（化学工程专业论文）腐殖酸类化学化工材料在生物菌制剂中应用的初步研究.pdf

摘要 摘要 在严格试验条件和环境中，单一“菌制剂”拮抗效果明显，当施用该菌制剂 进入大田土壤后，生物种群不能达到优势，抑制目的菌能力下降。通过使用化学 化工材料复配组合，可以改善微环境，使生物菌制剂活力保持旺盛状态，达到生 物治理病原菌的目的。 本文通过对香蕉的黄叶病菌 f u s a r i u mo x y s p o r u m c u b e n s e ( e e s m i t h ) s n y d e r e t h a s e n 分离与鉴定，同时，用这株病原菌与香蕉病株根部附近分离出来 的地衣芽孢杆菌，经过利用化学化工材料改良、优化其配方，制成复配生物菌制 剂，并将该制剂进行了不同阶段田间试验，3 次重复，初步得出以下结论： 1 香蕉黄叶病菌的分离与鉴定 对香蕉黄叶病菌进行了分离纯化，在培养皿和试管中接种，观察病原菌的菌 落生长情况、茵落颜色变化，以及菌落培养4d 后的生长直径，以及对病原菌作 显微镜观察，测量菌丝体中的大型分生孢予、小型分生孢子、厚垣孢子和产孢细 胞，并与参考文献m 中的尖胞镰刀菌图进行对比，分析得出病原菌时比较相符。 用于初步鉴定为尖胞镰刀菌。 2 地衣芽孢杆菌的分离鉴定 本研究从香蕉病株根部附近的土壤中，分离出了2 8 种拮抗菌。通过对地衣芽 孢杆菌进行了形态特征的分析。 经过大量试验，筛选出2 0 4 和2 1 拮抗菌比较理想。同时进行扫描电镜，观察 芽孢的分布密集性、芽孢的裂殖、芽孢的长宽等。通过这些对2 种细菌进行了比 较。与文献嘲中报道的特征相类似，因此，初步鉴定该拮抗菌为：她衣芽孢杆菌 ( b a c i l l u s l i e h e n i f o r m i s ) 。而且，其中2 0 8 和2 1 。都为同一地衣芽孢杆菌属的不 同菌株。 广东t 业犬学硕l 。学位论文 3 香蕉黄叶病的生物防治及其效果 本试验利用该拮抗菌种，经过利用化学化工材料改性制成生物菌制剂，大大 提高生物菌制剂活力。对香蕉的“黄叶病”( 或“香蕉巴拿马病”) 进行田间试验， 通过对比研究，认为利用这两种菌制剂可以控制香蕉巴拿马病毒的危害，达到防 病增产的目的，解决目前生产上迫切需要解决的问题。 4 农药与化工材料应用前景分析 由于化学农药带来环境污染，对生态环境破坏严重，直接威胁人们生命安全， 但是在生产上不能立即取缔或禁止使用。因此，发展。低毒、低残留、低成本、 高效”农药或生物菌制剂，具有广阔的应用前景。 关键词：香蕉；黄叶病；地衣芽孢杆菌；化工材料；菌制剂 u a b s l r a c t t h o u g hs i n g l eb i o l o g i cb a c t e r i u mp r e p a r a t i o nh a do b v i o u se f f e c tu n d e rt h e c o n t r o le n v i r o n m e n t , t h ei n h i b i t i o na c t i v i t yw o u l dd e s c e n db e c a u s et h eb i o l o g i c a l s p e c i e sc o u i d n tt ob ed o m i n a n tw h e np u ti n t ot h es o i l t h ep u r p o s eo fc o m b i n a t i o ns o m ec h e m i s t r ya n dc h e m i c a lm a t e r i a l sw i t h a n t a g o n i s mb a c t e r i u mi st oi m p r o v i n gm i c r o e n v i r o n m e n ta n dk e e p i n gi t sh i g ha c t i v e s t a t e i nt h i sp a p e rt h ep a t h o g e np a r a s i t e so fb a n a n ay e l l o wl e a fo rb l i g h td i s e a s e s f u s a r i u mo x y s p o r u m ，c u b e n s e ( e f s m i t h ) s n y d c fe th a s a n w e i ei s o l a t e da n d i d e n t i f i e d c o m b i n e d 、析mt h eb a c i l l u sl i c h e n i f o r m i si s o l a t e df r o mt h es o i la r o u n d d i s e a s e db a n a n ap r o d u c e dt h eb i o l o g i cb a c t e r i u mp r e p a r a t i o nb yi m p r o v i n gc h e m i s