（野生动植物保护与利用专业论文）小鼠骨骼肌细胞selw基因的rna干扰研究.pdf

摘硅 摘要 s e l e n o p r o t e i nw ( s e l w ) 蛋白在所有含硒蛋白中是发现得较晚的一个，虽有恻接证据 证期其在代谢过程中的角色与骨骼肌健康密切相关，但是尚未有支持这一论断的直接实 验证据。牛、羊、猴、人类和啮齿类组织中的s e l e n o p r o t e i nw 都对食物中硒的水平敏 感，并主要积聚于骨骼肌；其结构特点与其在缺硒状态肌肉组织中无法检测到的事实都 显示其和硒缺乏性骨骼肌病变之间有着密切的关系而值得研究。因此定性、定量地考察 7 s e l e n o p r o t e i nw 的作用，有利于分析其对于骨骼肌细胞代谢的重要意义。同时，通过检 测s e l e n o p r o t e i n w 定性、定量下调后细胞产生的变化，可以准确反应目标蛋白与骨骼肌 细胞健康之间的关系，模拟白肌病的临床病理过程。 本研究中s e l e n o p r o t e i nw m r n a 和蛋白的下调采用r n a 干扰技术，首先根据目的 m r n a 翻译区序列合成了2 i b p 长的，具有特殊结构要求的双链s i r n a ，参照文献记 载，选取对小鼠骨骼肌细胞转染效率较高的阳离子脂质体l i p o f a c t a m i n e 为转染试剂， 使其与合成的s i r n a 形成复合体，利用胞饮和范德华力作用机理，将复合体导入小鼠 骨骼肌细胞；当复合体成功进入细胞后，利用细胞所特有的机制，与细胞内特殊蛋白形 成沉默复合物，发挥剪切作用，达到降解目标m r n a 的目的。随后，利用蛋白印记和 荧光实时定量p c r 技术对细胞模型中的目标基因及其表达蛋白的动力学变化进行研 究，细胞状态的变化由流式细胞术进行测量。转染效率通过转染荧光标记的与目标宁列 无同源性的s i r n a 进行报告。本研究平行地在原代细胞和传代细胞进行。 在针对c 2 c 1 2 细胞系中s e l w 基因的r n a 干扰实验中，最高的干扰效率见于转染 后2 4 小时，本实验的转染效率为5 0 至7 0 。 在阳性小r n a 效能比较实验中，选取生物学特性稳定的传代细胞作为实验材料， 实验用细胞依转染不同的两个合成的s i r n a 分为组l ，组2 ，并按转染试剂推荐的常规 剂量，分别转染l u g 小r n a 。2 4 小时和4 8 小时后分别进行流式细胞术检测。 在剂量反应检测实验中，选取实验证明具有良好效果的l 号s i r n a 进行实验，将 肌细胞分为6 组，分别对应6 个梯度进行实验，以便依次梯度降低s e l wm r n a 水平， 考察针对小鼠骨骼肌细胞的合适转染剂量。每组依次转染2 u g ，1 5 u g ，1 2 u g ，l u g ，0 5 u g ， o 2 5 u gs i r n a ，各组依次按1 6 编号。2 4 小时后分别进行检测。 在2 个合成s i r n a 干扰效能比较实验的基础上，在实验确定了小鼠肌细胞最适的 s i r n a 转染剂量后，进行了干扰效率检测实验，实验设立阳性组、阴性组和空白对照组 3 组，分别转染、号阳性s i r n a 、阴性s i r n a ( 各l u g ) 和不转染s i r n a ( 不转染任何 外来物质仅进行培养基更换) 。 上述所有实验都进行后续检测，包括：流式细胞术、定量p c r 和w e s t e r nb l o t ，分别 针对实验用细胞状态、目的基因和蛋白的变化。 结果： 摘曼 1 两个合成s i r n a 都可以引起r n a 干扰，但从流式细胞术检测到的其引起细胞 凋亡结果看，二者的工作效能存在差异，l 号( 3 1 7 ) 优于2 号( 1 4 5 ) ，因此l 号 s i r n a 选做后续实验之用。转染后2 4 小时为最佳检测时段。 2 在传代细胞剂量反应实验中，当转染剂量为2 u g ，1 s u g ，1 2 u g 时，会导致5 0 至7 0 的细胞层脱落，细胞死亡过多导致细胞无法回收，使测定无法进行；当转染剂量 为l u g ，0 5 u g ，0 2 5 u g 时，流式细胞术检测发现，凋亡率分别为3 2 5 ，1 2 4 ， 6 5 8 ；上述3 组中s e l wm r n a 的量通过标准曲线法实时定量p c r 进行了r 测定，分别 是0 2 5 ，0 3 9 ，0 5 2 4 ；对蛋白检测时，假定组6 中s e l w 蛋白的量为5 0 ，幻4 ，5 ，6 中蛋白的相对量为：1 7 2 6 ，3 1 0 8 和5 0 。所有证据指出，lu gs i r n a 为最适合剂量， 可以激发最高的干扰效率，并在细胞健康与转染干扰之间维持平衡。 3 在传代细胞r n a 干扰效率检测实验的流式细胞术检测结果表明，最高的凋亡率 发生在r n a 干扰效率检测实验中，为3 7 5 ( 阳性组) ；与阴性对照组( 0 9 3 ) 和空 白对照组( 0 7 ) 相比差异显著，分别为p = 3 0 8 1 0 4 o 0 5 ，p = 2 9 5 1 0 9 o 0 5 。