（应用化学专业论文）2氧甲基核糖核苷的合成研究.pdf

硕士论文2 ，- 氧甲基核糖核苷的合成研究 摘要 2 一氧甲基核糖核苷，是通过对核苷进行甲基化修饰而得到的。这类27 氧甲基核 糖核苷广泛存在于r n a 和d n a 中，且成为用于第二代基因治疗的寡聚核苷酸序列合成 的基本原料组分。含有这样核糖核酸的寡聚核苷酸在体内和体外都表现了较好的稳定性 和较好地与目标互补基因的亲和能力。药理作用广泛，具有免疫调节、抗菌、抗炎、抗 肿瘤等方面的作用。 本文通过对27 氧甲基核糖核苷的合成路线研究，综述并设计了可行的合成路线及 方法。其中27 氧一甲基腺嘌呤核苷的合成是在无保护的情况下，直接使用重氮甲烷对腺 嘌呤核苷甲基化，最终经过阴离子交换树脂分离得到纯的2 氧甲基腺嘌呤核苷。而2 7 氧甲基鸟嘌呤核苷的合成是以鸟嘌呤核苷为起始原料，经过五步反应合成出2 氧一甲 基。鸟嘌呤核苷。首先对鸟苷进行乙酰化反应，将鸟苷糖基上的3 个羟基保护起来，得 到27 ，3 ，5 三一氧乙酰基鸟苷；其次经氯化反应，使鸟苷上的6 位羟基被氯置换，得到化 合物2 氨基6 氯2 ，3 ，5 三氧乙酰基鸟苷：然后经n h 3 气m e o h 的碱性条件处理，将 乙酰基脱去，制得2 。氨基6 氯鸟苷；之后再使用重氮甲烷对其进行甲基化，得到2 氨 基6 氯2 氧甲基鸟昔，此步也会生成2 氨基6 氯3 氧甲基鸟苷，最后将2 和3 的 异构体水解，使6 位上的氯脱掉，最终经过阴离子交换树脂分离得到纯的2 氧甲基 鸟嘌呤核苷。 通过熔点测试、红外、质谱、核磁等分析手段对合成的化合物的结构表征，结果表 明所得的产物符合目标产物，所合成的化合物的结构、性能指标与设计目标要求一致。 关键词：2 氧甲基核糖核菅，腺嘌呤核苷，2 氧甲基腺嘌呤核苷，鸟嘌呤核苷，2 ，3 ，5 三氧乙酰基鸟苷，2 氨基6 氯2 ，37 ，57 三氧乙酰基鸟苷，2 氨基6 氯鸟苷，2 氨基6 氯27 氧甲基鸟苷，27 氧甲基鸟嘌呤核苷。 a b s t r a c t 硕上论文 a b s t r a c t 27 一o m e t h y l r i b o n u c l e o s i d e sa r em o d i f i e db ym e t h y l a t i o no fr i b o n u c l e o s i d e s 2 o m e t h y l r i b o n u c l e o s i d e sa r ew i d e l yd i s t r i b u t e di nr n aa n dd n a a n dn o wh a v eb e e n e x t e n s i v e l yu t i l i z e da sas e c o n d g e n e r a t i o no l i g o n u c l e o t i d ec o n s t r u c t sd u et ot h e i rf a v o r a b l e i n v i t r oa n di n v i v op r o p e r t i e s t h e yp r o v i d eab e t t e rs t a b i l i t ya n da l s os t r o n gb i n d i n g c a p a b i l i t yt o t h ec o m p l e m e n t a r yg e n et a r g e t s t i l e yh a v em a n yp h a r m a c o l o g i c a lf u n c t i o n s s u c ha s i m m u n o r e g u l a t i o n ，a n t i b a c t e r i a l ，d i m i n i s hi n f l a m m a t i o na n dk i l lt u m o u r s i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，t h es y n t h e s i sw a y so f2 一o - m e t h y l r i b o n u c l e o s i d e sw e r es t u d i e da n d s u m m a r i z e d ，a n dp r a c t i c a la n df e a s i b l ew a y sw e r ed e s i g n e d t h es y n t h e s i so f2 一o - m e t h y l a d e n o s i n ew a sd i r e c t l ya c c o m p l i s h e db ym e t h y l a t i o no fa d e n o s i n ew i t hd i a z o m e t h a n ew i t h o u t p r o t e c t i o n ，t h e nt h ei s o m e r sw e r ei s