t r y a n dc h e m i c a lm a t e r i a l sa n do p t i m i z i n gi t sc o m p o s i t i o n b yt r e et i m e sf i e l de x p e r i m e n t , g o tt h ec o n c l u s i o n sa sf o l l o w i n g ： 1 t h ei s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no f p a t h o g e np a r a s i t e so f b a n a n ay e l l o wl e a f o r b l i g h td i s e a s e s b a c t e r i u mo fb a n a n ay e l l o wl e a fo rb l i g h td i s e a s e s ( f u s a r i u mo x y s p o r u m ， c u b e n s e lw e r ei s o l a t e da n dp u r i f i e d t h ep a t h o g e n yb a c t e r i u mw a si n o c u l a t e di n t o p l a t e sa n dt u b ef o ro b s e r v i n gi t sg r o 埘h , t h ec h a n g eo fc l o n ec o l o ra n dt h ed i a m e t e r ， c u l t u r e df o r4d a y s n es i z eo fb i gs p o r e s s m a l ls p o r e s , c h l a m y d o s p o r e sa n dt h ec e l lg r o w t h s p o r e sw e r e m e a s u r e db ym i c r o s c o p e t h e nt h ep a r a s i t ew 私c o m p a r e dw i t hf u s a r i u m o x y s p o r u m c u b e n s e ( e e s m i t h ) t h er e s u l t ss h o w e di tw a sf u s a r i u mo x y s p o r u m 2 t h ei s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no f b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s 2 8s t r a 沁o f b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sw e 佗s e p a r a t e df r o mt h es o i la r o u n dr o o to f t h e d i s e a s e db a n a n a si nx i e j it o w ng a o z h o u , g u a n g d o n gp r o v i n c ea n di t sc h a r a c t e r sa n d i i ! f o m a t i o nw e r ea n a l y z e d t h ea n t a g o n i s m e f f e c to ft h e2 矿a n d2 1 。b a c i l l u s l i c h e n i f o r m i sw e r eb e t t e rt h a no t h e r sb ym a n ye x p e r i m e n t sf e s u i t s t h e i rc h a r a c t e r s m e 删e db ys c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p ew e r es i m i l a rt or e f e r e n c e s1 2 1 3 t h eb i o c o n t r o le f f e c to f b a n a n ay e l l o wl e a f d i s e a s e t h eb i o l o g i cb a c t e r i u mp r e p a r a t i o n sw e r em a d eb ym o d i f i e dc h e m i s t r ya n d c h e m i c a lm a t e r i a l sw i t ht h ea n t a g o n i s t i cs t r a i n t h ee x p e r i m e n tr e s u l t ss h o w e