实 时定量p c r 检测结果也显示，阳性组细胞中s e l wm r n a 的量( 0 2 7 5 ) 与空白对照组 ( 0 9 9 6 ) 相比也下降了7 2 4 ：阴性对照组( 0 9 8 6 7 ) 与空白对照组( 0 ，9 9 6 ) 相比下降了 0 9 3 。蛋白含量变化的测定中，假定空白对照组中s e l w 蛋白的量为标准1 0 0 ) ，则 阳性组的s e l w 蛋白的相对量为：2 5 0 7 ；阴性对照组的s e i w 蛋白的相对量为： 9 8 7 5 ；与空白对照中蛋白量相比，阳性组与阴性组的量分别下降了7 4 9 3 ，1 2 5 。 值得指出的是，实施于原代细胞的剂量反应实验、r n a 干扰效率检测实验结果与 传代细胞相似，只是因干扰而引起的量的改变相对较弱：剂量反应实验中，转染过量 s i r n a 导致细胞死亡；转染l u g ，0 5 u g ，0 2 5 u g 时，凋亡率为1 8 3 ，8 1 ，4 3 ； s e l wm r n a 量为0 2 2 ，0 2 5 ，0 3 2 ；蛋白含量为3 9 5 ，4 6 2 ，5 0 ；r n a 干扰效率检测实 验中，阳性组、阴性组、空白对照组的凋亡率分别为2 0 o ，1 0 3 ，0 4 ；目的基因量 平均为0 5 3 4 n6 6 3 ，0 6 7 ；蛋白含量为4 1 2 ，4 8 8 ，5 0 。 实验证明，一、在小鼠骨骼肌细胞代谢过程中，s e l e n o p r o t e i nw 蛋白缺失会诱发细 胞凋亡，s e l e n o p r o t e i nw 蛋白的功能之一为凋亡抑制剂，揭示硒缺乏性肌病的病理机制 并非仅组织变性、坏死一个途径。二、r n a 干扰存在着闽值效应，即转染s i r n a 达到 相应剂量后才会产生理想的干扰效果，这对于借助r n a 干扰技术实施抗病毒和基因治 疗都具有非常现实的意义。三、r n a 干扰效率与基因丰度无关。虽然骨骼肌细胞中 s e l w 基因表达量相对较低，但实验证明r n a 干扰同样可以产生显著结果，支持不同基 因对于抗r n a 干扰存在着遗传差异性理论。四、原代细胞的r n a 干扰更趋向于保守。 来自于原代细胞的所有各组的相应实验结果都显示，发生于原代细胞的r n a 干扰效率 低于传代细胞，产生原因要求进一步的研究。 关键词骨骼肌细胞；s e l e n o p r o t e i nw ；r n a 干扰；定量p c r ：f c m a b s t r a c t s e l e n o p r o t e i nw w a so n eo fs e l e n o p r e t e i n sw h i c hw a sd i s c o v e r e dl a t e l y ， h e r ea r ei n d i r e c t e v i d e n c e st ov e r i f yt h a ti t sr o l ei nm e t a b o l i s mh a sr e l a t i o n s h i pw i t ht h eh e a l t h yo fs k e l e t a l m u s c l et i s s u e b u td i r e c te v i d e n c es t i l ld i dn o ts e e n t h es e l e n o p r o t e i nw si nt h et i s s u e so f b o v i n e o v i n e 、m o n k e y ，h u m a na n dr o d e n t sa y es e n s i t i v et ot h el e v e lo fd i e t e t i cs e l e n i u ma n d m a i n l ya c c u m u l a t ei nt h es k e l e t a lm u s c l e i t ss t r u c t t t r e a n du n d e t e c t a b l ec h a r a c t e r i s t i ci n s e l e n i u md e f i c i e n tm u s c l et i s s u ea l ld e m o n s t r a t et h a tt h e r ei sam y s t e r i o u sr e l a t i o n s h i pb e t w e e n s e l e n o p r o t e i nwa n ds e l e n i u m d e f i c i e n tm u s c l ed i s e a s e s t oi n v e s t i g a t et h er o l eo f s e l e n o p r o t e i nwq u a n t i t a t i v e l ya n dq u a l i t a t i v e l yi sh e l p f u lt oa n a l y s i si t si m p o r t a n tm e