（应用化学专业论文）人类基因3’UTR区的内含子保留对microRNA靶标影响研究.pdf

史国抖堂挂盔盔堂亟堂僮淦塞 生塞箍墨 中文摘要 m i c r o r n a s ( m i r n a s ) 是一类非编码r n a s ，它们能够通过与靶标基因的 m r n a 特异结合对靶标基因进行转录后调控。植物的m i r n a s 能够与靶标基因 的m r n a s 精确配对，并且结合区域可能是m r n a s 的所有部分；相对于植物， 动物的m i r n a s 与靶标基因发生不精确配对，因此形成比植物复杂的局部二级结 构，但是动物的m i r n 舢只与靶标基因的3 非编码区内序列结合。目前，实验 确定m i r n a s 的靶标还比较困难，到2 0 0 7 年初，总共实验验证的靶标不超过1 0 0 个，而现在在各个物种中发现的m i r n a s 已经有四千多个，预测人类中有l 3 的 基因受到m i r n a s 的调控，所以通过生物信息学手段确定m i r n a s 的靶标和研 究其功能就变得重要和迫切。从m r n a 前体中除去内含子得到信使m r n a 的过程被 称为r n a 剪接，而对同一m r n a 前体的不同剪接方式就成为选择性剪接，选择性 剪接在高等生物的基因调节中处于核心的地位，作为选择性剪接的一种模式，内 含子保留影响m r n a 的特性和蛋白质的编码，有其独特和重要的作用。虽然我 们知道部分内含子保留事件发生在3 非编码区，而人类中m i r n a s 靶标在3 非 编码区内，但是对于3 非编码区的内含子保留事件对m i r n a s 靶标的影响还没 有系统的研究过。本文中，我们从m a a s e 和a s d 两大数据库的近万个人类选 择性剪接基因中发现共有2 ，8 6 4 个基因含有至少一个内含子保留事件，进一步 分析发现共有3 8 7 个基因在3 非编码区含有至少一个内含子保留事件。我们通过 三个在线靶标预测工具m i r a n d a , t a r g e t s c a n s 和p i c t a r 分析这些保留内含子可 能含有的m i r n a s 靶标。研究发现m r n a 可能含有比目前发现的更多m i r n a 靶标， 一些m r n a 能通过3 u t r 区的内含子保留而受到m i r n a 的调节。研究还发现保留 内含子能显著增加宿主基因被m i r n a 调节的可能，一些基因内含子保留区域比其 他区域更可能含有m i r n a 的靶标位点。我们通过比较目前多个在线m i r n a 靶标预 测工具所采用的数据发现很多3 u t r 序列是不完整的，一些含有保留内含子的 长序列被忽视掉了，这说明m i r n a 的很多潜在靶标被忽视了。 【关键词】 微小r n a ，选择性剪接，内含子保留， 非编码区，微小r n a 靶标 生国整堂捷垄太堂塑堂焦淦塞 地l ! 墼! a b s t r a c t m i c r o r n a s ( m i r n a s ) a r eac l a s so fn o n - c o d i n gr n a st h a tp o s t - t r a n s c r i p t i o n a l l y r e g u l a t et h ee x p r e s s i o no ft a r g e tg e n e sb yb i n d i n gt ot h et a r g e tm r n a s i nc o n t r a s tt o p l a n tm i r n a s ，w h i c hr e c o g n i z et h e i rt a r g e tm r n a sb yn e a r - p e r f e c tb a s ep a r i n g ， a n i m a lm i r n a sb i n dl e s s t i g h t l yt o t h e i rt a r g e t sa n dp r o d u c em o r ec o m p l e x s e c o n d a r ys t r u c t u r e so fm i r n a t a r g e td u p l e x e s e x p e r i m e n t a l i d e n t i f i c a t i o no f m i r n at a r g e t si s d i f f i c u l t ，s oab i o i n f o r m a t i c sp r e d i c t i o no fm i r n at a r g e t s i s i m p o r t a n tf o ra s s i s t i n gm i r n af u n c t i o ni d e n t i f i c a t i o na n dc o m p r e h e n s i v eg e n o m e a n n o t a t i o n a so n