dt h et w o b a c t e r i ap r e p a r a t i o n sc o u l dc o n t r o lt h ep a r a s i t e ( f u s a r i u ma 口唧，0 胤) t h e r e f o r e ， c o u l dr e s o l v et h ep r o b l e mo fb a n a n ay e l l o wl e a fd i s e a s ea n de n h a n c et h ey i e l do f b a n a n a 4 t h ea p p l i c a t i o nf o r e g r o u n do f c h e m i s t r yp e s t i c i d ea n dc h e m i c a lm a t e r i a l s c h e m i c a l sb r o u g h tp o l l u t i o nt ot h ee n v i r o n m e n ta n db r o k eu pt h eb a l a n c eo f e c o l o g y , l i f es a f e t yw a sd i r e c t l yt h r e a t e n e db u ti tc o u l dn o tb ea b a n d o n e d o rs t o p p e d c h e m i c a l so rp e s t i c i d e so fl o w e s tt o x i n , l o w e s tr e s i d e s ，l o w e s tc o s ta n dh i g h e s t e f f i c i e n th a v e w i d ea p p l i c a t i o nf o r e g r o u n d k e yw o r d s ：b a n a n ( m u s an a n al o u t ，v a s c u l a r ) ；y e l l o wl e a f d i s e a s e f u s a r i u mo x y s p o r u m f c u b e m e ( e e s m i t h ) s n y d e re th a s e n ；b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ；c h e m i c a lm a t e r i a l s ； b i o l o g i cb a c t e r i u mp r e p a r a t i o n 兰= 耋竺：些：翌翌墼窒星苎查2 耋 第一章化学化工材料的应用技术研究 在二十一世纪的今天，科学技术之飞跃，带来应用学科的日新月异。因此，在学科 之间，相互渗透，相互演化，不断产生新分支或概念，例如：除了传统的无机化学、有机 化学以外，产生了物理化学、分析化学、应用化学、生物化工学、细胞生物学、分子生物 学、发育生物学、药物动力学等等。 因此，有必要认真回顾、总结，化学化工在材料科学领域的研究进展。特别是与化 学农药的关系，以及对生物农药使用改良，其实际意义重大。 1 1 化学化工材料的应用技术 近年来，化学化工材料发展快速。应用在建筑、国防或各个行业中，并取得显著成 就。特别是生物化工学科，化学化工材料的应用越来越受到了人们的高度重视，仅此深入 探讨，正确分析，为促进国民经济发展做出贡献【”。 据报道【l 】：我国2 0 0 5 年农药持续生产，再创历史最高，产量突破百万吨大关。 目前，农业市场需求旺盛，进出口贸易业务活跃，化学农药与化工材料的应用，都 表现强劲优势。促进产业结构调整顺利，产品质量稳定上升，经济效益全面增长。 据报道，在2 0 0 5 年，农药生产数量与前期相比较，各种剂型及总产量都有显著提高 ( 见表1 - 1 ) 。 表| - 12 0 0 5 年全国农药生产与前期的比较 垡! 型曼旦坐坐旦! 堂堂! 型! 鲤垒型i 璺! ! ! i 塑生巴也苎 项目产量( 万吨)增长幅度( ) 占总量( ) i t e m sy i e l d ( x10 4 t )e n h a n c e dr a t e ( )r a t i o ( ) 引包建中( 2 0 0 6 ) i l l 因此，农药生产，是国民经济不可缺少的一部分。其中，化学化工材料的合理应用， 是十分重要的。我们必须科学地、辨证地考察分析，就目前形势来看，以及学科相互渗透， 行业之间彼此的交叉。不能因为环境污染全面否定化学化工材料的开发。 再如：在我国石油和化学工业中，农药行业已经成为出n g , j 汇的主要贸易力量之一。 例如：( 见表1 2 ) 表1 - 22 0 0 5 年全国农药出口业的比较+ 曼坐! ! ! ：! 竺竺型苎塑2 1 堡! ! i ! ! 堂! 鱼! 坠巴堕i 坠! q ! ! 