（应用化学专业论文）N卤代邻羟基苯基取代氨基酸衍生物的设计合成及抗菌活性研究.pdf

摘要 本课题以抑杀病原体特异性基因的关键结构“邻羟基苯基 、“卤代邻羟基苯基”为 母核，与广泛应用于杀菌领域的氨基酸相联，设计、合成了一系列n 一( 邻羟基苯基) 桥连 氨基酸类化合物及其部分配合物并对其抑菌效果进行了测试。 根据结构的不同，将化合物进行如下分类： 1 以亚甲基为桥基的“邻羟基苯基”、“卤代邻羟基苯基”修饰氨基酸及其酯类化合物 以水杨醛或卤代水杨醛首先与各种氨基酸及其酯类衍生物在碱性醇溶液中进行 s c h i f f b a s e 缩合，经n a b h 4 还原后得到一系列的卤代邻羟基苄基氨基酸及其酯类化合物。 研究表明，在反应过程中，氨基酸侧链空间位阻越小，反应速率越快。侧链上连有羧基 的n 一( 5 氯邻羟基苄基) 谷氨酸对大肠杆菌的抑菌效果较好，侧链上连有苯环或含氮杂环 的n ( 5 氯邻羟基苄基) 苯丙氨酸和n ( 5 氯邻羟基苄基) 色氨酸对白色念珠菌的抑菌效果 较好。谷氨酸酯类衍生物显示出对抑菌的高效性和选择性，其中n ( 卤代邻羟基苄基) 谷氨酸甲酯对白色念珠菌有强抑菌效果，而羧基未经酯化的n 一( 卤代邻羟基苄基) 谷氨酸 对大肠杆菌具有强抑菌效果。 2 n ( 5 氯邻羟基苄基) 氨基酸铜配合物 n ( 5 氯邻羟基苄基) 氨基酸和硝酸铜在水和甲醇的混合溶剂中常温下生成n ( 5 。氯 邻羟基苄基) 氨基酸铜配合物，反应时配体与铜离子的物质的量比为l ：l 。合成的配合物 均为绿色粉末，颜色随基团的不同有深浅差异。产物难溶于水，易溶于乙醇。检测表明 配体的羟基、胺基和羧基参与了配位。抑菌测试表明，此类配合物对大肠杆菌和白色念 珠菌的抑菌效果远远胜于其相应配体，而对金黄色葡萄球菌的抑菌效果与配体无显著差 异，显示出化合物抑杀细菌的选择性。 3 n ( 邻羟基苯甲酰基) 氨基酸类化合物 以水杨酸甲酯为起始原料，经溴化、肼解后生成溴代水杨酰肼，再与乙醛酸和丙酮 酸等羰基酸先发生s c 址f rb a s e 缩合，再经n a b h 4 还原，生成以甲酰胺为桥基的邻羟基 苯基修饰氨基酸化合物。研究表明，苯环上有溴原子取代后，肼解反应和缩合反应的速 率和转化率都有所增强。此类化合物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有一定的抑菌效果， 对白色念珠菌的抑菌效果较差。 本文针对化合物的特性，对杀菌测试进行了实验方法的修订，进行了实验条件的探 讨和中和剂的筛选。结果表明，具有抑菌效果的部分化合物也具有杀菌活性，化合物的 最小杀菌浓度大于其最小抑菌浓度。 关键词：n ( 邻羟基苯基) 氨基酸类衍生物席夫碱缩合铜配合物抑菌活性 l a b s t r a c t a sw e l lk n o w n , t h ea m i n oa c i d sw e r eu s e di nb a c t e r i c i d a lf i e l dw i d e l y s ot h es e r i e so f j _ - - - _ 一一 n 一( 2 - h y d r o x y p h e n y l ) - a m i n oa c i d sd e r i v a t i v e sa n dt h e i rc o m p l e x e sw e r es y n t h e s i z e db a s e do n t h ek e ys t r u c t u r e s “2 - h y d r o x y p h e n y l ，2 - h y d r o x y - h a l o p h e n y l w h i c hp l a y e da ni m p o r t a n tr o l e f o rk i l l i n gt h ep t t h o g e n i cg e r m s t h ei n h i b i t o r ya c t i v i t i e so fm o s tc o m p o u n d sw e r et e s t e d f o rt h ed i f f e r e n c eo fs t r u c t u r e ，t h es y s t h e s i z e dc o m p o u n d sw e r ec l a s s i f i e da sb e l o w ： 1 n 一( 5 - c h l o r o o - h y d r o x y p h e n y l ) a m i n oa c i d sa n di t se s t e r s s a l i c y l a l d e h y d eo rh a l o g e n a t e d - s a l i c y l a l d e h y d ew a sc o n d e n s e dw i t hl 广a - a m i n oa c i d so r i t se s t e rd e r i v a t i v e si nt h ep r e s e n c eo fs o d i u mh y d r o x i d et oo b t a i