a n i n gt o s k e l e t a lm u s c l em e t a b o l i s m m e a n w h i l e ，m o n i t o r i n gc h a n g e so fc e l lc a u s e db yq u a n t i t a t i v ea n d q u a l i t a t i v ed o w n r e g u l a t i n go fs e l e n o p r o t e i nw t or e f l e c tt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt a r g e t p r o t e i na n dt h eh e a l t h yo fm u s c l ec e l l ，a n da n a l o g yt h ec l i n i c a lp a t h o l o g i c a lc o u r s eo fw h i t e m u s c l ed i s e a s e 1 1 h ed o w n 一r e g u l a t i o no fs e l e n o p r o t e i nwm r n ab yr n a ii n t h i sr e s e a r c h ，w h i c hw a s p e r f o r m e db yi n t r o d u c e ds y n t h e s i z e d2 1 b pd o u b l es t r a n d ss i r n ai n t om o u s es k e l e t a lm u s c l e c e l l ，i nw h i c hac o m p l e xc o n t a i n sl i p o f a c t a m i n e ，p l u sr e a g e n t sa n ds i r n aw i l lb et r a n s f e c t e d i n t oc e l lb yp i n o c y t o s i sa n d v a nd e rw a a l sf o r c e ；a f t e rt h ec o m p l e xg e ti n t oc e l l ss u c c e s s f u l l y ，a r n a i n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e xw i l lb eg e n e r a t e db yt h es p e c i f i cm e c h a n i s mo fc e l lt o d e g e n e r a t es e t e n o p r o t e i nwm r n a t h ed y n a m i c so fm r n a sa n dp r o t e i n so fs e l e n o p r o t e i n ww e r em o n i t o r e db yr e a lt i m ep c ra n dw e s t e r nb l o t ；w h i l ee e l ls t a t u sw a sm e a s u r e db yf l o w c y t o m e t r y t r a n s f e c t i o ne f f e c t i v e n e s sw a sr e p o r t e db yaf l o r e s c e n tl a b e l e ds i r n aw i t h o u t h o m o l o g yt ot h es e q u e n c eo ft a r g e tm r n a t h i sr e s e a r c hw a sp e r f o r m e do np a s s a g ea n d p r i m a r yc e l lp a r a l l e l ， t h ee f f e c t i v e n e s so fr n a ii nc 2 c 1 2c e l lo ns e l e n o p r o t e i nwg e n ew a sa s s a y e d t h e h i g h e s te f f e c t i v e n e s s o fi n t e r f e r i n gc a l lb es e e n2 4h o u r sl a t e ra f t e rt r a n s f e c t i o n t h e t r a n s f e c t i o ne f f e c t i v e n e s si nt h i sr e s e a r c hw e r ef r o m5 0 t o7 0 ， t h e2 p o s i t i v e s i r n a sw e r ec o m p a r e di np a s s a g ec e l lu n d e rt