项目数量( 万吨)同期增长( ) 金额( 亿美圆)占( ) i t e m sy i e l d ( x1 0 t )e n h a n c e dr a t e ( ) v a l u e ( x1 0 9 d o l l a r s )r a t i o ( ) 引自包建中( 2 0 0 6 ) f 2 1 明显可以看出：杀虫剂和除草剂的创汇最为突出，到达5 亿美圆以上。与前年同期相 比较，国家农药业在。十五”期间，取得了巨大成就。 另外，根据2 0 0 5 年国家统计局对7 2 3 家限额以上企业比较( 见表1 3 ) 。 表1 - 32 0 0 5 年全国7 2 3 家企业经济效益综合指数 旦坠坦! ：j 坠! ! 垄! 坐堡垒塑! ! 唑：! ! ! ! ! 塑翌堡! 堡! i ! 坐垫! ! ! ! 项目 同期增长( )类别金额( 亿元)同期增长( ) i t e m s e n h a n c e dr a t e ( ) t y p e v a l u e ( x1 0 u a n ) e n h a n c e dr a t i o ( ) 引自包建中( 2 0 0 6 ) 2 第一章化学化工材料的应用技术研究 其中，在实现主要经济指标方面，居行业前2 位的分别是“红太阳集团有限公司”和 “江苏苏化集团有限公司”。2 0 0 5 年，在现价工业总值和产品销售收入方面，他们各为2 7 3 、 3 4 8 和2 6 9 、2 5 1 亿元；在工业增加值上，他们各为7 6 9 和6 0 7 亿元。而在利润总额方 面，“浙江新安化工集团股份有限公司”和“扬州农化工集团有限公司”，分别达到3 2 8 和1 4 7 。亿元。还有新产品产值上，浙江新安化工集团股份有限公司与南通江山农药华工 股份有限公司，分别取得6 7 4 和4 0 1 亿元( 人民币) 业绩。 从以上可以看出，化学农药在保证农业丰收以及国民经济发展中起着非常重要的作 用，但同时我们可以看到化学农药给环境保护、人类的健康带来巨大的潜在威胁。如何发 展高效低毒甚至无毒无害的生物农药，就成为我国乃至世界上迫切需要解决的问题。 1 2 化学化工材料在现代农业中应用 1 9 9 1 年，联合国粮农组织提出，关于持续农业的系统定义为：管理保护自然资源， 并调整工艺技术和机构调整，改革方向，以确保获得满足目前几代人和今后世世代代的要 求，这种( 农业、林业和渔业部f j ) 持续发展，能保护土地、水资源、植物和动物遗传资源， 而且不会造成环境退化，同时，技术适当，经济可行，能被社会接受，以满足不断增长的 人口和粮食需求。 很明显，农业持续发展是一件关系到世世代代人的需求，是农业发展的战略。它涉 及到资源循环利用、保护等，并且在经济、生态、社会发展与文明等方面，均具有积极向 上的作用。这就需要我们在接纳某项先进技术的同时，必须从长远观点着眼，从资源利用 的角度来评价它的应用与推广价值。 农药有不少害处，使用后产生许多不良后果。所以推行“绿色产品”f 3 】、“绿色农药 ( 生物源农药) ”具有重要的作用。例如：在“九五”期间，国家成立了2 个农药创制( 工 程) 中心，大大推动了农药行业科技创新与技术进步1 4 1 。 直至。十五”末，我国自主创制了2 0 多个具有独立知识产权( 国家发明专利) 的高 效低毒新品种。例如：杀虫杀螨类药物，呋喃虫酰肼、硝虫硫磷、倍速菊酯、氯胺磷、丁 广东t 业夫学硕f 一学位论文 烯氟虫晴、氯烯菊酯；除草剂用的丙酯草醚、异丙酯草醚、单密磺隆、单密磺酯、双甲胺 草磷，以及杀菌用的氟吗啉、啶菌恶唑、金核霉粟、素、长川霉素、申嗪霉素、龙克菌等。 研究成果方面，获得国家技术发明二等奖4 项，中国石油和化学工业协会科技发明 和科技进步一等奖6 项，二等奖1 5 项、三等奖2 0 项。例如：催化加氢、不对成合成，定 向催化硝化、薄膜蒸发分离、生物手拆分、生物与化学工程结合等，先进工艺技术。包括 利用草甘膦副产品氯甲烷，回收用于甲基氯硅烷单体合成【2 】。 大力调整行业结构，促进品种、技术创新，重点开发高效、安全、农业生产急需药 物。例如：甲酰甲胺磷、啶虫醚、阿维菌素、甲基阿维菌素、甲基嘧啶啉、吡虫啉、乙酰 甲胺磷、毒死稗、菊酯类农药。2 0 0 7 年元月开始，停止生产、销售高毒农药，禁止在农 业上应用【1 1 。 通过改革、改组、兼并、联合，进行组建“科工贸”、“产学研”相结合体制，向具 有教大经济实力集团企业、资产结构多元化发展。把“化学化工材料”综合利用，特别是 在农业生产中合理利用推向新阶段，重视产能常量、销售收入、质量效益、外贸出口、科 技研发能力等。 1 3 化学化工材料与生物农药技术研究 加强环境保护，是“十一五”主要目标之一。要求治理“三废”，作为新厂审批、核 准条件否决项，否则，不予发证。大力发展“高效、安全、低毒”环保型农药，保护农业 生态品横，保障农产品安全，达到污物排放指标，强化工艺改良，参加全球p o p s 和p i c 公约行动。对行业和地方合作，专门成立“农药工业园”，例如：江苏省启东洋口、山东 省维坊海化基地，实行集团化，规模化、园区化生产。 在2 0 0 6 - 2 0 1 0 年，化学化工以及农药行业，抓住难得发展战略机遇，不懈努力，满足 市场需求，达到1 0 0 万吨生产能力，保护8 5 9 0 万吨农药生产量，完成销售额7 5 0 亿元， 预计出口量5 0 万吨，创汇额达1 7 1 8 亿美圆。