ef o r mo fa l t e r n a t i v es p l i c i n g ，i n t r o nr e t e n t i o nh a si n f l u e n c eu p o n m r n am o d i f i c a t i o na n dp r o t e i ne n c o d i n g t h ee f f e c to fm i r n ao nm r n a c o n t a i n i n gr e t a i n e d i n t r o nw i t h i n3 u t rh o w e v e r ，h a sn o tb e e ns y s t e m a t i c a l l y e l u c i d a t e d h e r e ，w ee x a m i n e dat o t a lo f2 ，8 6 4h u m a ng e n e sw h i c hc o n t a i na tl e a s t o n er e t a i n e di n t r o nf r o mt h em a a s ea n da s dd a t a b a s e sa n df o u n d3 8 7g e n e sh a v i n g c o n t a i n e dr e t a i n e di n 订o n sw i t h i n3 u t r n ee f f c c to f r e t a i n e di n t r o n su p o nr n i r n a t a r g e t sw a se x p l o r e dw i t l lt h r e ew e b - b a s e dp r o g r a m sf o rm i r n ap r e d i c t i o ni n c l u d i n g m i r a n d a , t a r g e t s c a n sa n dp i c t a r 1 1 碡r e s u l t ss h o w e dt h a tr e t a i n e di n t m n sc a n i n c r e a s ep u t a t i v em i r n at a r g e t si nh u m a nm r n a r e t a i n e di n u o n sh a v eh i g h e r c h a n c e st h a no t h e rr e g i o n so f3 u t ri ni n v o l v i n gt h es i t eo fm i r n a st a r g e t so fm o s t g e n e sw h i c hc o n t a i np u t a t i v em i r n at a r g e t sw i t h i ni t f u r t h e r m o r e ，s o m et r a n s c r i p t s c o n t a i nm i r n a t a r g e t ss o l e l yb e c a u s eo ft h er e t a i n e di n t r o n si n3 u t r i na d d i t i o n ， w ee x a m i n e dt h o s e i g n o r e d r e t a i n e di n t r o n sb ym i r a n d as o f t w a r ea n dt h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tm i r n a sm a yc o n t a i nm a n ym o r ep u t a t i v et a r g e t s k e y w o r d sl m i c r o r n a ，a l t e r n a t i v es p l i c i n g ，i n t r o nr e t e n t i o n ，u n t r a n s l a t e dr e g i o n s ( u t r s ) ，m ir n at a r g e t s i i 中国科学技术大学学位论文相关声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作 所取得的成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任 何他人已经发表或撰写过的研究成果。与本人一起工作过的个人以及 对本论文的研究工作所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明。 