o l a t e dt h r o u g hi o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yo nd o w e x 1 - x 2 ( o h 。) ，g e t t i n gp u r e2 - 0 - m e t h y la d e n o s i n e t h es y n t h e s i so f2 一o - m e t h y lg u a n o s i n e ， s t a r t i n gf r o mg u a n o s i n et h r o u g hf i v es t e p s f i r s t l y , a c e t y l a t i o no fg u a n o s i n e ，p r o t e c t i n gt h r e e h y d r o x y lo fg u a n o s i n e s e c o n d l y , 2 - a m i n o 一6 - c h l o r o 一9 - b d - r i b o f u r a n o s y l p u f i n eh a sb e e n p r e p a r e dv i ac h l o r i n a t i o nu s i n gp h o s p h o r u so x y c h l o r i d eo rs u l f u rd i o x i d e ，a n dd e a c e t y l a t i o n o f2 ，3 ，57 - t r i - 0 一a c e t y lg u a n o s i n e m o r e o v e r ，h i g hr e g i o s e l e c t i v em e t h y l a t i o no f2 - a m i n o 6 一 c h l o r o 一9 - p d r i b o f u r a n o s y l p u f i n ew i t hd i a z o m e t h a n e ，g e t t i n g2 - a m i n o - 6 一c h l o r o 一9 - 2 一o - m e t h y l b d r i b o f u r a n o s y l - p u r i n e t h e n f o l l o w e d b yh y d r o l y s i sp r o v i d e d2 - 0 一m e t h y l g u a n o s i n ea n d3 o m e t h y lg u a n o s i n e t h ei s o m e r sw e r ei s o l a t e dt h r o u g hi o ne x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h yo nd o w e x1 - x 2 ( o h 。) ，g e t t i n gp u r e2 - o m e t h y lg u a n o s i n e t h es t r u c t u r eo ft h es y n t h e t i cp r o d u c t sw e r ec h a r a c t e r i z e db ym e l t i n gp o i n t ( m p ) ，i n f r a r e d s p e c t o s c o p y ( i r ) ，m a s ss p e c t r a ( m s ) a n d hn u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e ( n m r ) t h er e s u l t s p r o v e d ：t h es t r u c t u r e sa n dp e r f o r m a n c ei n d i c a t e dt h a tt h ep r o d u c t sc o n f o r m e dt ot h ed e s i g n r e q u i r e m e n t k e yw o r d s ：2 - 0 - m e t h y lr i b o n u c l e o s i d e s ，a d e n o s i n e ，2 - 0 m e t h y la d e n o s i n e ，g u a n o s i n e ， 2 7 ，3 ，5 - t r i o a c e t y l g u a n o s i n e ，2 - a m i n o 一6 - c h l o r o 一9 一 27 ，37 ，5 一t r i o a c e t y l p d - r i b o f u r a n o s y l 一p u r i n e ，2 - a m i n o - 6 一c h l o r o - 9 一p d r i b o f u r a n o s