h ef l a m eo ft h e e f f e c t i v e n e s st oc a u s ec e l lc h a n g i n g c e l l sw e r es e p a r a t e di n t o2g r o u p st ot r a n s f e c t2d i f f e r e n t p o s i t i v es i r n a ss e p a r a t e l ya s1u ga c c o r d i n gt ot h ei n s t r u c t i o no fl i p o f e c t a m i n er e a g e n t t h e c e l l sw e r ea s s a y e db yf l o wc y t o m e t e r ya t2 4a n d4 8h o u r sa f t e rt r a i l s f e c t i o n i nd o s er e a c t i o na s s a yt h en o 1s i r n aw i t hs u p e r i o re f f e c t i v e n e s sw a ss e l e c t e df o rt h e e x p e r i m e n t sa n dc e l l sw e r ed i v i d e di n t o6g r o u p st oc o r r e s p o n d e n c ew i t h6d o s eg r a d i e n t so f t h es a f f l es i r n as oa st od o w n r e g u l a t et h el e v e lo fs e wm r n as t e pb ys t e p e v e r yg r o u p s w e r et r a n s f e c t e dw i t hs i r n ai nt h es e q u e n c eo f2 u g ，15 u g ，12 u g ，lu g ，o 5 u g ，o 2 5 u g ，a n d w e r em a r k e da s1 6 a s s a yw a sd o n e2 4h o u r sa f t e rt r a n s f e c t i o n o nt h eb a s i so ft h ec o m p a r i n go f2s i r n a sa n dd o s er e a c t i o na s s a y , t h ea s s a yo f e f f e c t i v e n e s so fk n a i n t e r f e r i n gw a sp e r f o r m e d i nw h i c hp o s i t i v e ；n e g a t i v ea n db l a n kc o n t r o l g r o u p sw e r es e tt ob et r a n s f e c t e dw j t l lt h en o 1p o s i t i v es i r n a n e g a t i v es i r n aa n dn o t h i n g o u s tc h a n g i n gt h em e d i u m ) a l lt h ec e l l su s e di np r i o re x p e r i m e n t sw e r ea s s a y e db yf l o wc y t o m e t e r y ，r e a l t i m ep c r m a dw e s t e r nb l o tt or e p o r tc e l ls t a t u s ，t h ec h a n g e so ft a r g e tg e n e sa n dp r o t e i n s r e s u l t s ： 1 e i t h e ro ft h e2s y n t h e s i z e ds i r n a sc a nt r i g g e rr n ai n t e r f e r i n g ；b u tt h e r ew a s d i f f e r e n c eo fe f f e c t i v e n e s sb e t w e e nt h e2s i r n a sa c c o r d i n gt ot h er e s u l t so ff l o wc y t o m e t e r y ； t h e n o 1s i r n a ( 3 1 7 ) i sb e u e r t h a n n o 2 ( 1 4 5 ) ，s o t h e n o 1s i r n a w a ss e l e c t e d f o r l a t e r e x p e r i m e n t s t h em o s ts u i t a b l et i m ef o ra s s a