（光学工程专业论文）光与生物组织相互作用的光谱学特性研究.pdf

中文摘要摘要本文从理论和实验上研究了光诱导人全血、人脑硫氧还蛋白还原酶( t r x r ) 的荧光光谱及其特性，以及高胆固醇血症血清的光谱学检测机理与方法。根据波长为4 0 7n l t t 的l e d 光诱导的人与实验小白鼠的全血荧光光谱谱线形状、谱线随血细胞浓度的变化趋势以及荧光的发光机理相似的现象，首次提出了在进行光与人血液相互作用机理研究时，可研究光与小自鼠血液相互作用的光谱学特性、发光机理及其产生的生物效应的物理机制，为研究光与人血相互作用机理提供参考。通过对波长为4 5 7n l n 的l e d 光、波长为4 5 7 9n l n 的a r + 激光和波长为6 3 2 8n m的h e n e 激光激励下的全血荧光光谱进行比较研究发现：采用激光光源激发可以显现血细胞荧光光谱的部分精细结构，这说明血细胞中的荧光团对激发光波长具有一定的选择性，这种选择是由其自身的能级结构和状态所决定的。此外，h e n e 激光诱导的血液荧光光谱强度相对较弱，因此在n l r r 临床应用中，h e - n e 激光引起的光生物效应也较小。由于弱激光的生物效应具有双相性和可累积性等特点，故采用h e n e 激光进行血管内照射疗法，可较容易控制其照射剂量与作用效果，因而更为安全可靠。在检测了波长为4 0 7n l r l 的l e d 偏振光诱导人全血溶液静态荧光偏振光谱偏振度的基础上，研究了偏振度随浓度的变化规律，并采用能量转移理论分析了在不同荧光区、不同浓度下，血液中各荧光团之间的不同能量转换机制及偏振度的变化现象。首次研究了正常人血清与高胆固醇血症血清的光谱学特性，结果表明正常人血清与高胆固醇血症血清的吸收光谱和荧光光谱的谱峰形状均存在较大的差异，且正常人血清的吸收率和荧光强度均较低，因此可以通过比较待测姐清的吸收光谱和荧光光谱初步判定血清中胆固醇含量是否异常。首次研究了波长为4 0 7n m 的紫色光和波长为2 5 3 7n l i l 的紫外光激励溶液状态下的人脑硫氧还蛋白还原酶( t r x r ) 分子的荧光光谱及其特性。理论与实验结果均表明t r x r 的荧光光谱与t r x r 分子的构象和空间结构密切相关。本文的研究结果对研究光与血液相互作用的机理、借助血液及其组分的自体发光特性进行临床诊断和治疗、以及研究生物大分子的构象与结构特点提供实验和理论依据。关键词：血液，高胆固醇血症血清，硫氧还蛋白还原酶，荧光光谱，荧光偏振光谱，胆固醇检测英文摘要a b s t r a c tl i g h ti n d u c e df l u o r e s c e n c es p e c t r aa n dl t sc h a r a c t e r i s t i co fh u m a nb l o o da n dt h i o r e d o x i nr e d u c a s e ( t r x r ) ，a n dt h es p e c t r o s c o p i cd e t e c t i o no fh y p e r c h o l e s t e m l e m i as e r u ma r es y s t e m i c a l l yi n v e s t i g a t e di ne x p e r i m e n ta n dt h e o r y b a s e do nt h ef a c tt h a tt h ep r o f i l e ，t h ec h a n g et e n d e n c yw i t ht h eb l o o dc o n c e n t r a t i o nc h a n g e ，a n dt h ee x c i t a t i o nm e c h a n i s mo ff l u o r e s c e n c ef r o mh u m a nb l o o da l es i m i l a rt ot h o s ef r o ml a b o r a t o r yr a t s b l o o d i ti sf i r s tp r o p o s e dt h a t 拜i tb l o o dc a r lb eu s e da sh u m a nb l o o dt oi n v e s t a g a t et h ec h a r a c t e r i s t i ca n dt h ep r o d u c t i o nm e c h a n i s mo fb l o o df l u o r e s c e n c es p e c t r aa n dt h ec o r r e s p o n d i n gb i o l o g i c a le f f e c t s e x p e r i m e n t a lr e s u l t so fl e dh g h t ( - l = 4 5 7n m ) ，a r + l a s e r ( - 缸- - 4 5 7 9n i n ) a n dh e - n el a s e r( l = 6 3 2 8n m ) i n d u c e dw h o l eb l o o df i u o r