（化学工艺专业论文）生物酶法制备胶原小分子肽及其初步分离研究.pdf

生物酶法制备胶原小分子肽及其初步分离研究 摘要 胶原肽是由胶原蛋白酶解得到的肽混合物，由于胶原肽有着优良 的加工特性、营养特性以及生物活性，在化妆品行业、食品行业等方 面有着广泛的应用前景，胶原蛋白酶解产物胶原肽作为功能因子应用 在化妆品中，分子量是最重要的影响因素，必须控制在1 5 k d a 以下。 以往胶原蛋白酶解制备胶原小分子肽存在：胶原蛋白酶解产物分 子量分布较广，酶解产物中大分子胶原肽含量高等问题，束缚了胶原 肽在化妆品中的应用。本论文采用两步复合酶解法，对胶原蛋白进行 了酶解，极大地提高了酶解效率，解决了胶原蛋白难酶解，酶解产物 分子量分布不集中等问题。 本研究以胶原蛋白为底物，从胶原蛋白结构入手；单因素实验筛 选木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶 等作为水解复合酶；复合酶优选实验确定复合酶由木瓜蛋白酶和菠萝 蛋白酶组成。通过单因素和正交实验，确定了最佳酶解条件：p h 值 为6 5 、酶解时间为4 h 、温度为4 0 c 、底物浓度为1 2 、木瓜蛋白酶 和菠萝蛋白酶酶用量分别3 0 0 0 和2 0 0 0 u g ，酸溶性多肽得率和水解 度分别为6 0 和5 2 6 。十二烷基硫酸钠一聚丙酰胺凝胶电泳表明： 胶原蛋白酶解产物中大分子多肽主要集中在2 5 7 4 0 3 k d a 之间。 为了制备胶原小分子肽，胶原蛋白酶解产物采用由碱性蛋白酶和 中性蛋白酶组成的复合酶进行了胶原小分子肽酶解研究。通过单因素 实验确定了最佳酶解条件为：p u 值为9 5 ，温度为5 0 。c ，时间为3 h ， 碱性蛋白酶酶和中性蛋白酶酶用量分别为7 0 0 0 和4 0 0 0 u g ，酶解产 物s e c - h p l c 分析表明：酶解产物平均分子量为3 8 6 3 d a ，满足了胶 原小分子肽应用在化妆品中对其分子量的要求。 用活性碳对酶水解产物进行脱色处理，以酶解液脱色率和多肽损 失率考察脱色效果，得出活性炭对酶水解产物脱色的适宜条件：活性 炭用量为1 5 、酶解液p h 为5 5 、脱色温度为3 5 、脱色时间为 4 0 r a i n ，此时酶解产物脱色率为8 6 2 1 ，多肽损失率为6 1 2 。 酶解产物分别采用截留分子量8 k d a 、2 0 k d a 超滤膜进行了处理， 截留物s d s p a g e 实验表明：两种膜片截留物分子量都为3 7 6 和 3 2 5 k d a 。结合酶解产物分子量分布情况确定了超滤膜截留分子量为 2 0 k d a ，通过单因素实验，确定了最佳超滤条件为：肽浓度3 9 1g l ， 压强0 5 m p a ，p h5 0 ，室温超滤1 5 0 r a i n ，分子量小于2 0 k d a 的酶解 产物透过率达9 6 1 ，透过物s e c h p l c 分析表明：分子量小于2 k d a 酶解产物峰面积9 9 7 9 。 关键词：胶原蛋白复合酶水解多肽超滤 s t u d yo np r e r a t i o no fs m a l lc o l l a g e n p e p t i d e sb yb i o e n z y m a t i ch y d r o l y s i sa n d t h es m a l lp e p t i d e so fs e p a r a t i o n a b s t r a c t c o l l a g e np e p t i d e si st h ee n z y m a t i ch y d r o l y s a t eo fc o l l a g e na n da m i x t u r ep e p t i d e s ，b e c a u s eo fi t sg o o df u n c t i o n a lp r o p e r t i e s ，p h y d i o n l o g i c a l a c t i v i t i e sa n de x t e n s i v eu t i l i z a t i o np r o s p e c ti nt h ef i e l do fc o s m e t i c & f o o d ，t h em o l e c u l a rw e i g h to fh y d r o l y z e dc o l l a g e ni sm o s ti m p o r t a n t f a c t o r si np r o d u c t i n gc o l l a g e np e p t i d e st ou s ea sf u n c t i o n a lm a t e r i a l si n c o s m e t i c i nt h ep r e v i o u ss t u d i e s ，t h e r ea r es o m ep r o b l e m si nt h ec o l l a g e n h y d r o l y z e ，h y d r o l y s a t e m