本人授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权，即：学 校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复印手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 作者签名：零| ；l 生 y 叻7 年月f 日 生匿型堂撞垄盔堂亟耄僮逾塞笠二童虹! ! 丛酸重要塞望塑墅塞理丛 第一章m i c r o r n a 的重要意义和研究现状 1 1m i c r o r n a 的发现 m i c r o r n a s ( m i r n a s ) 是一类长约2 2 核苷酸的非编码的单链r n a 分子，它们 广泛存在于植物、动物和病毒中。最早发现的是l i n - 4 和它的靶基因l i n 一1 4 。 1 9 9 3 年，l e e 等人在对秀丽新小杆线虫( c e l e g a n s ) 进行突变体的遗传分析中 意外地发现了一种控制细胞发育时序的基因，命名为l i n 一4 ，并通过定点突变发 现l i n 一4 并不编码蛋白，而是产生一种长度约为2 2 n t 的小r n a 分子 1 】。这种 小r n a 分子能以不完全互补的方式与其靶m r n a 的37 非翻译区的特定区域相互 作用来抑制l i n 一1 4 的表达，最终导致1 i n - 1 4 蛋白质合成的减少，这种现象叫 做转译抑制。通过转译抑制，l i n - 4 控制着c e l e g a n s 幼虫由l l 期向l 2 期 的转化。为什么一个只有2 2n t 的r n a 分子起着如此重要的调节作用? 当时人 们无法解释，只能认为是一种稀少的个别现象。但是，2 0 0 0 年第2 个m i r n a l e t - 7 及其人类和果蝇中同源物的发现改变了人们的看法，m i r n a 可能是一类进 化上保守的、在生命中起着重要调控作用的分子 2 。它们能有效地抑制相关蛋 白质的合成，导致靶m r n a 的降解，或者其他形式的调节机制来抑制靶基因的表 达，。产生基因沉默。 近年来发现m i r n a 可能在基因表达调控领域中起着超乎想象的重要作用， m i r n a 序列、结构、丰度和表达方式的多样性，使其可能作为蛋白质编码m r n a 的 强有力的调节子。早先研究人员认为m i r n a 通过抑制m r n a 的翻译，引起蛋白质 合成的减少而不影响m r n a 在细胞质中的水平；但是近年来的发现表明m i r n a 不 仅可以抑制蛋白质的合成也可以引起m r n a 的裂解从而使m r n a 的水平降低。m i r n a 的发现丰富了人们对蛋白质合成控制的认识，补充了在r n a 水平对靶m r n a 分 子进行更迅速和有效的调节，展现了细胞内基因表达调控全方位多层次的网络 系统，m i r n a 的发现也是对中心法则中r n a 调节角色的重要补充 3 5 。 1 2 寻找m i r n a 基因 1 2 1 克隆方法寻找m i r n a 基因 2 0 0 1 年m i r n a 研究开始飞速发展l a g o s q u i n t a n a 等人设计出一种专门 克隆小片段r n a 的方法，在2h 的果蝇胚胎的裂解液里和h e l a 细胞的总r n a 中 克隆了3 7 个新的m i r n a 基因 6 。l a u 等人用稍微改进的克隆方法在线虫中找到 了5 5 个m i r n a 基因 7 。l e e 等人运用生物信息学和c d n a 文库相结合的方法找 虫巨型堂蕉盔盍堂墅堂焦淦銮簋二童世q 趔的重垩童竖塑班峦瑰丛 到了1 3 个m i r n a 8 。随后掀起了寻找m i r n a 基因的热潮l a g o s - q u i n t a n a 等 人继续他们寻找m i r n a 基因的工作，2 0 0 2 年和2 0 0 3 年用同样的方法分别在小 鼠和人特异组织中克隆了3 4 和3 1 个新的m i r n a 9 1 0 。 随后人们将寻找m i r n a 基因的目光转向特异的组织和发育的特异阶段。 m o u r e l a t o s 等人用小片段克隆的方法在h e l a 细胞中克隆了3 1 个m i r n a 1 1 。 h o u b a v i t y 等人在小鼠e s 细胞中克隆了1 5 个m i r n a 1 2 。d o s t i e 等人和k i m 等人在哺乳动物神经细胞中分别找到了5 3 和4 0 个m i r n a 1 3 1 4 。a m b r o s 等人 在线虫中又找到2 1 个m i r n a 1 5 。a r a v i n 等人在果蝇的不同发育阶段找到了6 3 个m i r n a 1 6 。w a n g 等人在籼稻中找到了2 0 个m i r n a 基因 1 7 。p f e f f e r 等 人在e b 病毒的基因组中，找到5 个编码m i r n a 的基因 1 s ，这为m i r n a 基因家 族添加了病毒中的成员。不久后该研究组又在另3 种病毒中找到了2 9 个病毒 m i r n a 1 9 。s u h 等人在人胚胎干细胞中找到了3 6 个m i r n a 基因，这些m i r n a 随着胚胎的发育表达量逐渐减少 2 0 。