na m i n oa c i ds c h i f fb a s e s ， t h e nt h es c h i f fb a s e sw e r er e d u c e db yn a b i - 1 4t op r o d u c eo h y d r o x y l b e n z y l - a m i n oa c i d sa n d t h e i rd e r i v a t i v e s i ts h o w st h a t ，t h er e a c t i o nr a t ew a si n f l u e n c e db yt h es p a c ep o s i t i o n r e s i s t a n c e t h es m a l l e rs p a c ep o s i t i o nr e s i s t a n c ew a s ，t h ef a s t e rt h er e a c t i o nr a t ew a s n 一( 5 - h y d r o x y - o - h y d r o x y p h e n y l ) g l u t a m i ca c i d ，w h i c ht h es u b s t i t u e n ti sc a r b o x y l ，h a sh i 曲 i n h i b i t o r yr a t i ot oe s c h e r i c h i ac d 厅；n - ( 5 - c h l o r o o h y d r o x y p h e n y l ) p h e n y l a l a n i n ea n d n - ( 5 - c h l o r o 一2 一h y d r o x y p h e n y l ) t r y p t o p h a n ，w h i c ht h es u b s t i t u e n t sa r ea r o m a t i cr i n ga n d n i t r o g e nh e t e r o c y c l e ，t h ei n h i b i t i o nt om o n i l i aa l b i c a n si sm u c hh i g h e r t h ea n t i b a c t e r i a l p r o p e r t yo fe s t e r d e r i v a t i v e sh a so b v i o u ss e l e c t i v i t ya n ds p e c i f i c i t y n 一( 5 一h y d r o x y - o h y d r o x y p h e n y l ) g l u t a m a t em e t h y l h a s h i g hi n h i b i t o r y r a t i ot om o n i l i aa l b i c a n s ， n - ( 5 一h y d r o x y - o - h y d r o x y p h e n y l ) g l u t a m a t ee t h y le s t e rh a sh i g hi n h i b i t o r yr a t i ot oe s c h e r i c h i a c o l ii nc o n t r a s t 2 n - ( 5 一c h l o r o o - h y d r o x y p h e n y l ) a m i n oa c i dc o p p e rc o m p l e x e s n - ( 5 - h y d r o x y - o - b e n z y l ) a m i n oa c i da n dc o p p e rn i t r a t ei nw a t e ra n dm e t h a n o lm i x e d s o l v e n t sa tr o o mt e m p e r a t u r et og e n e r a t ec o m p l e x e s ，t h em o l a rr a t i oo fl i g a n da n dc o p p e ri o n i s1 ：1 c o m p l e x e sa r eg r e e np o w d e r ；t h ec o l o r sw e r ed i f f e r e n tf o rt h ed i f f e r e n tg r o u p s t h e p r o d u c t sd i s s o l v e dd i f f i c u l t l yi nw a t e rb u te a s i l yi ne t h a n 0 1 i tw a sd e t e r m i n e dt h a th y d r o x y l g r o u p ，a m i n eg r o u pa n dc a r b o x y lg r o u pw e r ec o o r d i n a t ew i t hc o p p e r