o l e c u l a rw e i g h ti sl a r g oa n d t h ec o n t e n to fb i g m o l e c u l a rw e i g h ti sh i g h ，s oc o l l a g e np e p t i d e sa p p l i c a t i o n sw a sa s t r i c t e d i nc o s m e t i c i nt h ep a p e r , a d o p t e dt w o - c o m p l e xp r o t e a s e st oh y d r o l y z e c o l l a g e n ，s oh e i g h t e n e dt h ee f f i c i e n c yo fh y d r o l y z a t i o na n ds o l v e d d i f f i c u l th y d r o l y z e u s i n gc o l l a g e n 嬲t h es u b s t m t ea n dt h er a t eo fa c i d i t yd i s s o l u t i o n p o l y p e p t i d e s a se x a m i n a t i o n i n d e xf r o mt h es t r u c t u r eo fc o l l a g e n ； p a p a i n ，b r o m e l i n ，a l k a l i n ep r o t e a s e ，n e u t r a lp r o t e a s ea n df l a v o r e n z y m ep r i n c i p i u mc h o s e na n du s e df o rt h eh y d r o l y s i so fc o l l a g e nb y m o n o - f a c t o re x p e r i m e n t a t i o n c o m p l e xp r o t e a s e sw a sc o n s t i t u t e do f p a p a i na n db r o m e l i nb yt h ec o m p a r et e s to fc o m p l e xp r o t e a s e s t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m a lc o n d i t i o no fh y d r o l y s i sb ym o n o f a c t o r t e s ta n do r t h o g o n a lt e s t ：p h6 5 、t i m e ( t 14 h 、t e m p e r a t u r e ( t ) 4 0 * 2 、 s u b s t a n c e ( i s i ) 1 2 、p e p s i na n db r o m e l i ne sa r e3 0 0 0a n d2 0 0 0 u g - 1 r e s p e c t i v e l y ，t h er a t eo fa c i d i t yd i s s o l u t i o np o l y p e p t i d e sa n dd h w a s6 0 a n d5 2 6 r e s p e c t i v e l y t h es d s - p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s ( s d s - p a g e ) s h o w e dt h a tt h em o l e c u l a rw e i g h to fh y d r o l y s i sw h i c ht h e v e s t i g eb i gp e p t i d e sc o n c e n t r a t e do nb e t w e e n 2 5 7k d aa n d4 0 3 k d a i no r d e rt ot b t a i ns m a l lc o l l a g e np e p t i d e s ，t h ec o l l a g e nh y d r o l y s a t e s f u r t h e rh y d r o l y z e dw i ma l k a l i n ep r o t e a s ea n dn e u t r a lp r o t e a s ea s c o m p l e xp r o t e a s e s ，a n do p t i m i z e d t h ec o n d i t i o n s b ym o n o f a c t o r e x p e r i m e n t a t i o n ：p h 9 5 、t i m e3 h 、t e m p e r a t u r e5 0 。