（高分子化学与物理专业论文）分子印迹聚合物的设计、制备及应用.pdf

摘要 得到高 效液相色谱分离填料。通 过采用不同的流动 相可实 现懈皮素和其结构相 似物的 分离。该材料 用作固 相萃取 填料， 可实 现懈皮素的 有效吸附分离。 关键词:分子印迹 蛋白质 壳聚糖 懈皮素 a b s t r a c t ab s t r a c t c h i t o s a n w a s u s e d a s f u n c t i o n a l m a c r o - m o n o m e r t o d e s i g n , p r e p a r e m o l e c u l a r l y i m p r i n t e d p o l y m e r s ( m i p s ) f o r s e p a r a t i o n p r o t e i n s o r n a t u r a l p r o d u c t s . f o r s e p a r a t e p r o t e i n s , f o u r s i m p l y m o l e c u l a r l y i m p r i n t e d p o l y m e r s ( mi p s ) w e r e p r e p a r e d u s i n g h e m o g l o b in ( h b ) a s t h e i m p r i n t e d m o l e c u l e . t h e f i r s t w a s u s e d a c ry l a m i d e a s t h e f u n c t i o n a l mo n o me r a n d c r o s s - l i n k e d c h i t o s a n b e a d s a s t h e s u p p o r t i n g m a t r i x , r e s p e c t i v e l y . t h e m i p b e a d s w e r e fr e e d fr o m t h e s u r r o u n d i n g p o l y a c ry l a m i d e g e l 妙 w a s h i n g . t h e l a n g m u i r a n d f r e u n d l i c h a d s o r p t i o n m o d e l s w e r e a p p l i e d t o d e s c r i b e t h e e q u i l i b r i u m i s o t h e r m s . l a n g m u i r a n a l y s i s s h o w e d t h a t a n e q u a l c l a s s o f a d s o r p t i o n w as f o r m e d i n t h e mi n a n d t h e a d s o r p t i o n e q u i l i b r i u m c o n s t a n t a n d t h e m a x i m u m a d s o r p t i o n c a p a c ity w e r e e v a l u a t e d . t h e m i n h as m u c h h i g h e r a d s o r p t i o n c a p a c i t y f o r h e m o g l o b i n t h a n t h e n o n - i m p r i n t e d p o ly m e r w i t h t h e s a m e c h e m i c a l c o mp o s i t i o n , a n d t h e mi p a l s o h a s a h i g h e r s e l e c t i v i ty f o r t h e i mp r i n t e d m o l e c u l e . t h e mi p s c a n b e r e u s e d i n a n e a s y w a y a n d t h e r e c o v e ry c o e f f i c i e n t w as v e ry h i g h a t l o w c o n c e n t r a t i o n . t h e s e c o n d w as u s e d ma l e i c a n h y d r i d e m o d i f i e d c h i t o s a n b e a d s a s t h e s u p p o rt i n g m a t r i x , t h e a c ryl a m i d e w as g r a ft e d o n t o t h e m o d i f i e d c h i t o s a n b e a d s b y t h e v i n y l g r o u p s . t h e o b t a i n e d