y l - p u r i n e ，2 - a m i n o - 6 一c h l o r o 一9 - 2 一o m e t h y l 一 1 3 - d - r i b o f u r a n o s y l 一p u r i n e ，2 - 0 一m e t h y lg u a n o s i n e 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在 本学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发 表或公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学 历而使用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均 已在论文中作了明确的说明。 研究生签名：圈扯 础年占月扣e l 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅 或上网公布本学位论文的部分或全部内容，可以向有关部门或机构送 交并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容。对 于保密论文，按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名：肚一一叩矿年占月亨9 日 硕士论文2 氧甲基核糖核苷的合成研究 1 绪论 1 1 核苷的化学结构和应用 众。吱。码岭。 i 绪论 一 硕1 ：论文 3 腺嘌呤 o 鸟嘌呤 嘌呤是一类由嘧啶与咪唑稠合的氮杂环化合物，它的化学性质综合了原有两种氮7 c 杂环的化学性质特点。已知嘧啶是一个7 【电子密度较高的杂环，两环稠并后，使原本缺 兀电子的嘧啶环从7 c 电子较多的咪唑环上吸取部分电子，因而，嘌呤的碱性( p k a = 2 4 ) 略大于嘧啶( p k a - - 1 3 ) ，但是，却大大地小于咪唑( p k a = 8 9 ) 。这样，嘌呤环2 位和6 位上取代反应活性相当于嘧啶2 位、4 位或6 位，具有较强的亲电性，嘌呤的8 位的反 应活性类似与咪唑的2 位，而具有较强的亲核性。总的来说，在嘌呤环上发生的化学反 应主要是亲核取代反应( 在2 位和6 位上) ，若发生亲电取代反应，则主要得到8 取代产 物。对于自由基反应，如果6 位没有被其他取代基占领，只先发生在6 位上，其次才可 能发生在8 位上。另外，由于氮原子上有一对未共用电子，可以发生环上氮原子的烷基 化反应。 另外还有一种重要的核苷为肌苷( 或者称为次黄嘌呤核苷) ，在d n a 中存在，它和 鸟苷一起作为d n a 的分解产物，是最先被分离出来的嘌呤类核苷【l 】。 1 1 2 核苷的作用和用途 具有治疗疾病效果的核苷和核苷酸类药物在化学药物中占有非常重要的地位，其数 量呈迅速增长的趋势。在人类基因计划研究的推动下，有关基因与疾病关系的信息受到 人们的高度重视，开发研制核苷( 包括核苷的碱基) 和核苷酸的新药已形成热点。 这两类药物从结构上分，又可分为两大类，天然的核苷与核苷酸和非天然的核苷和 核苷酸，它们分别有不同的治疗作用。 1 1 2 1 天然核苷与单核苷酸的用途 由于天然核苷与单核苷酸这类化合物都是构成细胞核酸的主要成分，是天然的代谢 激活剂，对改善机体的物质代谢和能量代谢有很大帮助，它们中大多数要直接进入细胞， 参与糖代谢，促进蛋白质合成，加速受损组织的修复，促使病态细胞、缺氧组织等恢复 正常的生理功能。所以这类化合物广泛用于放射病，血小板减少，急慢性肝炎，血细胞 减少，心血管疾病和脑损伤等。这类化合物中也有少数被一些基团进行修饰，如二丁酰 环腺苷酸，腺苷用二丁酰基修饰后，可增强环腺苷酸的亲酯性，易于透过细胞膜，避免 在体内被磷酸二酯酶水解，从而增强缓解冠心病作用，用于抢救异常心绞痛和急性心肌 梗死等。又如胞二磷酸胆碱与磷酸代谢有十分密切的关系，它是卵磷脂体内生物合成的 2 硕上论文2 氧甲基核糖核苷的合成研究 重要辅酶，可治疗意识障碍，对脑损伤恢复有作用【l 】。 1 1 2 2 寡核苷酸与反义治疗 现今临床所应用的绝大多数药物和即将上市的大多数药物都是以蛋白质和酶、受体 或离子通道为靶点的，由于蛋白质的结构和其作用模型非常复杂，常不能彻底搞清楚， 所以使药物的作用以及新药设计受到相当的限制。如果人们把作用靶点放到核酸水平 上，即抑制基因表达，不让产生引起疾病的蛋白质，则会对疾病达到彻底的治疗目的。 反义寡核苷酸是指与目标靶r n a 或d n a 特异性互补的短链核苷酸片段，该技术是 近十几年迅速发展起来的旨在利用碱基互补配对原则而选择性抑制特定基因的复制、转 录或翻译的一种新的生物工程技术。 反义疗法是一个较理想的治疗策略。反义治疗主要有两条途径：一条途径是以d n a 为靶分子，反义药物序列特异性地与d n a 双螺旋相结合，形成三链d n a ，在基因转录 或复制水平上调节基因表达，称为反基因技术；另一条途径是以m r n a 为靶分子，反 义药物与m r n a 形成双链，改变r n a 的剪接方式、阻断翻译甚至摧毁异常r n a ，在 剪接或翻译水平上调节基因表达，称为反义技术。