c 、a l k a l i n ep r o t e a s e a n dn e u t r a lp r o t e a s ee s7 0 0 0a n d4 0 0 0 u gr e s p e c t i v e l y t h er e s u l to f h y d r o l y s a t eb y s i z ee x c l u s i o n c h r o m a t o g r a p h y - h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( s e c - h p l c ) ：t h ea v e r a g em o l e c u l a rw e i g h t ( a i 垤w ) o fh y d r o l y s a t ew a s3 8 6 3 d a , t h ea p p l i c a t i o nr e q u e s t o f m o l e c u l a rw e i g h ts a t i s f i e dt ou s ei nc o s m e t i c a c t i v a t e dc a r b o nw a sc h o s e da sd e c o l o u r i n ga g e n to fh y d r o l y s a t e ，i t i sa ne f f e c t i v ea n ds i m p l ed e c o l o u r i z e ro nt h ed e c o l o r i z a t i o no f h y d r o l y s a t e t h er e s u l ts h o w e dt h a th i g hd e g r e eo f d i s c o l o u r i z a t i o nc o u l d b eo b t a i n e du n d e rt h ef o l l o w i n gc o n d i t i o n s ：a c t i v a t e dc a r b o nc o n c e n t r - a t i o n1 5 ，p h5 5 ，t e m p e r a t u r e4 0 。c ，t i m e3 0 m i n ，d e c o u r i n ga n dt h el o s s r a t eo f p e p t i d e sa r e8 6 2 1 a n d6 1 2 r e s p e c t i v e l y m o l e c u l a rw e i g h tc u t - o f f ( m w c o ) 8 k d a 、2 0 k d ao f u l t r a f i l t r a t i o n m e m b r a n ew e r ea d o p t e dt op r i n c i p i u ms 印啪t eh y d r o l y s a t e ，t h er e s u l to f r e m o v a lh y d r o l y s a t e ss d s - p a g e ，t h em o l e c u l a rw e i g h to fh y d r o l y s a t e a r ea l l3 7 6a n d3 2 5 k d ab yu l t r a f i l t r a t i o n - m e m b r a n em w c o8 k d aa n d 2 0 k d a w ec o n f i r m e dt h em w c o2 0 k d ao fu l t r a f i l t r a t i o nm e m b r a n eb y c o m b i n i n gt h ec h r o m a t 蠼即mm a po fp e p t i d e so fh y d r o l y s a e ，t h eo p t i m a l c o n d i t i o n s ：t h ec o m c e n l x a t i o no f p e p t i d e s3 9 1g l ，p r e s s u r e0 5 m p a ，p h 5 0 ，t h et i m eo fu l t r a f i l t r a t i o n1 5 0 m i ni nr n l t h ep e r m e a t ef l u xo f p e p t i d e si s9 6 1 t h es e c h p l cs h o w e dt h a tt h em o l e c u l a rw e i g h to f h y d r o l y s a t el e s st h a n2 k d ap e a ka r e ai s9 9 7 9 k e yw o r d s ：c o l l a g e nc o m p l e xp r o t e a s e sh y d r o l y s i sp e p t i d e s