mi p c a n s e l e c t i v e l y a d s o r b h b , a n d t h e a d s o r p t i o n c a p a c i ty i s h i g h . t h i s m i p b e a d s w e r e u s e d as s o l i d p h as e i n t h e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y , c a n s e p a r a t e t h e p r o t e i n s m i x t u r e w h i c h c o n t a i n 1 71 b a n d b s a e ff e c t i v e l y . t h e t h i r d m i p w as c h i t o s a n / p o l y a c ry l a m i d e s e m i - i n t e r p e n e t r a t i n g p o l y m e r n e t w o r k ( s e m i - i p n ) h y d r o g e l . t h e h y d r o g e l o b t a i n e d h a s b e e n i n v e s t i g a t e d b y u s i n g t h e r m a l a n a l y s i s , x - r a y d i f fr a c t i o n , d i ff e r e n t i a l s c a n n i n g c a l o r i m e t ry ( d s c ) , a n d e n v i r o n m e n t a l s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p e ( e s e m ) . t h e i m p r i n t e d s e m i - i p n h y d r o g e l h a s a m u c h h i g h e r a d s o r p t i o n c a p a c i ty f o r h e m o g l o b i n t h a n t h e n o n i m p r i n t e d h y d r o g e l w i t h t h e s a m e c h e m i c a l c o m p o s i t i o n a n d a l s o h as a h i g h e r s e l e c t i v i ty f o r t h e i m p r i n t e d m o l e c u l e . t h e f o u r t h m i p w as p r e p a r e d u s i n g t w i c e - c o a t e d s i l i c a p a rt i c l e s w i t h s p e c i f i c r e c o g n i t i o n s i t e s f o r h e m o g l o b i n . c h i t o s a n w as u s e d as i n t e r m e d i u m t o b e c o a t e d o n s i l i c a p a r t i c l e s v i a p h ase i n v e r s i o n p r o c e s s , a n d t h e a b u n d a n c e o f e x p o s e d a mi n e g r o u p s 困场) w e r e a c t i v e s i t e s f o r i n t r o d u c i n g ab s t r a c t a l d e h y d e g r o u p s . a ft e r h b w a s c o v a l e n t ly i m m o b i l i z e d 妙 f o r m i n g i m i n e b o n d s w i t h t h e a l d e h y d e g r o u p s , a c ry l a m i d e w a s t h e n p o l y m e r i z e d o n t o c h i t o s a n c o a t e d s i l i c a p a r t i c l e s t o f o r m t h e r e c o g n i t i o n c a v i t i e s . t h e o b t a i n e d mi p p a r t i c l e s w e r e c h a r a c t e r i z e d b y f t - i r s p e c t r o s c o p y , t h e r m o g r a v i m e t r i c a n a ly s i s ( t