要使反义寡核苷酸能有效的在细胞内 发挥作用，必须克服许多困难，除了给药方法外，最重要的是寡核苷酸在体内未达到靶 r n a 或d n a 前的稳定性，这一问题主要是由于反义寡核苷酸易受到体内存在的r n a s e h 和d n a s e h ( 核酸酶) 等的破坏而被提出，为此，必须对寡核苷酸进行结构修饰，以抵御 核酸酶的影响。 除了反义核酸和核酶外，最近又发展了一种新型的反义药物：反义肽核酸( p n a ， p e p t i d en u c l e i ca c i d ) 。反义治疗的经典策略是阻断致病基因的表达。反义核酸和p n a 均 可与目标d n a 双链结合形成三链结构，阻断特定基因的复制或转录；也可与目标m r n a 结合，阻断m r n a 剪接、翻译或导致r n a 酶对m r n a 的降解作用。三链d n a 是由经 典双螺旋中含多聚嘌呤的那条链通过h o o g s t e e n ( 三链d n a 中存在的特殊氢键，如嘧啶 幸嘌呤嘧啶型三链的第三条链与w a t s o n k r i c k 双链中的嘌呤链正向平行，碱基配对方式 为t 木a t 和c * g c ，其中t * a 和c * g 之间的氢键与a t 和g c 之间的不同，为h o o g s t e e n 型) 和反式h o o g s t e e n 型氢键与第三条链相互作用而形成的，有两种形式：嘧啶，- c 嘌呤 嘧啶型( y 宰r y ) 和嘌呤木嘌呤嘧啶型( r 木r y ) 。y 木r y 型的第三条链与w a t s o n c r i c k 双链的 嘌呤链正向平行，碱基配对方式为t a t 和c 幸g c ；r * r y 型的第三条链与w a t s o n c r i c k 双链中的嘌呤链反向平行，碱基配对方式为g * g c 、a a t 和t a t 。p n a 与d n a 也可 形成p n a * d n a p n a 型三链结构，形成过程为链替换：即一条p n a 链先替换下双链 d n a 的一条链，形成d n a p n a 的w a t s o n c r i c k 双螺旋，再与另一条p n a 链通过 h o o g s t e e n 键形成三螺旋。三链的形成改变了d n a 结构，加上寡聚脱氧核苷酸本身的位 阻效应，能够位点专一地干扰转录因子或r n a 聚合酶与d n a 的结合，抑制转录起始和 链延伸，阻碍d n a 聚合酶沿模板d n a 的移动，抑制d n a 的复制。 1 绪论 硕十论文 核酶则以另一种完全不同但非常有效的方式阻断异常基因的表达。它可以像酶一样 识别异常m r n a 的特定序列并切断它。核酶的作用选择性很强。随着研究的深入，又 发现反义核酸能够纠正r n a 剪接错误，可以用来调整基因表达比例。根据现有的临床 结果，无论是从疗效、短期毒性、药代动力学，还是从应用的广泛性来看，反义药物都 有望成为常规药物。但是要真正成为理想的常规药物，还有不少问题有待解决。1 稳定 性。反义药物在细胞内常常被内源性核酸酶降解，其稳定性一直是反义基因治疗的瓶颈 之一。为此发展了多种对反义核酸进行化学修饰的技术，使反义核酸在体内的稳定性达 到了可以接受的水平。但是，不断补充反义寡核苷酸既昂贵又费事，限制了其临床应用。 一种最近发展起来的技术是选择功能强大的启动子构建真核表达载体，在细胞内源源不 断地转录产生反义片段，不失为反义给药的一条新途径。核酶因分子小也可通过基因治 疗载体输入和表达。这一策略在h i v 的基因治疗中己广泛应用。2 届0 作用。动物和人体 实验都证明反义药物有剂量相关的副作用，这是由于其免疫原性和多聚阴离子性质。第 一代p s o n ( 反义硫代磷酸酯寡核苷酸，p h o s p h o r o t h i o a t eo l i g o n u c l e o t i d e ) 可与细胞内外的 多种蛋白如血清蛋白、生长因子、转录因子等结合而引起副作用。第二代反义o n 在保 留第一代反义o n 优点的同时，通过修饰碱基或骨架，去除其多聚阴离子性质。3 长期 毒性。虽然目前所有毒理实验都未发现反义药物的负面影响，但并不能消除人们对其长 期毒性，特别是对基因组d n a 的损伤即基因毒性( g e n o t o x i c i t y ) 的担心。这方面有待于 数据的积累。 1 1 2 3 非天然核苷与核苷酸 非天然核苷与核苷酸可称为核苷与核苷酸类似物，从化学结构上看它们和天然核苷 与核苷酸有不同程度的相似之处，所以在体内有以假乱真之效，从而干扰或者直接作用 于核酸的代谢过程，阻断蛋白质、核酸的生物合成，因此这些化合物在抗病毒和抗肿瘤 化疗药物中具有非常重要的地位，占有较大的比例，特别是这方面药物的研发速度很快， 可以这样说，只要对天然核苷的结构进行各方面的修饰和变换，就可能获得新的抗癌， 抗病毒的药物。 ( 1 ) 抗肿瘤药物p 4 j 由于非天然的核苷和核苷酸干扰和或作用与核酸的代谢过程，故这些类似物可被称 为代谢药物，按核苷碱基的不同，常分为两类。 