u l t r a f i l t r a t i o n 符号说明 时间( m i n 、h ) 温度( ) 底物浓度( ) 水解度( ) 酶用量( k u g o ru g ) 酸溶性多肽得率( ) 平均分子量( d a ) 电泳迁移率( 呦 蛋白质水解后每克蛋白被裂解肽键的毫摩尔数( r e t o o l g ) 每克原料蛋白质中肽键的毫摩尔数( m m o l g ) 所水解蛋白质中氨基酸的平均分子量( d a ) 组成蛋白质的某种氨基酸的百分含量( ) 组成蛋白质的某种氨基酸的分子量( d a ) 碱用量( m 1 ) 碱浓度( m o l l ) 酶解液中蛋白质质量( n 6 2 5 ) ( g ) ； a - n h 2 平均解离度 n i - 1 3 + 的解离常数 数均分子量( d a ) 重均分子量( d a ) 粘均分子量( d a ) 平均肽链长度 有效膜面积( m ? ) 膜透过速率( g ( 力血m 2 ) i v ，r阎册船粥枷母尥n肺口坼坼口丛一砌一撕一胞踞h 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的 成果和相关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名单位 发表或使用本论文的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发 表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研 究工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 一秘 2 唧年了月z 厂日 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文： 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全都内容。 论文作者签名僻承导师签名。文a 裂2 0 0 7 年r 月飞日 j 穗j “绀 q k a r | 和，r j r ，p 膏j 巴 1 1 弓l 言 第一章绪论 蛋白质是维持人类生命的最重要营养物质之一，是人体组成及代谢的物质基 础，也是人类饮食结构的重要成分。因此，蛋白质一直以来都是生命科学和食品 科学重要的研究对象。 现代研究发现，不少天然蛋白质的功能特性往往尚不明确，而在其水解过程 中，由于可离解基团n h 4 ，c o o 一) 数目增多、分子内部疏水性残基暴露、多肽 链长降低，导致蛋白水解物的许多关键性参数，如消化吸收性、溶解性、粘度、 乳化性等，较原蛋白质相比有很大程度的提高【l j 。大量研究表明蛋白水解物的功 能特性较原蛋白质而言存在更多的优越性，尤其是某些肽类物质显示出一系列独 特的生理活性。 1 2 生物活性肽生理功能及应用 生物活性肽饵i o a e t i v ep e p t i d e s ) 是指具有一些特定生理功能的肽类物质，具有 多种生物体代谢和生理调节功能。肽易消化吸收，具有免疫调节、激素调节、抗 肥胖、抗癌、抗菌、抗病毒、降压降脂、增强肌肉的力量和消除疲劳、促进矿物 质吸收、抗衰老、抗肿瘤、抗病毒等生理活性。除生物功能外，肽还具有较好的 酸、热稳定性、水溶性及粘度随浓度变化迟钝等优点，因而易于作为功能因子添 加到各类食品中，市场前景极好。 1 2 1 生物活性肽生理功能 ( 1 ) 小肽的吸收机制 传统蛋白质营养理论认为，蛋白质在动物体内一部分降解为氨基酸，直接用 于体内蛋白质的合成，另一部分降解为小分子肽，而小分子肽必须在肽酶作用下 分解为氨基酸，才能被机体吸收利用。生物代谢实验证明，大部分蛋白质并非完 全水解成氨基酸才被吸收，而是在多肽形式时就能直接被人体吸收，而且二肽和 三肽的吸收速度比相同组成的氨基酸还要快。 与游离氨基酸相比，小肽的吸收具有以下优点：1 ) 小肽中氨基酸残基的吸 收速度大于等量游离氨基酸的吸收速度；2 ) 小分子肽能直接提高氨基酸在体内 的吸收速度，减少氨基酸之间的撷抗作用；3 ) 小分子肽本身吸收速度快、耗能 低、载体不易饱和。a d i b i 【2 1 进行了g l y 、g l y - g l y 、g l y - g l y - g l y 经口服观测血中 漕h 峨“骨习q a j i ， ，f 囊毫 含量的实验，结果表明吸收速率和吸收量是三肽 - - 肽 单个氨基酸。f a n a b i k i 研究发现：小肽日粮组小鼠体内蛋白合成率较相应氨基酸日粮组小鼠高2 6 ，研 究表明这是由于小肽吸收迅速，从而提高整体蛋白质的合成。 ( 2 ) 降压作用 血管紧张素转化酶( a c e ) 在人体血压调节过程中是至关重要的。血浆中的血 管紧张素原被肾素水解成血管紧张素i ，在a c e 酶作用下，继续水解产生血管紧 张素i i 。血管紧张素h 能使血管强烈收缩，血压上升。降压肽能与a c e 酶上的n 区和c 区两个活性区域强烈结合，竞争性的抑制a c e 酶催化血管紧张素i 转化为 血管紧张素，同时可降解激肽，使之失活，这样就抑制了血管紧张素酶a c e 的活性，从而抑制了血管平滑肌的收缩，抵抗高血压的产生i ”。 