e s c e n c es p e c t r ai n d i c a t et h a tu s i n gl a s e ra se x c i t a t i o nl i g h tc a l le x h i b i tap a r to ff i n es t r u c t u r eo fb l o o dc e l ls p e c t r a ；w h i c hs u g g e s t st h a tf l n o r o p h o r e sh a v eas e l e c t i v ea b s o r p t i o nt ot h ew a v e l e n g t ho ft h ee x c i t i n gl i g h tt a n dt h i ss e l e c i t i v i t ya l ed e p e n d e n to nt h ee n e r g yl e v e ls t r u c t u r ea n dt h es t a t eo ft h ef l u o r o p h o r e s i na d d i t i o n ，t h ef l u o r e s c e n c es p e c t r ao fb l o o de x c i t e 2 1b yh e n el a s e ri sm u c hl o w e rt h a nt h eo t h e rt w o a sar e s u l t ，t h ep h o t o b i o l o g i c a le f f e c to fh e n el a s e ri ss m a l l e r s i n c et h eb i o l o g i c a le f f e c to fl o w e rp o w e rl a s e ri sb i - d i r e c t i o n a la n dc u m u l a t i v e ，i ti se a s yt oc o n t r o lt h ei r r a d i a t i o nd o z ea n dt h ee f f e c t i v e n e s si fh e - n el a s e ri su s e di nc l i n i c a lt h e r a p yo ft h ei n t r a v a s c u l a rl o w l e v e ll a s e ri r r a d i a t i o n ( 儿l i t h ef l u o r e s c e n c ep o l a r i z a t i o no fw h o l eb l o o di n d u c e db yl e dp o l a r i z e dl i g h ta t4 0 7n n la n di t sv a r i a t i o nr u l e sw i t ht h eb l o o dc o n c e n t r a t i o na l ei n v e s t i g a t e db ye x p e r i m e n t b a s e do nt h et h e o r yo fe n e r g yt r a n s f e r , t h ee n e r g yt r a n s f e rm e c h a n i s mi nd i f f e r e n tf l u o r e s c e n c ea r e a s ，u n d e rd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fw h o l eb l o o da sw e l la st h ev a r i a t i o nm e c h a n i s mo fp o l a r i z e dd e g r e ea r ed i s c u s s e d t h es p e c t r o s c o p yc h a r a c t e r i s t i co fn o r m a lh t t m a ns e r u ma n dt h eh y p e r c h o l e s t e r o l e m i as e r u mi n d i c a t et h a tb o t ht h ea b s o r p t i o ns p e c t r aa n dt h ef l u o r e s c e n c es p e c t r ao fh y p e r c h o l e s t e r o l e m i as e r u t na r ed i f f e r e n tf r o mt h o s eo fn o r m a lh u m a ns e r u m ，t h u s t h ea b n o r m a lc o n t e n to fc h o l e s t e r o li ns e r u mc a nb ej u d g e db yc o m p a r i n gt h ea b s o r p t i o na n df l u