创制5 - 1 0 个具有知识产权的高效新品种， 行业内建成2 个获得国际认可的g l p 实验室。 4 第一章化学化工材科的麻用技术研究 同时，涌现出一批资产在5 0 1 0 0 亿元，销售收入达到3 0 5 0 亿元的大型集团企业， 采取经济、行政、法律手段控制、淘汰技术落后、质量低劣，资源浪费、亏损严重的小企 业。创制高效、安全、经济、环境友好( 包括化学或生物源农药) ，产业结构优化、行业整 体管理水平提高，具有世界竞争实力。 化学化工材料，在应用方面，工业、农业、医药、食品、电子技术、信息科学、建筑、 军事或国防等领域广泛丽普遍。 例如：腐殖酸( 有机矿质物) 类农药，就具有以下特点： 1 ) 它来源天然，本身属于环境一部分，无毒、无公害； 2 ) 资源分布广泛，可以说是取之不尽； 3 ) 能够提高药效，满足粮食增产需求。 因此，无论从经济、生态或社会效益评价，它都是非常值得探索和开发利用的化工原 料。 “绿色食品”的概念定义为：不受农药等有害化学物质影响、无农药残留、保持作物 天然品质的食品。而“绿色农药”，则是能够应用于绿色食品生产，并符合环境保护要求 的新型农药f 4 j 。 其中，腐殖酸类农药属于增效剂，同时又是一个激素体。它对作物有很好的生长调节 作用，还能够抑制病菌，防治作物多种病害。也就是说，它是多功能体，特别是具有化学 吸附作用，不改变反应双方原有特性，给予新结合体活力，大幅度提高药效。 据文献报道【4 】，认为：腐殖酸类农药复合体，其增效有4 种作用方式： 1 ) 物理方式，即：表面活性、渗透性、粘着性、以及细胞膜的通透性等。 2 ) 化学方式；主要通过多含氧基团原子与分子相互作用，使分子达到激发太状态， 降低活化能，提高药效； 3 ) 生物房屋，就是具有调节作用功能酶，或者某些功能酶或特殊功能蛋白，提高催 化活性而增加药效； 4 ) 综合方式，由于以上2 或3 种方式，同时起作用所致，结果达到其优化作用。 目前，化学化工材料在生物菌制剂中应用，不断有人迸行尝试和探索( 刘聪敏等，2 0 0 6 ) 1 4 。由于单一生物菌制剂，在严格试验条件和环境中，具有明显效果，但是，当施用该菌 制剂进入大田土壤后，生物种群不能达到优势，抑制目的菌能力下降。通过利用化学化工 材料复配组合，可以改善微环境，使生物菌制剂活力保持旺盛状态，有效达到生物治理病 原菌的目的。 本研究就是通过上述理论分析，进行生产实践，探索香蕉巴拿马病，又名：“黄叶病”， 它是由一种土壤传播的兼性寄生菌，尖胞镰刀菌( f u s a r i u m s p p ) 危害，引起植株在生长 旺盛期枯死的病害，进行生物菌制剂防治试验。初步研制出香蕉“抗霸”生物菌制剂，取 得良好的防治效果。 6 第二章地衣芽孢杆菌的研究进展 第二章地衣芽孢杆菌的研究进展 地衣芽孢杆菌( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ) 是一类分布广泛，重要的微生物，与其他微生物 一起在土壤中起着重要作用【5 l o 其中，一些地衣芽孢杆菌不仅有防病作用，而使产量增加，可以改善植物根际环境， 刺激和调控作物生长，抑制作物病害的发生。 根据这一发现，可以进行深入研究，将该菌研发成为一种微生制剂，部分代替传统化 学农药 7 1 。本文就是围绕着地衣芽孢杆菌对香蕉黄叶病的防治，对香蕉黄叶病菌的拮抗活 性进行研究。 2 1 地衣芽孢杆菌的形状及生化特性 地衣芽孢杆菌研究分别从其形态及生化特性进行阐明。有报道植物枯萎病已用地衣芽 孢杆菌，来抑制其中的病原菌，进行拮抗试验来抑制病原菌的繁殖，达到改善植物的存活 性，提高植物的产量。 鉴定细菌种类，主要依据是形态特征，菌体大小，以及生化特性。根据文献报道，确 定形状特征和生长测定( 见表2 1 ) 【刀。 表2 - 1 地衣芽孢杆菌的形状鉴定 旦垒! ! 三：! ：! 堡翌堡竺翌! ! ! 鲤鱼罂苎i ! 呈! ! 堡! 丝丝! 丝竺查 特征测定结果 m e a s u r e m e n ta n dc h a r a c t e r i s t i c sr e s u l t 菌体大小( 1 a n ) 芽孢 着生方式 形状 长1 7 5 ，宽0 7 中生 短棒状 引自刘魏，范树田，李心治，等( 1 9 9 6 ) 同时，为了进一步了解，确定其分类地位，对其生化特性的鉴定是其重要指标( 见表 2 ) 因此，可以判定为：地衣芽孢杆菌川。 7 表2 - 2 地衣芽孢杆菌的生化特征 t a b l e2 - 2 t h eb i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c so f bl i c h e n i f o r m i s 生化特性测定 t h eb i o - e h e m i c a ie l l a r a c t e r i s t i c sm e a s u r e 反应4 r e a c t i o n 化学物质利用 柠檬酸盐 葡萄糖产酸 木糖产酸 甘露糖产酸 阿拉伯糖产酸 葡萄糖厌氧发酵 接触酶 甲基红反应 v p 反应 淀粉水解 酪素水解 引自刘魏，范树田，李心治，等( 1 9 9 6 ) ；一阳性。 