s e i t z 等人在人的1 4 q 3 2 区域找到4 6 个 m i r n a 基因，发现它们多数在人的胚胎中表达，只由母性染色体表达，并且受 到上游2 0 0k b 处的一个甲基化区域( i g d m r ) 调节 2 1 。z a s a s h i m a 等人运用 克隆的方法检测了t p a 诱导人白血病细胞h l - 6 0 分化前后m i r n a 表达谱的变化， 找到了3 个新的m i r n h ，并发现不同m i r n a 在分化前后表达量不同 2 2 。最近 w a n g 等人通过基因芯片技术在人类肺部发现大量组织特异m i r n a 2 3 3 。目前科学 家们已在不同的种属中克隆了大量的新m i r n a 基因。 1 2 2 计算机软件预测m i r n a 基因 m i r n a 是由一个约7 0n t 的茎环结构前体而来，并且在进化上是保守的， 因此可用计算机的方法来识别。 l i m 等人开发了一个软件m i r s c a n ，这是一个能特异的识别2 个物种间的同 源序列的程序。用它在c e l e g a n s 和c b r i g g s a e 中寻找到同源的发卡结构，通 过已知m i r n a 的训练后去给那些发卡结构打分，预测线虫的m i r n a 2 4 。l i m 等 人用同样的方法，在脊椎动物里寻找m i r n a 基因，并预测出人的m i r n a 基因数 在2 0 0 2 5 5 之间，这个数字大约是人类基因组的1 2 5 。2 0 0 4 年。m i r s c a n 程 序又被用来检测了线虫中m i r n a 基因上下游序列的同源性，和内含子中产生 m i r n a 的寄主基因的同源性( h o s tg e n e ) ，并且找到了一个非常一致的序列模块 运用这个不断改进的m i r s c a n ，又在线虫中发现了9 个m i r n a ，并被p c r 实验所 证实 2 6 。 2 生国丑堂撞苤太堂亟堂焦迨塞差= 童女i ! 剑的重要童竖塑班盔埋挞 l a i 等人根据m i r n a 的3 个特点开发出软件m i r s e e k e r ：( 1 ) m i r n a 的保守性， 需要形成一个7 0 1 0 0n t 的前体：( 2 ) 在相似的物种中，m i r n a 是很保守的：( 3 ) 在相距较远的物种间，m i r n a 是有一定的分歧的它包括以下3 个步骤：( 1 ) 通 过a v i d 寻找果蝇中基因间的保守的序列：( 2 ) 通过m f o l d 辨认此序列是否能形 成保守的茎环结构，并给这个结构打分评价：( 3 ) 评价m i r n a 在不同物种中的 分歧模式最后，m i r s e e k e r 也需要通过分子生物学的方法，加以验证 2 7 。 l e g e n d r e 等人用“e r p i n ”代替“b l a s t ”从基因组中搜寻与已知m i r n a 类似的m i r n a 基因，输入已矢i m i r n a 软件可以根据已知m i r n a 的结构从基因组 中搜寻到结构类似的候选m i r n a 基因 2 8 。 通过实验手段和生物信息学手段，至2 0 0 7 年初，欧洲桑格实验室的m i r n a 数据库中收录的m i r n a 数已经达到4 4 4 9 个，包括4 9 个物种( 2 0 0 7 年2 月，版本 8 0 h t t p ：m i c r o r n a s a n g e r a c u k s e a u e n c e s i n d e x s h t m l ) 。 1 3m i r n a 的分布、结构特征、加工过程与生物功能 1 3 1m i r n a 的分布 目前发现m i r n a 主要分布在基因间区和基因的内含子区，极少部分位于基 因的3 u t r 区和外显子区。并且有近半数的m i r n a 相邻分布，形成很多m i r n a 簇( 图1 ) 。 m 1 螂f l - 2 1 一 翌 轴郇却卵晦g _ _ j l - 一。 m i r - 1 7 8 一l o a 一2 0 - i g b - 1 9 2 - 1 嘲，。 噩噩噩噩显建 l 帆 m i r - 1 5 a 一1 6 - ti nd 王j e ，2n c f l n al n 甘o n 嘲，晰叭八n 建噩厂一一 m i r - i 0 6 b 一9 3 2 5l nm c m 7p m - m r n ai n t r o n 嘲m w 蝴翊噩旷椭 虫国型堂撞垄盔堂亟堂焦迨塞差= 耋女i ! ! 1 8 丛鲍重噩重竖塑鲤窟理鉴 图lm i r n a 的分布特征 1 3 2m i r n a 的结构特征 m i r n a 由m i r n a 前体p r e m i r n a 力f 1 3 ：而来，p r e m i r n a 是长约7 0 n t 的非编码的 r n a ，它由内源性基因的d n a 反向重复序列转录而来并且具有茎一环结构( 图2 ) 。 