o r e s c e n c es p e c t r a t h ef l u o r e s c e n c es p e c t r ao ft r x rs o l u t i o nf r o mh u m a nb r a i ne x c i t a t e db yv i o l e tl e dl i g h ta t4 0 7n ma n du l t r a - v i o l e tl i g h ta t2 5 3 7n l na l ei n v e s t i g a t e df o rt h ef i r s tt i m e t h ei l l英文摘要e x p e r i m e n t a la n dt h e o r e t i c a lr e s u l t si n d i c a t et h a tt h ef l u o r e s c e n c es p e c t r ao ft r x rh a v ec l o s er e l a t i o n s h i pw i 吐lt h ec o n f o r m a t i o na n ds p a c es t r u c t u r eo f t r x rm o l e c u l e k e yw o r d s ：b l o o d ，h y p e r c h o l e s t e r o l e m i as e r u m , t h i o r e d o x i nr e d u c a s e ，f l u o r e s c e n c es p e c t r a ，f l u o r e s c e n c ep o l a r i z a t i o ns p e c t r a ，c h o l e s t e r o ld e t e c t i o ni v声明y 7 7 3 1 9 3本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在本学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发表或公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学历而使用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出胞贡献均已在论文中作了明确的说明。研究生签名：纽埘年朗匐日学位论文使用授权声明南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容，可以向有关部门或机构送交并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对于保密论文，按保密的有关规定和程序处理。研究生签名：兰查盟。贰年真函b博士论文光与生物组织相互作用的光谱学特性研究光生物医学及其机理研究进展1 1 研究背景光生物医学是光学及其技术应用渗透到生物科学和医学等方面而形成的一门新兴学科。其涉及的范围甚广，包括正常的光生物过程，如植物的光合作用，光周期与人眼的视觉与光运动等；紫外和可见光对生物的刺激与损伤过程，如光复活作用与光动力作用等；生物系统( 包括人体组织) 以光子形式释放能量过程与来自生物系统的光探测过程，以及这些光子所携带的有关生物系统的结构与功能信息，还包括利用光子的特性对生物系统进行加工与改造等f 1 一。光生物医学的基本特征是研究低能辐射( 即可见光与紫外光) 对生物组织的作用。光辐射将引起生物组织内分子激发，激发的分子由于比原来的分子有较高的能量所以不稳定，因而必然会发生一系列弛豫过程，将多余能量以不同形式释放，分子本身又回到稳定的基态。当然，在光对生物组织照射时，生物组织必须有能吸收这些波长光的物质存在才能发生反应。生物组织中这些能吸收可见光和紫外光的分子称为生色团，这些生色团中有一些会发荧光，所以将它们称为发光团或荧光团。研究生物组织的光吸收、荧光发射及特性、激发能的转移等有助于对光与生物组织相互作用过程及其特性进行深入的了解，这也是研究生物大分子结构与特性的重要手段之一。生物组织无论是吸收光，还是发出荧光都与其分子结构及其能级结构有关。因而在有关研究中必将涉及生物大分子的激发态与构象，以及分子内组分之间的相互作用过程。研究生物大分子的激发态，一方面可以从理论上计算其能级和能量，另一方面，因为组织的吸光与发光是激发态的一种外部表现，故也可从实验方面进行研究。由于吸收光谱和荧光光谱的获得和测量都较直接，且每一种物质的吸收光谱和荧光光谱相对比较稳定，并有其特殊性，因而研究生物组织的吸收光谱和荧光光谱，不仅可了解其内部构成，还可根据光谱特征的变化间接得到其结构变化的规律。可以说，通过检测生物组织的吸收光谱和荧光光谱变化特征，或外源荧光对生物组织的作用，一方面可以对生物组织及其变化进行诊断或治疗，另一方面也可以研究光与生物组织的作用的机制。光诱导产生的荧光光谱及其特性了解和研究生物大分子的结构或诊断生物组织病变已经盛行多年，其目的就为最终借助内源或外源性的荧光分析辅助阐明溶液状态下生物大分子的构象口一，因而至今仍是光子生物医学领域的较为活跃的研究热点之一。