嘌呤类 这类化合物包括修饰的嘌呤碱基和由它们所形成的核苷和单核苷酸，其中应用最早 的抗肿瘤嘌呤核苷类似物是6 硫基嘌呤( 6 - m e r c a p t o p u r i n e ，6 一m p ) 和6 巯基鸟嘌呤 ( 6 。t h i o g u a n i n e ，6 t g ) 。这类化合物主要特点是6 位有一个巯基或甲锍基，从而抑制体内 嘌呤核苷酸的生物合成，主要用于抗白血病。 嘧啶类 4 硕士论文2 氧甲基核糖核苷的合成研究 这类化合物主要以5 氟尿嘧啶( f u ) 及其核苷和胞苷衍生物为主，由于c - f 键有较高 的稳定性，参与体内的代谢过程中不易分解，从而干扰脱氧胸苷酸的生物合成，对肝癌 及头颈部癌症等有疗效。胞苷类衍生物主要用于各类急性白血病的治疗，亦作为抗病毒 药物应用。 ( 2 ) 抗病毒药物【5 ，6 】 目前，核苷类似物在抗病毒药物中占有很重要的地位，它们主要作为病毒复制过程 中一些重要酶的抑制剂，达到中止病毒复制，阻止病毒浸染靶细胞的目的。这类抗病毒 化合物至今己合成千余种新的化合物，按其作用的病毒种类可分为抗d n a 病毒的核苷 类似物和抗r n a 病毒的核苷类似物。 嘌呤核昔类似物是一种重要的肿瘤化疗剂，它们通过干扰肿瘤细胞d n a 中嘌呤， 嘌呤核苷酸的合成从而抑制了肿瘤细胞存活和复制的必经代谢途径，也抑制了以细胞内 的酶，核酸为作用靶产生细胞毒性的过程。6 巯基嘌呤核苷和6 巯基鸟嘌呤核苷是最早 应用于抗肿瘤的嘌呤核苷类似物。目前治疗慢性淋巴细胞白血病的药物f l u d a r a b i n e 和治 疗非霍奇金淋巴瘤的药物c l a d r i b i n e 均为嘌呤核苷衍生物。嘌呤核苷类似物也是目前临 床治疗病毒性疾病的主要药物。大量的研究已表明在嘌呤核苷上引入取代基有很好的医 药效用，目前为止，国外许可应用的抗病毒药物，绝大多数是核苷衍生物。另外，嘌呤 核苷及其衍生物也是合成其他大量药物的原料或中间体，在食品，饲料，农业，只化， 材料等领域有着极其重要的作用。 嘌呤核苷类似物的实用价值，特别是医用价值，引起了许多化学家和生物学家的重 视。最初，人们从动植物体内提取嘌呤核苷衍生物，发现其有很好的生物活性，从而开 始合成研究，嘌呤核苷衍生物的研究已有半个多世纪，其研究成果主要集中在两个方面： 一是在嘌呤环上引入取代基合成系列核菅衍生物，并通过与受体的作用探讨其对一些心 血管病，艾滋病和糖尿病等疾病的生化性质和药理作用的影响；二是在糖基上引入取代 基合成核苷衍生物并探讨其药刘1 1 。 核苷是核酸的重要组成部分，其嘌呤环上引入不同的取代基所得衍生物表现出抗病 毒、抗癌和降血压等重要的生物活性和强的荧光性质。 在鸟嘌呤核苷的糖基上引入烷基合成核苷衍生物2 氧甲基鸟嘌呤核苷，其具有抵 抗酶解和碱性水解、磷酸分解核苷键之作用，如能抵御细胞中磷酸单酯酶，核糖核酸酶 和核苷酸酶( 如毒蛇核苷酸酶) 的水解。这类2 氧甲基核糖核苷成为用于第一代基因治 疗的寡聚核苷酸序列合成的基本原料组分。含有这样核糖核酸的寡聚核苷酸在体内和体 外都表现了较好的稳定性和较好地与目标互补基因的亲和能力【l 】。 ( 3 ) 2 - 氧甲基鸟嘌呤核苷( 2 - o m e t h y l g u a n o s i n e ，v 6 ) p j 凋亡诱导核菅( a p o p t o s i s i n d u c i n gn u c l e o s i d e s ，a i n ) 是一类从c d 5 7 + h l a d r 晰曲t - n s 细胞培养上清液中分离出的核苷，因能诱导肿瘤细胞的凋亡，故名a i n 。a i n 包括6 种核 1 绪论 硕i ：论文 苷，分别是27 脱氧尿嘧啶核苷( 2 - d e o x y u r i d i n e ，v 1 ) 、核糖胸腺嘧啶核苷( r i b o t h y m i d i n e ， p 2 ) 、2 氧甲基尿嘧啶核苷( 2 0 m e t h y l u r i d i n e ，p 3 ) 、胸腺嘧啶核苷( t h y m i d i n e ，p 4 ) 、2 - 氧甲基次黄嘌呤核苷( 2 - 0 m e t h y l i n o s i n e ，p 5 ) 和2 氧甲基鸟嘌呤核苷( 2 - o m e t h y l g u a n o s i n e ，p 6 ) 。研究发现，将以上6 种a i n 作用于胃癌细胞、前列腺癌细胞、白血病细胞、 食管癌细胞、乳腺癌细胞等，均能有效地诱导肿瘤细胞凋亡，其中，以p 6 的作用最强， 表明a i n 有望成为一种新的抗肿瘤药物。但尚有一些问题需要进一步研究，如药代动力 学、抗瘤谱及毒副作用等。 1 2 核苷类化合物的分离技术 核苷最早是通过酶解法从天然产物( 如灵芝、冬虫夏草) 中提取分离，但如果要分离 出某种单一核苷，通常步骤繁多，需要多次层析，而且收率非常低。不同的核苷化合物 结构各有特点，来源和分离目标产物的目的也不尽相同，所以在分离提取中用到的技术 也难以统一。