2 2 地衣芽孢杆菌培养 不同微生物对营养要求不同，或者说差异很大，它们需要不断从外界吸收养料，从而 获得能量，合成新的细胞物质。然而，不同营养成份的培养基，特别是生长因子对微生物 生长、细胞物质的合成产生极大的影响嘲。 1 培养基 利用单因素试验确定了葡萄糖、蔗糖和淀粉以1 ：1 ：2 的质量配比混合，作为碳源。以 豆粕作为氮源，包括酵母膏、k 。h p o 。、m g s 0 。作为发酵生产地衣芽孢杆菌的基本培养基成 分。 2 最优培养基配方 通过复合设计及分析，揭示了培养基主要5 种成分对发酵水平的影响大小及其之间相 s 第二章地衣芽孢杆菌的研究进展 互协同作用效果。并预测最优培养基质量配比：2 4 糖总量、3 豆粕、0 3 酵母 膏、0 2 k 揶氇、0 0 6 m g s o + ，根据预测结果，调整培养基，产率大大提高，由原来 3 5 1 0 7 个m l 提高到1 2 1 0 8 个m 1 9 1 。 2 3 地衣芽孢杆菌的拮抗活性 之所以拮抗菌能够防治病害，是因为它在生长中分泌胞外活性物质。具有很强的拮抗 专化性，可以抑制同种菌不同株系或近缘种细胞的生长嘲。 2 3 1 拮抗细菌对病原菌菌丝生长的抑制 拮抗细菌对病原菌菌丝生长，有较强的抑制作用。拮抗细菌不同时间移接对病原菌生 长的抑制效果有较大影响，以往提前移接的抑菌作用最好，其次，是拮抗细菌与病原菌同 时移接，而拮抗细菌延后移接抑菌效果大大下降【1 0 l 。 2 3 2 拮抗细菌对病原菌菌丝的破坏 经拮抗细菌处理后，病原菌菌丝发生扭曲，菌丝颜色变淡；也有出现膨大畸形，胞内 物质减少，菌丝有断裂现象【l l 】。 2 4 地衣芽孢杆菌生物防治机理 生物防治主要是通过拮抗菌及病原菌间的拮抗作用、竞争作用、重寄生作用、诱导抗 性及促生作用进行的。 2 4 1 拮抗作用 9 广东t 业大学硕 。学位论文 拮抗细菌可在代谢过程中，通过产生小分子的抗生素和大分子的抗菌蛋白或胞壁降解 酶类来抑制病原菌的生长、繁殖和侵染1 2 】。后又有发现，抗灰葡萄孢菌等多种病原真菌 的地衣芽孢杆菌培养液中，具有拮抗活性的物质是一种蛋白或多肽。 2 4 2 竞争作用 拮抗细菌可以通过快速生长和繁殖而夺取水分和养分、占有空间、消耗氧气等，以至 削弱和排除同一生境中的某些病原物【1 3 1 。 2 4 3 重寄生作用 p a u l ( 1 9 9 9 ) 1 1 4 1 研究发现一种腐霉对病原菌具有重寄生作用，它进入主菌丝后形成 大量的分枝和有性结构，因而能抑制病原菌症状的出现。 2 4 4 诱导抗性 有些细菌可以诱导寄主产生防御反应，形成局部或系统获得抗性( s a r ) 。童蕴慧( 2 0 0 0 ) 等 1 5 1 发现，地衣芽孢杆菌及其代谢物不仅能直接抑制病原菌孢的生长和繁殖，而且能诱 导植株产生系统获得抗病性【1 6 1 。 2 4 5 促生作用 研究表明，抗病原菌地衣芽孢杆菌对植物也有一定促生效果【m 。不仅能控制病原菌 的发生，而且能增加种子萌发率、根和苗的长度以及植株的活力( 林冠伦) 1 8 1 。 由于生物因子对人畜安全无毒，不污染环境，无残留；对病害的特异性强，伤及天敌 和有益生物作用小，对病原物也只是压低而不是消灭，能保持生态平衡，更符合农业的可 持续发展啤2 0 。2 1 i 。 1 0 第二章地衣芽孢杆菌的研究进展 2 5 展望与应用 本文采用生物防治”j7 】，用化学化工材料改良地衣芽孢杆菌，优化生物菌制剂配方， 对香蕉黄叶病菌进行了拮抗活性的研究，是在对香蕉黄叶病菌瞄2 3 1 的其他拮抗菌的基础 上，从香蕉病株根部附近的土壤中分离出对病原菌有抑制作用的地衣芽孢杆斟“3 3 1 。这 样，既可以达到防治香蕉黄叶病( 又名：巴拿马病) 的目的，又可以减少环境的污染。 随着人类对生态环境的进一步重视，以及农业可持续性发展的需要，生物防治技术势 必将进一步发展，特别是在现代生物技术的应用【批2 “2 4 1 必然会开拓生化科技的新领域。 生物农药的研究和应用，在新世纪之初，迎来一个前所未有的历史机遇和技术挑战，产业 发展前景十分广阔。 因此，利用地衣芽孢杆菌对香蕉黄叶病进行防治，是一种极其有效的方法，可以增加 香蕉的产量，减少了农药的使用，保证了农业可持续性发展。 第三章香蕉黄叶病菌的性状鉴定及防治 自古以来，香蕉在广东很多地区大面积的种植。可是，近年来，香蕉黄叶病的现象越 来越明显，受染范围也不断扩大汹。4 。而直接采用化学药品如农药来进行防治，是很难 达到满意的结果。目前，越来越多的人趋向于对香蕉进行生物防治。 3 1 香蕉黄叶病原鉴定及防治方法 本文对香蕉黄叶病的性状作了详细了解，根据该病菌的生长状况，包括菌丝的形状、 颜色的变化、大型分生孢子及小型分生孢子等，来进行鉴定咖3 ”。并对此病的防治不同方 法作了介绍，以此进行比较，减少症状的发生。 3 2 香蕉黄叶病的性状及鉴定 香蕉黄叶病( b a n a n a y e l l o w l e a f ) ，又称为：。巴拿马病”、。