t h ei n h i b i t i o ne f f e c tt o m o n i l i aa l b i c a n sa n de s c h e r i c h i ac o l io ft h i sl 【i n do fc o m p l e xi sf a re x c e e d st oi t sr e l e v a n t l i g a n d ，b u tt h ei n h i b i t i o no fc o m p l e xt os t a p h y l o c o c c u sa u r e u si sn o th i g h e rt h a ni t sr e l e v a n t l i g a n d 3 n - ( d h y d r o x y - b e n z y l a c y l ) a m i n oa c i dc o m p o u n d s a st h es t a r t i n gm a t e r i a l ，m e t h y ls a l i c y l a t ei sb r o m i n a t e da n dg y d r a z i n o l y s e d ，w h i c hi s p r o d u c e ds c h i f fb a s ew i t hg l y o x y l i ca c i da n da c e t o n ea c i d ，e t c t h e nr e d u c e db yn a b h 4 n s h o w st h a ta f t e rt h es u b s t i t u t e di nb e n z e n er i n g ，t h er a t ea n dc o n v e r s i o no ft h er e a c t i o nw e r e e n h a n c e d t h e s ek i n d so fp r o d u c t sw e r ee x h i b i t e dh i g hi n h i b i t o r yr a t i ot oe s c h e r i c h i ac o l i a n ds t a p h y l o c o c c u sa u r e u s b a s e do nt h ec h a r a c t e r i s t i c so fc o m p o u n d s ，t h em e t h o d so fb a c t e r i c i d a lt e s tw e r er e v i s e d ， t h ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n sw e r es t u d i e da n dt h en e u t r a l i z e r sw e r es e l e c t e d i ts h o w e dt h a t s o m eo ft h ec o m p o u n d sh a db a c t e r i c i d a la c t i v i t i e s ；t h em i n i m a li n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n ( m i c ) w a sl e s st h a nt h em i n i m a lb a c t e r i c i d a lc o n c e n t r a t i o n ( m b c ) k e yw o r d s ：n 一( 2 一h y d r o x y p h e n y l ) 一a m i n oa c i d sd e r i v a t i v e ，s c h i f fb a s er e a c t i o n ，c o p p e r c o m p l e x ，a n t i b a c t e r i a la c t i v i t y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取 得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得天盗理工大至或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：；1 1 弦签字日期：渺譬年月竹日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 叁盗堡墨太堂有关保留、使用学位论文 的规定。特授权叁盗墨墨太堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编， 以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复本和电子 文件。