高血压是当今流行最为广泛的心血管疾病，据世界卫生组织( w h o ) 估计，全 球患病人数已达5 亿，同时，高血压又是冠心病、心及肾功能衰竭的最主要的发病 因素，被国际上称为“无声杀手”，所以研制高效降压药物也是当前一个研究热点。 j i u m - r o n gc h e n f f ：0 s u h - c h i n g y a n g i 4 1 j 书胃蛋白酶酶解大豆分离蛋白，在酶解产物中分 离的到的l i e - t y r - l e u - l e u ，t i e a l a ，p h e - p h c l e u ，t y r - l e a - g l y - a s n - o l n & v a l - m e t a s p - l y s - p r o - g l n - g l y 等小分子活性肽对a c e 有很强的抑制效果，能有效地降低高 血压，并且对正常人无任何副作用。m u r a k a m im 【5 】等对先天性高血压的大鼠实验 发现，a l a - l e a p r o m e t 四肽有很好的降压功效。研究发现：酶解大豆分离蛋白水 解度达3 1 时，产生了大量由2 6 个氨残基组成的、分子量在2 0 0 6 0 0 d a p _ 间的 降压肽【6 】。日本学者营野等的研究发现，胰蛋白酶酶解大豆分离蛋白产物中，分子 量在5 0 0 0 d a 以下的大豆肽具降低胆固醇的作用，而分子量在1 0 0 0 d a 以下的大豆肽 具有降压的效果。沙丁鱼肉水解生产的沙丁鱼肽，主要成份是a c e 抑制肽，已被 用于各种食品尤其是高血压患者的保健食品或制剂中【7 】。 ( 3 ) 促进矿物质吸收作用 有些肽有促进矿物质吸收作用，研究最多的为酶解酪蛋白所获得的肽， 研究表明：酪蛋白磷酸肽中在连续3 个s e r - p 残基后连接谷酞胺基部分( 核心部 位) ，核心部位能在p n 7 8 的条件下有效地与钙形成可溶性复合物，可防止在各 种钙磷比值条件下产生不溶性磷酸钙i s 】。酪蛋白磷酸肽还可作为其它许多矿物质 的载体，如锌、铁、锰、铜及硒等。肽促进矿物质吸收主要是通过螯合矿物质阳 离子，使其保持在肠道中的溶解状态而实现的。 后来研究发现矿物质结合肽不仅来源于乳蛋白，还产生于其他食物蛋白，如 大豆蛋白、鱼和谷蛋白等。m e i s e l 等从牛的1 酪蛋白中获得到的磷酸肽，如l - 酪蛋白的6 5 7 5 氨基酸残基构成的肽片段s e r - s e r - g l u g l u - i l e - v a l p r o - a s h ，其丝 氨酸残基几乎被磷酸化，其可以和ca ：2 + ，f e 2 + ，c u 2 + 和z n 2 + 形成可溶性盐，促进 这些离子有效吸收。m a r i a 等( 1 9 9 5 ) 报道，肉类水解产物中的肽类物质使铁离子 2 可溶，吸收率提高。离子的可溶性、吸收率提高。施用晖等研究发现，在蛋鸡日 粮中添加小肽制品后，血浆中的铁有了显著的提法高。z a m b o n i n oi n f a n e 等在 1 9 9 7 年报道了，在鲈鱼苗日粮中添加小肽后，能极大减少骨骼的畸形现象，这可 能是由于有些小肤具有与金属结合的特性，从而促进钙、铜和锌的被动转运过程 及在体内的储存。 ( 4 ) 促进脂肪代谢作用 过度肥胖会引起许多疾病，但低能膳食方式的减肥又会导致减肥者体质下 降，因此在减肥过程中保持氮的平衡非常重要。肽有阻止脂肪吸收的作用，还具 有更强的促进脂肪代谢的效果。因而，在保证足够肽摄入的基础上，将其余能量 组分降至最低，则既可达到减肥的目的，又能保证减肥者的体质。 ( 5 ) 抗氧化作用 人体的正常代谢过程中不断产生自由基，这对于许多生化反应是必要的。体 内与自我免疫有关的吞噬细胞在消灭细菌、真菌、病毒和其它抗原物质中会产生 自由基；健康机体对各种外界影响作出反应的同时会产生自由基；年龄老化过程 中机体也在不断产生自由基。氧无处不在而且氧易于接受电子，氧自由基在细胞 代谢过程中普遍存在，所以人体总是处于自由基伤害的危险之中【9 1 0 1 。生物体内 的氧化最终导致生物体的衰老，因此机体的氧化作用引起了世人的关注。目前有 很多研究表明，一些食物中的蛋白质或酶解产物具有抗氧化活性。 ( 6 ) 美容作用 随着年龄增长，人体内的胶原蛋白含量会逐渐流失，网状支撑体亦会渐渐变 厚变硬、失去弹性；当真皮层的弹性与保水度降低，皮肤便会失去弹性出现变薄 和老化，而且还会出现脂肪萎缩、汗腺及皮脂腺分泌减少。这会令皮肤出现色 斑、皱纹等一系列老化现象，显出老态。 胶原肽主要活性表现在营养性、保湿性、亲合性、配伍性、去色斑作用、美 白等特性。胶原肽特别是小分子肽易吸收，改善皮肤细胞生存环境和促进皮肤组 织的新陈代谢，增强循环，达到滋润皮肤延缓衰老、美容、消皱、养发的目的【”】。 化妆品应用中对胶原水解物分子量的要求一般小于1 5 k d a ，此分子量范围的胶原 水解物在与化妆品表面活性剂配合使用时，不仅不会降低各自的活性，能缓和化 妆中表面活性剂对毛发和皮肤的刺激作用，改善皮肤的健康状况。因此目前国外 的一些高档化妆中大量添加胶原小分子肽以期改善皮肤状况，滋润肌肤，赋予皮 肤光滑感觉。 ( 7 ) 抗肿瘤作用 纤维粘连蛋白是基质中一种重要的糖蛋白，存在于胶原纤维和许多结缔组织 细胞周围。纤维粘连蛋白呈原纤维状，由两条多肽链组成，两条肽链的一端由若 干二硫键连接，每一肽链上均有若干特定的功能区，能分别与细胞、胶原、肝素 和纤维素等结合。在癌细胞转移过程中纤维粘连蛋白起着非常重要的作用。一般 认为，癌细胞转移的抑制作用与其抑制癌细胞附着和浸润基底膜的纤维粘连蛋白 和层粘连蛋白有关，也就是与抑制癌细胞新生血管的形成有关。 胶原肽与纤维粘连蛋白具有很高的亲和性，所以胶原肽对癌细胞转移过程具 有很深的影响。x i a oy a hg a o 等【12 】人利用胰蛋白酶水解酸洗明胶所得到的组分， 用纤维粘连蛋白s c p h a r o s c 亲和色谱分离活性肽，再进一步用凝胶过滤高效液相 色谱和反相高效液相色谱纯化得到两个与纤维粘连蛋白具有很高的亲和性肽。 f u j i s a w a n 等发现了一个6 个氨基酸残基的小分子肽，它在体内能显著抑制腺癌 的生长，包括肺、胃及大肠腺癌p 3 1 。c h e n c 纠1 4 1 发现一个8 个氨基酸残基的小分 子肽，它能进入肿瘤细胞，激活抗癌基因p 5 3 ，诱导肿瘤细胞的死亡。可见肽类 物质生物活性的发现为治疗这一死亡率很高的恶性肿瘤开辟了一条新的道路。 ( 8 ) 抗血栓作用 血栓形成是由于纤维蛋白原参与的结果，纤维蛋白原既参与血小板的凝固， 又参与纤维蛋白的形成，血纤维蛋白原r 链c 末h i s h i s l e u - o l y g l y a l a - l y s - g l n - a l a - a s p - v a l 片段与a r g g l y a s p s e r p h e 片段，这两种肽都能抑制血小板的凝集和 纤维蛋白原结合到a d p 活化的血小板上。n o n a k ai 等人【”】研究发现，胶原蛋白 肽g l y p r o a 曜及其衍生物具有抑制a d p 诱导的血小板凝集，0 3 m m 的g l y p r o - a r g 或其衍生物g i y p r o 吨一g l y 、g l y p r o a r g g l y p r o 等抑制人体血小板凝集 的效果高于5 0 。来源于牛k - 酪蛋白1 0 6 1 1 6 残基的c a s o p l a t e l i n ( m e t - a l a - i l e p r o p r o l y s l y s a s n - g l n a s p l y s ) 和k - 酪蛋白1 1 2 1 1 6 糖肽片段的l y s - a s p - g h - a s p l y s 可抑制a d p 诱导的血小板凝集及其与纤维蛋白原结合的作用，即具有抑制血 液凝固及抗血栓形成的作用【1 6 】。大豆蛋白水解物中含9 肽m e t - a l a - i l e p r o - p r o - l y s a s n - a s p l y s 能有效地抑制a d p 诱导的血小板凝集。经酶解或微生物分解的大豆 蛋白产物经小肠吸收进入血液，对血小板的凝集、对纤维蛋白原与活化的血小板 结合起到抑制作用，从而对人体起到健康保护作用【1 7 1 。 ( 9 ) 防治肝性脑病 正常人的芳香族氨基酸在肝脏中代谢分解，当肝功能衰竭时对芳香族氨基酸 分解能力降低，在血液中的浓度升高，而支链氨基酸是在骨骼肌中代谢的，肝脏 病变不会影响它的代谢，因此肝病患者表现为血液中支链氨基酸与芳香族氨基酸 比例下降。高支低芳氨基酸可供临床应用，并有良好的效果。大量的芳香族氨基 酸通过血脑屏障进入大脑，影响了神经传导，产生肝性昏迷。大量的动物实验和 临床证明，注射或口服高f 值氨基酸混合物可使病人血中b a c c a a a 接近或大于 3 。并能有效地维持血中b a c c 的浓度，从而纠正血脑中氨基酸的病态模式，改 善肝昏迷程度和精神状态【l 引。有研究表明大豆蛋白经过特殊酶的组合水解，可 4 婚t k 卜翻r 亏懂a r | 鲁嘎葺p 竞 以获得高支低芳氨基酸的大豆肽，在临床上可以防治肝性脑病。 ( 1 0 ) 降低胆固醇作用 大豆蛋白经酶作用产生的食饵饲喂老鼠时，血清胆固醇浓度降低；大豆蛋白 消化物的疏水性与胆汁酸的结合呈正相关。因此，有人认为消化生成的肽能刺 激甲状腺激素的分泌增加，促进胆固醇的胆汁酸化，粪便排泄胆固醇增加，由此 起到降低血液胆固醇的作用。蛋白质消化物的疏水性与胆汁酸的结合呈正相关， 蛋白酶水解物肽类能刺激甲状腺激素的分泌增加，促进胆固醇的胆汁酸化，从而 使粪便排泄胆固醇量增加【1 6 1 7 1 。 日本学者营野等人通过实验发现，大豆蛋白质的酶解物分子量在5 0 0 0 个左右 的部分有降低胆固醇的效果，并且具有以下优点：1 ) 对于胆固醇值高的人具有 降低总胆固醇的功效，而对胆固醇值正常的人没有降低胆固醇作用；2 ) 胆固醇 值正常的人在食用高胆固醇含量食品时，也有防止血清胆固醇值升高的作用；3 ) 使胆固醇中有害的l d t 、v l d l 值降低，但不会使有益的h d l 值降低。 