动物p r e m i r n a 的茎一环较为一致，而植物p r e m i r n a 的茎一环则差异比较大。m i r n a 位于p r e - m i r n a 的茎上，目前在不同物种中发现的m i r n a 的长度约为2 1 2 3 个碱基 3 ，4 。 a uu c 一0 遣笔 量：3 辜，一 宝尝：g 乏： 毋气 譬3 i b 乒u 。： a ：冀 o c 。 o 罄8 g 嚣 主二嚣 4 c 台 餐 嚣 饕 舞i 。器 嚣 蓄 芒 东 u f 琶醚 ：3=罄!：li管醛燃墓姆 g2：。2：guesxc92，菇飞麓馨q鼍冀琵w_q臻w缨运鼍，“：k。；替一跳e；。：。oo。 u ”k v a baf lo。 j ，u c u 一嚼。熬蔽。躲鑫鉴缸。舭 翥薹紫矍辔ii警一 生巨型堂撞垄叁堂亟堂僮逾塞星= 童匹! 丛丛笪重要壶竖塑鲤塞瑰丛 图2m i r n a 前体的结构特征：( a ) 早先发现的l i n - 4 和l e t - 7 m i r n a ；( b ) 典型 的动物m i r n a ；( c ) 典型的植物m i r n a 。 1 3 3m i r n a 的加工过程 目前，哺乳动物m i r n a 的加工成熟过程模型如图3 所示。首先，m i r n a 基因在 细胞核内转录成前体转录本( p r i m i r n a ) ，并被r n a s e i i i 核酸酶d r o s h a 力l 工成长 约7 0n t 的发夹状的m i r n a 前体( p r e - m i r n a ) 2 9 ，3 0 】。p r e m i r n a 在r a n - g t p 和蛋白e x p o r t i n 5 的帮助下从细胞核进入胞质内 3 1 - 3 2 】。胞质中p r e - m i r n a 在 d i c e r 酶的作用下，被切割成双链的m i r n a ：m i r n a 配对分子，然后成熟的 m i r n a 配对分子被解旋酶解链，单链的m i r n a 进入一个核糖蛋白复合体 m i r n p ( 也i q r i s c ) ，m i r n a 通过与靶基因的3 7 u t r 区互补配对，指导m i r n p 复 合体对靶基因m r n a 进行切割或者翻译抑制。与动物相比，植物的m i r n a 的加工 过程稍有不同。在植物中是由蛋白复合体d c l i 将p r i - m i r n a 力i t 成p r e m i r n a 并在 核内加工成双链的m i r n a ：m i r n a + 配对分子 3 3 。双链的m i r n a ：m i r n a 配对分子 在r a n - g t p 的帮助下进入细胞质中，然后成熟的m i r n a 配对分子被解旋酶解链， 单链的m i r n a 进入一个核糖蛋白复合体m i r n p ( 也g q r i s c ) ，m i r n a 通过与靶基因 互补配对，指导m i r n p 复合体对靶基因m r n a 进行切割或者翻译抑制，与动物不 同的是，植物m i r n a 与靶标基因的配对不只局限在3 u t r 区。 1 3 4m i r n a 的作用方式和生物功能 成熟的单链m i r n a 通过核糖蛋白复合体m i r n p ( r i s c ) 去调节基因的表达有两 种模式：靶标m r n a 的降解或者靶标m r n a 的翻译抑制。先前认为m i r n a 与靶标基因 进行精确配对时发生降解，发生不精确配对时只抑锖o m r n a 的翻译 3 。但随着确 定功能的m i r n a 逐渐增多，发现翻译抑制或者降解与是否精确配对之间没有必然 的联系 3 4 。相信随着研究的深入，m i r n a 的作用方式与配对关系会更一步清晰。 虽然目前发现的m i r n a 已经有数千个，但是确定功能的只有百个左右。确定 m i r n a 功能的困难主要在于：( 1 ) m i r n a 往往只在细胞发育的特定时期和特定组 织表达功i i ：( 2 ) m i r n a 的分子量太小，容易被其他分子信息掩盖；( 3 ) m i r n a 的靶标基因不容易确定。至1 2 0 0 7 年4 月止，发现的m f r n a 功能主要表现在：发育时 序调节、细胞分化、细胞凋亡、细胞增殖、原癌或抑癌基因、调节胰岛素分泌、 调节胆固醇的代谢等 3 ，4 。近年来，发现m i r n a 与人类一些重要疾病，如：癌 症、心脏病等密切相关 3 5 3 7 。 生鱼整堂撞盔盔堂亟堂僮途塞墓二童匹! ! ! e 丛数重蔓意竖塑盟塞丑丛 图3 m i r n a 的加工成熟过程：( a ) 动物中的m i r n a s 加工成熟过程；( b ) 植物中 的m i r n a s 加工成熟过程。 1 4m i r n a 的靶标基因 1 4 1 靶标研究现状 由于m i r n a 是通过抑制或者降解靶标基因表达自身功能，确定m i r n a 的靶标基 因就成为理解m i r n a 功能的重要途径。