yi s2 4h o u r sl a t e ra f t e rt r a n s f e c t i o n 2 i nd o s er e a c t i o na s s a yi np a s s a g ec e l l ，e x c e p tf r o m3g r o u p sw i t he x c e s s i v ed o s eo f s i r n at r a n s f e c t i o nw i t ha5 0 7 0 c e l ll a y e rd e t a c h e da n df a i lt ob ea s s a y e d ；t h er e s u l t si n o t h e rg r o u p sw e r e ：a p o p t o s i sr a t e3 2 5 ，1 2 4 ，6 5 8 ；t h ea m o u n t so fs e l wm r n ao 2 5 o 3 9 a n d0 5 2 4b ys t a n d a r dc n r v em e t h o do fr e a lt i m ep c r ；i np r o t e i na s s a y ，s e tt h ev a l u eo f g r o u p6a ss t a n d a r d ，t h ea m o u n t so f p r o t e i n sw e r e1 7 2 6 ，3 1 0 8a n d 5 0 a l le v i d e n c e ss h o w t h a t lu go fs i r n ai sm o s ts u i t a b l ed o s e ，w h i c hn o to n l yc a nt r i g g e rh i g h e s te f f e c t i v e n e s so f i n t e r f e r i n g ，b u ta l s os u f f i c i e n tt os u s t a i nab a l a n c eb e t w e e nc e l lh e a l t h ya n di n t e r f e r i n g 3 i nr n a ie f f e c t i v e n e s st e s te x p e r i m e n ti np a s s a g ec e l l ，t h er e s u l to ff l o wc y t o m e t r y s h o w e dt h a tp o s i t i v eg r o u pc a nc a u s eah i g h e s ta p o p t o s i sr a t eo f3 7 5 t h e r ew e r es i g n i f i c a n t d i f f e r e n c ew h i l ec o m p a r i n gt h ep o s i t i v eg r o u pw i t hn e g a t i v e ( o 9 3 ) a n db l a n kc o n t r o l s ( 0 7 ) ： p = 3 0 8 x 1 0 9 0 0 5 ，p = 2 9 5 x 1 0 9 o 0 5 r e a lt i m ep c rr e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h em r n ao f s e l wi np o s i t i v eg r o u p ( 0 2 7 5 、d r o p p e da p p r o x i m a t e l y7 2 4 c o m p a r et ob l a n kg r o u p ( 0 9 9 6 ) ， a n dn e g a t i v ec o n t r o lg r o u p ( 0 9 8 6 7 、d r o p p e d0 9 3 i nt h ea s s a yf o rt h ec h a n g i n go fp r o t e i n s ， t a k i n gb l a n kc o n t r o la sas t a n d a r d ( 1 0 0 ) ，t h ea m o u n t so fp r o t e i n si np o s i t i v e ，n e g a t i v eg r o u p w e r e ：2 5 0 7 ，9 8 ，7 5 ；t oc o m p a r ew i t hb l a n kc o n t r o l ，t h ea m o u n t so fp r o t e i n si np o s i t i v ea n d n e g a t i v eg r o u pd r o p p e d7 4 9 3 a n d1 2 5 o n es h o u l db en o t e dw a st h a tt h er e a c t i o n si np r i m a r