g ) , a n d s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( s e m ) . t h e m i p b e a d s e x h i b i t e d s e l e c t i v e l y a d s o r p t i o n f o r t h e i m p r i n t e d p r o t e i n c o m p a r e d t o t h e n o n - s e l e c t iv e l y a d s o r p t io n o f m o s t o f p r o t e i n s o f t h e ni p b e a d s . t w o d i f f e r e n t m a t e r i a l s w e r e u s e d t o s e p a r a t e fl a v o n o i d c o m p o u n d s , o n e m a t e r i a l w as p r e p a r e d b y m o l e c u l a r i m p r i n t i n g m e t h o d , i n w h i c h q u e r c e t i n w a s u s e d as t h e im p r i n t e d m o l e c u l e , m e t h a c ry l i c a c i d as f u n c t i o n a l m o n o me r a n d m a c r o p o r o u s c h i t o s a n b e a d s as f u n c t i o n a l m a t r i x . t h e o b t a i n e d m o l e c u l a r l y i m p r i n t e d p o l y m e r m a t e r i a l s w e r e e v al u a t e d b y l i q u i d c h r o m a t o g r a p h . t h e m i p e x h i b i t e d a h i g h e r s e l e c t i v i t y f o r q u e r c e t i n i n a m i x t u r e o f fl a v o n o i d s t h a n t h e n o n - i m p r i n t e d p o l y m e r 伽i p ) . t h e o t h e r m a t e r i a l w a s p r e p a r e d b y c o p o l y m e r i z a t i o n u s i n g al l y l - b r o m i d e m o d i f i e d c h it o s a n as m a c r o m o n o m e r , e t h y l e n e g l y c o l d i m e t h a c ry l a t e ( e g d m a ) as c r o s s - l i n k e r . t h e m a t e r i a l w as e v a l u a t e d b y c h r o m a t o g r a p h i c a n a l y s i s , i t e x h i b i t e d h i g h s e l e c t i v i t y s e p a r a t i o n f o r q u e r c e t i n a n d i t s s t r u c t u r a l a n a l o g u e s u s i n g d i f f e r e n t m o b i l e p h as e s . t h e m a t e r i al c o u l d d i r e c t l y t r a p a s p e c i f i c c l as s o f c o m p o u n d s i n c l u d i n g q u e r c e t i n a n d k a e m p f e r o l fr o m t h e h y d r o l y z a t e o f g i n g k o b i l o b a e x t r a c t ( g b e ) . t h e s e r e s u lt s d e m o n s t r a t e d t h e p o s s i b i l i t y o f d i r e c t e x t r a c t i o n o f c e r t a i n p h a r m a c o p h o r i c c o n s t i t u e n t s fr o m h e r b u s i n g t h i s m a t e r i al 月 f ur t h e r mo r e , t h e r e