1 2 光生物医学的研究状况光学在生命科学中的应用，在经历了一个较缓慢的发展阶段后，由于激光与新型光1 1 光生物医学厦其机理研究进展博士论文子技术的介入，现正在进入迅速发展的新阶段。光生物医学可具体分为光生物学和光子医学两个相对独立的部分。二者的区分主要在于研究对象的不同。目前，光生物学主要研究生物系统以光子形式释放能量及其所反应的过程，以及光子在生物学研究、诊断、农业、环境、甚至食品品质检查方面的重要应用。光子医学则主要研究包括光在组织中的传输规律与生物组织光学模型、医学光谱技术、生物组织光学成像术等光诊断和光治疗技术及其作用机理等等。可见，生物学研究和医学研究、诊断和治疗涉及到光学及其相关的应用技术，包括其中最基础性的光物理问题，均可列为光生物医学的研究对象1 5 , 6 , 7 , 8 。由于本文的内容主要涉及光子医学，因而有关光生物学内容以下不再涉及。光学或光孑学在医学中的应用主要有二大类：一类是将光学用于临床治疗中，另一类是将光学用于生物组织有关参量的检测中。下面分别对这二类应用在国内外的研究状况进行简单地介绍。1 2 1 生物组织的激光治疗技术研究状况一般认为，光学领域未来发展的重点是将各种复杂的光学系统和技术更加广泛地应用于保健和医疗中。当今世界中，与光学有关的技术直接应用于人类健康领域，并正在改变着药物疗法和常规手术的实施手段，为医学临床治疗提供新方法和手段。1 2 1 1 眼科的应用h 艮睛是一种典型的与光学仪器类似的器官，因此在物理测定或治疗中，对各种光( 包括激光) 所起的作用都非常敏感。如今，光学和激光技术已成熟地应用于眼科的l f 备床实践，并可以完成大部分眼科手术治疗。其中激光治疗白内障、网膜炎、眼底出血和视网膜脱落等有失明危险的疾病取得了显著的疗效 9 。其中关于眼底治疗就是利用眼前节组织对光的聚光特性，从而在眼底的疾病部位照射激光并加热脱落的网膜组织，使其黏接( 凝固) 或对出血部位进行止血。由于光所通过的角膜、晶状体、玻璃体等的主要成分是水，对可见光特别是对蓝光和绿光的透射率较佳。因此作为治疗用光源大多采用波长为5 1 4 51 1 1 1 1 的a r + 激光；但是利用的最佳波长取决于治疗目的与病变部位，特别是组织的深度。如对眼底血管瘤的直接凝固中，常采用血红蛋白能较好吸收的波长为5 7 7 撇激光；又如对脉络膜等眼底深部的治疗中，常采用光穿透长度更长的波长为6 3 0 l l n l 的激光。由于在这些治疗中利用了可见激光在眼睛前部组织中具有较大透射系数的特点，因此若在治疗中不小心的话，这些光意外照射眼底的黄斑或视网膜，则有损伤黄斑或视网膜的危险。近期得到迅猛发展的治疗近视眼屈光手术，就是根据眼睛对光的折射由角膜与晶状体完成，因晶状体较难进行手术治疗，而角膜的一侧与大气接触，因而利用烧蚀效应对角膜表面进行精密切削，从而控制角膜的厚度，达到矫正眼睛成像系统折射率的目的。在眼科激光屈光手术中，目前广泛采用准分子激光角膜消融术0 r k ) 和准分子激光原位2 博士论文光与生物组织相互作用的光谱学特性研究角膜磨镶术( l a s i k ) 1 0 j 。l a s i k 术后视力恢复快、屈光度稳定、可矫正范围大，成为目前最有前途的屈光校正手术方式。但是，由于此时需要制作角膜瓣，因而存在潜在的术中和术后并发症，如角膜瓣破碎、上皮植入等，这就使l a s i k 手术风险较p r k 更高。1 9 9 9 年，由c a m e u i n t “1 提出并展开了保留角膜上皮的准分子激光上皮下角膜磨镶术f l a s e k ) ，可以明显减轻p r k 术后疼痛和角膜h a z e ，并可用于治疗l a s i k 术后屈光欠矫暇1 3 ，14 1 。此外，老年性核心白内障透明皮质的激光乳化术】，激光虹膜切除术1 6 1 等，都在眼科手术中得到广泛地应用。1 2 1 2 皮肤科的应用激光在皮肤科主要应用于激光治疗红斑、激光除皱和纹身及对损伤皮肤的修复等。美国整型外科的医生们在临床上利用可调的氩泵浦染料激光器进行激光除痣、纹身和消除浅褐色的色素斑点已经取得了很好的疗效 1 7 1 。正在美国和澳大利亚进行的临床实验表明，用二氧化碳激光器输出的高功率激光，可消除脸部的皱纹、疤痕及其它皮肤缺陷，在9 0 0 人参加的试验中，9 0 的人消除了脸部7 5 的皱纹 1 8 1 。国内外科学家在激光作用于皮肤的基础理论和临床应用方面都做了大量的工作，例如激光照射皮肤对细胞破坏程度的研究，在激光治疗中的热量问题等，得出了许多有用的参考数据1 9 ，2 0 1 。1 ，2 1 3 激光在心血管中的应用激光在心血管中的应用主要体现在两方面，即血管的选择性破坏和血管重建术。激光用于血管的选择性破坏在理论和应用方面已经取得一些突破性的进展，由于血管内充满血色素，研究得知氧基血红素对波长为5 7 7n l n 的激光有最大的吸收率 2 ”。美国激光与血管曲张治疗中心研究得知9 4 0 b i n 的激光具有较深的穿透性。据报道，利用波长为9 4 0n m 的d o r n i e r d 9 4 0 激光器对血管曲张的治疗取得了很好的疗效翊。激光心肌血管重建术是目前代替常规方法治疗心脏病的一种有效手段。它是利用激光与心肌组织作用产生的热效应，用高强度激光束在缺血的心肌区域内打数个微孔，通过这些微孔把心腔中的血液引向缺血的心肌区域改善心肌血液微循环以达到治疗的目的i z 3 。