传统的基因筛选和定位克隆方法选找靶标 基因比较困难，由于目标不明确，效率很低。现在寻找m i r n a 靶标的主要方法是 通过生物信息学手段，其中有很少部分靶标基因通过实验验证后确认了对应 m i r n a 的功能 3 8 3 9 。目前认为一个典型的动物m i r n a 可能作用于上百个靶标 6 虫巨型堂捷盔左堂亟堂焦途塞 蔓二童! i ! q 堕酸重要壶竖独班塞埋鉴 基因，而人类中有超过3 0 的基因受至q m i r n a 的调节 4 0 4 2 。 1 4 2 生物信息学方法确定m i r n a 靶标 1 4 2 1m i r n a 与靶标基因的配对模式 2 0 0 3 年间，几个研究小组分别独立的开发出第一代m i r n a 靶标预测工具， 分别适用于果蝇 4 3 4 5 和哺乳动物 4 6 ，4 7 。由于缺乏高通量的实验验证手段， 生物信息学手段预测靶标得到进一步发展，到2 0 0 7 年初，已经有超过l o 个m i r n a 靶标在线预测工具( 表1 ) 。 表1 目前在线m i r n a 靶标预测工具和其适用物种 眦 h m c 町 h 蛳删d i a 啊。p c b l w p e n n “u 竹 1 2 眦瞻p e c 妇l i t 坼，帅聃t i m b h 白州h r 亩毗f m 陋 州 n y 3 2 蹦l 州i 胁昨，州碡哪r 帆o f 吖f 埘t 母 “ 嘲j n d l h c 坼，_ 州m c m m l o i 吖 w 哟h 曲1 8 p k t a r l h 嘞似口n n 7 p n tf m 脚 ” h 西i r 却：，p c 乜l 嘶r 帅柚jv e n 曲r | 略 1 5 n 咖h 却c ，p “帆m ，础ta l l y 1 7 r 札z 7 ，函删龇肿眦勘n 州l i f i a 妒w o r r h a n d f r u i t 母 打 i n 2 2 咻，c 如m 咐t 幻n t b m ( o m m a 2 z h 协i i 竹 r h i 帅卅i 蜘，脚晡鲫t e d l i a k u m 枷e k 6 利由矿 州 弘 r a r q 嵋0 0 i t 聃舯：，铀啪1 m 掘哪叫由咖黼州细托勺 棼 阳b 柏弘舯乜学t 蹦h 酗哪巾畦触 w 咖铆t 睇 ” 已有的实验数据都支持m i r n a 与靶标基因配对时，m i r n a 的5 区的6 8 个碱基的种子序列优先与靶标配对。根据m i r n a 除种子序列外的其他序列与靶 标配对的模式，m i r n a 与靶标基因的配对模式大体上可以被分为三类：( 1 ) 除 种子序列配对外还有其他序列补充配对，但与靶标序列配对不连续；( 2 ) 种子 序列精确配对，但其他区域配对不显著；( 3 ) 与靶标序列有近乎连续和完全的 配对( 图4 ) 。当m i r n a 与靶标形成不完全配对时，m i r n a 与靶序列间能形成环 状结构，如图5 。 p 霹= = = ac 尹i = = = = ：鞠呵i = = = = 3 二_ _ 、厂- 图4 m i r n a 与靶基因配对方式 7 生国叠堂挂苤太堂亟堂僮迨塞墓= 童巫! q e 丛的重壁意塞塑班壅理挞 、 q矿 图5 m i r n a 与靶标形成的典型二级结构 1 4 2 2 计算机方法预测m i r n a 的靶标 虽然计算机方法预测m i r n a 靶标的方法多种多样，但是这些方法可大体上分 为三类：( 1 ) m i r n a 与靶标的配对可能性是基于碱基配对的热力学稳定性计算， 不对靶标序列进行进化保守性分析，这种方法主要在早期被采用，优点在于原理 简单，可快速的寻找出可能存在的靶标 4 6 - 4 7 。但是这种方法噪音很大，现在 一般只用在粗略分析m i p , n a 靶标上。( 2 ) 随着研究的深入，发现m i r n a 和其靶 标在进化上都具有较高的保守性，因此在早期单纯基于热力学计算的方法上，研 究人员开发出了同时考虑靶标保守性和热力学稳定性的预测方法。基于这种方法 并具有较高可靠度的工具有：p i c t a r 4 8 、t a r g e t s c a n s 4 9 m i r a n d a 5 0 这 种方法的不足在于可能忽略掉了物种特有的m i r n a 靶标。( 3 ) 通过已实验验证 的m i r n a 与靶基因配对的二级结构模式预测新的具有相同或相似的二级结构的 靶标 5 1 】。这类方法具有较高灵敏度，但是实验验证的靶标有限，因此潜在的 新的配对类型不容易发现。 