s u l t s o f t h i s m a t e r i a l as s p e m a t e r i a l a r e p r e s e n t e d k e y w o r d s : m o le c u l a r i m p r i n t i n g p r o t e i n c h i t o s a n p o l y a c ryl a m i d e 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了 解南开大学关于收集、保存、 使用学位论文的规定， 同意如下各项内容:按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本;学校有权保存学位论文的印 刷本和电 子版， 并采用影印、缩印、 扫描、 数字化或其它 手段保存论文; 学校有权提供目 录检索以 及提供 本学位论文全文或 者部分的阅览服务; 学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交 论文的复印 件和电 子版; 在不以 赢利为目 的的前 提下，学校可以适当复 制论文的部分或全部内容 用于学术活动。 学位论文作者签名: 年月日 经指导教师同 意， 本学位论文属于保密， 在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名:学位论文作者 签名: 解密时间:年月日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下: 洲一 户、分一洲 权气、分， 内 部 5 年( 最 长 5 年 ， 可 少 于5 年 )念 .又 一丫 一 乞 纷 秘 密 * 10 年 、 最 长 1。 年 ，几 。于 10 。一 . 二 一、 - 一 机 密 * 2。 年 最 长 2 。 年 ，一 可 少 ， 2。 年 ) 一 犷 一 鑫 共 ) 么 一 二 类 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明: 所呈交的学 位论文， 是本人在导师指导下， 进行 研究工作所取得的成果。 除文中己 经注明 引用的内 容外， 本学 位论文 的 研究成果不包含任何 他人创作的、 已 公开发表或者没有公 开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的 其他个人和集 体， 均已 在文中以明 确方式标明。 本学位论文原创性声明的 法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名: 年月日 第一章分子印迹聚合物的研究进展 第一章 分子印迹聚合物的研究进展 第一节 分子印 迹技术简介 分子印迹 ( m o l e c u l a r i m p ri n t i n g ) 是指制备对某一特定分子( 模板分子或印 迹 分子)具有选择性的聚合物的过程。它通常可描述为制造识别 “ 分子钥匙”的 人工 “ 锁”的技术。在天然生物体如酶、受体和抗体中，分子识别在生物活性 方面发挥着重要作用，这种高选择性来源于与底物相匹配的空穴的存在。为获 得 这 样的 空穴 ， 人们 应 用小 分 子 环状 或 桶 状 化 合 物 如 冠 醚 q 、 环 番 21 、 环糊 精 3 1 杯芳 烃 4 1等来 模 拟 生 物 体系 。 应 用 分 子印 迹同 样 可以 在 聚 合 物中 制 造 相 似的 空 穴。如果以一种分子充当模板，选用适当的功能单体与 之依据共价或非共价键 的方式预组装后，其周围用交联剂交联，当模板分子除去后，聚合物中就留下 了 与此分子相匹配的空 穴。如果构建合适，这种分子印 迹聚合物就象锁一 样对 此钥匙具有选择性。因此这种技术是一种非常有效的制备具有专一选择性手性 拆分吸附分离材料的方法。 分子印迹的出现源于免疫学，早在二十世纪三十年代 b r e i n l 和 h a u r o w i t z , 而后是m u d d 提出一 种当 抗原 侵入时 生物体产生抗体的理论，后 来由p a u l i n g 做 了进一步说明 s 1 ， 它的基本点是抗体在形 成时 其三维结 构会尽可能的同 抗原 形成 多重作用点， 抗原作为一种模板就会 “ 铸 造”在抗体的结合部位。 后来 “ 克隆 选择” 理论否定了 p a u l i n g的抗体形成 学说， 但这种学说 却为分子印 迹理论奠 定了基础。 从p a u l i n g 理论出 发， 科学家对分 子印 迹进行了 各种尝试， 但直到七、 八十 年代这一技术才真正有所突破。1 9 7 2 年 bl u ff小 组 6 -7 首次 报导成功制备出 分子 印迹聚合物。 经过二三十年的努力，分子印 迹技术趋于成熟，并在分离提纯、 免疫分析、模拟酶以及生物传感器等方面显示出应用潜力和广泛的应用前景。 分子印迹聚合物 ( 简称 m i p )的 制备一般为:印 迹分子与功能单体相互作 用形成超分子复合物，在交联剂的 作用下形成聚合物，然后在一定的条件下除 去印迹分子， 聚合物中就形成了 与印 迹分子空间结构互补的具有多 重作用的空 穴。