2 2 生物活性肽的应用 肽类物质具有良好酸、热稳定性、水溶性及粘度随浓度变化迟钝等理化性能 和独特的易消化吸收，具有免疫调节、激素调节、抗肥胖、抗癌、抗菌、抗病毒、 降压降脂等生理特性，不仅可用于大多数的普通食品中，还可用于营养疗效食品、 功能保健食品、保健医药制品、运动员食品、医疗行业和化妆品等行业，应用十 分广泛。肽类不仅能提供人体生长、发育所需要的营养物质，同时还能防病治病、 调节人体生理机能的功效，有些特性是原蛋白质或其组成氨基酸所没有的独特的 生理活性。 k a t o a 等【1 9 】研究发现，食用蛋白质蛋白酶水解作用后，其大分子被水解生成 小分子肽，甚至游离氨基酸，其功能特性有很大的改善。张根生等用a l c a l a s e 蛋 白酶酶解火鸡骨胶原的水解多肽液再配一定量的木糖醇和蜂蜜等，开发了火鸡骨 胶原口服液。赵玉红等【2 0 】将鲢鱼副产物( 鱼头、鱼皮和鱼骨刺) 中的蛋白质加 酶水解，得到的水解产物易利用易吸收，可广泛应用于临床营养、老年人保健食 品和运动员营养食品。水产胶原蛋白中应用较多的是鱼皮胶原蛋白，水解鱼皮胶 原蛋白可生产新型的胶原多肽、氨基酸口服液、胶原蛋白饮料等保健食品。 1 3 生物活性肽的制备 肽是由氨基酸通过肽键连接而成的化合物，它是机体组织细胞的基本组成部 分。生物活性肽的生产制备的方法和途径有三条：1 ) 从自然界的生物体中提取 j 爿喇寞“牖日q a j ，- j r r | 嚏 其本身固有的各种天然活性肽类物质；2 ) 通过蛋白质降解的途径可以获得具有 各种生理功能的生物活性肽：3 ) 通过化学方法和重组d n a 技术合成的方法来制 备生物活性肽。 天然生物体中存在着具有各种生理功能的生物活性肽，因此从天然生物体中 可以提取生物活性肽，但其生产成本较高，而且生物活性肽在生物体内的含量普 遍很低，很难实现大规模的生产；重组d n a 技术合成法也被广泛应用，但是这 种方法多用来生产长肽和蛋白质，而许多生物活性肽都是短肽，所以也限制了这 种方法的使用。化学法是利用酸碱水解蛋白，虽然简单价廉，反应条件剧烈、氨 基酸受损严重、导致l 氨基酸转化成d 氨基酸，形成像氯丙醇等这样的有毒物质， 且难以按规定的水解程度控制水解。生物酶法反应条件温和、酶解专一性强、反 应容器小、没有毒性物质产生、水解过程容易控制1 2 l j 。所以工业上化学法制备 肽类物质将逐步被酶水解蛋白法代潜。 1 3 1 直接提取分离法镧备生物活性 这种方法是应用各种分离纯化技术，直接从自然界生物体把生物体本身所 含有的各种生物活性肽提取出来。一般而言生物体所含有的活性肽含量很低，要 把这些生物活性肽从生物体分离出来获得较高纯度的产物，必然要经过多次分 离，这将造成很高的加工操作成本。因此应用直接提取分离法制备生物活性肽是 难以实现大规模工业化生产。直接提取分离法制备生物活性，绝大多数是不能满 足人类所需的生物活性肽，它的最大用途是为肽合成法制备生物活性肽或蛋白质 酶降解制备生物活性肽提供先导化合物。 1 3 2 合成法制备生物活性肚 近年来生物活性肽合成的操作广泛地应用在基础研究与高f 值医药用的生物 活性肽生产，常用的活性肽合成方法包括化学合成法( 分为固相和液相两种化学 合成方法，它们的基本化学原理是一样的) 、d n a 重组法和酶合成法等三种。总 体上讲，合成法虽可按人们的意愿合成任意活性肽，但目前因为存在成本高、副 反应多及残留有毒化合物等问题制约着合成法制备生物活性肽的发展。 1 3 3 生物酶解法制备生物活性肽 蛋白质水解物的生产方式主要有化学降解法和生物酶法。化学法是利用酸碱 水解蛋白，虽然简单价廉，但由于反应条件剧烈。蛋白质酸碱水解的不安全性， 生产过程中氨基酸受损严重，使l 氨基酸转化成d 氨基酸，并能形成像氯丙醇等 这样的有毒物质，且难以按规定的水解程度控制水解，故较少采用。而生物酶法 6 纠峙藏k 卜翻r ，墨i 湘，j 门鼍r ，巴 易于控制水解进程、能在温和的条件下进行、且可通过选择酶的种类、控制反应 条件进行定位水解产生特定的生物活性肽。 生物酶法制备生物活性肽安全性极高，蛋白质能在温和的条件下进行定位水 解产生特定的生物活性肽，且生物酶解过程易控制，近年来报道的生物活性肽的 制备方法主要是生物酶解法。生物酶可来源于植物( 木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、 无花果蛋白酶等1 、动物( 胃蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、羟肽酶a 、胰凝乳 蛋白酶等) 和微生物( 碱性蛋白酶、中性蛋白酶、羟肽酶c 、核菌蛋白酶、e n d oa r g c 、e n d o a s p n 、e n d o l y s c 、毛酶) 等瞄】。酶的选择、在生产蛋白水解物中酶 的选择是关键，它不仅影响最后产品的生理功能、得率、反应速度，而且也直接 影响产品的风味和物理化学特性，与目标生物活性肽的下游技术( 特别是分离纯 化技术) 一起成为决定蛋白质酶解法能否实现大规模工业化生产的关键。 1 4 生物酶法制备生物活性肽的研究进展 在蛋白质的多肽链内部可能普遍存在着活性功能区，选择合适的生物酶水解 这些多肽链，通过生物酶解的方法，将具有生物活性的肤片段从蛋白质前体释放 出来，就有可能把蛋白质中所蕴藏的功能区肽片段释放出来，制备出具有各种各 样生理活性的生物活性肽制备瞄】。