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：疬1 劣 导师签名： 签字日期：卯孚年 月d 一日签字日期： 多形 磁 月 1 吖 广 幺呶 第一章文献综述 1 1 杀菌剂的应用及分类 第一章文献综述 近年人们对杀菌、消毒的意识骤然加强，日常生活中，对于杀菌、消毒液和杀菌消 毒气雾剂类同化产品的需求有了极大的增长。尤其是近几年，世界范围的传染病频频发 生，使杀菌药剂的需求大大增长。 抗菌剂大体上可分为无机系、有机系和天然生物系三大类【1 1 。 1 1 1 无机系抗菌剂 利用银、铜、锌等金属或其氧化物本身所具有的抗菌能力，通过物理吸附或离子交 换等方法，将银、铜锌等金属( 或其离子) 固定在沸石、硅胶等多孔材料的表面制成抗菌 剂，然后将其加入到制品中就可获得具有抗菌性的材料。水银、镉、铅等金属具有与银 同样的抗菌性能，但是对人体有害；锌有一定的抗菌性，但其强度仅为银的1 1 0 0 0 ，因 此，无机系抗菌剂中银系抗菌剂占据着主导地位。 1 1 2 有机系抗菌剂 在抑制有害细菌、霉菌的产生与繁殖，从而达到杀灭细菌等的抗菌方法中，多种多 样的有机抗菌剂的研制和开发占据了主要地位。有机抗菌剂的种类很多，一般分类有： 季铵盐系化合物( 如新洁尔灭等) 、二苯醚类化合物( 如三氯生等) 、含硫苯并咪哗化合物( 如 2 ，4 噻哗苯并咪唑等) 、亚硫氰酸化合物( 如亚甲基氰酸脂等) 、羟基喹啉化合物( 如8 羟基 喹啉等) 、醇类化合物( 如乙醇等) 、苯酚化合物( 如甲酚等) 、醛醇化合物( 如福尔马林等) 以及羧酸化合物( 如山梨酸等) 。有机抗菌剂的优点是：灭菌速度快，有的能有效杀抑霉 菌，无论是粉状或液态，都能比较容易地分散使用。但是它也有诸多致命弱点：如化学 稳定性差，不耐热，遇热、光或水等容易挥发，难以实现长效。 1 1 3 天然系抗菌剂 有些天然物质，如壳聚糖、香辣料等可作为抗菌剂。天然抗菌剂的优点是：它不属 于化学品，完全是从天然食物或植物中提取，使用过程中一般不产生污染。但其抗菌功 能有限，做不到广谱长效，应用范围受到极大限制。 第一章文献综述 1 2 氨基酸衍生物在抑菌方面的应用 1 2 1 氨基酸( 酯) 类衍生物在抑菌方面的应用 自二十世纪谷氨酸钠开始应用以来，人们对氨基酸及其衍生物的利用开发就日新月 异，特别是近年来，氨基酸类产品备受人们所关注，其应用更加广泛，其中可用于食品 工业、饲料添加剂、医药及其他方面。氨基酸系列杀虫剂、杀菌剂及除草剂、植物生长 调节即等的开发利用更具广阔的市场【2 j 。 某些氨基酸及其衍生物可以抑制细菌的生长繁殖，这一类抗菌剂的共同特点是原料 来源丰富，价格低廉；应用于农作物时，易被植物吸收，无残毒，不污染水源；由于其 本身的毒性很低，能广泛地应用于食品、化妆品、医院或家庭卫生等部f - jr 3 1 。如甘氨酸 能抑制枯草杆菌、大肠杆菌地生长，在火腿、腊肠等食品中加入1 2 的甘氨酸可以 防腐。氨基酸酯代替氨基酸用于食品添加剂，可改变食品的口感和风味，增加食品的保 鲜期【4 】。如含氨基酸酯的酒类饮料，室温下贮存几个月未见微生物生长。 近年来发现，氨基酸在机体代谢过程中具有重要的生理功能。它与活性分子连接之 后，可以改变活性分子的性质，增强对靶细胞的作用和选择性，还可增强药物对膜的透 过性，提高生物利用度，因而被广泛地应用于药物的分子设计与合成研究之中【5 j 。 用长链脂肪酸酰化而成的n 酰化氨基酸、用高级醇经酯化而成的氨基酸酯、用低 级醇把n 酰化氨基酸酯化成的n 酰基氨基酸酯【6 】，对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌有广 谱的抗菌活性，对霉菌也有作用，广泛用作活性剂和防腐剂氨基酸酯加入青霉素g 和溶 菌酶中可使青霉素g 和溶菌酶表现出强烈的抗菌力和溶菌力。 e i - n a g g a r 等【卜8 】用氨基酸或氨基酸甲酯的盐酸盐与2 呋喃丙烯酰氯进行酰化反应， 得到2 呋喃丙烯酰氨基酸，一部分进行肼解得到相应的酰肼衍生物。这些化合物都具有 抑菌活性。例如d l - 天冬氨酸的衍生物对枯草芽孢杆菌( b s u b t i l i s ) 有抑菌活性，最小抑 菌浓度是5 0 0p g m u l 。 e 1 n a g g a r 等【9 】用氨基酸和2 ，3 二羟基喹喔啉6 磺酰氯进行磺酰化反应，得到2 ，3 二羟基喹喔啉6 。磺酰氨基酸，及其甲酯及酰肼衍生物，所有制得的化合物对一些病原微 生物，如蜡状芽孢杆菌( b c e r e u s ) 和产朊假丝酵母( c a n d i d a u t i l i s ) 都有抑菌活性。他们还用 2 氨基嘧啶与p h t ，t o s 氨基酸在d c c 中缩合得到2 ( 氨酰基) 氨基嘧啶衍生物，对枯草芽 孢杆菌( b s u b t i l i s ) 有抑菌活性。后来他们又报道了尿嘧啶的磺酰氨基酸衍生物具有抑菌 作用，如d l 丝氨酸甲酯的衍生物对枯草芽孢杆菌( b s u b t i l i s ) 有抑菌活性，最小抑制浓 度5 0 0g i g m l 。他们合成的2 烈一t o s 一或n p h t 氨酰基或自由氨酰基) 氨基6 甲基取代的 苯并噻唑氨基酸衍生物【l o l ，其抑菌活性较未有氨基酸修饰时的母体高。 i b r a h i m 等【l l 】合成的3 氯苯并噻吩2 羰基氨基酸及其甲酯和酰肼衍生物对各种病原 微生物都有杀灭活性。