目前激光心肌血管重建术有两种方式，一种是n 很( i y m n s m y o c a r d i a ll a s e rr e v a s c u l a t i z a t i o n ) ，利用外科手术使心脏暴露，用激光束从心外膜向心内膜打孔。另一种方式p m r ( p e r c u t a n e o u sm y o c a r d i a ll a s e rr e v a s c u l a t i z a t i o n ) 则不需要外科开胸，而是利用光导纤维经皮肤动脉穿刺进入心室，从心内膜向心外膜打孔朔。近年来，国内外关于准分子激光和c 0 2 激光在心肌血管重建术中的研究已经取得了许多成果：在欧洲和美国，用激光心肌血管重建术治疗冠心病已经成为可以接受的治疗方案：荷兰也有报道，准分子激光已经成功地应用于血管的搭桥术 2 6 , 2 7 。1 光生物医学及其帆理研究进展博士论文1 2 1 4 激光在中医治疗学中的应用传统的中医学与激光技术和其它先进科学技术相结合，将形成- - i - 1 新兴的交叉学科一光予中医学嘲。根据激光对生物组织的弱刺激作用和生物组织的超微发光特性，在利用激光针灸、激光血管内照射和利用对生物超微发光的检测来诊断治疗疾病方面，已取得了许多的成果。临床应用表明，利用波长为8 0 8n n l 的半导体激光穴位照射与针刺对血管性痴呆症状治疗取得了很好的疗效，对患者的智能及症状有明显的改善作用。低能量激光穴位照射在治疗疼痛方面，对风寒症、气滞血瘀症和气血两虚症等都有较好的疗效。而激光血管内照射在中医治疗中有活血化瘀、扶正固本、清热解毒和引经增效等作用。在对人的五指的超弱发光测试试验中，发现吸烟者与同龄正常人的超弱发光测试结果有明显的区别。近年，在激光针灸的计算机辅助诊断方面，已经研究出了相关的硬件设施和软件系统【2 9 j u j 。i 2 1 5 光动力疗法 3 1 , 3 2 , 3 3 某些光敏感性物质具有在生物体内肿瘤中容易残留的性质( 即肿瘤亲和性) ，因此给癌症患者静脉注射这种光敏感物质，经一定时间后，在病变部位照射激光，可以有选择的破坏癌细胞，这称为光动力疗法( p d t ：p h o t o d y n a m i ct h e r a p y ) 。这些光敏感物质中有血卟啉衍生物( h p d ) ，它是由8 种组分组成的混合制剂，其有效成分主要是双血卟啉醚或酯，其吸收光谱如图1 1 ( a )所示，它在紫外域上具有称为s o r e t带的强的吸收带，又在可见域中具有称为q 带的弱吸收带。以h p d 为代表的混合卟啉类光敏剂属于第一代光敏剂，虽然该类光敏物质在正常组织中代谢( 排泄) 是相对比较波长，嫩o d ( o p t i c a ld e a x i t y ) = l o g l d i d i )图1 1 光敏感物质h p d ( a ) 和n p e 6 ( b ) 的吸收光谱快的，但仍有残留物引起光线过敏症的副作用，因此患者在治疗时必须有一段时间内在遮光环境下生活的必要。雨h p d 仍需要数十日的时间，因此希望开发出代谢更快的光敏物质i 同时，为了治疗深部的癌组织，也希望利用吸收带处于长波长侧的光敏感性物质。因此八十年代以后，第二代光敏剂的开发研究发展迅速，在光敏活性、吸收光谱和组织选择性方面比第一代光敏剂有很大改进。第二代光敏剂都是单体化合物，大多为卧啉类化合物的衍生物，包括卟啉、卟吩、红紫素、内源性卟啉等，其它还有金属酞菁、稠环醌类化合物等。其中具有代表性的是单天冬氨酰基二氢卟吩( m o n o l - a s p a r t y l博士论文光与生物组织相互作用的光谱学特性研究c h l o r i n e6 ，n p e6 ) 。n p e6 代谢快，在q 带的波长为6 5 0n m 附近具有比较低的吸收峰值，如图1 1 0 ) 所示。在此波长附近可利用半导体激光器和可变波长的光参量振荡器作为治疗光源。近年来，在光福林( p h o t o f r i n ) 、a l a 等几种光敏剂己经获得一些国家正式批淮的基础上，又对一些新的光敏剂进行实验研究或进入临床试用，包括某些a l a酯类或原卟啉酯类、细菌叶绿素衍生物如w s t 0 9 ( t o o k a d ) 、二氢卟吩衍生物如a t xs 1 0 ( n a ) 、酞箐衍生物、还有p a d - - s 3 1 、m o t e x a f i n 镥等，都显示了光动力的显著效果，可能为今后发展光动力治疗提供更为广泛的选择余地。1 2 1 6 弱激光照射疗法 3 4 , 3 5 , 3 6 , 3 7 3 司弱激光照射疗法是使用不致使组织产生不可逆损伤的低功率密度的激光束进行照射治疗的统称。基础研究和大量的临床应用结果表明，弱激光对生物组织有多方面的刺激作用。如能促进免疫反应，增强巨噬细胞吞噬功能，改善全身状况；能对神经电生理活动和神经损伤后再生过程产生影响；能促进软组织和骨组织愈合；能改善血液流变学性质，纠正组织微循环障碍；能够提高生物体内硝酸还原酶、酯酶、尿激酶、组织激素酶等活性；能够提高细胞利用氧的能力。临床上已采用弱激光以多种照射方式针对多种疾病进行治疗并在许多情况下疗效良好。弱激光用于临床治疗所使用的激光器主要为h e n e 激光器和半导体激光器；采用的激光波长范围在6 3 0 8 9 0 蛐之间；功率一般为几毫瓦到几十毫瓦；照射方式主要有穴位照射，局部照射，血管内照射和离体血照射再回输等。