这样的空穴具有 “ 记忆”功能，可以选择性地吸附待分离混合物中的印迹 第一章分子印迹聚合物的研究进展 面嫁 接印 迹层获得 成功。 先将印 迹分子与功能单体在有机溶剂中反 应形成 加合 物，然后将此加合物与表面活化的硅胶、聚 t r i m 粒子和玻璃介质反应嫁接， 这样获得的分子印迹聚合物解决了传统方法中对模板分子包埋过深或过紧而无 法洗脱下来的问题。 分子印 迹技 术中使用的 单体 包括共价型单体和非共价型 单体。 前者包括乙 烯基官能团的硼酸合二醇、键合有含硼酸官能团的硅烷混合物的硅胶颗粒、键 合有氨基的 硅烷凝胶颗粒。 后者 包括丙 烯酸、 丙烯酞胺、 对乙 基苯乙 烯、亚甲 基丁二酸、二丙烯酞胺一 2 一 甲 基一 1 一 丙磺酸、4 一乙烯基毗咤、2 一乙烯基毗咤。 使用的 交联剂有 n , n 一 亚甲 基双丙烯 酞胺、二甲基 丙烯酸乙 二醇酷、二乙烯基 苯、三丙烯酸季戊四醇酷、三甲氧基丙烷三 甲基丙烯酸醋、季戊四醇四甲基丙 烯酸醋等。 3应用 1 . 1 . 3 . 1色谱分离 m i p最广泛的 研究领域之一是利 用它的特异识别性去分离化混合物。近年 来，引人注目 的立体、特 殊识别 位选择性已被完成. 其适用的印 迹分子范围宽 广，无论是小分子 ( 如氨 基酸、 药物) 还是大分子 ( 如蛋白 质)已被用在各种 印迹技 术中， 并且将制备的 介质用在h p l c , t l c 和c e 分离中 。 另外， 分子印 迹技术已 广泛 地用于 药物地手性拆分中， 这是相当重要的。 目前市场上大约有 5 0 0多种旋光性药物，而 9 0 %被作为外消旋混合物管理，而 手性混合物是一种旋光性药品，往往具有毒副作用。正是基于这一事实，这些 年来，一些国家食品和药物管理局 对新的手性药品 提出了要 求，对映体必须被 分离和分别管理，并进行各自 的毒理 和药理实验， 这就要求 提高分离技术。大 量研究表明，分子印迹技术能满足这一技术要求，能将手性混合物拆分，并易 于实现商业化、规模化。 1 . 1 . 3 . 2抗 体和受体模拟物 印迹聚合物被研究的另一 个应用领域是它作为抗体和受体模拟物的适用 性。研究发现，mi p具有类似于抗体和受体的高度特异识别性，因此可被用来 代 替 抗 体 而 用 于 免 疫 测 定 中 。 1 9 9 3 年 ， m a ta k i s 等 2 41 首 先 在 这 一 领 域 做了 报 道 ， 第一章分子印迹聚合物的研究进展 他们用支气管扩张药品茶碱和安神药安定为模板分子制备的印迹聚合物显示出 惊人的专一识别性。通过竞争性放射免疫测定发现，mi p的相关识别结构是不 存在的或远低于印迹分子，但它们的交叉反应同单克隆抗体一致。由于分子印 迹聚合物的物理化学性质稳定， 保证了 识别性质的高度稳定性。m a r r i a k e m p e 等2 5 】用印 迹聚合物代替抗体在放射免疫测定中 检测药物中 的吗啡、 茶碱等。但 值得注意的是某些天然抗体的印 迹聚合 物是难以 获得的，如免疫抑制性药品 和 小分子非免疫性物质。对于小分 子化合物，通常需连接一个载体分子， 但这样 可能会导致抗原性质发生相当大的变化。 分子印迹聚合物也可看作受体模拟物，一个例子是肾上腺受体模拟物的制 备。除了药品的交叉反应研究外，受体模拟物还可用于新药品的检测库。 1 . 1 . 3 . 3固相萃取 s e lle r g r e n 2 6 首 次 报 道了 将分 子 印 迹 聚合 物 用 于固 相 萃取 。 近年 来 ， 相 续 有 一些报道 z 7 出现， 这种方法可用于医药、 食品 和环境分析样品的制备。通常， 样品的制备都包括溶剂萃取，由于分子印迹技术的出现 ，这可以用固相萃取代 替，并且可利用分子印迹聚合物选择性富集目标分析物 。由于印迹聚合物既可 在有机溶剂中 使用， 又可在水溶液中使用，故与其他萃取过程相比， 具有 独特 的优点。 特殊识别现象在传感器技术中 扮演了一 个重要的角色。化学或生物 传感器， 都是由 识别元件和与其紧密接触的 转换器组成的，它将对分析物产生的 应答信 号转变成输出信号。关于环境监测、生 物医疗、食品分析等的传感器都是将生 物分子 ( 如酶、抗体)作为其 特异识 别元件。由 于生物分 子物理 化学稳定性差， 从而导致了人造受体得到了广泛的重视。分子印迹系统的有利之处在于其识别 位是 “ 特制的”，并且同时引入了固相聚合支撑物。正是考虑到 mi p有非常高 的特异性及物理化学稳定性，科学家们在这一方面做了大量的尝试。 1 9 9 1 年， mo s b a c h 等首次将印 迹与传 感器技术结合 起来，利用mi p 作为识 别 元件， 制备出生 物传感器并申 请了 专利，后来陆续有人报道了 关于氨基联苯、 吗啡、绣去津等的m i p 传感器的 研究.目 前利 用分子印迹聚合物生产的传感器 已用于实际测定中，并且可望用于光学传感器。 第一章分子印迹聚合物的研究进展 1 . 1 . 3 . 5在催化和合成中的应用 ( 1 )催化作用 长期以来，化学家们梦想着生产酶模拟物或人工酶作为新型的催化剂但取 得的 进展及其微小。 而随着分 子印 迹技术的出现， 使这 一状况大为改 观。 在 1 9 8 7 年， l e o n h a r d t 等2 8 1 利用硝 基苯 一 甲 基磷酸酷为模板 制备得到分子印迹聚合物， 并 将其 用于对硝基苯苯乙酸酷的 水解， 所值的 m i p加 速了 水解过程。 