所合成的4 硝基噻吩2 磺酰基氨基酸及其甲酯和酰肼衍生物中， 脯氨酸甲酯和甲硫氨酸甲酯的衍生物具有较高的抑菌活性，其余化合物对枯草芽孢杆菌 ( b s u b t i l i s ) 、蕈状芽孢杆菌( b m y c o i d e s ) 、大肠杆菌( e c o l i ) 和伤寒沙门氏菌( s t y p h o s a ) 抑 菌活性较弱。他们又合成2 ( 氨酰基) 氨基6 一溴代( 或碘代) 苯并噻唑，具有令人满意的抑 2 第一章文献综述 菌活性，尤其是p h t g l y 、4 t o s v a l 、h g l y h c i 、h p h e h c l 、h a l a h c l 的衍生物活性 最高。他们还以b ( 2 一苯并噻唑) 丙烯酸与氨基酸甲酯盐酸盐t h f e t 3 n 中，在d c c 存在 下缩合得到b ( 2 苯并噻唑) 丙烯酰氨基酸甲酯【i 引，并进一步处理得到酰肼衍生物，其中 s e r 、p h e 、t y r 、t r p 的衍生物对若干病原微生物都显示抑制作用。 s h a l a b y 等【l3 】将n p h t a a 或n t o s a a 与氨基噻哗缩合得到保护的氨基酸噻哗酰 胺。苯二甲酰亚氨基衍生物进行肼解得到相应的氨基酸酰胺衍生物，其中一些具有抑细 菌和真菌活性。此外，还有苯并嗯唑等五元杂环类氨基酸衍生物，它们也对一些病原微 生物有良好的抑菌活性。 k o r a 【1 4 】合成了吡啶2 ，6 二羰基氨基酸甲酯衍生物以及吡啶一2 ，6 二( 氨甲酰基) 氨基酸 甲酯衍生物，并进一步进行水解、氨解或肼解，得到相应的氨基酸衍生物及其酰胺或酰 肼衍生物，这些化合物对一些病原微生物具有专一的抑菌活性。 n ( 2 吡咯甲酰基) d 丙氨酸甲酯是全合成具有良好生理活性的a l d i s i n 类生物碱( 从 海绵体中分离出的一类吡咯并内酰胺七元环生物碱) 的中间体1 1 5 。1 7 】，而透过n ( 2 吡咯甲 酰基) 伽丙氨酸甲酯，则有望合成吡咯并内酰胺六元环生物碱。根据n ( 2 吡咯甲酰基) 氨基酸甲酯分子结构的特点，利用其结构中的羰基、酰胺基及吡咯环上l ，3 ，4 ，5 位加以化 学修饰，可生成系列含吡咯环衍生物。因此，把2 毗咯甲酰基接在天然氨基酸的氨基上， 合成系n n ( 2 吡咯甲酰基) 氨基酸甲酯含吡咯环单元，可用于筛选和进一步合成有更强 大生物活性的含吡咯环化合物 1 8 - 1 9 】。王占岳、花文廷掣2 0 】将天然氨基酸侧链引入吡咯 环n 位，研究表明该类化合物具有较好的抗炎活性。 1 2 2 氨基酸席夫碱及其配合物在抑菌方面的应用 氨基酸席夫碱及其配合物的合成及生物活性研究，前人已经做了不少的工作【2 卜2 3 1 。 不断的有新型配体及相应的配合物出现【2 4 口7 1 ，如合成的铜与甘氨酸三肽的配合物 c u ( g l 赠y 哲y ) b r 1 5 h 2 0 【2 8 j ，配合物是五配位的三角双椎构型。 在氨基酸席夫碱配合物的研究过程中，配体常是水杨醛、邻香草醛、胡椒醛等与各 种氨基酸形成的席夫碱，而配位金属多数是铜、铁、钴、锌等过渡金属。 氨基酸水杨醛席夫碱金属配合物作为研究维生素b 6 酶反应的优良模型以及催化氨 基转移和外消旋作用，得到了许多化学家的注意。同时，n 亚水杨基酸及其锌( h ) 、铜( i i ) 配合物的合成及其抗菌活性越来越受到人们的重视，并且发现金属配合物的抑、杀菌活 性明显较配体本身的吲2 9 引】。苏玲玲f 3 2 】等发现甘氨酸水杨醛席夫碱和赖氨酸水杨醛席夫 碱对大肠杆菌、沙门氏菌有较强的抑菌作用。甘氨酸水杨醛铜配合物和赖氨酸水杨醛铜 配合物对金黄色葡萄球菌有较强的抑菌作用，其中甘氨酸水杨醛铜配合物的抑菌活性最 强。研究此类配合物有助于了解生物体内金属离子与蛋白质的键合作用，并可用作生物 模拟 3 3 - 3 6 】。 苯环上有硝基、卤表等取代基的水杨醛与氨基酸席夫碱的配合物也具有较好的抑菌 效果。如刘兴荣【3 。7 】等合成的5 硝基水杨醛缩甘氨酸及与c o ( i i ) 、n i ( i i1 ) 、c u ( i i ) 和z n ( i i ) 的配合物。z n ( i i ) 配合物对枯草杆菌、杂色霉菌，c o ( i i ) 配合物对腊样芽胞杆菌有抑菌 3 第一章文献综述 活性。王剧3 8 】等合成了2 氯苯甲醛缩甘氨酸和4 氯苯甲醛缩甘氨酸席夫碱及其c u ( i i ) 、 z n ( i i ) 、c o ( i i ) 、n i ( i i ) 的会属配合物，抑菌结果显示，这四种席夫碱配合物对石膏样毛 癣菌、絮状表皮癣菌、犬小孢子菌和红色毛菌癣等浅部真菌均有强烈抑菌作用，其中 c u l 2 3 h 2 0 ( l = 2 氯苯甲醛甘氨酸) 的抗菌效果最好，具有较大的丌发应用价值。 邻香草醛氨基酸s c h i 蹴及金属配合物的合成、表征及杀菌活性的研究，以严振寰、 李群幸及李淑兰等的工作为代表【3 3 1 ，他们合成了邻香草醛甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸 的席夫碱及与c u ( i i ) 、n i ( i i ) 、z n ( i i ) 金属形成的配合物。