核苷类化合物的分离技术有 8 】： 1 2 1 薄层色谱法 薄层层析是一种简便、快速、微量的层析方法，是以撒布到平面如玻璃片上，形成 薄层的吸附剂做为固定相( 分离介质) ，再选用适当的溶剂做为流动相进行层析，通过被 分离物质在固定相和流动相中的分配系数不同而实现分离。黄红兵等【9 】用含4 磷酸氢二 钠的0 1 3 c m c 调制的硅胶g f 2 5 4 为固定相，以氯仿醋酸乙酯异丙醇水浓氨水( 8 ：2 ：6 ： 0 3 ：0 2 ) 为流动相，分离了赤芝子实体中的核苷。此法具有简单易行、结果可靠、专属性 强等优点。徐文豪等【l o 】用薄层层析( 硅胶g f 板) 结合柱色谱，从西藏产冬虫夏草的子座中 分离得到次黄嘌呤核苷、腺苷、胸腺嘧啶等物质。邱蔚然】用凝胶薄层层析分离并测定 肌苷。 在2 0 世纪7 0 年代，还有将纤维素、甲壳质粉作为固定相用于核苷的薄层分离的报道。 薄层层析构造简单、成本低廉，可用于定性、定量，可用作分离鉴定，也可用作制备分 离，所以获得了广泛的应用。当采用的固定相分离速度较慢，而被分离的核苷带电荷时， 可将薄层板置于直流电场中进行层析分离，此为薄层电泳层析。薄层色谱中展开剂( 流 动相) 向一个方向运动为一维展开，当被分离物质成分复杂时可采用二维展开，即一维 层析展丌后再在垂直方向上进行第二次展开。二次展开可采用不同极性的展开剂系统。 吴有光等【2 1 采用在同一块薄层板上进行多相二维分离的方法，对临床采集的血样和尿样 进行检测，分离出了2 0 余种核苷类化合物。 1 2 2 柱色谱法 柱色谱法是将固定相均匀地填充于柱管内构成色谱柱，利用被分离物质在固定相和 流动相之间的分配系数差异而实现分离。出于被分离物质分子在柱内与固定相和流动相 6 硕士论文 2 氧甲基核糖核苷的含成研究 相互接触的路径长，因此分离效果好、分辨率高，一次性可处理较大体积的样品，当样 品液体积较大而其中的待测物浓度较低时，仍可有效分离。若采用高压输送流动相、高 效固定相并且联接上在线检测器等，则分离效能更高，应用范围更广。较之薄层色谱， 柱色谱具有灵敏、快速的优点。 目前，用于核苷类化合物分离的分离介质主要有硅胶、离子交换树脂、大孔树脂、 活性炭、氧化铝、凝胶和十八烷基硅胶等。 1 2 2 1 硅胶柱层析 硅胶是一种酸性吸附剂，适用于酸性或中性物质的分离。因其具有硅氧交联结构且 表面有许多作为活性基团的硅醇基，故能与极性化合物或不饱和化合物形成氢键而具有 吸附性。硅胶柱层析属于吸附层析，分离的效果取决于固定相、流动相和被分离化合物 的性质三个因素。核苷类化合物杂环中的氮以及各种取代基具有结合和释放质子的能 力，故具有酸性和碱性解离的性质，控制溶液的p h 值可改变该类化合物的解离状态，达 到与其他化学成分分离的目的，再通过硅胶柱使不同极性的核苷类化合物分离。 1 2 2 2 十八烷基( o c t a d e c y l s i l y l ，o d s 或c 1 8 ) 硅胶是常用的非极性键合相，是将十八烷基 氯硅烷试剂与硅胶表面的硅醇基经多步反应生成o d s 键合相，用于高效相分析检测或分 离制备。王忠华等 1 3 】研制了一种新型含极性基团的芳烃键合固定相：苯胺甲基键合硅胶 ( p a m s ) 固定相，它对被分离物质的主要保留机制为疏水作用和i ：7 1 ；作用，同时亚氨基的 存在使该固定相还具有氢键和离子交换作用。 1 2 2 3 离子交换树脂层析 离子交换层析( i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ，i e c ) 是以离子交换剂为固定相，利用流 动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力的大小进行分离的 一种层析方法。用阴阳离子交换树脂进行核苷分离时，可通过调节样品p h 值或其他方 法，使待分离物质带有易吸附在阳离子或阴离子交换树脂上的负电荷或正电荷，然后选 择合适的溶剂( 流动相) 进行洗脱。自2 0 世纪5 0 年代至8 0 年代，国内外曾有将d o w e x i c l 。、 d o w e x i o h 。、d o w e x i n i - 1 4 + 、d o w e x 5 0 n i - 1 4 + 离子交换树脂用于虫草素( 37 脱氧腺苷) 分离纯化的报道。1 9 7 3 年，中国科学院上海生物化学研究所就曾使用阳离子交换树脂分 离得到肌苷。 1 2 2 4 大孔吸附树脂层析 以大孔吸附树脂作为固定相，是2 0 世纪6 0 年代末继离子交换树脂后发展起来的分离 技术。大孔树脂的孔径和比表面积大，具有物理化学稳定性高、吸附容量大、选择性好、 吸附速度快、解吸条件温和等优点，目前己得到广泛应用。凡属于弱电解质或非离子型 的核苷类化合物均可用大孔吸附树脂进行分离纯化。 1 2 2 5 活性炭吸附层析 以活性炭作为固定相的吸附分离技术，是利用其强大的吸附力将溶液中的核苷类物 7 1 绪论 硕上论文 质富集于活性炭上，再以合适的方法解吸分离，然后使用结晶等技术获得纯品。1 9 8 4 年， 日本t a k e d a 化工股份有限公司的研究人员将经树脂处理过的含有核苷酸、核苷、嘌呤的 溶液的酸碱度调至p h = 9 ，再将溶液加入活性炭柱，结果显示，柱子对核苷和嘌呤的吸附 率达1 0 0 ，可采用合适的洗脱剂将这两种物质洗脱，并用结晶技术将核苷分离出来。 