脏器官发育过程中的调控作用 f g f 信号在脊椎动物胚胎晚期的心血管、肝脏、肾脏、肺等组织器官的发生、发育过程 中发挥着重要的调控作用。脊椎动物器官发育过程中，心脏发育的不同阶段受到不同f g f 信 号的调控。研究发现，在小鼠中胚层心脏发育过程中，f g f 8 是首要的受体，正常发育的斑马 鱼胚胎中胚层早期原肠胚形成过程中的心脏发生区域有f g f 8 表达【档l 。心脏中胚层f g f 8 的表 达，分泌的成形素促使内胚层的前肠发育成心脏，也促使肝脏的形成【4 9 】。而f g f 8 缺失型胚胎 呈现出特定的心室结构缺失，并且还可观察到n k x 2 5 和g a t a 4 的表达出现明显下降，骨形 态发生蛋白b m p 2 ( b o n em o r p h o g e n e f i cp r o t e i n2 ，b m p 2 ) 和f g f 处理的胚胎非心脏中胚层中心 脏区的发生也被诱导 5 0 5 ”。r c i f c r s 等p 2 1 研究表明，脊椎动物心脏的发育从中胚层两边侧板 5 西南大学硕士学位论文 n k x 2 5 和g a t a 4 等转化因子表达后开始的，斑马鱼胚胎的心脏前端和心室后端出现f g f 8 表 达，对心脏前端细胞发育具有直接的调控功能。a c e 突变体胚胎中n k x 2 5 和g a t a 4 的表达 也减少，但引入f g f 8 能恢复a c e 突变体胚胎中n k x 2 - 5 和g a 2 t a 4 表达，而n k x 2 5 ，g a t a 4 。 f g f 8 和b m p 4 在斑马鱼心脏的不同区域中表达。 胚胎细胞命运和形态发生依赖于邻近组织附近的转换信号分泌分子，肺的形态分化和细胞 分化过程中需要间叶细胞组成的上皮细胞交感作用的调节。肺发育过程中必需的早期分化因 子n k x 2 1 在心脏和胰腺的早期标志物白蛋白和p d x l 分泌后在内胚层前肠腹部表达，标志着 肺、心脏和胰腺的形成 5 3 1 。而与肝脏相似，与心脏中胚叶直接接触的内胚层腹部的发育完全 需要诱导生物体内n k x 2 1 和包括表面活性蛋白c ( s u r f a c t a n tp r o t e i nc 。s p - c ) 和c l a r a 细胞分泌 蛋白( c c s p ) 在内的肺下游靶基因表达，且内胚层的腹部前肠发育与f g f l 和f g f 2 有关，f g f 信号也能诱导肺部n k x 2 1 的分泌。b r o w n 等酬研究发现，t b x l 基因会诱导f g f 8 在咽内皮 层表达来调控心血管、心大动脉和肺动脉平滑肌的分化。f g f 8 还通过依赖生物体内t b x l 的 分泌来促进其在心脏流出物中的表达 5 5 1 。 在人类和老鼠生殖发育过程中，h o x a l 3 突变会导致肢体和泌尿生殖系统畸形。m o r g a n 等 5 6 1 研究小鼠生殖结节发育的早期信号时发现，h o x a l 3 是尿道上皮细胞f g f 8 和b m p 7 正常 表达的基本要求，h o x a l 3 突变实验老鼠中尿道上皮细胞的f g f 8 和b m i 7 表达失败，导致尿 道下裂的发生和问叶细胞侧翼n o g 基因的异常表达。在生物体补充f g 礴后出现正常恢复增 殖，提示f g f 8 直接调控生殖结节发育的早期增殖。此外，小鼠的h o x a l 3 突变也会改变雄性 激素受体的表达。 1 4 4f g f 8 对脊椎动物咽喉系统发育的调控 f g f 8 在早期胚胎发育头部、咽喉及耳组织发育过程中是必需的。前脑和腮弓处表达的 f g f 8 对神经间隙细胞( n e u r a lc r e s t ，n c ) 的发生有很大的作用，从而促进了面部骨骼的形成 5 7 , 5 ”。当端脑和腮弓( b a ) 上的f g f 8 表达清除时，h o x 基因不表达，面部骨骼发育失败， 前脑神经管发育受到抑制。咽动脉和咽腺发育需要咽上皮细胞分泌的f g f 8 信号调控，若清 除外胚层咽弓区的f g f 8 蛋白会导致第四咽弓动脉形成缺失，致使9 5 突变体主动脉弓和锁骨 下动脉畸形，且外胚层第三、四咽弓和外胚层中的f g f 8 切除，导致腺体缺陷和主动脉瓣二叶 化畸形，提示外胚层区域f g f 8 表达对咽和瓣膜发育具有离散功能1 5 9 1 。w a l s h e 等1 6 0 l 研究也表 明，f g f 3 失活会导致第三、四、五、六咽弓软骨基础缺失，而f g f 3 和f g f 8 失活将致使 咽软骨和软骨神经完全缺失。野生型斑马鱼胚胎有足够的f g f 3 和f g f 8 进行的基板的f o x i l 阳性诱导，但在斑马鱼f g f 3 和f g f 8 突变胚胎中出现腮状但b ) 基板标志基因f o x i l 和p a x 2 a 不表达及内胚层咽组织发育受阻【6 l 】。 1 4 5f g f 8 对脊椎动物耳系统发育的调控 脊椎动物的后脑窗体附近外胚层增厚形成耳基板和囊小泡，发育成内耳，再发育成复杂立 6 第一章文献综述 体的听觉平衡器官 6 2 1 。整个耳组织的发育过程受到f g f 家族的生长因子( f o f s 、f o f 3 ) 和d i x 家族的转录因子( d t x 3 b ，d l x 4 b ，s o x 9 a , s o x 9 b ) 的调控。f g f 8 和f g f 3 诱导耳基板和耳囊上皮组织 发育，其缺失就阻碍耳的发育。而消除d l x 3 b ，d l x 4 ba n ds o x 9 a 基因，虽然依然有一些离散的耳 细胞形成耳上皮组织，但是耳组织无法正常发育，且s o x 9 b 被封锁后这些细胞就不再出现叫 h