接着又有大 量报 道出 现，利用具有催化活 性的m i p作为 底物， 过渡状态或产品 模拟物显示 出其有利之处。 ( 2 )在合成中强化反应 1 9 9 3 年，m o s b a c h 等阐述了将m i p 用于 化学合 成的 原理， 尽管制得的m i p 不具有催化活性，但是由于其具有特殊的键合性而加速反应物的合成。最近， 有人报道将类似的系统用于改善不太理想的酶反应的热力学平衡，原理是利用 以产物为模板制备的 mi p去连续吸附产物，而将其清除掉。 第一章分子印迹聚合物的研究进展 第二节蛋白 质分子印 迹聚合物的制备 1 . 2 . 1蛋白 质分 子印 迹聚 合 物的 制备 条件 目前用 于印迹 的蛋 白质 种类 多种多样 ，较 为常 用的有 牛血清 蛋 白 ( b s a ) 29 ,3 1,3 2 1、 血 红蛋白 (m) 2 9 ,3 4 ,3 7,3 8 1 、 核 糖 核 酸 酶3 1,33 ,3 7 ,3 8,39 和 溶菌 酶 4 0 ,4 1 等 等。 蛋白质是水溶性生物大分子，对其识别主要发生在水体系中，所以选择合 适的 单体使得到的m i p 在水中 识别蛋白 质显得尤为重要。对蛋白 质的印迹目 前 常采用的 单体有丙 烯酸 3 5 , 3 6 、甲 基丙烯酸3 0 ,3 1 、 丙烯酞胺 3 5 -3 8 , n - ( 1 一 乙 烯节基 ) 亚 氨 基 二乙 酸 铜 ( 1 1 ) 3 3 1, n n ， 一 二甲 基 氨 基 丙 基 丙 烯 酞 胺 35 ,3 61 等 。 在实 际 中 为 了使印迹分子与单体间作用力的种类和数量增加，也可以将不同的功能单体混 合使用， 如甲 基丙烯酸与2 一 乙 烯基毗吮3 1 1共用， 丙烯酸与丙烯酞 胺3 5 ,3 6 共用等。 另外， 也可以 采用天然产物如壳聚糖作为基 质制备mi p 2 9 。 在众多 功能单体中 较为常用的为甲基丙烯酸和丙 烯酞胺。前者的梭基可以以 离子键方 式与氨基发 生作用， 也可以以氢键方式与酞胺、竣基发生作用。后者是色谱和电泳中常用 的惰性凝胶单体，适于蛋白质的分离纯化。它的酞胺功能团即使在极性溶剂中 也可以 形成较强的氢键，另外和狡基不同的是，酞 胺基在水溶液不会离子 化。 以蛋白质为印迹分子时，蛋白质中的肤键可以和酞胺形成较强的作用力。因此， 迄今为止，选择性较好的蛋白质印迹聚合物是以丙烯酞胺为功能单体制备的。 印迹聚合物的选择性与交联剂的种类和用量有密切的关系。对交联剂的选 择既要考虑其应具有适当的柔性以使孔穴具有良好的可近性，又要有一定的刚 性和交联度以 维持孔穴的形 状.根据选择的功能单体不同可以 选择不同的 交联 剂，目 前 常 用的 有 双甲 基丙 烯 酸乙 二 醇 酷 (e g d m a ) 3 0l , n n ，一 亚甲 基 双丙 烯酞 胺 3 5-3 8 , n ,n - 1 ,2 - 经基 亚甲 基 双丙 烯酞 胺 3 5 ,3 6 、 三甲 氧 基 丙 烷 三甲 基 丙 烯 酸 醋 (t r im ) p 1喀。 m i p 的 制 备 通 常 是 通 过自 由 基 引 发聚 合 而 成的 。 根 据 不同 的 制 备 方法， 采用不同的引发剂。 考虑到蛋白 质分子的活性，目 前常用偶氮二异丁睛 (a i b n ) 引 发 13 0 ,3 11 ( 低 温 或 光引 发) ， 或 用 水 溶 性的 过硫 酸 盐 一 四甲 基 亚乙 二 胺 (t e m e 功3 5 一的 氧 化 一 还 原 体 系 引 发 。 引 发 聚 合 反 应前 ， 反 应 混 合 液 要 通 氮 气 除 氧，因为氧气的存在会淬灭自 由基，使聚合反 应不完全， 甚至不能反应。 第一章分子印迹聚合物的研究进展 1 . 2 . 3蛋白 质分子印迹聚合物的讨论 以 上证据说明蛋白 质印 迹是可行的， 然而， 在分子印迹领域中， 关于蛋白 质分子印 迹发表的文章要少于2 %， 大多数分子印迹的焦点仍 然是具 有生物活性 的小分子。蛋白质分子印迹其固有的困难使其在分子印迹中研究的比较少，尤 其是和其他技术如抗体识别，免疫亲和柱， e l i s a和分离凝胶这些己 经商品化 和成熟的技术相比。 模板分子的尺寸和其空间结构是分子印迹技术的难点。在本 体聚合中， 对 大分子模板的印迹要求是具有高的孔隙率来 进行物 质的传 递。反 过来， 多孔性 也使得聚合物的结构变得脆弱，导致在实际 应用中稳定 性下降。总的 来说， 在 本体聚合中，用于印迹蛋白 质分子的丙烯酸醋类材料 往往 是依 赖于包埋有特异 性识别位点的松弛交联结构的聚合物14 8 ,4 5 , 3 8 ,5 2 ,4 7 1 。 这种低交联度使得物质 传递成 为可能，例如凝胶，其溶胀性能是对模板分子的去除和再吸附的额外因素。通 过环境条件来控制孔径的 尺寸 对蛋白 质分子印 迹极 其有益， 例如成国 祥研究组4 7 1 制备的丙烯酞胺球，在其吸附范围内具有大孔结构。利用水凝胶技术可以将蛋 白 质的包 埋和印迹结合 起来。 例如，用这类 材料 做药 物传递可通过环境条件的 改变来降解或孔径的变化对模板在己知速率下进行释放。然而，用于蛋白质的 分离来讲，这种不稳定性和性能的丧失是不利的。