s 生巨整堂撞垄太堂亟堂僮i 金塞 簋= 室匝! q 8 丛的重要塞塞塑堑塞理丛 1 5 参考文献 1 l e e ，r v ，cf e i n b a t u n ，r l a n da m b r o s ，v ( 1 9 9 3 ) t h ec e l e g a u sh e t e r o c h r o n i c g o n el i n - 4e n c o d e ss m a l lr n a s 、v i t i la n t i s e u s ec o m p l e m e n t a r i t yt ol i n - 1 4 c e l l7 5 8 4 3 5 4 2 r e i n 1 a n ，b j ，s l a c k ，f j ，b a s s o n , m ，p a s q u i n e l l i ，a e ，b e t t i n g e r , j c ，r o u g v i e ， a e ，h o r v i t z ，h r a n dr u v k u n ，g ( 2 0 0 0 ) t h e2 1 n u c l e o t i d el e t - 7r n ar e g u l a t e s d e v e l o p m e n t a lt i m i n gi nc a a n o r h a b d i t i se l e g a n s n a t u r e4 0 3 ，9 0 1 6 3 a m b r o s ，v ( 2 0 0 4 ) n ef u n c t i o n so f a n i m a lm i c r o r n a s n a t u r e4 3 1 ，3 5 0 5 4 b a r t e l ，d p ( 2 0 0 4 ) m i c r o r n a s ：g e n o m i c s ，b i o g e n e s i s ，m e c h a n i s m ，a n df u n c t i o n c e l l1 1 6 2 8 1 - 9 7 5 c h e r t , k a n dr a j e w s l q , , n f 2 0 0 7 ) 耵l ee v o l u t i o no f g e n er e g u l a t i o nb y t r a n s c r i p t i o nf a c t o r sa n dm i c r o r n a s n a tr e vg e n e t8 ，9 3 1 0 3 6 l a g o s - q u i n t a n am ，r a u h u tr l e n d e c k e lw ：e ta 1 ( 2 0 0 1 ) i d e n t i f i c a t i o no f n o v e l g e n e sc o d i n gf o rs m a l le x p r e s s e dr n a s s c i e n c e 2 9 4 ：8 5 3 8 5 8 7 l a u ，n c l i i i l ，l p w e i n s t e i n ，e qb a r t e l ，d p ( 2 0 0 1 ) a na b u n d a n tc l a s so f t i n yr n a s 埘t 1 1p r o b a b l er e g u l a t o r yr o l e si nc a e n o r h a b d i t i se l e g a n s s c i e n c e 2 9 4 ：8 5 8 8 6 2 8 l e e ，i lc a m b r o s ，v ( 2 0 0 1 ) a ne x t e n s i v ec l a s so f s m a l lr n a si nc a e n o r h a b d i t i s e l e g a u s s c i e n c e ，2 9 4 ：8 6 2 - 8 6 4 9 l a g o s q u i n t a n a , m r a u h u t ，r y a l c i n ，a m e y e r , j l e n d e c k e l ，w t u s c l l l ，t ( 2 0 0 2 ) i d e n t i f i c a t i o no f t i s s u e s p e c i f i cm i c r o r n a sf r o mm o u s e c t i i tb i 0 1 1 2 ：7 3 5 7 3 9 1 0 l a g o s - q u i n t a n a , r a u h u t , r m e y e gj b o r k h a r d t , a t u s e h l t ( 2 0 0 3 ) n e w m i c r o r n a sf r o mm o u s ea n dh u m a n r n a 9 ：1 7 5 1 7 9 1 1 m o u r e l a t o s ，z d o s f i e ，j p a u s h k i n , s m i r n p s ：( 2 0 0 2 ) an o v e lc l a s so f r i b o n u c l e o p r o t e i n sc o n t a i n i n gn u m e r o u sm i c r o r n a s g e n e sd e v , 1 6 ：7 2 0 - 7 2 8 1 2 h o u b a v i y , h b m u r r a y , m f s h a r p p a ( 2 0 0 3 ) e m b r y o n i cs t e mc e l l s p e c i f i c m i c r o r n a s d e lc e l l 5 ：3 51 - 3 5 8 1 3 d o s f i e ，j m o u r e l a t o s ，z y a n g ，m s h a r m a , a d r e y f u s s ，g ( 2 0 0 3 ) n u m e r o u s m i c r o r n p si nn e u r o n a lc e l l sc o n t a i n i n gn o v e im i c r o r n a s r n a 9 ：1 8 0 1 8 6 1 4 k i m ，j k r i c h e v s k y , a g r a d , yh a y e s ，gd k o s i k ，k s c h u r c h , gm r u v k u n , g ( 2 0 0 4 ) i d e n t i f i c a t i o no f m a n ym i c r o r n a st h a t 9 生国整堂挂丕盔堂亟堂僮逾塞差= 童女i q 耻艘重蔓盛塞塑班窭理丛 c o p u r i f yw i t hp o l y r i b o s o m e si nm a m m a l i a nn e u r o i l s p r o cn a i la c a ds c iu s a ， 1 0 1 ：3 6 0 3 6 5 1 5 a m b r o s ，vl e e ，r c l a v a n w a y , a w i l l i a m s ，et j e w e l l ，d ( 2 0 0 3 ) m i c r o r n a sa n do t h e r t i n ye n d o g e n o u sr n a si nc e l e g a n s c u r rb i o l ， 1 3 ：8 0 7 8 18 1 6 a r a v i n , a a l a g o s q u i n t a n a , m ( 2 0 0 3 ) 1 1 地s m a l lr n ap r o f i l ed u r i n g d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e rd e v e l o p m e n t d e vc e l l ，5 ：3 3 7 - 3 5 0 1 7 w a n g ，j fz h o u ，h c h e n , yq l u o ，q j q u , l h ( 2 0 0 4 ) i d e n t i f i c a t i o no f 2 0 m i c r o r n a sf r o mo r y z as a t i v a n u c l e i ca c i d sr e s ，3 2 ：1 6 8 8 - 1 6 9 5 1 8 p f e f f e r , s z a v o l a n ，m g r a s s e r , f a c h i e n , m ( 2 0 0 4 ) 1 d e n t i f i c a t i o no f v i r u s - e n c o d e dm i c r o i 斟a s s c i e n c e ，2 0 0 4 ，3 0 4 ：7 3 4 7 3 6 1 9 p f e f f e r , s s e w e r , a 但0 0 5 ) l a g o s q u i n t a n a , m s h e r i d a n , r i d e n t i f i c a t i o no f m i c r o r n a so f t h eh e r p e s v i r u sf a m i l y n a tm e t h o d s 2 ：2 6 9 - 2 7 6 2 0 s i l l l ，m r l e e ，y k i m ，j y k i m ，s k m o o n , s h l e e ，j y c h a , k y c h t m g ， h m y o o n ，h s m o o n , s yk i m ，v n k i m ，k s ( 2 0 0 4 ) h u m a ne m b r y o m c s t e mc e l l se x p r e s sau n i q u es e to f m i c r o r n a s d e vb i o l ，2 7 0 ( 2 ) ：4 8 8 - 4 9 8 2 1 s e i t z ，h r o y o ，h b o r t o l i n , m l l i n ，s p f e r g u s o n s m i t h ，a c c a v a i l l e ，j ( 2 0 0 4 ) al a r