该公司的研究人员还用活性炭柱对核苷、核苷酸进行了分离：将含有核苷、核苷酸、嘌 呤的溶液调至酸性，经过活性炭柱，用水冲洗炭柱后通入n a o h 溶液，可将吸附于柱上 的核苷酸洗脱下来；再用醇及n a o h 溶液，可将核苷洗脱，回收率可达9 0 以上。我国 也有使用活性炭柱分离提取肌苷的报道【1 9 ，15 1 。 1 2 3 毛细管电色谱法 毛细管电色谱( c a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y ，c e c ) 是以电渗流( 或电渗流结合高压 输液泵) 为流动相的驱动力，利用电泳迁移和色谱固定相的保留机制达到物质分离的目 的。一般而言，溶质与固定相间的相互作用对分离起主导作用。该法有很大的选择性， 可以根据不同核苷类物质的分子性质( 如分子大小、电荷数、疏水性等) 进行有效的分离。 1 2 4 其他分离方法 j o k e l a t l 6 】j 各一种交联了木糖异构酶的晶体( c l x i c ) 作为固定相填充于7 1 8 m m x 3 0 0 m l t l 钢柱中，发现该固定相对尿苷、胞苷、腺苷、鸟苷、胸苷有良好的亲和力，加入流 动相后的洗脱顺序与被洗脱物分子中各碱基组分的含量百分比有关。研究发现核苷分子 与c l x i c 固定相之间的作用不仅是离子交换或疏水作用，还存在碱基分子与c l x i c 特殊 的交换作用。 1 3 核苷化学合成的重要性 核苷最早是通过酶解法从天然产物( 如灵芝、冬虫夏草) 中提取分离，但如果要分离 出某种单一核苷，通常步骤繁多，需要多次层析，而且收率非常低。2 0 世纪8 0 年代开 始，酶法合成被用于生产核苷及其衍生物。该法一般是先用能产生特定酶的微生物发酵 生成核苷，然后提取精制得到成品。为了克服从天然产物中提取核苷存在的品种少、分 离困难、时问长、产率低等缺点，人们开始用化学方法进行核苷的合成。化学合成核苷 系列产品具有产量大，纯度高的优点。 随着人类基因组计划的完成，各种功能基因的发现和从基因水平上寻找疾病产生原 因及诊断技术，对寡核苷酸的保护方法和给药方式的改进和发展等，都促进人们对核苷 和核苷类化合物需求量的提高。以美国为首的西方国家，在反义药物方面已经有十多年 的研发历史，除了已经上市的一种反义o d n 药物用于治疗病毒引起的视网膜炎外，世 界许多大的制药公司都有处于临床研究阶段的反义药物。修饰的脱氧寡核苷酸需求量也 在提高。如此大量地对核苷和寡核苷酸的需求，若从生物体中提取天然核苷完全不能满 r 硕士论文2 氧甲幕核糖核苷的合成研究 足的。当然，从生物体( 包括菌体和生物细胞) 中提取天然核苷在质量上是可保证的，即 易产生异构体。但是产量低，因为提取的步骤多，分离困难等问题造成的。如果从酵母 菌体中分离提取核苷，会由于在菌体中四种核苷同时存在( 即a ，c ，g u ) ，分离出这四种 单质的核苷较为困难，操作步骤多，需经过多次离子交换树脂柱层析，这样产量势必很 低，生产效率低下，并且耗能大，费工时。再如要从天然生物体中提取脱氧核苷更是困 难，并且耗时长【lj 。 鉴于天然提取核苷存在很多困难，我们不断地在研究利用化学法合成核苷。利用化 学方法合成核苷及其衍生物具有多方面的优点：合成步骤较少，可以大规模地工业化 生产，产量高；反应周期大大缩短，能保证需方对时间的要求，生产效率高；减轻 生态环境的负担，合成的原料可来自多方面，如石化产品，农副产品等；可根据需要 用化学方法合成单核苷和各种修饰性核苷及其衍生物，这是化学方法的最为重要的优 势【l 】。 1 427 氧甲基一核苷的简介 h o 2 一氧甲基腺嘌呤核苷2 氧一甲基鸟嘌呤核苷 1 4 1 2 氧甲基腺嘌呤核苷 腺苷，又名腺嘌呤核苷，分子式c l o h l 3 n 5 0 4 ，分子量2 6 7 2 4 ，白色结晶，微有咸苦 味，易溶于水，几乎不溶于乙醇和乙醚，熔点2 3 4 2 3 5 c ，比旋度6 1 7 ，( c = 0 7 0 6 ， 水中) 。 腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参 与心肌能量代谢，同时还参与扩张冠脉血管，增加血流量。腺苷对心血管系统和肌体的 许多其它系统及组织均有生理作用。 此外，腺苷是合成a t p ，腺嘌呤，腺苷酸，阿糖腺苷的重要中间体。 2 。氧甲基腺嘌呤核苷是对腺嘌呤核苷进行甲基化修饰而得到的一种修饰核苷。2 氧甲基腺嘌呤核苷具有抵抗酶解和碱性水解、磷酸分解核苷键之作用，如能抵御细胞 中磷酸单酯酶，核糖核酸酶和核苷酸酶( 如毒蛇核苷酸酶) 的水解。含有这样核糖核酸的 9 1 绪论 硕士论文 寡聚核苷酸在体内和体外都表现了较好的稳定性和较好地与目标互补基因的亲和能力， 现在已有含2 氧甲基核糖核苷的寡聚核苷酸用于临床研究，例如抗血管生成 ( a n t i a n g i o n e n i c ) 核酶大分子( 用于抗肿瘤) 。 2 氧甲基腺嘌呤核苷，2 - 0 一m e t h y l a d e n o s i n e ；c l l h l 5 n 5 0 4 ；m = 2 8 1 2 7 ；m p ：2 0 2 - 2 0 4 ；白色晶体。 