现已从酪蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白、豌豆 蛋白、玉米蛋白、卵白蛋白、丝蛋白、胶原蛋白、水产蛋白等的酶解物中制得一 系列功能各异的生物活性肽。除生理功能外，这些生物活性肽还具有较好的酸、 热稳定性、水溶性及粘度随浓度变化迟钝等优点，因而易于作为功能因子添加到 各类食品中，市场前景极好。 近年来人们在生物活性肽方面取得了很大进展，越来越多生物活性肽被发现 并分离出来，并确定了结构。活性肽的不断发现，以及对它们的结构、功能和机 理的深入研究，无疑在理论研究和临床实践中都有其重要意义。 1 4 1 生物酶法制备生物活性肽国外研究进展 国外对蛋白质生物酶水解的研究始于1 0 0 多年前，自1 8 8 6 年开始把蛋白质水 解物应用于食品工业，当时把酸水解的植物蛋白水解物( h v p ) 作为调味剂添加 于食品中。随后关于蛋白质水解的研究是针对如何改善蛋白质的加工功能特性 上，如水溶性、乳化性、起饱性、热稳定性、贮存稳定性以及风味特性等。 较早时国外大部分学者是以d 酪蛋白为底物，研究血纤维蛋白溶酶酶解酪蛋 白的定位水解机理，研究发现，血纤维蛋白溶酶对b 一酪蛋白中的l y s 2 5 一l y s 2 ， l y s l o s h i s l 嘶，* 0 l y s l 0 7 _ g 1 u 1 椰等肽键有很强的定位专一水解特性l 。s n o e r 蚴和v a n r i e l ( 1 9 7 9 ) 发表了从牛血或牛奶中提取的血纤维蛋白溶酶能快速酶解嘞- 酪蛋白 7 爿一p 囊 “卜翻号，l a 1 0 和口吃铲，r | 哥，b 的报道，经过4 d , 时的孵化，只有2 0 的啦酪蛋白未水解，血纤维蛋白酶酶解啦- 酪蛋白与b 酪蛋白酶解率基本相同【2 5 i 。1 9 8 9 年，两个研究小组在血纤维蛋白溶酶 缓冲体系中酶解嘞酪蛋白研究发现，血纤维蛋白溶酶酶解主切点是7 l y s x 和 a r g - x 删t 2 6 j 。m a f q l | e z 等人【2 7 l 研究了以血红蛋白为底物的碱性蛋白酶催化水 解的动力学模型。t e l l o 等人瞄】以乳清蛋白为底物，研究了m p k p r o t e a s e6 6 0l 、 a l c a l a s e0 6l 和p e m2 5 0 0s 等三种酶促水解的动力学模型。 近年来，国外对蛋白质酶解的研究主要集中在下面几个方面：1 ) 挖掘新的 蛋白质资源及其酶解产物功能特性的研究；2 ) 蛋白酶解工艺的研究；3 ) 分离纯 化的研究；4 ) 应用领域的研究；5 ) 新型酶制剂研究和相关下游工程技术的研究。 1 4 2 生物奠法制备生物活性肽国内研究进展 我国利用生物酶法制备生物活性肽方面的研究起步较晚，早期对蛋白质水 解的研究主要是基于改善蛋白质的加工功能特性方面，而且大量的研究工作都集 中在大豆蛋白、花生蛋白、玉米蛋白等植物蛋白。前几年在我国调味品行业用量 比较大的植物蛋白水解物，其水解方法是利用酸水解法制造的，结果直接导致蛋 白水解物中残留异丙醇等有毒物质，对我国的调味品产业造成比较大的冲击。 关蕊等研究表明：胰蛋白酶不仅可以切断琥珀明胶主链上的肽键，而且对琥 珀酸基和明胶侧链氨基所形成的酰胺键也具有反应活性，导致降解后琥珀明胶酰 化度下降。他的研究还发现在反应过程中，可以通过酶的加入量和酶解反应时间 调节酶解产物的酰化度。李书国等根据酶促反应动力学原理系统分析了影响大豆 蛋白酶解的主要因子对大豆蛋白水解度的影响。吴建中等提出丁采用p r o t a m e x 酶 和f l a v o u r z y m e 酶双酶法分步酶解工艺来生产低苦味大豆多肽的方法，研究发现 f l a v o u r z y m e 酶能够有效地将疏水性氨基酸从大豆多肽端基切除，降低人豆多肽 的苦味。钱方研究相了同水解条件下，将a l c a l a s e 碱性内切酶、h a p 低温高碱碱 性蛋白酶、1 3 9 8 中性蛋白酶、f l a v o u r z y m e 复合风味蛋白酶、胃蛋白酶等五种蛋 白酶分别作用于大豆分离蛋白，比较其酶解物苦味的大小。研究发现：h a p 低温 高碱碱性蛋白酶、1 3 9 8 中性蛋白酶、f l a v o u r z y m e 复合风味蛋白酶不易产生苦味， 而胃蛋白酶和a l c a l a s e 碱性内切酶两种酶较易产生苦味。林伟锋等以沙丁鱼蛋白 为底物，应用数学推导与实验研究结合的方法，建立了胰蛋白酶酶解沙丁鱼蛋白 的可控酶解过程的动力学模型。 近年来，国内外已开展了相关的蛋白质酶解的动力学研究，主要集中在以大 豆蛋白为主的植物蛋白以及以酪蛋白、乳蛋白和血红蛋白为主的动物蛋白。大部 分学者主要是通过测定酶解反应过程的水解度( d h ) 来控制酶解反应的进程。 8 1 4 3 生物奠法镧备胶原小分子肽研究进展 自从1 9 7 9 年日本学者大岛等p j 确认胶原多肽具有降血压作用以来，相继有 许多研究表明胶原多肽具有很多生理功能，特别是最近的一些报道表明胶原多