yc e l li nd o s er e a c t i o na s s a y ，r n a i e f f e c t i v e n e s sa s s a 3w e r ec o n s i s t e n tw i t ht h a ti np a s s a g ec e l l b u tt h ec h a n g i n gc a u s e db yr n a i n t e r f e r i n gi np r i m a r yc e l lw a sw e a k n e s st h a nt h a ti np a s s a g ec e l l i nd o s er e a c t i o na s s a y o v e r - d o s es i r n ac a u s e dc e l ld e a t h ；w h e nl u g o 5 u g o 2 5 u gw e r et r a n s f e c t e d ，a p o p t o s i sr a t ew e r e 18 3 ，8 1 ，4 3 ；t h ea m o u n to fm r n a sw e r e0 2 2 ，o 2 5 o 3 2 ；a m o u n t so fp r o t e i nw e r e 3 9 5 4 6 2 ，a n d5 0 i nr n ai n t e r f e r i n ge f f e c t i v e n e s sa s s a y , r e s u l t si np o s i t i v e ，n e g a t i v ea n db l a n k c o n t r o lg r o u p ：a p o p t o s i sr a t ew e r e2 0 o 1 0 3 ，0 4 ；t h ea m o u n t so ft a r g e tg e n ew e r e0 5 3 4 ， 0 6 6 3 ，0 6 7 ；t h ea m o u n t so fp r o t e i n sw e r e4 1 2 ，4 8 8 ，5 0 i v i e s t si l l u s t r a t e d ：1 i nt h ec o u r s eo fs k e l e t a lm u s c l em e t a b o l i s m t h ed e p l e t i o no fs e l w i n d u c et oa p o p t o s i s ，a n do n ef u n c t i o no fs e l wp r o t e i ni sa p o p t i ci n h i b i t o r ，w h i c hi l l u s t r a t e d f r o md e g e n e r a t i o nt on e c r o s i sw e r en o tt h eo n l yp a t h o l o g i c a lm e c h a n i s mo fs e l e n i u md e f i c i e n t m u s c l ed i s e a s e 2 ，t h e r ei sat h r e s h o l di nr n a i n t e r f e r i n g ，i e b e t t e rr e s u l tn e e d se n o u g hd o s e o fs i r n a t h i si s m e a n i n g f u lt oa n t i v i r u sa n dg e n et h e r a p yi n t r o d u c e db yr n a i 3 t h e e f f e c t i v e n e s so f r n a ii sn o ti n f l u e n c e db yt h ea b u n d a n c eo f t a r g e tg e n e t h o u g hs e l wi sal o w a b u n d a n c eg e n ei nm u s c l ec e l l ，e x p e r i m e n td e m o n s t r a t e dt h a tab e t t e rr e s u l to fr n a ic o u l db e t r i g g e r e do ni t t h i ss u p p o r t e dt h et h e o r yt h a tt h er e s i s t a n c e st or n a io fd i f f e r e n tg e n e sa r e h e r e d i t y 4 r n a i i np r i m a r yc e i li sm o r ec o n s e r v a t i v e a l lr e s u l t sc o m ef r o m e v e r y e x p e r i m e n t si np r i m a r yc e l ls h o w e dt h ee f f e c t i v e n e s si np r i m a r yc e l lw a sl o w e rt h a nt h a t i n p a s s a g ec e l l ，a n dt h er e a s o nn e e d s 缸r t h e rs t u d y k e y w o r d s m u s c l ec e l l ：s e l e n o p r o t e i nw ：r n a i n t e r f e r i n g ；r e a l - t i m ep c r ：f c m v 绪论 1 绪论 1 。