1 4 2 2 ，氧甲基。鸟嘌呤核苷 鸟嘌呤核苷( g u a n o s i n e ) 又名9 b d 呋喃核糖基鸟嘌呤，简称鸟苷。它是食品和医药 产品的重要中间体。在食品工业中，鸟苷可用于合成食品增鲜剂5 鸟苷酸二钠、核苷酸 二钠，也可用于生产各种功能性食品。在医药工业中，鸟苷可作为很多高效药物的中间 体，由此生产的核苷类抗病毒药，对疱疹、感冒病毒、抗肝炎等有十分确切的疗效。2 一 氧甲基鸟嘌呤核苷是对鸟嘌呤核苷进行甲基化修饰而得到的一种修饰核苷。2 氧甲基 鸟嘌呤核苷具有抵抗酶解和碱性水解、磷酸分解核苷键之作用，如能抵御细胞中磷酸 单酯酶，核糖核酸酶和核苷酸酶( 如毒蛇核苷酸酶) 的水解。这类2 氧一甲基核糖核苷成 为用于第一代基因治疗的寡聚核苷酸序列合成的基本原料组分。含有这样核糖核酸的寡 聚核苷酸在体内和体外都表现了较好的稳定性和较好地与目标互补基因的亲和能力，现 在已有含27 氧甲基核糖核苷的寡聚核苷酸用于临床研究，例如抗血管生成 ( a n t i a n g i o n e n i c ) 核酶大分子( 用于抗肿瘤) 。 2 - 氧甲基- 鸟嘌呤核苷：27 - o - m e t h y l g u a n o s i n e ；c 1 1 h l s n s 0 5 ；m = 2 9 7 2 7 ；m p ：2 3 4 , - 。 2 3 6 ；白色晶体。 1 52 ，氧甲基核苷的合成方法 自从1 9 5 9 年s m i 也和d u n 【l7 】首先从鼠的肝脏和小麦胚胎中分离出2 氧甲基核苷， 就证实了2 氧甲基核苷广泛存在。m o i s a w a 和c h a r g a f f 验证了鼠的肝脏细胞的r n a 的 二核苷酸片段在碱性条件下是稳定的，但酵母可使其溶解，并且发现在酶作用于这些片 段以后产生了2 氧甲基鸟苷。l a n e 在最近的研究中已经发现在小麦胚胎r n a 的核苷 类物质中2 氧甲基核苷占到了1 7 。水解小麦胚胎的s r n a 发现2 氧甲基核苷占有 1 3 。在以后的研究中进一步发现这种核苷作为小组件存在与各种不同的r n a 序列中， 比如t r n a s ，r r n a s ，m r n a s ，s n r n a s 。从2 0 世纪6 0 年代初，人们丌始研究这些核菅生 物作用，认识到2 和3 氧甲基核苷具有抵抗酶解和碱性水解、磷酸分解核苷键的作用， 如能抵御细胞中磷酸单酯酶、核糖核酸酶和核苷酸酶的水解。所以，这类2 一氧- 甲基核 苷成为用于第一代基因治疗的寡聚核苷酸序列合成的基本原料组分【l8 1 。 对于2 氧甲基核苷的化学合成开始于这类化合物被发现不久，1 9 6 5 年b r o o m 和 r o b i n s w 】以及f u r u k a w a 等人发表了合成2 和3 ，氧一甲基核苷的文章【2 0 1 。总之，合成这 硕士论文 2 氧甲基核糖核苷的合成研究 类2 和3 氧烷基化核苷的化学方法大致可分以下几种。 1 5 1 由d 核糖作其始物 经一些选择合成方法得到2 和3 氧甲基核糖衍生物，然后再和核苷碱基偶合成相 应的2 和3 。氧甲基核苷。这种方法是由h a i n e s 和i m b a c h 首先创立的。最近的研究涉 及到大规模优化合成2 氧甲基呋喃核糖的先导物或者选择性保护的2 一氧甲基一合成纤 维再或者以d 一葡萄糖作为起始原料。总的说来，这种方法反应步骤多，而且关键的糖 基化这步往往会得到a 和b 异构体。 1 5 2 以选择保护基保护后的核苷作原料 在合成2 ，氧甲基核苷前，首先用3 和5 羟基的选择保护基，常用l ，1 ，3 ，3 ，四异丙 基1 ，3 一二硅烷1 ，3 二基( t i p d s ) 保护基，即m a r k i e w i c z 保护基，让2 羟基自由化，然后， 再对2 - 羟基作甲基化反应。甲基化试剂较多，常用m e i a 9 2 0 等。最好的合成2 氧甲 基鸟苷的方法是对57 ，3 氧t i p d s i 2 ，6 二氯鸟嘌呤核苷，使用新的甲基化体系 m e i b d d d p 。这个工艺后来发展为使用m e i b e m p 甲基化5 ，3 氧t i p d s i 0 6 - t b d p s i 鸟剖2 。 1 5 3 直接以核苷作原料 在甲基化前，对核苷的糖上羟基不做保护，或者即使保护，也使2 和y - o h 自由， 这样用一种直接方法仅对2 氧甲基化，现在大多数研究报道都采取这种方法。但该法 中由于3 - o h 没有保护，总是有3 氧甲基化异构体产生，并且也有可能存在核苷碱基 的甲基化，所以，此法需用分离的方法分离出目的产品。 1 5 4r o b i n s 方法 1 9 7 1 年和1 9 7 4 年r o b i n s 等人应用偶氮甲烷( c h 2 n 2 ) 作为甲基化试剂，在氯化亚锡 ( s n c l 2 ) 存在下对未保护的核苷进行甲基化，这一简捷的方法均可对四个天然的核苷实现 甲基化，并且总收率很高，反应中他们应用m e o h 或d m f 为溶剂