枯萎病”，是危害香蕉的一 种毁灭性病害，研究表明：其病原菌为尖胞镰孢菌株系 f u s a r i u mo x y s p o r u m c u b e n s e ( e f s n 时t h ) s n y d e re th a s e n 1 3 2 1 。 在春植的香蕉中，该病在乱7 月开始发生，g - - 9 月病害逐步加重，1 0 1 1 月为发病高 峰期；而秋植香蕉发病高峰期，是在翌年6 月。春、秋植的粉蕉发病高峰期，一般在1 5 3 3 1 。 3 2 1 香蕉黄叶病的性状 病株先呈特异性黄色，然后向上部叶片发展。同一片叶中，黄化自叶缘开始，通过叶 鞘维管束( v a s c u l a r ) 再逐渐沿叶脉横向扩展至整叶，叶片也随之失绿。由于导管堵塞，毒 素危害使病叶迅速凋萎( w i l t ) ，叶柄支撑力差而倒垂。母株仍可抽发新芽，但新芽终将发 病”1 。 第三章香蕉黄叶病菌的性状罄定及防治 病茎外部表现，在近地面处有若干条纵向裂缝，病茎横切面可见黄红色坏死病变，呈 斑点状或弧形状。肉质根发病腐烂，丧失吸收功能。病株往往失收或大幅减产 3 4 1 。 3 2 2 香蕉黄叶病的鉴定 病菌在p s a 上生长迅速，培养4d 时菌落直径达2 “0g n 3 ，1 5d 左右培养基底面 变成砖红色。气生菌丝体绒状、白色，能产生大、小型分生孢子( 见图版i i ) 。 大型分生孢子镰刀形，无色，有3 至多个隔膜，一般为3 个隔膜，3 隔的分生孢子为 2 8 0 ( 1 2 6 - 5 2 5 ) l l x3 8 ( 2 5 4 2 ) | l ；小型分生孢子数量多，在产孢体上呈假头状着生， 单胞或双胞，为7 0 ( 4 2 - 1 2 2 ) l i 2 7 ( 1 7 - 4 2 ) i i 。 厚垣孢子椭圆形或球形，顶生或间生，单生、2 个联生或多个串生，为8 0 ( 4 2 1 3 4 ) i x 6 8 ( 4 2 一1 1 8 1 l i 。 3 3 香蕉黄叶病防治方法 结合香蕉黄叶病特性，可以利用选育和利用抗病品种、基因工程、化学防治、生物防 治等方法进行防治。 3 3 1 选育和利用抗病品种 加强检疫，使用无病菌种苗。抓好二级无病菌育苗和严格限制病区二级苗、吸芽等带 土材料的调运。二级育苗场必须选取地势高、无水涝而远离发病点的地方，所用基质材料 均须采自无病区，育苗用水必须使用自来水。严禁带病种苗出棚 2 7 1 。 3 3 2 基因工程 随着分子生物学技术的发展，利用基因工程手段进行香蕉抗病育种已成为各国研究热 广东t 业人学硕 。学位论文 点，r e m y ( 1 9 9 8 ) 掣3 5 1 利用基因枪将抗菌肽基因d m a m p l 导入香蕉胚性悬浮培养细胞， 并在其中表达。 因此，利用基因工程手段进行抗病育种，是克服香蕉抗病育种难的新途径，并将发挥 巨大的抗病育种作用 2 2 3 1 。 3 3 3 化学防治 病株挖除后，病穴施石灰及多菌灵杀灭病菌，覆盖土壤。病穴周围2m 范围的蕉株 用5 0 多菌灵杀灭病菌，以土覆盖。病穴周围2n l 范围的蕉株用5 0 多菌灵5 0 0 倍液 淋根，预防病菌侵染 2 3 1 。 3 3 4 生物防治 香蕉枯萎病系尖胞镰刀菌引起的病害，关于此类真菌引起作物枯萎病的生物防治研究 已有一些报道。但是，香蕉枯萎病生物防治的研究，则刚刚起步，主要集中于香蕉枯萎病 拮抗的筛选，及其室内盆栽防治试验。例如：以菌治菌，通过导入抑制香蕉枯萎病的真菌 或细菌，提高香蕉抗病能力1 2 1 。 目前，国内相关研究报道汹“1 ，在研究香蕉内生菌区系时，从果园土壤中分离到几株 对香蕉枯萎病菌有极其显著抑制作用的拮抗菌【l j 。因此，香蕉枯萎病生防菌的筛选，有望 为香蕉枯萎病的防治开辟一条新的途径。 1 4 第四章生物抑苗拈抗试验 第四章生物抑菌拮抗试验 近年来，广东香蕉发生香蕉黄叶病的案例越来越多，严重影响到香蕉的产量“1 。对 香蕉黄叶病菌进行培养，对病原菌的生长特性、形状特征、颜色的变化等进行比较鉴定。 利用该病原菌与香蕉病株附近土壤中的地衣芽孢杆菌进行拮抗试验，经过5 次不同阶 段的试验后，进行比较分析。 4 1 香蕉黄叶病菌培养 本试验对香蕉病株根郝的病原菌进行了培养，以观察这些病原菌是否为引起香蕉黄叶 病的镰刀菌。并用显微镜分析出病原菌的大型分生孢子、小型分生孢子、厚垣孢子及产孢 细胞，与参考文献b 3 仉3 1 t3 研中的引起香蕉黄叶病的镰刀菌，进行了比较鉴定。 4 1 1 材料与方法 1 材料 ( 1 ) 菌种： 从来自广东省高州市谢鸡镇香蕉病株的根部中，分离出1 1 种病原菌。 ( 2 ) 培养基配方( 如表4 - 1 所示) ： 表4 一1 不同培养基成分比较设计 t a b l e4 - i t h ei n g r e d i e n t so f d i f f e r e n tc u l t u r em e d i u m 其中p d a 和p s a 培养基的不同在于使用的是葡萄糖还是蔗糖，而其他成分是相同的， 而且含量也是相同的。 广东t 业大学硕 。学位论文 2 方法： 在进行拮抗试验之前，必须分离获得纯化的病原菌和拮抗菌培养物，并了解其特性。 对其合适培养基必须掌握啪“删，才能够达到预期目的。 ( 1 ) 培养基配制： 每种配方分别分装试管和5 8 个三角瓶，容量为1 3 1 2 ( v 0 1 ) ：经过高压杀菌备用。 ( 2 ) 分离纯化： 取香蕉病株的病菌部交界组织，切成小块1 1 3 】。将小块组织放于7 0 乙醇水溶液中 3 0 - - 6 0s ，转入o 1 升汞( h g c l 2 ) 溶液中3 0 - 6 0s 。然后，用无菌水清洗2 3 次。置于p d a 或p s a 平板上恒温( 2 4 - 一2 7 左右) 培养5 7d ，可见白色絮状菌丝。 ( 3 ) 接种： 将培养皿中比较分散的菌落，用接种环接种到试管斜面。 ( 4 ) 培养温度： 病原性真菌的培养温度为2 4 2 6 。 4 1 2 结果分析 对病原菌b 2 4 菌株进行试管斜面和培育皿中平板培养，与病原菌时作对比。并用显微 镜对这种病原菌作观察，结果表明，这种病原菌，与引起香蕉黄叶病的镰刀菌“堋相似。 4 1 2 1 试管斜面接种后病原菌观察 斜面培养的ld ，可以观察到菌落的四周有少量的菌丝；2d ，菌丝生长的很快，形成 绒毛状；3d ，菌丝的绒毛状变得更加明显，并有少量的粉橙色出现；4d ，除了b 菌落 还是粉橙色外，其他的都有砖红色出现；5 、6d ，菌落和培养基的颜色越明显；接下来， b 2 ”培养基的颜色变得比较均匀，而其他几种则变化不大( 见图版i v ) 。 斜面培养7d 后，b 2 8 培养基的颜色变化比较均匀，而其他的斜面则变化不大，特别 是b ，培养基后面只有很少的粉橙色。 1 6 釜盟耋圭望竺耋董苎兰塞 4 1 2 2 病原菌平板接种 病原菌接种到培育皿的中央后的1d ，观察到菌落周围有少量的菌丝：2d ，菌丝生长 很快，形成绒毛状，菌落的中央出现少量的粉橙色；3d ，菌丝的绒毛状变得更明显，茵 落的形状是圆形的，菌落中央的粉橙色变为粉紫色，生长直径大约为2 5 3c m ；4d ，就 是菌落生长观察的最后1d ，菌落中央的粉紫色更明显，范围大约为o 5 2 5c m ；菌落的 生长直径大约为3 5 - 4 2e r a 。 将不同病原菌从1d 到4d 生长直径( 锄) 列表如下( 见表4 - 2 ) ： 表4 - 2 病原菌的生长直径( c l n ) t a b l e4 2 t h eg r o w t hd i a m e t e ro f p a t h o g e n s 病菌种类 s p e c i e so f p a t h o g e n 培养天数( 天) t h ed a y so f c u l t i v a t e ( d ) 1 _ 0 3 0 5 23 1 22 5 1 5 2 8 4 。- 3 9 4 3 b 2 4 b 6 # 经过3 次重复测定。 图1 不同病原菌的生长趋势 f i g i t h eg r o w t ht e n d e n c yo f d i f f e r e n tp a t h o g e n s 广东t 业大学硕七学位论文 结合图4 - 1 ，根据尖胞镰刀菌在p s a 上生长迅速，气生菌丝绒状至棉絮状，基物表 层牵牛紫，基物不变色。培养3 4d 时菌落直径达2 4 4 0e m ，4d 左右培养基底面变成 粉紫色( 见图版：a 和b ) 。 因此，再结合显微镜进行分析，对以上的病原菌进行大型分生孢子、小型分生孢子、 产孢细胞及厚垣孢子的观察。 4 1 2 3 病原菌形态特征显微镜观察 从显微镜中观察得出，结合引发香蕉黄叶病的尖胞镰刀菌形态特征进行分析【1 3 l ，b 2 4 菌落是比较符合的，见图版i v 所示( 其中a ，b ，c ，d 分别为小型分生孢子、大型分生孢子、 厚垣孢子和产孢细胞) 。 ( 1 ) 小型分生孢子 数量多，卵圆或肾形，假头状着生在产孢胞上，大小5 1 2 6 2 5 2 6 肛。 ( 2 ) 大型分生孢子 美丽组型，镰刀状，稍弯，向两端比较均匀地逐渐变尖，基胞足跟明显。l “隔， 多数3 隔，量度：1 2 隔，1 0 - 3 4 2 5 4p ；3 4 隔，2 3 5 6 6 3 - 5 肛：5 - 7 隔，3 1 6 0 3 - 6 肛。 ( 3 ) 厚垣孢子 易产生，球形，直径6 - - 8h ，单生、对生或串生。 ( 4 ) 产孢细胞 产孢细胞短，单瓶梗，大小：4 4 , - - 1 0 2 5 - 4 4 ，在菌丝上直接长出或分生孢子座 上成丛生状。在麦粒和p s a 培养基上，有些菌株可生长桔黄色分生孢子座。 通过与文献的对比可以得出：本试验培养出来的b 2 。病原菌，是引致香蕉发病的镰刀 病菌。 4 2 地衣芽孢杆菌拮抗活性研究 1 8 第四章生物抑菌拮抗试验 利用上述鉴定了的病原菌，与在香蕉病株根部附近土壤中，分离出来的地衣芽孢杆菌 进行拮抗试验，以p s a 作为培养基，2 5 下接种，病原菌生长5d 后，对拮抗试验进行 观察。 4 2 1 材料与方法 1 材料： ( 1 ) 菌种： 从广东省高州市谢鸡镇的香蕉病株附近土壤中，分离出2 8 株拮抗菌菌种。 ( 2 ) 培养基配方： 细菌培养基：营养肉汤l0 0 0m l ，琼脂粉2 0 - , 3 0g p s a 培养基：去皮马铃薯2 0 0 9 ，蔗糖2 0 9 ，琼脂1 5 , - - 2 0g ，蒸馏水10 0 0 m