治疗的疾病主要有感染性疾病，免疫障碍，脑梗塞、心脏供血不足、急性心肌梗塞、心绞痛等缺血性心脑血管与外周血管疾病，免疫性及结缔组织疾患，神经一精神疾患，内分泌代谢疾病及急性胆囊炎，急、慢性支气管炎和肺炎等疾病。其中对心脑血管疾病、感染性疾病和某些神经一精神疾病的治疗效果最为显著。1 2 2 生物组织的光学诊断与检一技术研究状况生物维织的躲瑗渗断按术悬现代技术应用于医学的重要领域之一。如c t 技术、核磁共振技术等i ：雀逮里我们糕主娄讨论与光学诊断和检钡4 有关的技术，以及相关的基础研究技恭昀国内外研究现状：1 2 2 1 生物代谢发光及其在功能检测中的应用”“”1 4 2 1在生命活动的代谢过程巾。生物绡织或细朐都自发地发射出一种微弱的光子流( 即生物光子辐射) ，对这种来自生物体本原信号所携带的与生命活动相关的信息进行检测，可以了解各种生命黼中的真实现象 4 3 州 。研究结果表明，生物光子辐射与生物系统的氧化代谢、细胞分裂和死亡、病变以及生长调控等许多基本过程均有内在联系。因而这一研究方向逐渐形成一个重要的交叉学科领域。生物代谢光子辐射技术包括：1 ) 光子1 光生物医学及其机理研究进展博士论文学检测技术：包括高灵敏度单光子计数技术、光谱分辨和时间分辨的功能检测技术、二维( - - 维) 单光子成像检测技术等；2 ) 生物光子辐射的物理增强技术：包括光诱导延时发光增强技术、弱超声场增强技术、交变磁场增强技术、选择性激发增强技术等；3 )生物光子辐射的化学增强技术：包括化学发光分子反应增强技术、电化学反应增强技术。这些技术不仅对生物科学领域具有重大的科学意义，也在农业、食品和环境科学等领域具有广泛的应用背景。1 2 2 2 活体生物组织显微光学测量术 4 5 4 甜7 1适用于活细胞和组织层次的各种高分辨三维光学成像方法及其应用技术，研究内容包括：三维扫描光学成像，如单光子与双光子荧光成像( 寿命成像，光谱成像，偏振成像，荧光漂白恢复测量，等等) ；非线性光学成像，图像处理与图像分析方法。单分子光学测量方法及其应用技术，研究内容包括：分子信标方法，共振荧光能量转移、单个荧光探针光谱及微观环境效应、荧光涨落谱方法等。这些基于分子光予学标记的成像技术对于生命科学及其相关学科的发展有着重要的意义，将在研究基因表达、蛋白质之间的相互作用、疾病的早期诊断、药学机理等方面起重要作用。1 2 2 _ 3 光镊和细胞或单分予操纵1 4 8 4 9 ，删光镊是利用光的力学作用，对微米以下的微小物体，用激光束夹住并使其移动的技术。光的力学作用是1 7 世纪牛顿首先预测到的，并于1 9 世纪末由麦克斯韦进行公式化，直至发明激光后才引起人们的关注。1 9 7 0 年，a s h k i n 5 1 , 5 2 成功地用对置的两束激光捕捉了微粒或用喷水提升的方法捕捉到了微粒。此后，作为光镊广泛被应用。特别是应用于分子生物学领域中，如微生物、染色体、细胞的操作( 如图1 2 和1 - 3 所示) 5 3 , 5 4 1 ，测定鞭毛和精子的力学特性【5 5 1 5 6 1 ，d n a 分子的弹性常数的测定及【5 7 1 d n a 结合蛋白质的力学测赳5 8 等。图1 2 将红细胞的三处进行俘获后测定形状复原特性时的模型闺图1 3由光镊子俘获各个细胞进行细胞黏接时的显微镜照片博士论文光与生物组织相互作用的光谱学特性研究1 2 2 4 生物组织中光的传输理论和数值模拟方法【5 9 印】生物组织中的光传输问题是光学c t 研制中必须解决的关键技术，因而成为光生物学研究的热点问题之一。目前，对生物中光传输特性的研究，己发展成了多种理论方法，如m o n t ec a r l o 模拟 6 1 , 6 2 1 、漫射近似理论嘲、电报方程法 6 4 t 、反响倍加法施5 1 等。其中m o n t ec a r l o 法计算精度高。因此，在发展生物组织中光传输的数值模拟时，可以根据生物组织的多样性和复杂性要求，除了把注意力放在开发新的更为有效的具体算法上外，还应把m o n t ec a r l o 方法作为工具，具体应用到实际的生物光学模型上，通过计算给出关于光在生物组织中传输的新知识i ”6 7 。除了了解光在组织中的分布与其光学性质基本参量之间的确定的经验关系，为无损活检光诊断开辟一条新的途径。1 2 2 5 光谱测量与诊断技术如果测定光照射在生物体上时的吸收、散射，荧光等光谱特性，则可进行各种生物体信息的i nv i v o 测定( 活的状态测定) 。若将这种测定进一步发展，则对疾病的诊断( 病理诊断) 也成为可能。这种用光谱测量的方法进行无侵袭的诊断称为o p t i c a lb i o p s y 。这种方法不仅能得到单纯的解剖学( 与生体结构有关的) 的信息，而且能得到生理学、生化学信息。这种利用生物体光谱测量进行诊断的技术呈现出巨大的潜在发展空间。( 1 ) 红外光谱技术对血糖进行无创伤光学诊断【鹋6 9 由于目前还没有彻底根治糖尿病的医学方法，因而必须通过频繁地监测血糖浓度，调整降糖药物的用量，以预防或减轻糖尿病并发症的发生。然而现行的测最方法需要经常性地采集血样、应用一次性的试剂、通过生化方法来实现。该方法既不方便又不及时，还给病人带来痛苦，并且有感染其它疾病的危险。由此可见实现人体血糖的无创伤检测意义重大。