邻香草醛甘氨酸钾 o v g k ， 邻香草醛甘氨酸镍( i i ) o v g n i ( i i ) 】及邻香草醛丙氮酸钾( o v a k ) 、邻香草醛丙氨酸合锌 ( i i ) 【o v a z n ( i i ) 】，邻香草醛丙氨酸合镍( i i ) o v a n i ( i i ) 】对白色念珠球菌、新型隐球菌 均有一定的杀菌作用。 祝振富m 】等合成了胡椒醛甘氨酸席夫碱，并以不同浓度对大肠埃希氏杆菌、金黄色 葡萄球菌、铜绿假单胞菌三种细菌菌株作了抑菌活性试验。试验结果表明，化合物对被 试细菌均有不同程度的抑菌活性，与目前临床上使用的氨基卞青菌素相比，对这三种细 菌的抑菌作用相当。 。另有报道氨基酸与其他醛或酮类化合物形成的席夫碱及配合物具有较好的抑菌效 果。如n g o hk h a n g 等【4 5 】人合成的2 羟基萘甲醛缩氨基酸系列络合锡( ) 具有很好的抗 真菌活性。王瑾玲【4 6 】等合成的2 ，4 戊二酮缩甘氨酸席夫碱及其过渡金属配合物对革兰氏 阴性菌和阳性菌有一定的抑制活性。朱华玲【4 7 】等合成了p m b p 缩苯丙氨酸乙酯、p m b p 缩色氨酸乙酯席夫碱以及它们的c u ( i i ) 、c o ( i i ) 、n i ( i i ) 、c r ( i i i ) 和f e ( i i ) 金属配合物， 生物活性试验表明，这几种化合物对大肠杆菌和金色葡萄糖球菌均有一定的抑制作用。 宋智君等【4 8 】研究发现多吡啶氨基酸铜配合物对d n a 具有识别、断裂作用，可以作为 d n a 断裂试剂；另外，这类配合物对超氧负离子自由基( 0 2 。) 具有催化歧化作用，可以作 为s o d ( 超氧化物歧化酶) 的模拟物。因此研究多吡啶氨基酸铜配合物对了解生物体内铜 酶的作用机理及开发新型高效低毒的药物具有重要意义【4 9 。5 1 l 。m a k o t o 等人【5 2 】通过e s r 谱 研究了一系列多吡啶氨基酸铜配合物与d n a 的相互作用，并且揭示了该类配合物与 d n a 作用的模式。 用氨基酸直接与金属形成配合物也可具有一定的抑菌效果。如i q b a lm s t 5 3 】合成的l 丙氨酸，精氨酸，l 组氨酸，l 赖氨酸，l 脯氨酸和l 苏氨酸的铜配合物，研究表明 复合l 丙氨酸，l 脯氨酸及l 苏氨酸对链球菌有非常好的抑菌效果。将这些配合物混 合也有类似的作用。 近年来，随着对稀土元素的深入研究，人们合成了大量的氨基酸稀土元素配合物， 并对其做了结构表征和生物活性测试。如刘宗怀【5 4 】等在水相中首次制得了稀土硝酸盐与 甘氨酸系列固体配合物r e ( n 0 3 ) 3 ( g l y ) 4 ( r e = l a 、c e 、p r 、n d 、s m 、e u 、g d 、t b ；g l y = g l y c i n e ) ，所合成的配合物具有一定的杀菌活性。何水祥【5 5 】等合成的r e ( a l a ) 2 i m ( c 1 0 4 ) 3 n h 2 0 ( r e = c e 、s m ，n = 2 ；r e = p r 、n d 、e u 、g d 、t b 、y b ，n = 1 ) 及l a ( a l a ) 3 i m ( c 1 0 4 ) 3 3 h 2 0 ，该类配合物尤其是重稀土配合物具有明显的广谱抑菌作用。张漫波【5 6 】等 合成了配合物 l n ( h 2 0 ) 2 ( t s g l y h ) 3 】m n h 2 0 ) ，其中( l n = l a ( 1 ) w i t hm = 2n = 6 ，n d ( 2 ) m = 2 n = 7 ，e u ( 3 ) m = 2n = 0 ，g d ( 4 ) l 手2n = 2 ，e r ( 5 ) m = 3n = 5 a n dy b ( 6 ) m = 3n = 0 ，t s g i y h 4 第一章文献综述 = n 对甲苯磺酰甘氨酸阴离子) ，该类配合物能在低浓度有效抑菌，是一类具有丌发前景 的复合药物。杨静【57 】等以稀土氯化物、l 广苯丙氨酸和邻菲咯啉为原料，在乙醇水溶液 中反应，制备了一类新型稀土三元配合物r e ( p h e ) 3 p h e n c l y 3 h 2 0 ( r e = l a 3 + 、c e 3 + 、p ，、 n d 3 + 、s m ”、e u ”、e ，、y ；p h e = l - 苯丙氨酸；p h e n = 邻菲咯啉) 。抗菌实验结果表明， 稀土三元配合物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌有较强的抑制作用( 最小抑 菌浓度m i c 分别约为6 5 x 1 0 4 、1 5 0 x 1 0 4 、4 0 0 x 1 0 4 ) ，属于广谱抗菌剂；抗菌效 果明显优于稀土氯化物、l 苯丙氨酸或邻菲咯啉。李森兰【5 8 】等合成并测定了对甲苯磺酰 b 丙氨酸与稀土镝配合物的晶体结构及抑菌活性。稀土由于其特殊的电子结构，容易与 一些中性、酸性和碱性生物配体形成配合物。 为了克服这类物质由于c = n 双键的刚性而稳定性差的弱点【5 9 1 ，在保证活性基因的 情况下，将席夫碱配体中的c = n 双键还原为c n 单键。