1 课题背景与意义 硒反应性骨骼肌肌病( s e l e n i u mr e s p o n s i v es k e l e t a lm u s c l ed i s e a s e s ) 是人和哺乳动物的 一种常见病和多发病 1 , 2 1 ，该病是由于人体和动物机体长期严重缺乏一种生理作用非常 重要的营养性因子微量元素硒例而引发。引起硒缺乏并导致该病的原因总的来说， 在动物为：长期采食大量低硒食物或由应激反应而造成；在人类，营养性诱因也是主要 因素，比如全肠外营养患者的硒缺乏1 4 j 等，此外遗传因素也是值得考虑的内容。浚类疾 病的发现与认识经历了相当长的时间，但是到目前为止，该病病理机制的研究，特别是 分子病理学机制的研究进展迟缓，并且在许多方面不能反应该病的发生、发展与转归的 实际情况，极待深入研究。 1 1 1 危害严重影响广泛 硒反应性骨骼肌肌病可见于多种动物和人。野生动物p ”、经济动物【8 】、动物园动 物柳、家畜| 1 0 , i t 】、家禽、家养宠物及永生动物等4 0 多种动物都育过缺硒病的报 道，并且骨骼肌为主要受累组织，如大羚羊、狒狒、长颈鹿、斑马的白肌病，牛的硒缺 乏瘸、羊白肌病、猪白肌病、鸭硒缺乏病、马骡驴硒缺乏病、趴窝病、幼驹白肌病、鹿 白肌病、水貂白肌病、马鹿硒缺乏病、牦牛硒缺乏病、兔硒缺乏病、犬白肌病、雉鸡硒 缺乏病等等。这类疾病对畜、禽的使役和生产影响颇大，并且严重损害人的健康。 从兽医公共安全角度来看，硒缺乏性横纹肌病，特别是骨骼肌病仍呈世界范围流 行，而且死亡率高达4 0 【1 5 j ，发达国家亦不能有效地预防。如上世纪8 0 年代日本1 0 万 头规模养猪场都曾爆发本病。另外大洋洲的新西兰、欧洲的许多国家都有过该病大面积 流行的报道。在我国由东北至西南存在着一条严重缺硒带，覆盖2 0 多个省份1 1 “，因此 缺硒性疾病是影响我国养殖业的一项重要疾病。从2 0 0 4 年春季本课题在我省牡丹江地 区调查结果以及北安地区统计数据来看，我省白肌病的流行仍十分严重，是春季动物死 亡和诱发感染其它病毒性、细菌性疾病的重要因素，防治工作急待加强，对机理研究的 需求也十分迫切。 人类的严重硒缺乏性疾病涉及心肌( 克山病) 与骨骼肌疾病7 、2 “。浚病曾广泛分布 于西伯利亚、朝鲜北部、日本信州地区、我国大部及中部非洲【2 2 ，”j 。该病在上世纪6 0 8 0 年代在我国的大面积流行，对国计民生曾产生过巨大的影响。硒缺乏同样加重柯萨奇 病毒性心肌病的损伤。 虽然经过我国科研人员的努力，成功地控制了这一疾病对人类健康的继续侵害1 2 “， 但是其巨大的灾难性影响是不可忘记的。近年来，陕西、云南等地克山病的发病率的上 升【2 。”l ，都要求我们不断研究，彻底克服这一疾病。 绪论 1 1 2 病理机制仍无确论 在研究这类疾病的过程中，学者们始终试图找出其发病机理。自1 9 5 7 年s c h w a r t z 和f o l t z 2 7 1 发现s e 能防止仔猪肝坏死，并由此发现猪白肌病，使学界第次意识到动物 骨骼肌肌病与硒这种微量元素之问的密切关系。 随后，世界各国的研究者们主要把精力集中在对谷胱甘肽过氧化物酶家族的研究中 1 2 8 、3 0 1 ，以及其他含硒酶”i - - 3 3 1 的研究上，希望以此打开突破口，找出硒缺乏性肌病的病 理机制，虽然取得了一定进展 3 4 , 3 5 1 ，但这些发现并不能全面而有效地对硒缺乏病的病理 机制作出合理而深入的解释，并且在上世纪8 0 年代中后期，相关的研究出现停滞。 目前认为，硒是作为谷胱甘肽过氧化物酶的活性位点而发挥作用的，硒能催化还原 型谷胱甘肽生成氧化型谷胱甘肽，通过谷胱甘肽过氧化物酶将产生的脂肪过氧化物 ( l i p dp e r o x i d e s ) 催化分解为无毒的羟脂肪酸( h y d r o x yf a t t ya c i d s ) ，它将进入1 3 一氧化 和三羧酸循环，完成最后的降解，防止过度氧化而引起的损害，从而保护细胞膜不受过 氧化物的破坏。当硒缺乏时不能充分提供正常生理性脂肪氧化的保护，发生过度氧化， 致使细胞组织受到自由基( c e l l u l a rf r e er a d i c a l ) 的损害。组织细胞发生以玻璃样退变为 主要形式的退行性病变和坏死，并可发生钙化。肌纤维退变将释放出乳酸脱氢酶、醛缩 酶、磷酸激酸激酶等。病变可波及全身，但以后躯的骨骼肌、隔肌、肋间肌、喉部肌肉 及心肌最为常见。