因此国内外学者展开了血糖无刨伤光学检测的研究。目前较为流行的是利用近、中红外光谱测量方法。由于红外光谱方法原理清楚，硬件、软件的发展均较成熟，实旌也较方便，可直接测量组织或血管等部位，易于实现体液成份的无创检测和多组分的同时测量，在生物医学领域已成功应用于血氧饱和度的测量。所以( 近) 红外光谱测量方法被认为是一种比较有应用前景的血糖无创检测技术f 7 0 7 1 一。( 2 ) 病变部位的荧光光谱诊断 7 3 , 7 4 , 7 5 1在治疗时准确地知道病变部位是非常重要的，但是不少场合没有准确诊断的有效手段。如果在生物体组织上照射激光时病变显示特有的荧光，那么根据此荧光就能确定其病变部位。这种诊断方法具有快速客观、灵敏准确、无痛无损且简单实用等特点，并可检测出常规方法难以发现的早期病症的微弱荧光，因而在皮肤、口腔、肺、肠胃、膀胱、子宫等肿瘤的临床诊断上得到了应用。目前应用荧光光谱诊断病变部位主要有两种做法：一是使用荧光药物诊断；二是利用生物组织的自体荧光进行诊断。前者是利用荧光物质与病变细胞有较强的亲合力的原光生物医学及其机理研究进展博士论文理，在病人服下或注入荧光物质后一段时间内接受激光照射，根据记录下来的荧光特征曲线来确定肿瘤部位。利用最多的光敏物质有血卟啉衍生物( h p d ) 和n p e 6 。根据其荧光图像，对癌组织和动脉硬化部位的确定很有效p6 1 。后者则是根据人体正常和病变组织在激光激发下产生的不同特征谱来加以诊断，如图1 4 唧和图1 5 【7 8 1 所示。5 0 06 0 0谊长( o图1 4 大肠癌、癌旁及正常组织连续i e a f 光谱剪04 8 84 5 05 0 0j 5 06 0 06 5 07 0 0渡长( i )图1 5 正常肺组织和肺癌组织的u a f 光谱( 3 ) 时间分辨光谱在医学诊断中的应用 7 9 , 8 0 , 8 1 , 8 2 利用激光诱导荧光技术进行肿瘤的早期诊断是当前临床诊断医学的一个重要研究方向。人体正常组织的荧光与癌变组织的荧光具有不同的光谱特性；而荧光寿命法则是根据人体正常组织与癌变组织所产生的荧光寿命之间存在显著的差异进行诊断的。早在上世纪八十年代，就有国外学者研究了健康细胞和肿瘤细胞荧光强度的衰减，发现由于健康细胞对h o d 的清除很快，其相应的衰减期就比肿瘤细胞的长得多，如图1 6 所示。时一( n s )图1 6 健康细胞和肿瘤细胞的时间分辨h p d 荧光比较衰减时间分别为2 5 丑s 和1 0 n s近年来，国内学者在研究波长为5 1 4a m 激光的激发下人体食道和乳腺组织，包括正常组织和癌变组织的在荧光发射峰处的时间分辨光谱时发现：正常组织荧光寿命大于癌变组织的荧光寿命。它们之间存在明显的差异。此外，他们还发现用于肿瘤光动力学诊断的新型光敏剂血啉甲醚在生理盐水和人血清环境中的荧光寿命具有显著差异，且光r ”加jo趟鼎瀑双靛謇m挖m86420划嘟w积蓝*博士论文光与生物组织桶互作用韵光谱学特性研究敏剂浓度对荧光寿命没有影响。因此将稳态荧光光谱和时间分辨光谱的测量结合起来，有望进一步提高癌变组织的早期诊断。( 4 )光声光谱在医学诊断中的应用瞵那光声光谱技术是一种灵敏度高和普适性强的吸收光谱探测方法。其最大的优点是试样可不经过预处理直接进行光声信号的幅度与相位的测定。该方法不但操作简单，更重要的是保持了试样的自然状态，还可以进行活体和剖面深度的断层分析。目前，该技术己用于人体组织及血液的研究，比如白血病、妊娠高血压症哺“以及胃癌、肺癌、鼻咽癌 8 6 8 7 等的诊断和人血中的血红蛋白和载氧血红蛋自陬8 9 1 等研究，能发现组织病理和疾瘸之间的内在关系，为早期诊断疾病提供有价值的分析工具。1 3光与生物组织相互作用机理研究进展无论在光治疗还是光学诊断技术中，都将涉及光子与生物组织相互作用这一基础理论问题。因而，国内外学者自从激光诞生的次年就开始进行这方面的研究工作。下面针对这一领域国内外的研究进展进行介绍。当光作用于生物组织时，其相互作用时产生的物理效应是多种多样的。而各种生物组织光学及物理特性的多样性，以及作用光波长、作用时间、使用的能量密度或功率密度等参数的变化使得这种过程更为复杂。一般来说，光与生物组织相互作用主要可分为两类：是强光与生物组织的相互作用，对应的作用过程包括光化学作用、热作用、等离子体诱导蚀除、光致破裂；另一类是低功率光与生物组织的相互作用，此时又可分两类：一是对生物体的微扰振动作用，产生了低热效应，如临床上早已广泛使用的红外理疗等，其治疗机制公认是生物组织吸收了光子而激发引起振动和转动，对应是低热效应在起主要作用，这一点与强激光的热效应产生机理类似；另一种是目前普遍认同的光特别是激光的生物刺激效应，这种生物刺激效应的作用机理虽然人们已从多方面进行了探讨和研究，但至今尚未得到统一。下面将就普遍认同的光与生物组织相互作用机理研究进行介绍【”j ”。1 3 1 光化学作用光化学作用是以实验结果为依据的，即光照射生物组织中的分子引起化学作用和化学反应。最常见的例子就是植物的光合作用。在激光医学领域常用的光动力疗法( p d d中，光化学作用机理起着很重要的作用。光动力疗法的观点在现代对癌症的处理中已成为最主要的支柱之一。虽然p d t 的作用机理尚未完全解释清楚，但认为有光敏分子的直接作用( 类型i ) 与活性氧的作用( 类型) 两种。图1 7 中给出了反应机制的示意图【9 2 】。