如果通过形成致密结构的材 料来保持稳定性和印迹功能，那么模板分子被包埋的几率也会极大的提高。反 过来，也 会降 低材料的实际 应用 ( 模 板分子 泄漏和总容量的降 低). v e n t o n 6 3 1 等人所制 备的更为 传统的高 交联度聚合物， 例如用溶液一 凝胶法制备的蛋白 质 印迹聚合 物，可 用以 识别蛋白 质分子; 然而，由 于孔隙 率的原因 ，很大一 部分 蛋白质被包埋在聚合物里。 在薄膜或表面上印迹蛋白质可以极大地降低空间作用的影响，但这也会导 致其他的问题，如印迹位点的不同导致的部分印迹。三维凝胶所产生的不稳定 性由于载 体， 如球 6 9 1 ，玻璃 7 9 1 或聚苯乙 烯 7 6 1 的支持而消失，而且与传 感器件的 结合也 有许多的 优点 7 8 ,7 5 1 。 然而， 二维印 迹同 样会降 低材料的总容量， 从而 会限 制其在一些环境中的实际应用，如用于高容量的分离。 在蛋白质分子印迹过程中，对水溶剂的依赖性也限制了对功能单体、交联 齐 和聚合方法的选择。对传统的分子印迹技术而言，由于水竞争和破坏在模板 分子和功能单体之间形成的氢键，因而并不是最理想的溶剂 9 4 1 。 一些因 环境改 变( p h , 离子强度， 温度) 而引 起的额外 和累 计效应也会影响聚合物的性能4 3 , 7 6 1 第一章分子印迹聚合物的研究进展 第三节 相皮 素分子印 迹聚合物的制备 1 . 3 . 1 棚皮素 简介 棚皮素亦称栋精、榭皮黄素，是黄酮醇的一种代表性化合物，它以糖醉的 形式广 泛存在于包括沙棘在内的 各种植物的果实、叶、 茎、根等各 种组织中 【 9 5 是食品 和中 草药的 一种重要生 理活性物质19 6 1棚皮素 进入体内 可以 与蛋白 质发 生相互作 用， 具有扩张冠状血 管， 降低血脂， 抗血小板聚 集， 抗炎、 抗过敏等 多种生 物活 性及药理作用， 棚皮素及其衍生物在医药、 食品、 化妆品 等领域具 有 广 泛 的 应 用 前 景 9 7 -10 01 。 有 关 懈 皮 素 的 药 理 作 用、 提 取 分离 和 测 定 ，国 内 外 研 究人员做了大量的研究。 棚皮素 ( q u e r c e t i n ) 及其衍生 物是自 然界分布最广的 类黄酮化合物， 具有抗炎、 抗氧化、抗过敏、抗菌抗病毒、抗癌等多方面的药理作用。榭皮素对恶性肿瘤 生长和转移的 抑制作用是近年来 一个十分活跃的 研究课 题， l e i g h t o n 等认为懈皮 素是已 知最强的 抗癌剂之一，能 在毫摩尔浓度直接阻滞 癌细胞增殖，国 外已 将 其作为抗癌药物应用于临床。目 前对榭皮素的抗癌机制尚不完全清楚，笔者将 近年来在此 方面的 研究进展作一 介绍。 对抗自 由 基作用许多物理化学 致癌因 素 均能 使机体组织 产生自由 基，自 由 基易富集于脂质的细胞膜周围，当 达到 一定 浓度时， 就会引 起脂质过氧化， 并可直接作用于嘿吟和嗜睫使细胞 d n a 解链断 裂， 从而诱发癌 变。 懈皮素是有效的自 由 基捕获剂 和抗氧剂，因而具有抗 癌作用。 有实 验表明黄酮类 化合物对超 氧阴 离子( 0 2 , 轻自 由 基( - o h ) 和单线态氧( 1 0 2 ) 均 有良 好 的 清 除 作 用 ， 且 这 种 作 用可 能 与 其 化 学 结 构 上 的 3 ,7 - 经 基 有 关 1o i 。 进 一 步 研究表明懈皮素 可与c u e + , f e + 及m n 2 + 结合， 其抗氧化作用可能是 通过 影响金 属离 子的体内平衡， 从而改变细胞内 氧化状态而实现的。椒皮素能与 超氧阴离 子 络合减少氧自由 基的 产生，与铁 离子络合阻 止轻自由 基的形成， 与脂 质过 氧 化基 ( r o o ) 反应抑制 脂质过氧化过程;同时 榭皮素 可抑制醛糖还原酶减少 n a d p h 消 耗， 从 而 提高 机 体 抗 氧 能 力 (10 2 1。 而 最 近的 研 究 表 明 撇 皮 素 的 细 胞 保 护 作用可能主要是阻断了细胞膜脂类的过氧化过程，而非清除细胞内的氧自由基 1103 10 1 0 m m o v l 的 榭 皮 素 与 h e p g 2 细 胞 系 共 同 孵 育 可 有 效 抑制 核 因 子 . k a p p a b 的 结合 活性， 并对 h 2 0 2 诱导的 d n a 损伤有保护作用 1 0 4 1 . 榭皮素对h 2 0 2 导致的 c a c o - 2 第一章分子印迹聚合物的研究进展 细胞d n a 损伤( 链断裂、嚓吟氧化、嗜 睫氧化) 也 具有保护作用， 但仅 抑制解链 作 用 而 不 改 变 碱 基的 氧 化 水 平 p o s lo r o d g e r s 等以 乳 腺 癌 细 胞系 为 实 验 材 料 ， 发 现 栅皮素除了 增加还原 型谷胧甘肤( g s h ) 的 含量外， 还抑制蛋白、 d n a , r n a 合成， 改变细胞形态， 增强d t - 硫辛酸胺脱氢酶、 n a d p h 细胞色素c 还原酶和谷胧甘肤 还原酶的 活性 1 0 6 1 。因此，减轻氧自 由 基对细胞的 损害和改变细胞 代谢状态可能 是懈皮素抗癌作用的机制之一 c o p e o f fl a c o t t u i d a l 黄周芯本结构 黄酮类化合物泛指两个苯 环( a 与 b ) 通过三个碳原子相互联结 而成的 一系列 化合物 1 07 1 。 