这使其结构具有更好的柔韧性， 对于寻求稳定的模型配合物或高效低毒的杀菌药物等均有重要意义。从文献唧斟】来看， 还原型氨基酸席夫碱配合物的研究大多集中于配合物的结构测定等表征，而对所合成的 配合物的生物活性及活性影响因素的研究报道较少。胡久荣【6 5 】等合成了c u ( i i ) 与n ( 2 羟苄基) 一d l 泓苯丙氨酸( h 2 s p h e ) 和2 ，2 联吡啶( 2 ，2 - b i p y ) 及1 ，l o 邻菲咯啉( p h e n ) 的三元配 合物 c u ( h s p h e ) ( p h e n ) ( c 1 0 4 ) 3 h 2 0 ( 1 ) 、【c u ( h s p h e ) ( 2 ，2 - b i p y ) 】( c 1 0 4 ) ( 2 ) 、 c u ( h s p h e ) ( 2 ，2 b i p y ) 】( n 0 3 x 3 ) 。用x 射线单晶衍射测定了配合物的晶体结构。3 种配合物中c u ( i i ) 离子 配位数均为5 ，处于变形四方锥配位环境中。抑菌活性试验结果表明，3 种配合物均对 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草杆菌有一定的抑制作用。配合物( 1 ) 还对大肠杆菌、 伤寒杆菌有较强的抑制作用，而配合物( 3 ) 对伤寒杆菌亦有一定的抑制作用。 为了进一步拓宽研究领域，李锦州嘲】在研究系列酰基吡唑啉酮席夫碱配合物工作基 础上，合成了1 苯基3 甲基4 ( 2 噻吩甲酰基) 吡唑啉酮5 缩b 丙氨酸及其1 0 个稀土配合 物。配体和l a ( n 0 3 ) ，对实验菌株有一定的抗菌活性，形成配合物后抗菌作用增强( 活性 提高2 8 6 6 ) 。 1 2 3 肽类物质在抑菌方面的应用 抗菌肽是生物体由于外界病原物质侵染而产生的一系列免疫应答反应产物，是生物 细胞特定基因确定的一类由1 3 , - 一5 0 个氨基酸组成的小分子多肽，其生成和释放是机体 炎症反应的组成部分，和上皮细胞、吞噬细胞、溶酶体、干扰素、补体一样是机体防御 病原微生物入侵的非特异性防御屏障，而被称为“第二防御体系 。2 0 世纪末已从生物 界分离到7 5 0 多种抗菌肽，它们分布极其广泛，从病毒、细菌等微生物到植物、昆虫、 软体动物、甲壳动物、两栖动物、鱼类、鸟类及哺乳动物等生物均有发现。 抗菌肽分子量小、活性强、水溶性好、热稳定、抗菌谱广、具有独特的抗菌机制、 免疫原性低，仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞而对j 下常真核细胞几乎无副作 用，同时具有不易产生耐药性、功能广泛等特点。抗菌肽对革兰阳性菌和革兰阴性细菌 均存在较强的杀伤作用。随着研究的深入发现某些抗菌肽对部分真菌、原虫和病毒也具 有明显杀伤作用。 5 第一章文献综述 用基因工程克隆与表达抗菌肽基因，改造、合成抗菌肽基因，动物的转抗菌肽基因 工程，人工设计和合成抗菌肽已获得成功。同时，植物抗菌肽转基因研究正成为热门话 题。尽管已有大量的转昆虫抗菌肽基因作物产生，但来源于植物的抗菌肽基因更易于在 作物中表达和调控。 随着研究的深入，小分子抗菌性肽类化合物备受关注【6 卜7 2 j 。 高达敏等【7 3 】将氨基酸或二肽引入多巴胺分子中，可增加多巴胺与受体的结合能力， 减少副作用，延长化合物在体内的作用时问。 戈平掣7 4 】在研究柔红霉素衍生物时也发现，当活性母体引入某些氨基酸或二肽酰化 氨基的结构，可保留母体化合物的活性，而毒性明显降低。 a p s 7 5 】是一种由蜡状芽孢杆菌产生的新型抗真菌环状多肽。研究表明，a p s 具有广 谱抗菌性，其对棉花枯萎病等多种病原真菌及黑曲霉的孢子萌发具有强烈的抑制作用， 最小的m i c 达2 5 g m l ，对真菌的生长亦具有强烈的抑制作用。随着a p s 处理浓度的 增加，菌丝生长速度明显降低，甚至为零。扫描电镜观察表明，经a p s 处理后，菌丝发 生顶端膨大，分支缩短等异常形态学变化。 m r o i e e 等【7 6 】合成了七个短肽链化合物，并对其进行了杀菌活性的测试，实验表 明，p 3 对大肠杆菌有极高的抑杀作用，p 一6 、p 7 对细菌细胞有致命的抑杀作用。随后， 许多科学家对肽类化合物进行了更为细致的研科7 7 】。a n n e m a r i eb e n c i v e n g o 7 8 】对同一类 化合物的端位氨基酸进行了研究，实验表明，p y r r h o c o r i c i n 的端位氨基酸为赖氨酸时， 该类化合物的抗菌效果最好且抗菌谱最广；k a b i r a j 。7 9 】合成了端位氨基酸为l 型和d 型的b a c t e n e c i n 7 ，实验表明构型的变化对化合物生物活性有很大的影响，端位为l 型 的b a c t e n e c i n 7 有很高的抗菌和抗真菌活性，端位为d 型的b a c t e n e c i n 7 抗菌活性完全丧 失，而抗真菌活性却有提高且抗真菌谱明显增广。i n a g a o k a 等【8 0 】人的研究表明：在治 疗细菌感染方面，具有抗菌性能的肽类化合物有望成为一类新药。 