其中的光敏感分子吸收激光，经过单纯激励状态( 1 m + ) 后成为三重线激励状态( 3 m + ) 。处于3 m + 的分子作用于基质( 肿瘤组织) 产生的反应性高的游离基破坏肿瘤细1 光生物医学及其机理研究进展博士论文胞，这属于类型i 。另外，处于3 m + 的分子也可以便周围的氧分子产生能量的转移而生成的氧化性非常强的单纯激励氧分子( 活性氧) 破坏肿瘤细胞，这属于类型。无论哪一种都将经过三重态激励状态，因此三重态激励状态的寿命对p d t 的作用给予很大的影响。以前认为，因为经过p d t 的癌细胞中可以观察到线粒体内膜的损失和粗面小胞体的膨胀化，所以上述的游离基和活性氧直接作用于癌细胞使其坏死。但是最近关注的是在皿管肿瘤上的作用，即发现闭塞肿瘤血管( 形成血栓) 就能卡断癌细胞的供氧和营养供给的作用。但是，此时的光敏感物质在正常组织中也可能有残留物而引起光过敏症。为了避免健康细胞的被氧化，在激光曝光后注射胡萝b 素，这样就可将有毒的单态氧生成为无害的三重态氧。通常，类型i 和类型反应同时发生。到底哪种机理占主导机制则主要取决于现存的三重态氧化浓度以及合适的目标分子。图1 7 光化学治疗的反应结构1 3 2 热作用热相互代表一大类作用类型，其中局部温度的升高是最重要的参数变化。热效应可以由连续或脉冲激光辐射产生，可产生凝结、汽化、碳化和熔融等效应，如表1 1 所示。衰1 , 1 藏光辐射组纸产生的燕麓应1 0 温度生物效应4 3 4 5 0 c体温过高5 0 。c酶活性减弱，细胞固定6 0 。c蛋白质和胶原蛋白变性、凝结8 0 。c生物组织膜穿透1 0 0 。c汽化、热分解( 蚀除) 1 5 0 。c碳化3 0 0 1 0 ( ) 0 。( 1 十熔融，组织热蚀除博士论文光与生物组织相互作用的光谱学特性研究其中使局部组织产生凝结的效应已形成了一种新型的肿瘤治疗技术，该技术称为激光诱导间质热疗法( 1 a s e r - i n d u c e di n t e r s t i t i a lt h e r m o t h e r a p y ，l i t t ) 。这种技术已被用于治疗多种肿瘤，如视网膜、脑、前列腺、肝脏、子宫等，而且在微创手术中它已成为一个合适工具1 9 3 鲫。l n t 的基本思想是：将激光头放在需凝结的组织或肿瘤内，然后将细胞加热到6 0 。c 以上以使其坏死。如表1 1 所示的那样，在该温度上就会出现蛋白质变性作用，凝结就会发生。由于此时伴随着血液凝结，所以它与传统的外科手术相比，很少发生大量的出血现象。1 3 3 光蚀除作用由紫外光诱导的蚀除称为光蚀除。该现象是上世纪八十年代发现的，在激光脉宽为纳秒级范围内，这种作用的典型阈值为1 0 7 1 0 8 w c m 2 。至于蚀除深度，采用脉冲光源切割组织时，其深度由光源的单脉冲能量所决定，但有一个饱和极限。被蚀除试样的几何形状则由激光束的空间参数确定。这种蚀除技术的主要优点在于它的蚀刻过程的精确度，极好的可预测性以及对邻近组织的无热损伤性，其物理原理概括在表1 2中。对于角膜届光手术，光蚀除技术是最成熟的技术之一。衰1 2 光蚀狳原理0o001 3 4 光致击穿与光致击穿有关的物理效应包括等离子体的形成以及冲击波的产生。如果击穿过程发生在软组织或流体中，还会附加产生空化和射流。当光脉冲单能量很高时，冲击波和其它机械方面的效应就会变得更严重，甚至会对要作用组织产生综合效应。此时所产生的机械效应与生物组织所吸收的光能量里线性相关。光致击穿作用的两个最主要的应用是：用于晶状体后囊膜切除术以及在泌尿系统结石的激光诱导碎石术。1 3 5 弱激光照射的机理研究进展对弱激光血管内照射疗法的作用与治疗机理研究，经过多年的不断发展，已经逐步形成了一些不同的研究方法。各种方法各有优缺点，简要叙述分析如下 9 5 , 9 6 , 9 7 , 9 8 。1 3 5 1 设想与假说( 1 ) 生物电场假说是前苏联学者在1 9 7 5 年首先提出的。该假说认为：由于生物组织特别是生物膜有电导区。电导区的代谢过程，使该区内存在一定密度的自由电荷生物等离子体。这些生物等离子体就构成了生物电场，并使自身处于稳定条件之下。h e - n e激光的光量子能量与生物电场的能量特征相近，所以用h e - n e 激光照射将引起生物组。1 1 l 光生物医学及其机理研究进展博士论文织对这种激光能量的共振吸收，进而干扰机体中不正常的场能，使之达到平衡，恢复健康。( 2 ) 色素调节设想的依据是光生物学揭示的光能调节动植物的生命过程这一基本规律也适用于激光，认为高等动物中也存在和植物类似的光色素系统。这种色素作用光谱窄，光敏性高，吸收h e - n e 激光后能调节和控制r n a 和蛋白质的合成，触发多种生理过程( 3 ) 细胞膜受体设想的大意是：h e n e 激光的刺激作用很可能是通过细胞膜受体( 光致敏化作用) 实现的。激光辐照通过受钵的参与产生光活化效应，表现为核仁活化( 解除抑制) 、d n a r n a 一蛋白质系统活性提高以及核糖体上蛋白质合成的活化。这些活化过程构成细胞功能活化的基础，d n a - r n a - 蛋白系统活性的提高还会增加细胞的有丝分裂，继而活化增殖过程，刺激细胞内外的生理和修复再生过程。( 4 ) 偏振刺激假说是m e s t e r 在1 9 7 7 年提出的，其根