主要包括黄酮、 黄酮醇、异黄酮、 二氢黄酮、查耳酮等。 黄酮 类化 合物具有广泛的生物活 性， 包括抗氧化， 抗 衰老， 抗菌， 抗肿瘤等 i o s - 11 1 。 最主 要的是它的抗氧化活性。黄酮类化合物通过酚羚基与自由基反应生成较稳定的 半醒式自由基，从而终止 自由基链式反应，这是黄酮类化合物清除自由基的最 主要机制。清除自由基的能力与其结构特别是芳香环核失电子有关。当这些物 质与自由基反应失电子或供氢时产生新的基团，此基团通过芳香核的自旋作用 被稳定下来，氧化链式反应的传导过程被中断，物质氧化被中断。影响黄酮类 化合物抗氧化作用强弱有以 下几个因素:酚 轻基的 位置及个数， 包括 a 环和 b 环; 2 , 3 位双键是否能与b 环形成共扼体系; 4 位 拨基的 作用:取代基对黄酮 类化合 物 的抗氧化作用也有一定影响。 3 . 2相皮素分子印迹聚合物的制备 目 前， 榭皮素的分子印迹聚合物的 制备都是 采用本体聚合的方法，即将一 定量的印迹分子棚皮素、功能单体、交联剂溶解在一定的溶剂当中，然后在引 发剂的引发下聚合，得到块状聚合物。经粉碎过筛后，装拄表征。 第一章分子印迹聚合物的研究进展 t a b le 1 .3 . 1 t h e d i ff e r e n t mi p s f o r q u e r c e t i n 印迹分子功能单体交联剂引发剂溶剂 p i c e a t a n n o l 12 l mmo l 4 - vp 5 mmo l edma 4 0 t mn o l ai bn 4 2 m g 6 0 0 c c h 3 c n - t h f ( 3 / 1 i o ml ) q u e r c e t i n 1 3 ,1 1 4 0 . 8 mmo l a c ryl a m i d e 4 mmo l edma 4 0 mmo l ai bn 2 2 m g 6 0 0 c thf 9 ml q u e r c e t i n l l s 2 t n mo l 4 - vp 8 mmo l edma 4 0 mmo l ai bn 0 . 4 8 mmo l 6 0c ac e t o n e 1 2 ml q u e r c e t i n 1 1 6 0.8 mmo l a c ryl a m i d e 4 mmo l tri m 2 6 . 7 mmo l ai bn 2 0 mg 6 0 0 c thf 9 ml 第一章分子印迹聚合物的研究进展 第四节 研究课题的提出 分子印迹技术是制备具有分子识别作用的客体材料的技术。通常，只有低 分子量的化合物如氨基酸衍生物、一些药物和杀虫剂用来作为印迹分子，生物 大分子如蛋白 质作为印 迹分子还比较少。采用常规的 带电 荷的单体而制备的蛋 白质分子印迹聚合物的选择性并不理想，这主要是因为印迹所用的单体是极性 的， 如甲 基丙 烯酸， 从而使色谱床或多或少地带有离子交换色谱或亲水色谱的 性质。用惰性的丙烯酞胺为功能单体制备的蛋白质分子印迹聚合物对目标分子 具有良 好的选 择性， 但用溶液聚合方 法得到的聚合物没有规则的几何形状，而 且硬度极低， 在色谱应用中 只允 许很低的 流速。为此，我们选择比较刚性的壳 聚糖为基质，与柔性的具有良好选择性的丙烯酞胺相互结合，刚柔并济，使得 到的蛋白质分子印迹聚合物具有具有良好的选择性。 榭皮素及其衍生物是自 然界分布 最广的 类黄酮化合物， 具有抗炎、抗氧化、 抗过敏、抗菌抗病毒、抗癌等多方面的药理作用。用传统的药物分离的方法来 分离黄酮化合物比较繁琐。 我们希望能够制备不同 类型的分离材料来分离黄酮 类化合物。 第二章 以壳聚糖为基质的蛋白质分子印迹聚合物的制备与性能研究 第二章 以壳聚糖为基质的蛋白质分子印迹聚合物的制备与 性能研究 第一节 前言 分子印迹技术是制备具有分子识别作用的客体材料的技术。通常，只有低 分子量的化合物如氨基 酸衍生物、 一 些药物和杀虫剂用来作为印 迹分子， 生物大 分子如蛋白 质作为印 迹分子还比 较少。 这主要是由 于通常用来印 迹蛋白 质的功能 单体 ( 如甲基丙烯酸) 是极性的， 所产生的色谱床或多或少地带有常规的离子交 换色谱或疏水作用色谱的性质， 也就是说， 由于功能单体和蛋白质之间产生强的 相互作用而丧失了 选 择性。 瑞典的 h j e rt e n研究小组于1 9 9 6 年采用非极性功能 单体 ( 丙烯酞胺和 n , n ， 一 亚甲 基双丙 烯酞胺) 对蛋白 质分子进行印 迹。 所得到 的聚丙烯酸胺凝胶对印迹分子蛋白质的特异性非常高， 如可实现空间结构非常相 似的 马肌红蛋白 和鲸 鱼的 肌红蛋白 的分 离。 但是这种采用溶液聚合的 方法得不到 球型的印 迹聚合物， 而且聚丙烯酞胺 凝胶非常软， 在色谱应用中 只允许很低的流 速。 壳聚糖 ( 2 - 氨基一 2 一 脱氧- b - d - 葡聚糖)是由甲壳素 ( 2 一 乙酞氨基一 2 一 脱氧 - b - d 一 葡聚糖) 脱乙 酞 化得到的天然聚 合物。甲 壳素 广泛存在蟹、 虾等低等动物 以及 藻类、 真菌等低等植 物中， 含量 极其丰富， 是仅次于纤