周丽芳等【s i 】研究发现，用吡啶丙氨酸来代替肽链中对生物活性起重要作用的苯丙 氨酸，可以改变多肽的生物活性和这些多肽的酶裂解产物。 张素芳【8 2 】等参照毕赤氏巴斯酵母( p i c h i a p a s t r o r i s ) 偏好密码子，改造并化学合成杂合 抗菌肽c e c a - m i l 基因。抗菌特性研究表明，该产物具有广谱抗菌活性，对多数革兰氏阴 性菌及革兰氏阳性菌均有较好的抑菌活性，特别是对氨苄青霉素抗性菌和卡那霉素抗性 菌抑杀效果更好，具有热稳定性和酸稳定性。 乳链菌肽作为高效、安全的天然食品防腐剂已得到广泛应用。成熟的乳链菌肽含有 3 4 个氨基酸残基，由5 个硫醚桥组成独特的内环结构，是研究蛋白质结构与功能的一个 很好的材料。牛纠8 3 】等对乳链菌肽的分子结构及其与细胞膜作用的分子机制进行了详细 的阐述。 1 3 常用抗菌检测方法 杀菌剂的种类繁多，目前已广泛用于医疗和家庭消毒、工业消毒杀菌防腐、农用杀 6 第一章文献综述 菌等方面，并且效果显著。 1 3 1 灭菌、杀菌、抑菌的含义 杀菌剂：根据不同的抗菌对象及场合，选择适当的抗菌剂迅速杀死细菌，使菌数降 至零。医院病房中采用的杀菌剂多为邻羟基环戊烯二酮等。食品加工厂、食品店、餐馆 多采用季铵盐、双胍类杀菌剂。 防腐剂：最初采用有机汞、福尔马林，以后被有机卤素化合物、有机锡、银等有机 金属和甲醛所取代。目前异噻唑类化合物已经成为主要的发展方向。 防霉、防藻剂：主要为2 ( 2 一吡啶一硫代1 一羟基) 锌( z p t ) ，2 ( 4 噻唑) 苯并咪唑( t b z ) ， 咪唑等，用于建筑内外壁装饰及船底涂料中。 灭菌：能够杀灭物体中所有微生物( 包括病原菌和非病原菌) 的繁殖体和芽胞的方法 或作用，叫做灭菌。 杀菌：能够杀死病原菌的方法或作用，叫做杀菌，具有消毒作用的药物称为消毒剂 或杀菌剂，在常用的浓度下只对细菌的繁殖有效，对于芽胞则无杀害作用。 抑菌：能够防止或抑制微生物生长的方法或作用，叫做防腐或抑菌。用于防腐的药 物，称为防腐剂或抑菌剂。许多药品在低浓度时只有抑菌作用，浓度增大或作用时间长 时，可呈杀菌作用，杀菌作用和抑菌作用总称为抗菌作用畔】。 1 3 2 文献中常用的抗菌检测方法 ( 1 ) 抑制菌丝生长速率法 把发酵原液1m l 与9m l 融化的p d a 培养基混匀，倒入无菌的培养皿中制成带药培养 基平板。培养基凝固后，放入1 个供试菌的菌饼( 直径为6m m ) ，使菌饼带菌丝的一面贴 在培养基表面，重复3 次。培养7 2 9 6h 后，用十字交叉法测量供试菌菌落生长直径，用 下述公式计算抑制率。 菌丝生长抑制率( ) = ( 菌落直径处理菌落直径) 对照菌落直径x1 0 0 。 ( 2 ) 抑制孢子萌发法【8 5 】 取供试病原菌的孢子配成适当浓度的孢子悬浮液，在1 0 x l o 低倍镜下，每个视野有 3 0 4 0 个孢子。将发酵液与孢子悬浮液混合，取l 滴滴加在凹玻片上，每处理3 次重复。 在2 5 下保湿培养6h 后检查对照孢子的萌发情况。当对照的萌发率达到8 5 后，检查 所有处理的萌发率。以孢子芽管长度大于孢子短半径者为萌发。按下式计算孢子萌发抑 制率。 萌发抑制率( ) = ( 对照萌发率处理萌发率) 对照萌发率x1 0 0 。 ( 3 ) 管碟法【踮1 此法又叫牛津杯法，将培养好的供试菌与适量培养基充分混匀，倒入9c l n 培养皿中 制成带菌平板，每个平板上放3 个牛津杯( 内径0 6 锄，外径0 8c m ，高1 0c m 的不锈钢杯) ， 每管加入发酵原液0 2m l ，以蒸馏水为对照，置2 5 温箱中培养2 0h 后，用十字交叉法 测量抑菌圈直径。 7 第一章文献综述 ( 4 ) 抑菌圈测定法，j 将1 5g l 。1 的底层营养琼脂培养基融化后取1 0m l 倒入无菌平皿中，凝固后取7g l 1 的温度为4 5 的琼脂培养基1 2m l ，n a 对数生长期的细菌旋涡振荡 终浓度( 3 4 ) 1 0 51 ，快速覆盖在底层胶上，凝固后在上层琼脂上打孔，把一定浓度的待测溶液滴入孔 中，3 7 孵育过夜。抑菌活力以抑菌圈直径( m m ) 表示。 ( 5 ) 浓度稀释法l 酗】 药液的稀释及种菌( 无菌操作) ：用无菌吸管吸取已配制好的样品原液0 2m l 于第一 支盛有1 8m l 培养基的试管中，振荡；用无菌吸管从第一支试管中吸取1 0m l 于第二支 盛有1 0m l 培养基的试管中，振荡：再用无菌吸管从第二支试管中吸取1 0m l 于第三支 盛有1 0m l 培养基的试管中，振荡；依次同法稀释成7 种不同浓度的混合液；另取一支 盛有1 0m l 培养基的试管作为对照：以上混合液分别加入培养1 8h 的液体菌悬液0 0 5 m l ，振荡。将上述稀释好的各试管混合液置于3 7 温箱培养2 0h 后观察。 观察方法及浓度计算：用接种环挑取培养2 0h 后的各试管培养物一环，分别接种于 牛肉膏蛋白胨琼脂平板上，置于3 7 温箱倒置培养2 4h 观察。若在上述试管中均有细菌 生长，表明药液在所测浓度下均不能全部杀死细菌。若在某一浓度之上均无细菌生长， 则表明该浓度为全杀死细菌的最小浓度。计算公式：c m i n = 1 0 3 m vx n i ( 1 t g m l - 1 ) 。 式中，m 为样品质量( m 曲，v