人以承重大的大肌群受累最重。病变时骨骼肌释放出肌红蛋白，所以 发病之初临床可见肌红蛋白尿。因此，硒及其化合物是一种强抗氧化剂，能使机体组织 免受过氧化物的损害，而对细胞的正常生理功能起保护作用。 该病急性的病程短，突然死亡，多见于幼兽( 人以儿童和育龄妇女多见) 尤其受 惊吓等刺激时，可突然倒地。或仪出现呼吸困难、气喘、黏膜发绀、心动急速、心音浑 浊、杂音、站立不稳、喝水时易发生吸入性肺炎。 亚急性的临床主症是骨骼肌营养不良，病兽喜卧懒动，站立时肘肌群和后躯部肌肉 震颤。肘头外展，躯体下降，四肢伸开，运动时后肢有旋转或向外划弧或鹅步姿势，不 能久站，很快躺卧。触诊病变部位肌肉肿胀，敏感和较硬。喉部肌肉麻痹松弛，肋矧肌 和隔肌发病，致使发生严重的u 乎吸困难和喘息声，极易继发吸入性肺炎。心搏亢进，而 且心音浑浊，伴有杂音等变化。 慢性患病幼兽生长迟缓，体弱消瘦，肠炎腹泻反复发作，久治不愈，机体抵抗力低 下，易患呼吸道童症，成年动物生产力低下，发生胎衣不下等繁殖障碍。 临床病理学检查可见骨骼肌色淡，如鱼肉样，尤以肩胛、胸背部、腰及臀部肌肉变 化最为明显，可见白色或淡黄色条纹、斑块状稍混浊的坏死灶。心肌扩张变薄，心内膜 隆起或下陷。肝肿大，切面有槟榔样花纹。肾充血肿胀，肾实质有出血点或灰色的斑状 灶。急性者来不及治疗则死亡。病程多为7 天左右，如能及早发现治疗，治愈率高，否 则预后不良。根据地方缺硒病史，有突发运动障碍和心力衰竭的临床症状、病理解剖 变化、饲料分析以及用硒制剂治疗有效等可以作出诊断。同时测定血液和毛发中的含硒 量、血液中维生素e 及谷胱甘肽过氧化物酶和磷酸肌酸激酶的活性，可以作为确诊本病 绪论 的可靠指数。 治疗上针对硒缺乏的个体，及时补硒，是治疗的关键。用亚硒酸钠或硒酸钠。口服 或配成稀溶液皮下注射，经3 5 天即可见效。对集约饲养的大群家畜，常把亚硒酸鼎掺 在含特和其它矿物质成分的添加剂中，或直接拌入饲料中，让动物自由舔食。用含硒制 剂喷洒牧草，可增加草料的合硒量，对于反刍动物，也可把含硒的铁丸( 铁硒比为9 ：1 ) 投入瘤胃和网胃中，铁丸沉积在网胃，缓慢释放，投一次可在1 8 0 3 6 0 天内有效。但应 注意，投放方寸不当可引起中毒。 人以口服亚硒酸盐及食用加硒盐进行补硒，一般不采用肌注方式。 1 1 3 研究热点引人关注 1 9 9 3 年， s e l e n o p r o t e i nw ( s e i w ) 蛋白的纯化，使得对于硒缺乏性骨髂肌病病理机 制的研究又前进了一步。 s e l e n o p r o t e i nw 是目前公认的与硒缺乏性横纹肌病关系最为密切的含硒蛋白，硒缺 乏性横纹肌病肌组织中s e l w 含量明显减少，呈规律性变化1 3 6 , 3 7 ，定性、定量研究s e i w 对细胞的作用和影响有助于深入认识硒缺乏性肌病的分子病理学机制，促进该类疾病的 防治工作。针对s e l e n o p r o t e i nw 蛋白的研究已经成为硒研究领域增长最快的一个领域， 并且有可能全盘激活硒的应用研究。 分子生物学的快速发展也使得这个领域的研究出现了日新月异的进步，事实已经清 楚，那就是硒的绝大多数生理作用是由含硒蛋白质实现的，因此基础研究都密切关注含 硒蛋白的表达、调控和功能。近2 年来，在美国科学家的带领下，越来越多的科学家加 入到这个行列中来，其中日本、韩国、德国、意大利、土尔其等国家投入鞍多，科研成 果也较丰富。在p u b m e d 和m e d l i n e 等大检索数据库中该类文献呈急速增加趋势。 目前对于人和动物硒缺乏性骨骼肌疾病的病理学机制的了解尚不足以在分子水平上 很好的解答骨骼肌硒缺乏性疾病的发生、发展与转归的过程：使用亚硒酸鼎对此类疾病 进行预防和治疗虽然在人和动物公共安全上发挥了巨大作用，但是，亚硒酸盐发挥作用 的分子药理学机制仍不明了口。这未知的领域都等待着我们。 1 1 4 面临问题需要解决 经过多年研究，虽然掌握了大量的实验证掘，但却并不能有效地解释一些关键问 题。 问题一：虽然兽医和人医临床上都使用谷胱甘肽过氧化物酶作为检测硒缺乏性且儿病 的生物标记，但实践中我 f l a i l 发现，谷胱甘肽过氧化物酶也好，其它已知含硒酶也好， 都不能单独成为硒缺乏性肌病的指示剂，而必须与其它相关检测相结合才能说明问题。 为什么在对谷胱甘肽过氧化物酶蛋自家族及其他含硒酶进行了诸多研究之后，仍然 不能完整地对硒缺乏性肌病的病理过程作出合理的解释? 如果这个病理机制真如目前认 定的那样：硒缺乏导致含硒酶数量减少，活性降低，最终使得骨骼肌组织变性、坏死， 并最终表现为疾病状态：那么硒酶的变化就应该与组织硒浓度变化线性萨相关，但事实 并非如此( 见1 2 2 ) 。x i a 3 9 1 等指出谷胱甘肽过氧化物酶作为硒状态的指示物的地位应 浚熏新审视因为他们发现含硒蛋白p 的表达要求较多的硒的摄入，这远高于细胞质内 谷胱甘肽过氧化物酶的表达需求。揭示含硒蛋白p 是优于谷胱甘肽过氧化物酶的硒状念 的指示剂。 如果从硒反应性疾病的发生、发展和转归角度来看，生物体内的硒含量并不总是与 与临床过程相一致。就象在中国的缺硒地区，低硒并不一定意味着克山病一样。这晚明 硒在机体内的作用